Evaluation de la fonction mitochondriale Analytical Toxicology

Evaluation de la fonction mitochondriale
Les mitochondries exercent deux fonctions essentielles dans la cellule, à savoir la
production de 90% de l’énergie de la cellule, et le contrôle de la survie cellulaire en tant que
partie de la mort cellulaire programmée (apoptose). Les changements indésirables dans
l’une ou l’autre de ces fonctions peuvent avoir des conséquences désastreuses, et donc la
surveillance des composés pour la toxicité mitochondriale est un élément crucial de tout
programme de dépistage toxicologiques, et de nombreux études toxicologiques.
Chaque année, un pourcentage appréciable de drogues est retiré du marché, ou leur
utilisation est réduite suite à des avertissements relatifs au danger qu’elles représentent à
des doses élevées, ou en raison d’un effet négatif qui n’a pas été encore découvert pendant
les essais précliniques et cliniques. C’est souvent parce que l’effet indésirable est subtil et
ne conduit pas à l’histopathologie.
Récemment, et avec une meilleure compréhension de la structure et de la fonction
mitochondriale, des tests de dysfonctionnement mitochondrial ont été développés.
L’Application de ces tests a révélé une forte détérioration mitochondriale par plusieurs
médicaments précédemment retirés y compris la cérivastatine (Baycol), la troglitazone
(Rezulin), la néfazodone (Serzone) et Tolcapone. Il n’est donc pas surprenant que l’accent
soit mis sur l’identification de la toxicité mitochondriale au début du processus de
développement.
Il ya trois effets indésirables généraux qui résultent de la toxicité mitochondriale: 1.
perturbation du métabolisme énergétique; 2. augmentation de la génération de radicaux
libres; 3. apoptose.
La capacité et les connaissance pour tester les médicaments pour ces effets progressent
rapidement. Pendant plusieurs années, les systèmes de dépistage cellulaire tels que
Cellomics® ont été disponible et comprennent typiquement un ou plusieurs essais de
toxicité mitochondriale, tels que des dosages pour évaluer la production d’ATP, le potentiel
membranaire, l’activation de la caspase 3 (apoptose) et les espèces réactives de l’oxygène.
Ces analyses présentent un écran de premier ordre utile pour les analyses mitochondriales
générales.
Mais aucun de ces dosages ne peut, même en combinaison, fournir les données
mécanistiques sur laquelle des décisions oui / non peuvent être prises en toute confiance
quant à la sécurité d’un médicament. Ces dosages sont également les plus appropriés pour
identifier les effets toxiques aigus et les effets chroniques de l’expression des protéines
mitochondriales et les effets des modifications post-traduction qui peuvent être manquées.
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L’ensemble de tests de la toxicité mitochondriale étend la capacité de collecte de données
du toxicologue en permettant d’identifier et de mesurer des sites spécifiques et des
mécanismes de toxicité au niveau de chaque protéine.
Paradigme de test de toxicité mitochondriale. Les trois effets toxiques
généraux peuvent être mesurés en utilisant des dosages appropriés à
la fois pour le criblage ainsi que pour ceux convenant au mécanisme
d’action pour des études détaillées. Tous les dosages peuvent être
réalisés dans des plaques à 96 puits. Tous les essais de dépistages
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ainsi que les autres essais de biogénèse mitochondriale sont
disponibles chez divers fournisseurs, Le dosage de la biogénèse ainsi
que le reste des essais mécanistiques sont exclusifs à « Mitosciences »
« le kit ».
Dépistage général de la fonction mitochondriale
Les analyses utilisées pour le criblage initial sont typiquement effectuées sur des cultures
cellulaires dans les 6 à 24 heures suivant l’administration du médicament pour identifier les
effets aigus. Les analyses de ce panel comprennent:
A. Production d’ATP
La réduction de la production d’ATP peut être primaire causée par un
trouble Mitochondrial, ou secondaire due à la modification du métabolisme par
l’intermédiaire des interactions des composés cellualaires.
B. Potentiel Membrane Mitochondrial
La mesure du potentiel de membrane fournit des informations sur la capacité de couplage
du transfert d’électrons à la synthèse de l’ATP, ainsi que la capacité de l’organelle à prendre
et à libérer des ions et des substrats à travers la membrane interne mitochondriale.
C. Consommation d’oxygène
La mesure de la consommation d’oxygène complète les dosages de l’ATP et du potentiel de
membrane, puisque l’utilisation de O2 par la cellule est en fonction à la fois du débit du
couplage de la chaîne de transport d’électrons et le processus de la production d’ATP. De
plus, le taux de consommation de O2 est directement lié au potentiel de la membrane car le
découplage, et la perte résultante de la translocation de protons à travers la membrane
interne mitochondriale, entraînent une perte de potentiel de membrane. La détermination
de la consommation d’O2 est la meilleure façon pour identifier les composés qui agissent
comme désaccoupleurs et qui sont souvent, mais pas toujours, faiblement hydrophobes.
D. Production de radicaux libres et le Glutathion
L’augmentation de la production de radicaux libres est caractéristique de la dysfonction
mitochondriale qui peut être
Mesurée à la fois par des dosages à base de colorants basés sur la génération de superoxyde
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ainsi que la réduction des taux de glutathion. La source prédominante de la génération de
radicaux libres est la la chaîne respiratoire mitochondriale, et l’inhibition de ce processus
est souvent liée à des niveaux accrus de radicaux libres. Cependant, il existe d’autres
sources cellulaires de radicaux libres dans des cellules, et ceci n’est donc pas un indicateur
sans équivoque de k’effet direct du composé sur le organelle. De plus, le dosage standard
des capteurs de radicaux libres ne mesure pas les conséquences de de l’augmentation
chroniques de la génération de radicaux libres.
E. Activation Caspase 3 & PARP
L’induction de l’apoptose est une mesure critique à effectuer, et plusieurs paramètres
différents de ce processus sont souvent déterminés dans des contexte de forte teneur, y
compris des la distribution de la phosphatidylsérine par la membrane plasmatique et
l’activation des caspases.
La dysfonction mitochondriale peut induire l’apoptose, et il existe un lien entre la perte en
production d’ATP et l’apoptose qui semble corréler avec la production de radicaux libres.
L’apoptose peut également être déclenchée par de nombreux événements cellulaires qui
n’impliquent pas directement le dysfonctionnement des mitochondries y compris les lésions
chromosomiques, mais inévitablement l’organite devient le foyer de ces réactions.
F. Biogenèse mitochondriale
Un composé qui ne présente pas d’effets toxiques dans les essais de criblage
susmentionnés, même à des concentrations élevées, ne peut être considéré comme exempt
de toxicité mitochondriale jusqu’à ce que le potentiel de toxicité chronique sera évalué. Cela
nécessite la culture des cellules avec ce composé pendant aussi longtemps qu’une semaine,
ou jusqu’à ce qu’il y ait eu plusieurs divisions cellulaires. C’est particulièrement important
pour les antibactériens et les antiviraux, qui peuvent affecter la biogenèse mitochondriale.
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La figure 3A montre une inhibition maximale de la Biogenèse mitochondriale après de
multiples divisions cellulaires par certains anti-bactériens et anti-viraux, alors que la figure
3B montre la perte de protéines mitochondriales induite par L’antibiotique choramphénicol,
en fonction du dosage. Le test de biogenèse mitochondriale est disponible en format de 96
puits (MS641) utile pour des expériences cellulaires et (MS631) utile pour les études sur les
animaux et les essais cliniques.
Etant donné que la réplication mitochondriale et la plus proches de celle chez les bactéries
par rapport aux systèmes cytosoliques / nucléaires correspondants. Ainsi, toute évaluation
de la toxicité de substance antibactériennes ou antivirale destinée à attaquer les
polymérases bactériennes ou leurs machines de synthèse doit être évalués pour leur effet
sur les mitochondries.
L’évaluation de la biogenèse mitochondriale mesure quantitativement la quantité d’une
enzyme dont la présence dépend de la réplication mitochondriale et de la synthèse des
protéines (cytochrome C oxydase) avec celle d’une protéine mitochondriale codée par l’ADN
nucléaire et traduite dans le cytosol (frataxine).
Exploration du mécanisme d’action
A. Essais sur l’activité enzymatique OXPHOS
Ces essais ont pour but de mesurer l’effet direct des médicaments sur les principales
enzymes de la chaîne respiratoire. De nombreux médicaments sont des inhibiteurs d’un ou
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plusieurs de ces complexes, et une telle interaction peut être une cause primaire de toxicité
cellulaire si le composé est susceptible de pénétrer dans les mitochondries. En fait, une
partie significative de ces composés, et en particulier ceux qui sont des acide faibles
hydrophobes, peuvent se concentrer dans les mitochondries.
Table : Sélection de composés avec
effets inhibiteurs sur les complexes de la
chaîne respiratoire. Les données sont
normalisées en pourcentages d’activité
enzymatique. OX1 L’activité du
Complexe I, OX2 + 3 mesure la Activité
des complexes II et III, l’OX4 mesure
Activité du Complexe IV, et OX5 mesure
la Activité de l’ATP synthase.
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Relation dose – réponse (effet) de l’activité
de l’ATP Synthase (Complexe V) et le
succinate Ubiquinone oxydoréductase
(Complexe II) en présence de Troglitazone et
Simvastatine respectivement. L’activité est
affichée Sur l’axe X et est donné en
pourcentage du contrôle DMSO. La
concentration de composés est représenté
sur l’axe Y et est donnée en µM.
B. Essais de Fractionnement et cellulaire et translocation de protéines
apoptotiques
Pour mesurer les mouvements de protéines entre les compartiments cellulaires à la suite
d’un traitement médicamenteux. La délocalisation des protéines est une partie importante
de la signalisation cellulaire métabolique et une étape irréversible de l’apoptose. La
libération du cytochrome c et d’autres facteurs apoptotiques de la mitochondrie est le
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point irréversible dans le processus apoptotique. En outre, il y a apparition de nouveaux
facteurs de transcription entre les facteurs mitochondriaux et les compartiments cellulaires.
De tels mouvements sont des étapes clés dans le contrôle de la biogenèse et la fonction
mitochondriale ainsi que dans l’exécution de l’apoptose.
Le mouvement des protéines dans et hors des mitochondries dans l’apoptose.
Cette figure Montre certains des mouvements clés des facteurs apoptotiques pendant la
mort programmée de la cellule. Le suivi de ceux-ci fournit un aperçu de la nature et du site
de la signalisation apoptotique, et donc le mode d’action d’une substance sur la machine
apoptotique.
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Séparation des fractions HepG2
cytosoliques (C), Mitochondriales (M)
et nucléaires (N), le Kit Mitosciences
utilisé pour la séparation (MSA861).
Les Fractions Ont été analysés par
Western blot en utilisant des Anticorps
Anti- matqueurs cytosoliques
(glycéraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase, GAPDH),
Mitochondriaux (Hsp70, F 1 -ATPase
α, Pyruvate Déshydrogénase (PDH)
E1α et le cytochrome C), et nucléaires
(PARP et SP1).
Lorsque des cellules subissant une apoptose sont examinées de la même manière, toute
redistribution des protéines peuvent être détectées et quantifiées. La figure (cidessus) montre l’exemple d’apoptose induite Par le Gleevec dans les cardiomyocytes. En
plus de la libération de cytochrome c et SMAC Diablo (Non représenté pour simplifier), il
existe un déplacement important de Bax, l’activation (clivage) et redistribution de PARP et
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le mouvement de GAPDH à partir d’une forme soluble dans le cytosol.
Avec différents stimulus apoptotiques, l’implication et les mouvements des protéines Bid,
p53, PUMA etc peuvent être suivis en utilisant des mixtures mAb appropriées.
C. Expression de protéine et essais de modification post-traductionnelle
Pour mesurer les niveaux de protéines métaboliques, les antioxydantes et les pro et antiapoptotiques, ainsi que leur phosphorylation, leur acétylation et leurs modifications
(Oxydation/ Nitration).
Les cellules sont le siège des mécanismes aigus et à long terme d’adaptation aux stress. Les
changements aigus sont basés sur la régulation du métabolisme par des modifications posttranslationnelles telles que la phosphorylation / déphosphorylation et Acétylation /
désactylation. L’adaptation à long terme est basée sur des changements dans la structure
de la protéine elle-même.
La puce MetabArray ™, par exemple fournie par Mitosciences contient des Anticorps qui
fixent plus de 50 protéines clés métaboliques, antioxydantes et apoptotiques, ces protéines
cibles qui ont été sélectionnées en fonction de leur évolution en fonction des traitements
médicamenteux ou sur des rapports mentionnés dans la littérature concerant à leur up- ou
down-regulation pendant le stress cellulaire.
Lorsque les cellules sont comparées avant et après un traitement médicamenteux, des
modifications d’une large gamme d’enzymes peut donc être analysée qualitativement pour
identifier les changement métaboliques induits. De nouveaux mAbs sont ajoutés
régulièrement à ce tableau.
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Quantification de la modification de nitrotyrosine,
représentée comme Signal à l’arrière-plan, après que
les mitochondries sont exposées in vitro au
Peroxynitrite (800 uM). De nombreuses enzymes sont
modifiées vraisemblablement en fonction des résidus de
tyrosine accessibles en surface.
Avec la mesure de l’expression des protéines, le MetAbArray ™ peut être duplexé pour la
meure des activité de phosphorylation et d’acétylation.
Le MetAbArray ™ peut également être duplexé Avec des mesures des dommages oxydatifs.
Le kit peut ainsi donner un aperçu des en mesurant non seulement la régulation ascendante
ou descendante des principaux éliminateurs de radicaux libres comme la SOD1, la SOD2 et
la catalase.
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Les effets du stress oxydatif sur l’enzyme pyruvate
déshydrogénase (PDH), le principal régulateur du
Métabolisme oxydatif, sont étudiés plus en détail. (A)
Comme la nitration des tyrosines augmente avec
exposition aux conditions oxydantes, l’activité
diminue en raison des modifications. (B) Après
purification en utilisant une technnique
d’immunocapture le site de modification est
clairement la sous-unité E2 qui contient une fonction
Lipoyle fonctionnellement nécessaire. L’acide
lipoïque acide très lié.
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