Réarrangement EML4 ALK
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ALK et Cancer bronchique I Rouquette Service d’Anatomie Pathologique Rangueil Plateforme génétique moléculaire des cancers (génotypage cancer du poumon) Translocations, mutations, amplifications + ONCOGENE ALK C H R O M O S O M E 2 CODE RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE Inversion bras court du chromosome 2 Fusion exons 1-13 d’EML4 /exons 20-29 de ALK (région codant pour la TK ALK) GENE DE FUSION Réarrangement EML4 ALK Fusion partie N-term.EML4 /portion intra-cellulaire du récepteur ALK : PROTEINE DE FUSION ONCOGENIQUE Réarrangement EML4 ALK Dimérisation et Phosphorylation constitutive du domaine TK ACTIVATION VOIES PI3K/AKT RAS/MAPK Variants les + fréquents V1 33% V3a/b 29% V2 9% Sur la plateforme on cherche • Quoi? Un réarrangement de l’oncogène ALK conférant une sensibilité au crizotinib • Chez qui? AMM traitement des patients adultes ayant reçu au moins un traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites cellules anaplasic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé • Comment? RT-PCR (reverse transcriptase PCR) FISH (hybridation in situ en fluorescence) IHC (immunohistochimie en paraffine) RT-PCR (ARN) • Mise en évidence des transcrits de fusion (le partenaire d’ALK est identifié) • Technique multiplexe: une amorce commune pour l’exon 20 de ALK, amorces spécifiques pour le partenaire de fusion • Très sensible, mais fragments amplifiés parfois très longs, donc mieux sur congelé • Kits développés sur paraffine: 70% des variants détectés • Confirmation nécessaire par une autre technique (faux négatifs) FISH Les sondes • Sondes de « séparation » ( break-apart, split ): deux sondes de couleurs différentes s’hybridant de part et d’autre du point de cassure de ALK , rouge en 3’, verte en 5’. On n’identifie que la cassure d’ALK (partenaire?) •Sondes de « fusion » une sonde rouge pour ALK, une verte pour EML4 •Sondes combinées: sonde de séparation + une troisième couleur pour le partenaire Dako ALK FISH DNA Probe, Split Signal Y5417 sonde Vysis® LSI® ALK Dual Color Break Apart Rearrangement Probe From A Mc Leer Florin “TriCheck™” (ZytoLight® SPEC ALK/EML4 TriCheck™ Probe). Lecture • Région tumorale préalablement sélectionnée par le pathologiste • Filtres en rapport avec la longueur d’onde des fluorochromes utilisés • Au moins 100 noyaux intacts (pb petites biopsies) • Distance split >=diamètre d’un signal • Seuil de positivité: 15% • Double lecture • Problème de l’autofluorescence • Si doute, vérifier par autre technique - Filtre DAPI λexcitation 365±12 nm / λemission ≥397 nm - Filtre Rhodamine-rfp λexcitation 546±12 nm / λemission ≥590 nm - Filtre FITC-gfp λexcitation 475±40 nm / λemission 530±40 nm Spectrum Orange Gold. Excitation: 547 nm Emission: 572 nm Equivalent: Rhodamine Sonde split DAKO: texas red /FITC Sonde split Abbott: orange gold/FITC Impact du préanalytique Prélèvement Délai ischémie froide Fixation Biopsies 6/8h pièces 24/48h Recoupe mise en cassettes Inclusion enrobage Paraffine <60°, démarrages WE Coloration biopsies Eosine autofluo, ADN Stockage blocs Stabilité en paraffine Support lames Superfrost IHC FISH Délai conservation lames 4° +/- enrobage 8 j Ecrasements AFA: pas d’hybridation Sous-fixation Os décalcification Autofluorescence éosine Impact du préanalytique •Formol neutre tamponné •Attention durée de fixation (protocoles week-end). •Décalcifiant = acide: si plusieurs sites métastatiques éviter de biopsier l’os Pièces osseuses: rinçage acide , vérifier pH hypercentres • Impact des colorants (éosine, autres): éviter de les utiliser • Ne pas couper les lames trop longtemps avant la FISH et l’IHC, les conserver à 4°C, les protéger. Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011 Pourcentage de résultats non interprétables 16,0% ADN non amplifiable 14,0% 12,0% Bloc épuisé 10,0% 8,0% % de cellules tumorales < seuil de détection 6,0% 4,0% 2,0% 0,0% EGFR act EGFR res KRAS BRAF PI3KCA HER2 ALK (FISH) Les taux de résultats non interprétables ont légèrement diminué depuis le début du programme Taux de NI élevé pour le test ALK en FISH (14%) FISH coûteuse, consommatrice de temps IHC ALK Anticorps disponibles 3 clones: ALK1, D5F3 et 5A4 sensibilité 92 à 100%, spécificité 99 à 100% Dilutions 1/25e à 1/100e selon amplifications, clones, automates Marquage modéré à intense (++ à +++), cytoplasmique diffus, >50% Faible et focal si AFA ou sous-fixation X40 architecture acineuse X2,5 ALK 5A4 x40 Scoring • Score classique= Intensité x % CT positives • H-score= (1 x % CT intensité à 1+) + (2x % CT 2+) + (3x %CT 3+) • from weak and multifocal(1+) to strong and diffuse (2+) J Thorac Oncol. 2013 Discordances • IHC -/FISH + : attention interprétation IHC, compter signaux en FISH. • IHC+/FISH- : plus rare, être exigeant sur la FISH, repérage zone tumorale, compter les noyaux, double lecture, pertinence de la limite à 15%? • Utiliser 3e technique, contrôles hors site, EEQ Discordances Tumeur hétérogène: les pneumocytes ont été comptés Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011 Données globales : Taux de translocation en FISH : 5,4 % Taux de translocation en IHC : 4,8 % Plateforme: 20% 1er trimestre, 4,7% dernier trimestre Stratégies des laboratoires : FISH uniquement : 10 FISH + IHC en parallèle : 5 IHC + FISH de confirmation : 21 Virchows Arch (2012) Thunnissen et al Diagnostic algorithm for ALK fusion from the Japanese Lung Cancer Society From Front. Oncol., 2012 Murakami Sholl J Thorac Oncol. 2013 Plateforme séquentiel EGFR 19 20 21 + IHC ALK EGFR MUTE ALK IHC - IHC ALK + IHC ALK - ALK FISH STOP Prescription ou Profil ALK + ALK EGFR18 KRAS BRAF HER2 PI3K Résistances acquises au crizotinib Doebele Clin Cancer Res 2012 Résistance au crizotinib Mutations domaine Tkinase ALK (Doebele Clin Cancer Res 2012) L1196 M Saturation site de liaison F1174C Favorise l’activation conformationnelle du RTK G1279A D1203N Giroux 2013 39 Conclusion • Technique de référence: FISH « time consuming »+ impact préanalytique: aide des systèmes de traitement d’images. • Place de l’immunohistochimie dans le screening, mais quelques discordances • Importance de l’organigramme choisi (résultats des études nationale et internationales en cours) • RT-PCR réservée à des cas particuliers • Intérêt de la recherche des mutations de résistance?
