coffret d`identification des bacilles à gram négatif non
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COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF REDACTEURS VERIFICATEUR Amadou DIOP Abdoulaye DIOP Dr Fatou Bintou GUEYE GBAYA Amy SYLLA Version : Date : 26/08/2013 APPROBATEUR Pr Cheikh Saad-Bou BOYE Sommaire 1. OBJECTIF............................................................................................ 5 2. PRINICIPE .................................................................................5 3. MATERIEL .......................................................................................... 5 4. réactifs..........................................................................................5 5. MODE OPERATOIRE ....................................................................... 5 5.1. Préparation des milieux ...........................................................5 5.2. Contrôle de qualité des milieux ...............................................6 5.3. Préparation des plaques ...........................................................6 5.4. Conditionnement ......................................................................6 5.5. Contrôle de qualité du produit fini ..........................................6 5.6. Stockage ....................................................................................8 6. ANNEXES ............................................................................................ 8 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 3 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF 1. OBJECTIF Ce document décrit la procédure de production du coffret d’identification des bacilles à Gram négatif non fermentaire (BGN-NF) par la galerie Micro CSB. 2. PRINICIPE Il s’agit d’une méthode miniaturisée standardisée permettant à partir de substrats déshydratés de mettre en évidence des activités enzymatiques ou d’assimilation de substrats carbonés. Il permet de faire un diagnostic de genre ou d’espèce avec 16 tests biochimiques. 3. MATERIEL • balance de précision • agitateur magnétique • pH-mètre • flacons en verre avec bouchon à vis de 2,50 et 100 ml • seringues • filtres de 0,2 μm de diamètre • erlenmeyer • embouts stériles • micro pipettes • autoclave • boîte de pétri de 4 ou 6cm de diamètre • hotte à flux laminaire • papier emballage • appareil de scellage • micro plaques • micro pipettes de 20 μl, 200 μl • pipette Pasteur • embouts stériles • étuve • films adhésifs • bec bunsen • microscope optique 4. RÉACTIFS • Sucres : Lactose, Glucose, Mannitol, Saccharose, Sorbitol, Rhamnose, Adonitol, Dulcitol, Inositol. • Lysine décarboxylase : LDC • Ornithine décarboxylase : ODC • Arginine dihydrolase : ADC • L-tryptophane • Phosphate monopotassique • Gélatine • NaCl • Urée • Alcool 95° • Eau distillée • Rouge de phénol à 1% • Peptone trypsique ou polypeptane • Pyruvate de sodium • Phosphate dipotassique • Charbon de bois en poudre • Fumarate disodique • Sulfate de magnésium • Phosphate mono-ammonique • NaCl • Bleu de bromothymol • Citrate de na • Citrate ferrique ammoniacal • Chlorhydrate de l cystéine • Dextrose • Extrait de levure • Malonate de sodium • Peptone de caséine • Peptone de viande • Poudre ONPG • Thiosulfate de sodium • Sulfate d’ammonium • Créatinine • Potasse • Alpha-naphtol (VP2) • Perchlorure de fer au 1/3 • Réactifs de KOVACS. 5. MODE OPERATOIRE 5.1 Préparation Milieux Les différents milieux du coffret sont les suivants : - Milieu Urée (Annexe 1) - Milieu Clark et Lubs (Annexe 2) - Milieu de Falkow (Annexe 3) - Milieu H2S/Indole (Annexe 4) - Milieu Citrate de Simmons (Annexe 5) - Milieu Citrate de Christensens (Annexe 6) - Milieu Nitrate (Annexe 7) - Milieu Malonate/Phenylalamine (Annexe 8) - Milieu à l’ONPG (Annexe 9) - Milieu à la Gélatine (Annexe 10) - Milieu MEVAG (Annexe 11) - Solutions de Sucres (Annexe 12) - Réactifs de Révélations (Annexe 13) URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 5 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF 5.2 Contrôle de qualité des milieux 5.2.1 Contrôle de stérilité - utiliser des tubes à hémolyse. - prélever 2 ml de chaque milieu liquide et l’introduire dans un tube donné. - Pour les sucres il faut ajouter 1 ml de MEVAG ENTERO. - Les tubes ont été fermés avec du coton et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24h. 5.3.1 Lavage - Tremper les plaques dans de l'eau savonneuse pendant 24 heures. - Après les 24 heures, rincer avec de l'eau 2 fois de suite - Tremper les plaques dans de l'alcool à 70° pendant 24 heures - Sécher au four pendant 1 heure 5.3.2 Stérilisation Interprétation et résultats Les milieux sont considérés comme stériles en l’absence de : - trouble du milieu - virage de l’indicateur coloré - coloration du milieu après ajout de réactifs de révélation pour les cupules concernées. 5.2.2 Test d’efficacité Pour chaque caractère biochimique (milieu liquide), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique - Il faut réaliser pour chaque souche de contrôle un inoculum dont la turbidité est ajustée à celle de l’échelle 0,5 de l’étalon standard de Mac Farland, en délayant les colonies dans de l’eau distillée stérile. - Distribuer les milieux liquides dans des tubes à hémolyse dont 2 tubes par milieux préparé ; l’un pour les contrôles positifs et l’autre pour les contrôles négatifs). - Marquer pour chaque tube le milieu qu’il contient et le nom de la souche dont on va faire le contrôle. - Ensemencer les tubes avec l’inoculum de la souche de contrôle correspondant (100 μl). - Ajouter une à deux gouttes de paraffine dans tubes contenant ADH, ODC, LDC, URE et tous les sucres. - incubées à l’étuve à 37°C. - Placer les plaques sèches sous UV pendant 24h 5.4 Conditionnement 5.4.1 Distribution La distribution des milieux dans les cupules des plaques se fait de la manière suivante : • 100 μl de milieu dans les puits correspondants, d’Urée à Nitrate • 10 μl de sucre à 10 % dans les puits correspondants (de glucose à raffinose). 5.4.2 Déshydratation Au préalable on doit faire : - Le nettoyage et la désinfection de l’étuve à l’aide d’antiseptiques spéciaux (ou eau de Javel diluée ou encore alcool 70°). - La Désinfection de l’enceinte à UV Après distribution des milieux dans les cupules, les plaques sont ensuite mises dans une étuve portée à la température de 43°C en présence d’un dessiccateur. L’humidité de l’étuve est contrôlée avec un hygromètre digital. Dans ces conditions, les substrats sont déshydratés en moins de 18 heures. 5.4.3 Emballage Après la déshydratation des milieux, les microplaques sont ensuite emballées dans des sachets stériles puis sont scellé à l’aide d’un appareil de scellage. - La lecture se fait 24h après l’incubation. 5.3 Préparation des plaques 5.5 Contrôle de qualité du produit fini 5.5.1 Contrôle de stérilité Si les plaques ne sont pas déjà stérile au départ, faire le lavage et la stérilisation des plaques de travail. Pour faire le contrôle de stérilité des lots de plaques déshydratées, on prend 2 à 3 lots de la préparation des plaques déshydratées. 6 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF Technique - Inoculer les cupules renfermant les milieux allant de l’URE à NIT avec de l’eau physiologique stérile. - les cupules renfermant les sucres avec le MEVAG ENT et deux gouttes d’huile de parafilm. - Recouvert la plaque d’un parafilm et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24h sur plateau recouvert de papier buvard imbibé d’eau. Le lot est considéré comme stérile en l’absence de virage de l’indicateur et en l’absence de réaction positive pour les tests révélés. 5.5.2 Contrôle d’efficacité Le test permet de voir si le milieu ne s’est pas dégradé au cours de la déshydratation. De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique Il est réalisé avec les mêmes souches bactériennes que pour le cas des milieux liquides. A la différence des milieux liquides : - L’inoculum bactérien est ajusté à 0,5 Mc Farland pour les BGN-NF. - Pour les milieux n’étudiant pas le métabolisme glucidique, 100μl d’inoculum bactérien sont distribués dans les puits correspondants, - Pour l’étude du métabolisme glucidique, 500μl d’inoculum bactérien sont incorporés dans 1ml de milieu MEVAG ENT et 100μl du mélange sont distribués dans les puits correspondants. URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 7 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF TABLEAU DE LECTURE Les tableaux ci-après donnent la répartition des contrôles positifs et négatifs 6 Tests Substrats LDC Lysine Réactions / Enzymes Lysine décarboxylase ODC Ornithine ADH URE Réactifs à ajouter Résultats positifs Résultats négatifs Violet Jaune Ornithine décarboxylase Violet Jaune Arginine Arginine dihydrolase Violet Jaune Urée Uréase Rose framboise Orange Rose-Rouge Incolore 1 goutte de KOH 1 goutte de créatinine 1 goutte de α-naphtol VP Glucose + pyruvate Production d'acétoïne GEL Gélatine Gélatinase Diffusion du charbon Incolore CS Utilisation du citrate Utilisation du citrate Bleu Vert CC Citrate de sodium Citrate de sodium Rose Jaune clair H2S Thiosulfate de sodium Production d’H2S Noir Incolore IND Tryptophane Tryptophanase Anneau rouge Anneau incolore MAL Malonate de sodium Utilisation du malonate Bleu Jaune vert TDA Phénylalanine Phénylalanine désaminase Marron Jaune ONPG ONPG Β-galactosidase Jaune Incolore LAC GLU MAN SOR XYL Lactose Glucose Mannitol Sorbitol Xylose Fermentation Jaune Rouge 1 goutte de Kovacs 1 goutte de perchlorure de fer URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF 5.6 Stockage Après validation du contrôle de stérilité et d’efficacité des plaques d’identification des BGN-NF, le reste du lot de la production déjà scellé est stocké au réfrigérateur à 4°C. ANNEXE 1 MILIEU UREE - TRYPTOPHANE USAGE Ce milieu permet de faire la mise en évidence d’une uréase au niveau de la bactérie. Il peut servir aussi à la recherche de Tryptophane-désaminase (TDA) après addition de perchlorure de Fer. PRINCIPE L’hydrolyse de l’urée provoque l’accumulation de carbonate d’ammonium qui produit l’alcalinisation du milieu et le virage au rouge de l’indicateur coloré. La TDA est mise en évidence par addition de chlorure ferrique, les acides cétoniques formés suite à la désamination de l’acide aminé donnent une coloration rouge-brun. COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles L-tryptophane 3g Acide aminé essentiel à la recherche de la TDA et de la tryptophanase Phosphate monopotassique 1g Source de Phosphore, Elément nutritif Essentiel pour la synthèse des acides nucléotides, de l’ATP et des acides nucléiques Phosphate dipotassique 1g Source de Phosphore … NaCl 5g Urée 20 g Alcool 95° 10 ml Solubilise le tryptophane 2,5 ml Indicateur coloré Rouge : milieux alcalin, neutre Jaune : milieu acide Rouge de phénol à 1% Source d’électrolytes Eléments nutritif Molécule azotée nécessaire pour la recherche d’uréase pH final : 7 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 9 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PREPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée stérile - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 - Stérilisation par filtration. - Le produit finit est coloré en jaune. LECTURE • Recherche d’une uréase - Virage alcalin (rouge violacé) : présence d’une uréase - Absence de virage (jaune) : absence d’uréase. • Recherche de la TDA Ajouter du perchlorure de fer officinal dilué au 1/3 après lecture de l’urée (1 volume pour 5 volumes de milieu). - Virage brun rouge : TDA (+) - Virage jaune orangé : TDA (-) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Proteus mirabilis Contrôle (-) Escherichia coli ANNEXE 2 MILIEU DE CLARK ET LUBS USAGE Ce milieu permet de faire la mise en évidence de la production d’acétoïne. Ce test est utilisé en particulier pour la différenciation des entérobactéries. Le résultat du test est obtenu après addition de réactifs de révélation. COMPOSITION (Pour 100 ml d’eau distillée) Composants Quantités (g) Rôles Peptone trypsique 0,5 Apport d’éléments nutritifs Source de carbone et d’azote Phosphate dipotassique 0,5 Source de P, élément nutritif essentiel à la croissance, Rôle de Tampon 0,5 Source de carbone Essentiel pour la production d’acide pyruvique qui est ensuite dégradé en acetylméthylcarbinol (Acetoïne) Glucose Ph final : 7 ± 0,2 8 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PRINCIPE PREPARATION La production d’acétoïne est mise en évidence par ajout d’une solution d’alpha-naphtol à 5% (VP1) et d’une solution de KOH à 40%, on obtient un virage au rose par fermentation de la 3hydroxybutanone. La production des acides mixtes est mise en évidence par la présence de rouge de méthyle (qui vire au rouge par acidification des acides mixtes). A l’inverse, la coloration jaune montre un milieu acide ou réalcalinisé, soit une absence de fermentation des acides mixtes. - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 100 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0.2 - Autoclaver à 121°C pendant 15 minutes - Le milieu fini présente une coloration jaune et limpide. LECTURE - Teinte Rouge : VP (+) - Coloration Jaune : VP (-) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Klebsiella pneumoniae Contrôle (-) Escherichia coli ANNEXE 3 MILIEU DE FALKOW USAGE C’est le milieu de base pour la recherche des décarboxylases. Le diagnostic différentiel des espèces appartenant aux familles des Enterobactiaceae, des Vibrionaceae, des Pseudomonaceae… est souvent facilité par la recherche de ces enzymes. COMPOSITION (Pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles Extrait de levure 3g Apporte des facteurs de croissance Glucose 1g Source de carbone 5g Source d’électrolytes Maintien l’équilibre osmotique du milieu Permet la croissance des bactéries halophiles telles que les vibrio. 1 ml Indicateur coloré Violet : milieu basique et neutre Jaune : milieu acide 5g Acides aminés, indispensables à la recherche de : l’ornithine-décarboxylase (ODC) l’arginine-dihydrolase (ADH) l’lysine-décarboxylase (LDH) NaCl Bromocrésol pourpre à 1.6 % (1.6g / 100ml alcool à 95°) L-ornithine L-arginine L-lysine pH final : 6.3 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 11 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PRINCIPE PREPARATION La fermentation du glucose entraîne une baisse de pH importante. La production, ainsi que l'activité, des décarboxylases et de l'ADH sera favorisée par un pH acide. D'autre part la lecture de l'alcalinisation nécessite une anaérobiose relative : - une bactérie non décarboxylante utilisera les peptones du milieu, et produira des acides organiques ainsi que des bases faibles comme l'ammoniac. - une bactérie décarboxylante après avoir utilisé le glucose va produire du dioxyde de carbone et des amines. L'alcalinité des amines est importante, et le virage de l'indicateur de pH sera obtenu. - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 6.3 - Autoclaver à 120°C pendant 15 minutes - Le produit finit est coloré en violet. LECTURE - Virage acide (jaune) : résultat négatif - Virage alcalin (violet) : résultat positif CONTRÔLE DE QUALITE ODC ADH LDC Contrôle (+) Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Escherichia coli Contrôle (-) Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Enterobacter cloacae ANNEXE 4 RECHERCHE DE H2S ET INDOLE 1.1 USAGE Ce milieu est utilisé pour la différenciation des entérobactéries basée sur la production d’hydrogène de sulfure et la production d’indole. COMPOSITION Composants Quantités (g) Rôles Peptone de caséine 6 Apport de facteur de croissance Riche en Tryptophane Peptone de viande 1.78 Apport d’éléments nutritifs Tryptophane 0.9 Acide aminé essentiel à la recherche de la tryptophanase Citrate ferrique ammoniacal 0.06 Indicateur de production d’acide sulfhydrique Thiosulfate de sodium 0,06 Apport du soufre Elément nutritif pH final : 7 ± 0,2 10 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PRINCIPE PRÉPARATION Le sulfure d’hydrogène est produit par des bactéries capables de réduire les composés contenant du soufre, tels que les peptones et le thiosulfate de sodium, présents dans le milieu. Le sulfure d’hydrogène réagit avec les sels de fer également présents dans le milieu pour former un précipité noir de sulfure ferrique. La présence de sucres fermentescibles peut inhiber la réaction enzymatique produisant l’H2S par la formation de produits acides, c’est pourquoi aucun sucre n’est présent dans ce milieu. La production d'indole à partir du métabolisme du tryptophane par l'enzyme bactérienne tryptophanase est révélée par l'apparition d'une couleur rose à rouge après ajout du réactif indole de Kovacs. - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0,2 - Autoclaver à 120°C pendant 15 minutes LECTURE - Production H2S - Présence d’une coloration noire : souche H2S (+) - Absence de coloration noire : souche H2S (-) - Production d’Indole (après addition du réactif de Kovacs) - Formation d’une coloration rouge : souche Indole (+) - Absence de coloration rouge : souche Indole (-) CONTRÔLE DE QUALITE H2S Indole Contrôle (+) Proteus mirabilis Escherichia coli Contrôle (-) Escherichia coli Klebsiella pneumoniae ANNEXE 5 MILIEU CITRATE DE SIMMONS USAGE Ce milieu permet de différencier les bacilles à Gram négatif d’après l’utilisation ou non du citrate comme seul source de carbone et d’énergie. COMPOSITION (pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles Sulfate de magnésium 0,2 g Apport de magnésium, élément nutritif. Phosphate mono-ammonique 1g Apport de phosphate, élément nutritif Rôle de tampon Phosphate dipotassique 1g Apport de phosphate, élément nutritif Rôle de tampon NaCl 5g Sources d’électrolytes Maintien l’équilibre osmotique du milieu Citrate trisodique 2g Source de carbone et d’énergie Bleu de bromothymol à 1 % 8 ml Indicateur coloré Coloration bleu-vert : ph > 7,6 Coloration jaune : ph < 6 pH final : 7 ± 02 12 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PRINCIPE Les bactéries capables d'utiliser le citrate de sodium comme seule source de carbone pourront se développer sur ce milieu. La fermentation du citrate de sodium entraîne alors une acidification qui provoque une coloration bleue du milieu en présence de bleu de bromothymol (indicateur de pH). Citrate + 3H2O Acide citrique + 3OH les dissoudre un par un dans de l’eau distillée stérile. - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0,2 - Stérilisation à l’autoclave à 120°C pendant 15 minutes - Le produit finit est coloré en vert. LECTURE PREPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et - Coloration bleu du milieu : Citrate (+) - Absence de virage, milieu inchangé : Citrate (-) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Klebsiella pneumoniae Contrôle (-) Escherichia coli ANNEXE 6 MILIEU AU CITRATE DE CHRISTENSEN USAGE C’est milieu qui permet d’identifier les bactéries coliformes pathogènes, basé sur l’utilisation du citrate. Il présente un intérêt particulier pour différencier les Escherichia et les Shigella. COMPOSITION (pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles Apporte des facteurs de croissance vitamines, acides aminés. Apport de phosphate, élément nutritif Rôle de tampon Sources d’électrolytes Maintien l’équilibre osmotique du milieu Extrait de levure 0,5 g Phosphate mono potassique 1g NaCl 5g Citrate de Sodium 3g Source de carbone et d’énergie Glucose 0,2 g Source d’énergie Rouge de phénol à 1% 4 ml Indicateur coloré Rouge : milieux alcalin, neutre Jaune : milieu acide pH final : 7 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 13 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF PRINCIPE PREPARATION Les organismes qui métabolisent le citrate en tant que seule source de carbone, clive le citrate pour donner de l’oxalo-acétate et de l'acétate. - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée stérile. - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 - Stérilisation à l’autoclave à 120°C pendant 15 minutes - Le produit finit est coloré en jaune. Ensuite une décarboxylase convertit l’oxaloacétate en pyruvate et en CO2. Le CO2 se combine avec le sodium et l'eau pour former du carbonate de sodium, un composé alcalin. Par conséquence, le pH du milieu augmente et le Rouge de phénol vire du jaune-orange au rougecerise. LECTURE - Coloration rouge-cerise : citrate (+) - Coloration jaune : citrate (-) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Escherichia coli Contrôle (-) Shigella spp ANNEXE 7 MILIEU NITRATE USAGE Ce milieu permet de mettre en évidence une enzyme du métabolisme énergétique chez la bactérie : la Nitrate-réductase (NR). COMPOSITION (pour 100 ml) Composants Quantités (g) Rôles Bouillon nutritif 1,5 Apporte les facteurs de croissance, vitamines et acides aminés Nitrate de Sodium 2 Apporte le Nitrate essentiel à la recherche de l’enzyme Ph final : 7 ± 0,2 PRINCIPE PREPARATION La réduction des nitrates par la nitrate réductase se traduit par la production de nitrites. Parfois, certaines bactéries peuvent poursuivre cette réduction, jusqu’à une dénitrification. En présence de Nitrites on obtient une réaction colorée en rose par addition d’acide sulfanilique (GRIESS I) et d’alpha naphtylamine (GRIESS II). En l’absence de nitrites, on va rechercher la disparition des nitrates par addition de zinc : en effet le zinc réduit les nitrates en nitrites. - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée - Compléter à 100 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). - Ajuster le ph à 7 ± 0,2 - Autoclaver à 120°C pendant 15 minutes 14 LECTURE - Apres incubation ajouter successivement une goutte de chaque réactif de révélation GRIESS URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF I puis GRIESS II : - Apparition d’une coloration rouge : la bactérie est NR (+) - Absence de coloration : ajouter de la poudre de zinc - Apparition d’une coloration rouge, le zinc a réduit en nitrite le nitrate initialement non réduit : la bactérie est NR (-) - Absence de coloration rouge, la réduction du nitrate a dépassé le stade nitrite pour donner du diazote : la bactérie est NR (+) CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Staphylococcus aureus Contrôle (-) Staphylococcus cohnii ANNEXE 8 MALONATE-PHENYLALANINE (MAL-PDA) Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate déshydrogénase). Seules les bactéries qui peuvent utiliser le cycle glyoxalique sont capables de pousser sur un milieu au malonate. L’utilisation du malonate s’accompagne d’une libération d’ions OH-alcalinisants suivant la réaction : OOC - CH2 - COO - + 2H2O HOOC 2 CH COOH + 2OH Acide malonique La PDA, enzyme induite, agit sur la phénylalanine en entraînant la formation d’acide cétonique correspondant selon la réaction : L’acide cétonique formé a la propriété de donner des complexes colorés avec les ions Fe3+ donnant une coloration bleue. USAGE C’est une base de culture permettant la différenciation des entérobactéries utilisant le malonate. Elle permet aussi de mettre en évidence la présence d’une phénylalanine-désaminase après addition de perchlorure de fer. URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 15 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF COMPOSITION (pour 1 litre d’eau distillée) Composants Quantités Rôles Extrait de levure 1 Source de complexe vitaminique Sulfate d’ammonium 2 Phosphate dipotassique 0,6 Source d’azote Source de phosphate Rôle de tampon Source de phosphate Rôle de tampon Phosphate mono-ammoniaque Chlorure de sodium 0,4 g 2g Malonate de sodium 3g Source d’énergie Essentielle pour rechercher l’utilisation du malonate Phénylalanine 2g Acide aminé dégradé par la PDA avec production d’Acide phénylpyravique Dextrose 0,25 g Source d’hydrate de carbone Permet de produire de l’acide pour neutraliser l’alcalinisation spontanée de certains microorganismes Bleu de bromothymol 1% 2,5 ml Indicateur coloré Coloration bleu-vert : ph 7,6 Coloration jaune : ph 6 pH final : 6.1 ± 0.2 PRINCIPE L’utilisation du malonate s’accompagne d’une alcalisation mise en évidence par le bleu de bromothymol. La phénylalanine est dégradée par la PDA avec production de phénylpyruvate qui donne une teinte verte en présence de fer III. - Ajuster le ph à 6.1 ± 0.2 - Autoclaver à 121° pendant 15 minutes - Le produit finit est coloré en jaune. LECTURE Malonate : - Virage au bleu du BBT : souche malonate (+) - Absence de virage du BBT : souche malonate (-) PREPARATION - Mesurer les différents composants du milieu et les dissoudre un par un dans de l’eau distillée stérile - Compléter à 1000 ml (tenir compte des proportions pour un volume différent). Phénylalanine : - Coloration verte après ajout de perchlorure : PDA (+) - Absence de coloration après ajout de perchlorure : PDA (-) CONTRÔLE DE QUALITE 16 Malonate PDA Contrôle (+) Klebsiella pneumoniae Proteus mirabils Contrôle (-) Escherichia coli Escherichia coli URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF ANNEXE 9 MILIEU A L’ONPG Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de β-galactosidase dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l’ONPG et non le lactose. En effet, il existe des germes qui reconnaissent l’ONPG du côté nitro-2-phénol et non celui du βgalactoside. Ces germes ont donc une activité ONPG hydrolase tout en ne formatant pas les lactoses. Le test à l’ONPG est une technique basée sur l’action directe de l’enzyme sur une molécule Chromogène pouvant être l’ortho-nitrophényl-β-Dgalactopyranoside ou le 2 - naphtol - β - D galactopyranoside. Ceux-ci sont utilisés comme substrat et libèrent respectivement l’orthonitrophénol (jaune) et le β-naphtol. FORMULE Les disques d’ONPG ont été immergés dans une solution de lactose à 10 % puis le milieu obtenu a été homogénéisé pour favoriser l’élution des disques. ANNEXE 10 MISE EN EVIDENCE DE LA GELATINASE USAGE Cette technique permet de mettre en évidence les enzymes gélatinolytiques au sein de la bactérie. COMPOSITION (Pour 100 ml d’eau distillée) Composants Masse (g) Rôles Gélatine 15 Protéine essentiel pour la recherche de la gélatinase charbon de bois en poudre 0.4 Indicateur de l’hydrolyse - Faire fondre la gélatine dans l’eau distillée - Refroidir à 45° et ajouter le charbon. - Mélanger jusqu'à obtention d’une solution homogène. - Couler sous forme de plaque. solution de formol du commerce (1/10) diluée au 1/2. - Rincer ensuite à l’eau courante, pendant 48 heures. - Placer en flacons remplis d’eau distillée. - Tyndaliser au Bain Marie à 60°C pendant 1 heure, 3 jours de suite pour stériliser. 2ème ETAPE LECTURE - Après solidification, couper en cubes de 0,5 cm de côté. - Rassembler les cubes dans une compresse en gaze et immerger pendant 24 heures dans une - Une réaction positive se traduit par une libération du charbon qui est facilement remis en suspension. - En absence de gélatinase le disque den gélatine reste entier. PREPARATION 1er ETAPE CONTRÔLE DE QUALITE Contrôle (+) Pseudomonas aeruginosa Contrôle (-) Escherichia coli URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 17 COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF ANNEXE 11 MEVAG DES ENTEROBACTERIES Il s’agit d’une base de culture pourpre, commercialisée sous forme de poudre déshydratée, servant à la différenciation de cultures pures basées sur la réaction de fermentation. MODE D’EMPLOI FORMULE APPROXIMATIVE PAR LITRE Réactifs ......................................... Quantités - Peptone de protéase N°2 ........................ 10,0g - Extrait de Bœuf ......................................... 1,0g - Chlorure de sodium ...................................... 5g - Bromocrésol pourpre (BCP) .................... 0,02g - Eau distillé ........................................... 1000 ml Mettre 16 g de poudre en suspension dans 1 litre d’eau purifié, Autoclaver le mélange à 118°C pendant 15 minutes. ANNEXE 12 LES SUCRES Glucides Lactose Glucose Mannitol Sorbitol Xylose Arabinose 10 % 10 % 10 % 10 % 10 % 10 % Stérilisation Température et Durée Filtration ou tyndallisation Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage 60° C 30 minutes X3J 110°C 10 min 110°C 10 min 110°C 10 min 110°C 10 min 110°C 10 min ANNEXE 13 REACTIFS DE REVELATION USAGE Ces réactifs de révélations sont destinés à mettre en évidence des caractères complémentaires pour l’identification des bactéries. - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - Conserver à + 4°C à l’obscurité REACTIF TDA/PDA • SOLUTION DE PERCHLORURE DE FER 1/3 Pour une préparation d’une solution de 90ml REACTIFS VP • SOLUTION D’ALPHA NAPHTOL A 6 % : VP1 - Peser 6 g de poudre d’alpha naphtol - Dissoudre la masse pesée dans 100 ml d’Ethanol - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - A conserver à l’obscurité à + 4°C - Mesurer 30 ml de Perchlorure de Fer Officinal - Ajouter 60ml d’eau distillée - Bien Homogénéiser, conserver à +4°C à l’abri de la lumière •SOLUTIOND’HYDROXYDEDEPOTASSIUM KOH A40 % :VP2 REACTIFS NITRATE • SOLUTION D’ACIDE SULFANILIQUE 8 % : GRIESS I - Peser 40 g de Poudre de KOH - Peser 300 mg de Créatine - Dissoudre les masses pesées dans 100ml d’eau distillée - Peser 0,8 g de poudre d’acide sulfanilique - Dissoudre dans 100 ml d’Acide Acétique 5N - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - Conserver à + 4°C à l’abri de la lumière 18 URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : COFFRET D’IDENTIFICATION DES BACILLES À GRAM NÉGATIF NON FERMENTAIRE URBM/MON/Id.BNF • SOLUTION D’ALPHA NAPHTYLAMINE A 6 % : GRIESS II - Bien agiter jusqu’à dissolution complète - Conserver à + 4°C à l’abri de la lumière - Peser 0,6 g d’Alpha naphtylamine - Dissoudre la masse pesée dans 100 ml d’Acide Acétique 5N REACTIFS DE KOVACS REACTIFS DE KOVACS COMPOSITION Alcool empirique ou isoempiruique 75 ml P diméthyle amino-benzaldéhyde 5g Acide chlorhydrique concentrée 25 ml PREPARATION - Dissoudre l’aldéhyde dans l’alcool au Bain marie à 60°C - Mettre le flacon dans la glace pour refroidir - Ajouter goutte à goutte l’acide en maintenant le flacon dans la glace - Mettre le produit fini dans un flacon (marron de préférence) et conserver à + 4°C - NB : Le réactif doit avoir une couleur jaune paille. URBM/MON/Id.BNF / Date d’application : Décembre 2013 / Version : 19 Tél. (221) 33 825 24 36 Tél. (221) 77 649 43 39 Site web: www.microcsb.net www.cismed-inov.org
