IHC, FISH, CISH, NGS
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IHC,FISH,CISH,NGSdanslesCBNPC: quellesévolu*onsdansl’èredesbiomarqueurs maisjesuis Pneumologue!!! MarieWislez ServicedePneumologieetdeRéanima8on GRC«Theranoscan»UPMC,ParisVI HôpitalTenonParis L'èredelamédecinedeprécision dèsla1èreligne CBNPC IIIB IV Addiction oncogénique Gefitinib vvvvvvvvvvvvvvvvvv Non épidermoïde Epidermoïde Doublet CDDP Beva Doublet CDDP sans Pem sans Beva Immunothérapie Gefitinib Erlotinib Afatinib osimertinib Crizotinib ceritinib ProgrammeBiomarqueurEmergent leréseaudesplateformesenFrance 28plateformes(2006) 7biomarqueurspourlesCBNPCnon épidermoïdes Cancer Molecular Target Lung EGFR mutations EML4-ALK transloc. Non-sq KRAS mutations NSCLC HER2 ex20 mutations BRAF mutations PI3K mutations ProgrammeACSE Cohortesetnouveauxbiomarqueursémergents 20Cohortespré-définies: • Lymphomeanaplasiqueàgrandescellules–enfantsetadultes–Transloca8onALK • Cancercolorectal–adultes–Transloca8onALK • Cancercolorectal–adultes–Amplifica8onMET • Cancercolorectal–adultes–Muta8onMET • Cancerdupoumonnonàpe8tescellules–adultes–Amplifica8onMET Sarcomatoides poumon • Cancerdupoumonnonàpe8tescellules–adultes–Transloca8onROS1 mutation épissage de l’ • Cancerdusein–adultes–Transloca8onALK exon 14 MET • Cancergastrique–adultes–Amplifica8onMET • Carcinomedesvoiesbiliaires–adultes–Transloca8onROS1 • Cancerdel’ovaire–adultes–Amplifica8onMET • Carcinomerénalàcellulesclaires–adultes–Transloca8onALK • Carcinomerénalàcellulesclaires–adultes–Amplifica8onALK • Carcinomerénalpapillaire–adultes–Muta8onMETouAmplifica8onMET • Carcinomehépa8que–adultes–Amplifica8onMET • Neuroblastome–enfantsetadultes–Amplifica8onALKouMuta8onALK • Tumeurinflammatoiremyofibroblas8que–enfantsetadultes–Transloca8onALK • Rhabdomyosarcome(alvéolaireetembryonnaire)–enfantsetadultes–Amplifica8onALK • Glioblastome–adultes–Amplifica8onMET=>ouverteaprèsamendement • Canceranaplasiquedelathyroïde–adultes–Muta8onALK • Cancerdelathyroïde(folliculaire+médullaire+papillaire)–adultes–Muta8onMET 3Cohortessupplémentaires: • Maladiespédiatriquesdiversesrares(donthépatocarcinome)associéesàunealtéra8ond’unedesciblesducrizonib • 2cohortesconcernant2autrespathologiesporteusesd’unealtéra8onquelconqued’unedesciblesducrizonib,(gèneAXLcompris) iden8fiéesgrâceauxprogrammespangénomiques(CGHarray,ouSNParrayouNGS.Ex:le1ercasiden8fédecancerduseinavec amplifica8ondeMETcréeraunecohorte). Commentciblerlesanomalies moléculaires NGS Hybrida8on insitu IHC Immunohistochimie TTF-1 P40 Bleu alcian Alk P63 CK5/6 Marqueurs neuroendocrines ATCD autre primitf WHOClassifica8onofTumorsLung,Pleura,ThymusandHeart,WHO–IARC,4thEdi8onIARC,Lyon,2015 crizo&nib en 1ière ligne : essai profil 1014 10,9 mois 6,0 mois Solomon BJ, N Engl J Med, 2014 crizo&nib en 2ième ligne essai profil 1007 7,7 mois 3,0 mois ShawAT,NEnglJMed,2013 Immunohistochimie technique calcification Ac 5A4 1/50 mucus Techniquesautoma8sées VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody VENTANA PD-L1 (SP142) Assay FDA approved test predictive for TECENTRIQ™ in urothelial carcinoma (UC) patients. Techniquesautoma8sées DAKOPD-L1IHC28-8pharmDx TheonlyFDA-approvedandCE-IVD markedtestforPD-L1expression associatedwithenhancedsurvivalwith OPDIVO®(nivolumab)fornon-squamous NSCLC DAKOPD-L1IHC22C3pharmDx ACE-IVD-markedtesttoaidin iden8fica8onofNSCLCpa8entsfor KEYTRUDA®(pembrolizumab). AutostainerLink48-DakoAgilent BOND-IIIFullyAutomatedIHCandISH LeicaBiosystems Bond™Ready-to-UsePrimaryAn8body AnaplasNcLymphomaKinase(5A4) Techniquesautoma8sées Exemples de coûts à l’Hôpital Tenon AP-HP(Paris) prix anticorps nus et kits de révélation Immunohistochimie sur Ventana BenchMark ULTRA PrixAP-HPHT euros CondiNonnement Nombredetests AnNcorps Prêtàl’emploi 50tests Prêtàl’emploi ALK,D5F3 50tests 100µl ROS-1 50tests 100µl PDL1 100tests Prêtàl’emploi KitultraviewDAB 250tests Prêtàl’emploi Kitop8viewDAB 250tests Prêtàl’emploi Ampliop8view 50tests ConfirmC-MET Fournisseur KituNlisé Roche UltraviewDAB Diagnos8cs Roche Op8view+ampli Diagnos8cs 3697,81 3697,81 Cellsignaling UltraviewDAB 479,18 Cellsignaling UltraviewDAB 494,00 Roche Diagnos8cs Roche Diagnos8cs Roche Diagnos8cs 1025,00 1180,00 138,67 Ciblerlestransloca8onsdeALK Europe « XALKORI est indiqué dans le traitement des patients . adultes ayant reçu au moins un traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites cellules anaplastic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé» USA Hybrida8oninsitu Fluorescenceinsituhybridiza8on technique • Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier • Détection de délétions, identification de translocations ou autres réarrangements chromosomiques Fluorescenceinsituhybridiza8on technique • Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier • Détection de délétions, identification de translocations ou autres réarrangements chromosomiques Fluorescenceinsituhybridiza8on FISH:lestandardpourALK Chromosome 2 ALK Sonde T ALK/EML4 Sonde T Sonde C Sonde C EML4 FISH “break apart“ Soda M, Nature 2007, 448:561; Horn L, J Clin Oncol 2009, 27:4232; Shaw AT, J Clin Oncol 2009, 27:4247 FISH ALK Sonde vysis Antoine M, anatomopathologie, Hôpital Tenon Fluorescenceinsituhybridiza8on autresréarrangements Saito M, Cancer Science 2016 Ciblerlestransloca8onsdeROS 24 ACSEcrizo8nib cohorteCBNPCréarrangéROS A 2 cycles RO= 54 % (19/36) [38 ; 70] Taux de contrôle= 86 % (31/36) [71; 95] Meilleure réponse ORR = 69 % (25/36) [52 ; 84] DCR = 89 % (32/36) [74 ; 97] Diagnostic aout 2012 Diagnostic aout 2012 IHCFISH Ros Aspiration bronchique homme de 35 ans non fumeur opacité alvéolaire clone d4d6 Sonde clinisciences Antoine M, anatomopathologie, Hôpital Tenon 30 octobre 2014 Quatrième ligne par crizotinib Fluorescenceinsituhybridiza8on amplificaIon MET Sonde clinisciences Antoine M, anatomopathologie, Hôpital Tenon ACSEcrizo8nib cohorteCBNPCamplifiéMET A 2 cycles RO% = 32 % (8/25) [15;54] Taux de contrôle= 60 % (15/25) [41;79] Meilleure réponse RO = 32 % (8/25) [15;54] Taux de contrôle = 60 % (15/25) [41;79] FISH rouIne Avantages Inconvénients Paraffine Techniquelourde impactdupréanaly8que lecturedifficile expériencedupathologiste Pe8tprélèvement Pe8tprélèvementmais100noyaux Sensibleetspécifique Microscopeàfluorescence Grandchoixdesondes Analyseciblée Couteux Techniquessemi-automa8sées Exemples de coûts à l’Hôpital Tenon AP-HP(Paris): prix sondes et kits de révélation FISH technique semi-manuelle sur DAKO Hybridizer Sondes CondiNonnement Nombredetests Fournisseur KituNlisé PrixAP-HPHT euros ROS-1 Prêtàl’emploi 20tests ZYTOVISION HistologyFISH AccessoryKit 1041,20 MET/CEN7 Prêtàl’emploi 20tests ZYTOVISION HistologyFISH AccessoryKit 1041,20 ALK Prêtàl’emploi 20tests ABBOTT HistologyFISH AccessoryKit 2702,10(HM) RET Prêtàl’emploi 20tests ZYTOVISION HistologyFISH AccessoryKit 1041,20 HistologyFISH AccessoryKitDako 20tests DAKO 392,46 Testsmoléculairesenrou8ne 7biomarqueurspourlesCBNPCnonépidermoïdes Cancer Lung Non-sq NSCLC Molecular Target EGFR mutations EML4-ALK transloc. KRAS mutations HER2 ex20 mutations BRAF mutations PI3K mutations Mais aussi mutations de MET Analysedugénome méthodeenzymaIqueSanger Testsmoléculairesenrou8ne versdestechniquesàhautdébit Testsmoléculairesenrou8ne versdestechniquesàhautdébit Testsmoléculairesenrou8ne versdestechniquesàhautdébit Rivzi N, Science 2015 NGSnext-genera8onsequencing • Wholegenomesequencing(WGS) • Wholeexomesequencing(WES) • Amplicon-basedNGS NGSnext-genera8onsequencing NGSnext-genera8onsequencing •Rapidité : plus de patients, plus de gènes étudiés en simultané •Coût : inférieur au séquençage de Sanger •Sensibilité : supérieure au Sanger, détection de sous-clones, suivi de MRD •Exhaustivité : plus d’exons, gènes entiers •Économie du matériel biologique : qq ng d’ADN pour un grand nombre de gènes Perspec8vespourlarou8ne? RCPmoléculaire Deuxsites • Tenon/HEGP Deuxorganes • Poumon/côlonrectum RéunionsélecNondedossier • 2fois/mois But • SélecNonnerdespaNentsayant uneaddicNononcogénique àunbiomarqueurnon recherchéenrouNne Sujet • «plutôt»jeune,nonfumeur, stadeIV,sansbiomarqueur idenNfié Deuxprélèvementstumoraux debonnetaille • chirurgical? Congelésetparaffine Sang • consultaNond’oncogénéNque Perspec8ves analysedel’exome«enrouIne» Compterenduprovisoirele20Février2015 Résultatsexomedu14TH10341-ADN-N-14TH10341-ADN-T Aucuneanomalieconstitutionnellemiseenévidencesurlesgènessuivants: BRCA1;BRCA2;TP53;STK11;MLH1;MLH2;MSH6;PMS2;APC;MUTYH;VHL;MEN1;RET; PTEN; RB1; SDHD; SDHAF2; SDHC; SDHB; TSC1; TSC2; WT1;NF2; COL3A1; FBN1; TGFRBR1; TGFBR3; SMAD3; ACTA2; MYLK; MYH11; MYBPC3; MYH7; TNNT2; TTNI3; TPM1; MYL3; ACTC1; PRKAG2; GLA; MYL2; LMNA; RYR2; PKP2; DSP; DSC2; TMEM43; DSG2;KCNQ1;KCNH2;SCN5A;LDLR;APOB;PCSK9;RYR1;CACNA1S Perspec8ves analysedel’exome«enrouIne» AnalyseSomatique Anomaliedunombredecopie Aucungènepouvantêtreimpliquédansunepathologiecancéreusen’aétéidentifié commeayantunnombredecopiesupérieureà6(amplifié) LesgènesCDKN2AetCDKN2Bprésententunedélétionhomozygoteprobable Perspec8ves analysedel’exome«enrouIne» AnalyseSomatique Recherchedemutationssomatiques 587mutationsponctuellesontétéidentifiées Lafréquencedesmutationsenfonctiondeleurtypeestindiquéedansletableausuivant. Cetterépartitionestévocatriced’uneintoxicationtabagique: ATtoGC ATtoCG ATtoTA GCtoCG GCtoTA GCtoAT 0,08 0,13 0,11 0,09 0,40 0,19 total nb_de_mutation 1,00 587 Perspec8ves analysedel’exome«enrouIne» AnalyseSomatique Perspec8ves analysedel’exome«enrouIne» Whole exome sequencing (WES) and RNA sequencing (RNA-seq) in routine clinical practice for colorectal cancer (CRC) and non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (pts). Authors: Geraldine Perkins1,2, Elizabeth Fabre3, Vincent Fallet4, Helene Blons5, Nicolas Pecuchet3, Valerie Gounant6, Laure Gibault7, Martine Antoine8, Marie Wislez4, Delphine Le Corre9, Karen Leroy10, Robert Lacave11, Julien Taieb1, Jacques Cadranel4, Pierre Laurent-Puig2,5 Between 09/2014 and 4/2016, 35 pts were selected ..The median analysis turnaround was 21.5 days (8-92). Potential driver alterations were found in 27 pts, most frequently in HER/RAS/MAPK (n=14), PTEN/PI3K/AKT (n=6), STK11 (n=4) pathways. Gene alterations were identified in chromatin organization (ARID1A/ ARID2/EZH2, n=8), cell cycle checkpoint signaling (ATR/ATRX/ATM, n=4), and DNA repair (BRCA1/BRCA2, n=4) pathways. Therapy could be personalized in 13 pts, of whom 7 were included in a clinical trial. These results are encouraging on the feasibility of WES and RNA-seq analysis in routine clinical basis, in order to select dedicated TT in pretreated pts. Geraldine Perkins et al; Esmo 2016 Evolu8on • Biopsiesliquides – Sangcirculant/Urines… • Contrôlesdequalité;normes • Consulta8ond’oncogene8que Conclusion évoluIondesméIers biologiste moléculaire radiothérapeute oncologue pneumologue chirurgien anapath radiologue
