Evaluation de la fonction mitochondriale Analytical Toxicology

Evaluation de la fonction mitochondriale
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Les mitochondries exercent deux fonctions essentielles dans la cellule, à savoir la
production de 90% de l’énergie de la cellule, et le contrôle de la survie cellulaire en tant que
partie de la mort cellulaire programmée (apoptose). Les changements indésirables dans
l’une ou l’autre de ces fonctions peuvent avoir des conséquences désastreuses, et donc la
surveillance des composés pour la toxicité mitochondriale est un élément crucial de tout
programme de dépistage toxicologiques, et de nombreux études toxicologiques.
Chaque année, un pourcentage appréciable de drogues est retiré du marché, ou leur
utilisation est réduite suite à des avertissements relatifs au danger qu’elles représentent à
des doses élevées, ou en raison d’un effet négatif qui n’a pas été encore découvert pendant
les essais précliniques et cliniques. C’est souvent parce que l’effet indésirable est subtil et
ne conduit pas à l’histopathologie.
Récemment, et avec une meilleure compréhension de la structure et de la fonction
mitochondriale, des tests de dysfonctionnement mitochondrial ont été développés.
L’Application de ces tests a révélé une forte détérioration mitochondriale par plusieurs
médicaments précédemment retirés y compris la cérivastatine (Baycol), la troglitazone
(Rezulin), la néfazodone (Serzone) et Tolcapone. Il n’est donc pas surprenant que l’accent
soit mis sur l’identification de la toxicité mitochondriale au début du processus de
développement.
Il ya trois effets indésirables généraux qui résultent de la toxicité mitochondriale: 1.
perturbation du métabolisme énergétique; 2. augmentation de la génération de radicaux
libres; 3. apoptose.
La capacité et les connaissance pour tester les médicaments pour ces effets progressent
rapidement. Pendant plusieurs années, les systèmes de dépistage cellulaire tels que
Cellomics® ont été disponible et comprennent typiquement un ou plusieurs essais de
toxicité mitochondriale, tels que des dosages pour évaluer la production d’ATP, le potentiel
membranaire, l’activation de la caspase 3 (apoptose) et les espèces réactives de l’oxygène.
Ces analyses présentent un écran de premier ordre utile pour les analyses mitochondriales
générales.
Mais aucun de ces dosages ne peut, même en combinaison, fournir les données
mécanistiques sur laquelle des décisions oui / non peuvent être prises en toute confiance
quant à la sécurité d’un médicament. Ces dosages sont également les plus appropriés pour
identifier les effets toxiques aigus et les effets chroniques de l’expression des protéines
mitochondriales et les effets des modifications post-traduction qui peuvent être manquées.

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L’ensemble de tests de la toxicité mitochondriale étend la capacité de collecte de données
du toxicologue en permettant d’identifier et de mesurer des sites spécifiques et des
mécanismes de toxicité au niveau de chaque protéine.
Paradigme de test de toxicité mitochondriale. Les trois effets toxiques
généraux peuvent être mesurés en utilisant des dosages appropriés à
la fois pour le criblage ainsi que pour ceux convenant au mécanisme
d’action pour des études détaillées. Tous les dosages peuvent être
réalisés dans des plaques à 96 puits. Tous les essais de dépistages

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ainsi que les autres essais de biogénèse mitochondriale sont
disponibles chez divers fournisseurs, Le dosage de la biogénèse ainsi
que le reste des essais mécanistiques sont exclusifs à « Mitosciences »
« le kit ».
Dépistage général de la fonction mitochondriale
Les analyses utilisées pour le criblage initial sont typiquement effectuées sur des cultures
cellulaires dans les 6 à 24 heures suivant l’administration du médicament pour identifier les
effets aigus. Les analyses de ce panel comprennent:
A. Production d’ATP
La réduction de la production d’ATP peut être primaire causée par un
trouble Mitochondrial, ou secondaire due à la modification du métabolisme par
l’intermédiaire des interactions des composés cellualaires.
B. Potentiel Membrane Mitochondrial
La mesure du potentiel de membrane fournit des informations sur la capacité de couplage
du transfert d’électrons à la synthèse de l’ATP, ainsi que la capacité de l’organelle à prendre
et à libérer des ions et des substrats à travers la membrane interne mitochondriale.
C. Consommation d’oxygène
La mesure de la consommation d’oxygène complète les dosages de l’ATP et du potentiel de
membrane, puisque l’utilisation de O2 par la cellule est en fonction à la fois du débit du
couplage de la chaîne de transport d’électrons et le processus de la production d’ATP. De
plus, le taux de consommation de O2 est directement lié au potentiel de la membrane car le
découplage, et la perte résultante de la translocation de protons à travers la membrane
interne mitochondriale, entraînent une perte de potentiel de membrane. La détermination
de la consommation d’O2 est la meilleure façon pour identifier les composés qui agissent
comme désaccoupleurs et qui sont souvent, mais pas toujours, faiblement hydrophobes.
D. Production de radicaux libres et le Glutathion
L’augmentation de la production de radicaux libres est caractéristique de la dysfonction
mitochondriale qui peut être
Mesurée à la fois par des dosages à base de colorants basés sur la génération de superoxyde

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ainsi que la réduction des taux de glutathion. La source prédominante de la génération de
radicaux libres est la la chaîne respiratoire mitochondriale, et l’inhibition de ce processus
est souvent liée à des niveaux accrus de radicaux libres. Cependant, il existe d’autres
sources cellulaires de radicaux libres dans des cellules, et ceci n’est donc pas un indicateur
sans équivoque de k’effet direct du composé sur le organelle. De plus, le dosage standard
des capteurs de radicaux libres ne mesure pas les conséquences de de l’augmentation
chroniques de la génération de radicaux libres.
E. Activation Caspase 3 & PARP
L’induction de l’apoptose est une mesure critique à effectuer, et plusieurs paramètres
différents de ce processus sont souvent déterminés dans des contexte de forte teneur, y
compris des la distribution de la phosphatidylsérine par la membrane plasmatique et
l’activation des caspases.
La dysfonction mitochondriale peut induire l’apoptose, et il existe un lien entre la perte en
production d’ATP et l’apoptose qui semble corréler avec la production de radicaux libres.
L’apoptose peut également être déclenchée par de nombreux événements cellulaires qui
n’impliquent pas directement le dysfonctionnement des mitochondries y compris les lésions
chromosomiques, mais inévitablement l’organite devient le foyer de ces réactions.
F. Biogenèse mitochondriale
Un composé qui ne présente pas d’effets toxiques dans les essais de criblage
susmentionnés, même à des concentrations élevées, ne peut être considéré comme exempt
de toxicité mitochondriale jusqu’à ce que le potentiel de toxicité chronique sera évalué. Cela
nécessite la culture des cellules avec ce composé pendant aussi longtemps qu’une semaine,
ou jusqu’à ce qu’il y ait eu plusieurs divisions cellulaires. C’est particulièrement important
pour les antibactériens et les antiviraux, qui peuvent affecter la biogenèse mitochondriale.

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La figure 3A montre une inhibition maximale de la Biogenèse mitochondriale après de
multiples divisions cellulaires par certains anti-bactériens et anti-viraux, alors que la figure
3B montre la perte de protéines mitochondriales induite par L’antibiotique choramphénicol,
en fonction du dosage. Le test de biogenèse mitochondriale est disponible en format de 96
puits (MS641) utile pour des expériences cellulaires et (MS631) utile pour les études sur les
animaux et les essais cliniques.
Etant donné que la réplication mitochondriale et la plus proches de celle chez les bactéries
par rapport aux systèmes cytosoliques / nucléaires correspondants. Ainsi, toute évaluation
de la toxicité de substance antibactériennes ou antivirale destinée à attaquer les
polymérases bactériennes ou leurs machines de synthèse doit être évalués pour leur effet
sur les mitochondries.
L’évaluation de la biogenèse mitochondriale mesure quantitativement la quantité d’une
enzyme dont la présence dépend de la réplication mitochondriale et de la synthèse des
protéines (cytochrome C oxydase) avec celle d’une protéine mitochondriale codée par l’ADN
nucléaire et traduite dans le cytosol (frataxine).
Exploration du mécanisme d’action
A. Essais sur l’activité enzymatique OXPHOS
Ces essais ont pour but de mesurer l’effet direct des médicaments sur les principales
enzymes de la chaîne respiratoire. De nombreux médicaments sont des inhibiteurs d’un ou