Manager les ressources microbiennes impliquées dans la

Journées Recherche-Industrie
Biogaz-Méthanisation
Rennes du 3 au 5 Février 2015
Manager les ressources
microbiennes impliquées
dans la digestion anaérobie
Marina Moletta-Denat (Merci Patrick!),
Jérôme Hamelin, Kim Milferstedt et Eric Trably
ALIMENTATION
Marina Moletta-Denat
INRA Transfert Environnement
ENVIRONNEMENT
[email protected]
AGRICULTURE
De la recherche à l’industrie…
INRA TRANSFERT
ENVIRONNEMENT
est
régulièrement sollicité pour apporter des réponses
à des problématiques liées à la microbiologie.
Par exemples :
Choisir un inoculum ?
Diagnostiquer un dysfonctionnement de la biomasse ?
Identifier et surveiller les espèces pathogènes présentes dans un procédé ou
une filière ?
Prévenir une dérive de la microflore d’un bioprocédé ?
Suivre l’impact microbiologique d’un rejet dans l’environnement ?
Suivre et tracer la microflore d’une matrice ?
Etc…
Offre de services
Prestations
technologiques
Prestations « catalogues »
• Analyses et caractérisation de
sources de pollution (MST,
séquençage haut débit), mesures
de biodégradabilité, mesure de
biodiversité (CE-SSCP), Recherche
d’espèces pathogènes, Mesure
d’impact microbiologique
Prestations « sur-mesure »
• Études de faisabilité au stade
laboratoire et/ou au stade pilote
• Étude des microorganismes dans
leur environnement
• Expertise des procédés
industriels de dépollution
•…
Prestations tertiaires
Formation, information,
accompagnement
• Formation en accompagnement
d’actions de transfert
• Mise à jour technologique
• Organisation de formation
thématiques et de journées
techniques
• Expertise, veille technologique et
synthèses bibliographiques
• Accompagnement des porteurs de
projets dans le cadre de projets de
R&D, ou de projets industriels
De la recherche à l’industrie…
Collecte échantillon et extraction des acides
nucléiques
Empreintes moléculaires (CE-SSCP), PCR et RT-PCR quantitative en
temps réel, Illumina MiSeq.
Identifier, Suivre, Quantifier les espèces présentes dans un procédé …
… pour Diagnostiquer le fonctionnement du procédé
Petit rappel de biologie moléculaire
Bactéries
ADN
ADN = présence et identité des microorganismes + potentialité des microorganismes
ARNr = activité globale des microorganismes
ARNm = activité spécifique des microorganismes (méthanisation, nitrification, pathogénicité, etc…)
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
CE-SSCP (Capillary Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymophism)
Permet d’observer et de mesurer la diversité microbienne d’un écosystème
• Surveiller la diversité bactérienne, archée et eucaryote d’un procédé
o Suivi de montée en charge
o Dérive
o Effet toxique….
• Comparer les échantillons sur la base de leur diversité (Indice de Simpson
(Haegeman et al, 2014)…)
• Suivre la microflore active d’un échantillon de biomasse
Clostridium indolis
Synergistes
Cytophaga
Cytophaga
Spirochaetes
Gram+ Bas GC
Gram+ Bas GC
Green Non
Sulphur
16S rDNA =
presence
16S rRNA =
activité
Delbès et al. LBE, 2000
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
Stratégie microbienne de biodégradation de la lignocellulose
Thèse JC Motte, LBE, 2013
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
Développement d’indicateurs bactériens de dysfonctionnement de la méthanisation
voie sèche
Bac 2 et 3 : Clostridium cellulosi
Bac 1 : Clostridium cellulovorans/butyricum
Thèse A . Abassi, LBE, 2012
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
PCR ou RT-PCR quantitative en temps réel
PCRq : Permet de quantifier les groupes microbiens et fonctions présents dans un
échantillon (Mesure du potentiel)
RT-PCRq : Permet de quantifier l’activité des groupes microbiens et fonctions
présents dans un échantillon (Mesure de l’activité)
• Gestion de procédés
o Suivi du démarrage d’un procédé
o Surveillance de la charge microbienne globale (Bactérie, Archée,
Eucaryote) ou de groupes microbiens spécifiques
• Surveillance de groupes microbiens pathogènes ou
de bio-indicateurs spécifiques.
o Suivi d’une filière, hygiénisation
o Réutilisation des eaux traitées
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
Exemple : Ecosystème microbien nitrifiant
7 millions
billes
Influence de la concentration en matières sèches
sur lesde
communautés
bactériennes et
archées impliquées dans la digestion anaérobie
Groupe A DA fonctionnelle
Groupe B DA inhibée
DA inhibée = bactéries indicatrices en forte hausse et archées méthanogènes en chute
Arc 1, 2 et 4 Methanobacterium (H2)
Arc3 Methanosarcina (acetate)
Thèse A . Abassi, LBE, 2012
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
Séquençage haut-débit
Permet d’identifier et de mesurer l’abondance des groupes microbiens présents dans
un échantillon, de développer des outils de gestion
• Création de base de données sur des écosystèmes spécifiques
o Référence dans le diagnostic de fonctionnement d’un procédé
ex: Diversité/abondance des méthanogènes
Diversité/abondance de groupes fonctionnels
o Aide à la conduite des procédés
ex: Appui au choix d’inoculum
Identification d’espèces pathogènes
• Développement de nouveaux
bio-indicateurs
Diagnostiquer, Identifier, Surveiller, Prévenir, Suivre
Comparaison de la diversité microbienne des inoculum
Digesteurs
Composts
Autres
écosystèmes
Composts après
extraction des cellules
Milferstedt et al, ISME 15
Conclusions
Structure et
abondance de la
diversité
Concentration,
Potentiel
Concentration,
Activité
Structure de la diversité,
abondance des populations,
identification
Principales
cibles
Bactérie, archée,
eucaryote producteur
d’hydrogène, bactéries
sulfato-réductrices…
Bactéries, archées,
fonctions clés
(méthanogènèse,
dégradation de
xénobiotiques…)
Bactéries, archées
eucaryotes…
Temps de
réponse
Bactéries, archées,
fonctions clés
(méthanogènèse,
dégradation de
xénobiotiques,
pathogènes…)
2 jours
2 jours
2 jours
1 mois
Informations
Avantages des outils moléculaires
• Sensibles
• Permettent d’accéder à la microflore non cultivable (environ 99% de la
diversité microbienne)
• Rapides (réponse en 48h)
• Génériques et applicables à tous les écosystèmes (air, surfaces,
résidus, matrice alimentaire, sols, matériaux de construction…)
• Depuis 2005, ces nouveaux outils sont intégrés dans la réglementation
(Microbiologie des aliments, Qualité de l’eau, Qualité des sols…)
(ISO 17601 Qualité des sols - Méthode pour quantifier l'abondance des
communautés microbiennes à partir d'ADN extrait d'échantillons de sol)
Merci de votre attention