5 - microcsb
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COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.STAPH REDACTEURS VERIFICATEUR Amadou DIOP Abdoulaye DIOP Dr Fatou Bintou GUEYE GBAYA Amy SYLLA APPROBATEUR Version : Pr Cheikh Saad-Bou BOYE Sommaire 1. OBJECTIF ............................................................................................ 5 2. PRINICIPE ................................................................................. 5 3. MATERIEL .......................................................................................... 5 4. Réactifs ........................................................................................ 5 5. MODE OPERATOIRE ....................................................................... 5 5.1 Préparation Milieux ................................................................. 5 5.2 Contrôle de qualité des milieux ............................................... 5 5.2.1 Test de stérilité ....................................................................... 5 5.2.1.1 Interprétation et résultats .......................................................................... 5 Les milieux sont considérés comme stériles en l’absence de ................................ 5 5.2.2 Test d’efficacité ...................................................................... 6 • Technique ..................................................................................... 6 5.3 Préparation des plaques ........................................................... 6 5.4 Conditionnement ...................................................................... 6 5.5 Contrôle de qualité du produit fini .......................................... 6 5.5.1 Contrôle de stérilité ............................................................... 6 • Technique ..................................................................................... 6 5.5.2 Contrôle d’efficacité ............................................................... 7 TABLEAU DE LECTURE................................................................................................ 7 5.6 Stockage ............................................................................................................ 7 ANNEXE 1 ............................................................................................................. 8 MILIEU UREE - TRYPTOPHANE ................................................................................ 8 USAGE ................................................................................................................................. 8 PRINICPES ........................................................................................................................ 8 COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée)....................................................... 8 PREPARATION..................................................................................................... 8 LECTURE ........................................................................................................................... 8 CONTRÔLE DE QUALITÉ ............................................................................................. 9 MILIEU DE CLARK ET LUBS ...................................................................................... 9 USAGE ................................................................................................................................. 9 PRINCIPE.............................................................................................................. 9 COMPOSITION (Pour 100 ml d’eau distillée) .................................................... 9 PREPARATION..................................................................................................... 9 LECTURE ........................................................................................................................... 9 CONTRÔLE DE QUALITÉ ............................................................................................. 9 MILIEU DE FALKOW ................................................................................................... 10 USAGE ............................................................................................................................... 10 PRINCIPE............................................................................................................ 10 COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée) .................................................... 10 PREPARATION....................................................................................................10 LECTURE ......................................................................................................................... 10 CONTRÔLE DE QUALITÉ ........................................................................................... 10 MILIEU NITRATE ......................................................................................................... 11 Usage ..................................................................................................................... 11 Principe .................................................................................................................11 Composition (COMPOSITION POUR 100 ML) ..........................................................11 Préparation ...........................................................................................................11 Lecture ............................................................................................................................... 11 CONTRÔLE DE QUALITÉ ........................................................................................... 11 MILIEU A L’ONPG ......................................................................................................... 12 Formule ................................................................................................................ 12 ANNEXE 5 - 6 - 7 ................................................................................................. 12 MEVAG /STAPH .............................................................................................................. 12 Mode d’emploi ...................................................................................................... 12 LES SUCRES ............................................................................................................................ 12 URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 3 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.STAPH COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph 1. OBJECTIF Ce document décrit la procédure de production du coffret d’identification des Staphylocoques par la galerie Micro CSB. 2. PRINICIPE Il s’agit d’une méthode miniaturisée standardisée permettant à partir de substrats déshydratés de mettre en évidence des activités enzymatiques ou d’assimilation de substrats carbonés. Il permet de faire un diagnostic de genre ou d’espèce avec 16 tests biochimiques. 3. MATERIEL • balance de précision • agitateur magnétique • pH-mètre • flacons en verre avec bouchon à vis de 2,50 et 100 ml • seringues • filtres de 0,2 μm de diamètre • erlenmeyer • embouts stériles • micro pipettes • autoclave • boîte de pétri de 4 ou 6 cm de diamètre • hotte à flux laminaire • papier emballage • appareil de scellage • micro plaques • micro pipettes de 20 μl, 200 μl • pipette Pasteur • embouts stériles • étuve • films adhésifs • bec bunsen • microscope optique 4. RÉACTIFS • Sucres : Lactose, Glucose, Mannitol, Saccharose, Tréhalose, Glycérol, Mannose Raffinose • Lysine décarboxylase : LDC • Ornithine décarboxylase : ODC • Arginine dihydrolase : ADC • L-tryptophane • Phosphate monopotassique • NaCl • Urée • Alcool 95° • Eau distillée • Rouge de phénol à 1% • Peptone trypsique ou polypeptane • Pyruvate de sodium • Phosphate dipotassique • Fumarate disodique • Sulfate de magnésium • Phosphate mono-ammonique • NaCl • Bleu de bromothymol • Chlorhydrate de l cystéine • Dextrose • Extrait de levure • Peptone de caséine • Peptone de viande • Poudre ONPG • Thiosulfate de sodium • Sulfate d’ammonium • Créatinine • Potasse • Alpha-naphtol (VP2) • Perchlorure de fer au 1/3 • Réactifs de KOVACS. 5. MODE OPERATOIRE 5.1 Préparation Milieux - Milieu Urée (ANNEXE 1) - Milieu de Clark et Lubs (ANNEXE 2) - Milieu de Falkow (ANNEXE 3) - Milieu Nitrate (ANNEXE 4) - Milieu à l’ONPG (ANNEXE 5) - MEVAG Staph (ANNEXE 6) - Les Sucres (ANNEXE 7) - Réactifs de révélation (ANNEXE 8) 5.2 Contrôle de qualité des milieux 5.2.1 Test de stérilité - utiliser des tubes à hémolyse. - prélever 2 ml de chaque milieu liquide et l’introduire dans un tube donné. - Pour les sucres il faut ajouter 1 ml de MEVAG Staph. - Les tubes ont été fermés avec du coton et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24h. 5.2.1.1Interprétation et résultats Les milieux sont considérés comme stériles en l’absence de : URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 5 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph - virage de l’indicateur coloré - coloration du milieu après ajout de réactifs de révélation pour les cupules concernées. - trouble du milieu 5.2.2 Test d’efficacité Pour chaque caractère biochimique (milieu liquide), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique - Il faut réaliser pour chaque souche de contrôle un inoculum dont la turbidité est ajustée à celle de l’échelle 0 ,5 de l’étalon standard de Mac Farland, en délayant les colonies dans de l’eau distillée stérile. - Distribuer les milieux liquides dans des tubes à hémolyse dont 2 tubes par milieux préparé ; l’un pour les contrôles positifs et l’autre pour les contrôles négatifs). - Marquer pour chaque tube le milieu qu’il contient et le nom de la souche dont on va faire le contrôle. - Ensemencer les tubes avec l’inoculum de la souche de contrôle correspondant (100 μl). - Ajouter une à deux gouttes de paraffine dans tubes contenant ADH, ODC, LDC, URE et tous les sucres. - incubées à l’étuve à 37°C. - La lecture se fait 24H après l’incubation. 5.3 Préparation des plaques Si les plaques ne sont pas déjà stérile au départ , faire le lavage et la stérilisation des plaques de travail. 5.3.1 Lavage - Tremper les plaques dans de l'eau savonneuse pendant 24 heures. - Après les 24 heures, rincer avec de l'eau 2 fois de suite - Tremper les plaques dans de l'alcool à 70° pendant 24 heures - Sécher au four pendant 1 heure 5.3.2 Stérilisation - Placer les plaques sèches sous UV pendant 24 h 5.4 Conditionnement 5.4.1 Distribution 6 La distribution des milieux dans les plaques se fait de la manière suivante : • 100 μl de milieu dans les puits correspondants, d’Urée à Nitrate • 10 μl de sucre à 10 % dans les puits correspondants (de glucose à raffinose). 5.4.2 Déshydratation Au préalable on doit faire : - Le nettoyage et la désinfection de l’étuve à l’aide d’antiseptiques spéciaux (ou eau de Javel diluée ou encore alcool 70°). - La Désinfection de l’enceinte à UV Après distribution des milieux dans les cupules, les plaques sont ensuite mises dans une étuve portée à la température de 43°C en présence d’un dessiccateur (silicagel). L’humidité de l’étuve est contrôlée avec un hygromètre digital. Dans ces conditions, les substrats sont déshydratés en moins de 18 heures. 5.4.3 Emballage Après la déshydratation des milieux, les microplaques sont ensuite emballées dans des sachets stériles puis sont scellé à l’aide d’un appareil de scellage. 5.5 Contrôle de qualité du produit fini 5.5.1 Contrôle de stérilité Pour faire le contrôle de stérilité des lots de plaques déshydratées, on prend 2 à 3 lots de la préparation des plaques déshydratées. Technique - Inoculer les cupules renfermant les milieux allant de l’URE à NIT avec de l’eau physiologique stérile. - les cupules renfermant les sucres avec le MEVAG STAPH et deux gouttes d’huile de parafilm. - Recouvert la plaque d’un parafilm et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24h sur plateau recouvert de papier buvard imbibé d’eau. Le lot est considéré comme stérile en l’absence de virage de l’indicateur et en l’absence de réaction positive pour les tests révélés. URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph 5.5.2 Contrôle d’efficacité Technique Le test permet de voir si le milieu ne s’est pas dégradé au cours de la déshydratation. De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Il est réalisé avec les mêmes souches bactériennes que pour le cas des milieux liquides. A la différence des milieux liquides : - L’inoculum bactérien est ajusté à 1 Mc Farland pour les staphylocoques. TABLEAU DE LECTURE Tests Substrats Réactions / Enzymes Résultats positifs Résultats négatifs URE Urée Uréase Rose framboise Orange ADH Arginine Arginine dihydrolase Violet Jaune ODC Ornithine Ornithine décarboxylase VP Glucose + pyruvate Production d'acétoïne ONPG ONPG Bêta galactosidase NIT Nitrate de potassium Nitrate réductase GLU TRE MAN XYL SAC GLY MNE LAC RAF Glucose Tréhalose Mannitol Xylose Saccharose Glycérol Mannose Lactose Raffinose Fermentation Réactifs à ajouter Violet 1 goutte de KOH 1goutte de créatinine 1 goutte de α-naphtol Jaune Rose-Rouge Incolore Jaune Incolore Noir Incolore Jaune Rouge 1 goutte d’acide sulfanilique. 1 goutte α-naphtylamine 5.6 Stockage Après validation du contrôle de stérilité et d’efficacité des plaques d’identification des staphylocoques, le reste du lot de la production déjà scellé est stocké au réfrigérateur à 4°C. URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 7 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph ANNEXE 1 MILIEU UREE - TRYPTOPHANE USAGE Ce milieu permet de faire la mise en évidence d’une urèase au niveau de la bactérie. Il peut servir aussi à la recherche de Tryptophanedésaminase (TDA) après addition de perchlorure de Fer. PRINICPES L’hydrolyse de l’urée provoque l’accumulation de carbonate d’ammonium qui produit l’alcalinisation du milieu et le virage au rouge de l’indicateur coloré. La TDA est mise en évidence par addition de chlorure ferrique, les acides cétoniques formés suite à la désamination de l’acide aminé donnent une coloration rouge-brun. COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles L-tryptophane 3g Acide aminé essentiel à la recherche de la TDA et de la tryptophanase 1g Source de Phosphore, Elément nutritif Essentiel pour la synthèse des acides nucléotides, de l’ATP et des acides nucléiques Phosphate dipotassique 1g Source de Phosphore … NaCl 5g Source d’électrolytes Eléments nutritif Urée 20 g Molécule azotée nécessaire pour la recherche d’uréase Alcool 95° 10 ml Solubilise le tryptophane 2,5 ml Indicateur coloré Rouge : milieux alcalin, neutre Jaune : milieu acide Phosphate monopotassiqu e Rouge de phénol à 1% pH final : 7 PREPARATION LECTURE - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée stérile - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 - Stérilisation par filtration. - Le produit finit est coloré en jaune. • Recherche d’une uréase - Virage alcalin (rouge violacé) : présence d’une uréase - Absence de virage (jaune) : absence d’uréase. • Recherche de la TDA Ajouter du perchlorure de fer officinal dilué au 1/3 après lecture de l’urée (1 volume pour 5 volumes de milieu). - Virage brun rouge : TDA (+) - Virage jaune orangé : TDA (-) 8 URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Proteus mirabilis Contrôle (-) Escherichia coli ANNEXE 2 MILIEU DE CLARK ET LUBS USAGE Ce milieu permet de faire la mise en évidence de la production d’acétoïne. Ce test est utilisé en particulier pour la différenciation des entérobactéries. Le résultat du test est obtenu après addition de réactifs de révélation. PRINCIPE La production d’acétoïne est mise en évidence par ajout d’une solution d’alpha-naphtol à 5% (VP1) et d’une solution de KOH à 40%, on obtient un virage au rose par fermentation de la 3hydroxybutanone. La production des acides mixtes est mis en evidence par la présence de rouge de méthyle (qui vire au rouge par acidification des acides mixtes). A l’inverse, la coloration jaune montre un milieu acide ou réalcalinisé, soit une absence de fermentation des acides mixtes. COMPOSITION (Pour 100 ml d’eau distillée) Composants Quantités (g) Rôles Peptone trypsique 0,5 Apport d’éléments nutritifs Source de carbone et d’azote Phosphate dipotassique 0,5 Source de P, élément nutritif essentiel à la croissance, Rôle de Tampon 0,5 Source de carbone Essentiel pour la production d’acide pyruvique qui est ensuite dégradé en acetylméthylcarbinol (Acetoïne) Glucose Ph final : 7 ± 0,2 PREPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 100 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0.2 - Autoclaver à 121°C pendant 15 minutes - Le milieu fini présente une coloration jaune et limpide. LECTURE - Teinte Rouge : VP (+) - Coloration Jaune : VP (-) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Klebsiella pneumoniae Contrôle (-) Escherichia coli URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 9 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph ANNEXE 3 MILIEU DE FALKOW USAGE C’est le milieu de base pour la recherche des décarboxylases. Le diagnostic différentiel des espèces appartenant aux familles des Enterobactiaceae, des Vibrionaceae, des Pseudomonaceae… est souvent facilité par la recherche de ces enzymzes. PRINCIPE La fermentation du glucose entraîne une baisse de pH importante. La production, ainsi que l'activité, des décarboxylases et de l'ADH sera favorisée par un pH acide. D'autre part la lecture de l'alcalinisation nécessite une anaérobiose relative : - une bactérie non décarboxylante utilisera les peptones du milieu, et produira des acides organiques ainsi que des bases faibles comme l'ammoniac. - une bactérie décarboxylante après avoir utilisé le glucose va produire du dioxyde de carbone et des amines. L'alcalinité des amines est importante, et le virage de l'indicateur de pH sera obtenu. COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles Extrait de levure 3g Apporte des facteurs de croissance Glucose 1g Source de carbone 5g Source d’électrolytes Maintien l’équilibre osmotique du milieu Permet la croissance des bactéries halophiles telles que les vibrio. 1 ml Indicateur coloré Violet : milieu basique et neutre Jaune : milieu acide 5g Acides aminés, indispensables à la recherche de : l’ornithine-décarboxylase (ODC) l’arginine-dihydrolase (ADH) l’lysine-décarboxylase (LDH) NaCl Bromocrésol pourpre à 1.6 % (1.6g / 100ml alcool à 95°) Lornithine L-arginine L-lysine pH final : 6.3 PREPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 6.3 - Autoclaver à 120°C pendant 15 minutes - Le produit finit est coloré en violet. LECTURE - Virage acide (jaune) : résultat négatif - Virage alcalin (violet) : résultat positif CONTRÔLE DE QUALITE ODC ADH LDC Contrôle (+) Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Escherichia coli Contrôle (-) Escherichia coli Escherichia coli Enterobacter cloacae 10 URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph ANNEXE 4 certaines bactéries peuvent poursuivre cette réduction, jusqu’à une dénitrification. MILIEU NITRATE USAGE Ce milieu permet de mettre en évidence une enzyme du métabolisme énergétique chez la bactérie : la Nitrate-réductase (NR). PRINCIPE La réduction des nitrates par la nitrate réductase se traduit par la production de nitrites. Parfois, En présence de Nitrites on obtient une réaction colorée en rose par addition d’acide sulfanilique (GRIESS I) et d’alpha naphtylamine (GRIESS II). En l’absence de nitrites, on va rechercher la disparition des nitrates par addition de zinc : en effet le zinc réduit les nitrates en nitrites. COMPOSITION (composition pour 100 ml) Composants Quantités (g) Bouillon nutritif 1,5 Nitrate de Sodium 2 Rôles Apporte les facteurs de croissance, vitamines et acides aminés Apporte le Nitrate essentiel à la recherche de l’enzyme pH final : 7 ± 0,2 PRÉPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 100 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0,2 - Autoclaver à 120°C pendant 15 minutes LECTURE - Apres incubation ajouter successivement une goutte de chaque réactif de révélation GRIESS I puis GRIESS II : - Apparition d’une coloration rouge : la bactérie est NR (+) - Absence de coloration : ajouter du poudre de zinc - Apparition d’une coloration rouge, le zinc a réduit en nitrite le nitrate initialement non réduit : la bactérie est NR (-) - Absence de coloration rouge, la réduction du nitrate a dépassé le stade nitrite pour donner du diazote : la bactérie est NR (+) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Staphylococcus aureus Contrôle (-) Staphylococcus cohnii URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 11 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph ANNEXE 5 MILIEU A L’ONPG Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de β-galactosidase dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l’ONPG et non le lactose. En effet, il existe des germes qui reconnaissent l’ONPG du côté nitro-2-phénol et non celui du βgalactoside. Ces germes ont donc une activité ONPG hydrolase tout en ne formatant pas les lactoses. Le test à l’ONPG est une technique basée sur l’action directe de l’enzyme sur une molécule chromogène pouvant être l’ortho-nitrophényl - β D - galactopyranoside ou le 2-naphtol - β - D galactopyranoside. Ceux-ci sont utilisés comme substrat et libèrent respectivement l’orthonitrophénol (jaune) et le βnaphtol. FORMULE Les disques d’ONPG ont été immergés dans une solution de lactose à 10 % puis le milieu obtenu a été homogénéisé pour favoriser l’élution des disques. ANNEXE 6 MEVAG /STAPH Il s’agit d’une base de culture au rouge de phénol, commercialisée sous forme de poudre déshydratée, servant à la différenciation de cultures pures basées sur la réaction de fermentation. Formule par litre Réactifs ............................................... Quantité - Extrait pancréatique de caséine ............ 10,0g - Chlorure de sodium ................................. 5,0g - Rouge de phénol ................................. 0,018g Mode d’emploi - Suspendre 15g de poudre dans un litre d’eau distillée. - Autoclaver le mélange à 118°C pendant 15 minutes. ANNEXE 7 LES SUCRES 12 Glucides Stérilisation Température et Durée Glucose 10 % Tréhalose 10 % Mannitol 10 % Xylose 10 % Saccharose 10 % Glycérol 10 % Mannose 10 % Lactose 10 % Raffinose 10 % Autoclavage Autoclavage Autoclavage Filtration ou tyndalisation Filtration ou Tyndalisation Autoclavage Autoclavage Filtration ou tyndallisation Autoclavage 110°C 10 min. 110°C 10 min. 110°C 10 min. 60° 30min x 3J 60° 30min x 3J 115°C 30 min. 110°C 10 min. 60° 30min x 3J 110°C 10 min. URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph ANNEXE 8 REACTIFS DE REVELATION USAGE Ces réactifs de révélations sont destinés à mettre en évidence des caractères complémentaires pour l’identification des bactéries. REACTIFS VP • SOLUTION D’ALPHA NAPHTOL A 6 % : VP1 - Peser 6 g de poudre d’alpha naphtol - Dissoudre la masse pesée dans 100ml d’Ethanol - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - A conserver à l’obscurité à + 4°C KOH A40 % :VP2 - Peser 40 g de Poudre de KOH - Peser 300 mg de Créatine - Dissoudre les masses pesées dans 100ml d’eau distillée - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - Conserver à + 4°C à l’obscurité • SOLUTION D’ALPHA NAPHTYLAMINE A 6 0/00 : GRIESS II - Peser 0,6g d’Alpha naphtylamine - Dissoudre la masse pesée dans 100ml d’Acide Acétique 5N - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - Conserver à + 4°C à l’abri de la lumière • SOLUTIOND’HYDROXYDEDEPOTASSIUM URBM/MON/Id.Staph / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 13 COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.STAPH COFFRET D’IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES URBM/MON/Id.Staph Tableau VI : Identification des principales espèces de staphylocoques URE ADH ODC VP ONPG NIT GLU + + - + - + + - + - - + + - + - + - + - - + + - - - + - TRE MAN XYL SAC GLY MNE LAC RAF + + - + + + + - S. aureus + + - - d + d - - S. auricularis + + - - - d + + d - S. capitis - + + + + - - + + + - S. cohnii + + + + - - - + + - + - S. epidermidis - + - + + + + - + + - + - S. haemolyticus + - + - + + + - - + + - + - S. hominis - - - + + + + + + + + + + + + S. lentus d - + + + + + + - - + + + + - S. lugdunensis + d - + + d + + + - + + + + - S. saprophyticus - + - + - + + + - - - + + - - S. chleiferi - - - d + + + + + - + + + + - S. sciuri + + - d + + + + + - + + d + - S. simulans + + - + d + + + + - + + + - - S. warneri + - - + + + + + d + + + + + - S. xylosus Caractère négatif : 0-25 % des souches Caractère variable (d) : 26-70 % des souches Caractère positif > 70% des souches ESPECES Tél. 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