EMML 28.09 - Accueil xcazer.fre.fr
publicité
Le pouvoir pathogène de la bactérie Helicobacter pylori Helicobacter pylori Bacille Grammicroaérophile catalase et oxidase +, urease+ muqueuse intestinale présent dans 25 à 50% de la population (pays développés) responsable de gastrites, d’ulcères et de cancers de l’estomac génome (env. 1.6Mb) séquencé facteurs de virulence (CagA cytotoxin-associated geneA , VacA, vacuolating cytotoxin A induit l’apoptose) Rôle dans l’estomac humain étudiée depuis plus de 20 ans Raisons de sa persistance dans l’estomac mal connues Pierre Gounon (http://www.unice.fr/ccma/). www.interet-general.info Le pouvoir pathogène de la bactérie Helicobacter pylori Pierre Gounon (http://www.unice.fr/ccma/). www.interet-general.info Les cellules T-CD4+ : rôle cruciale dans l’élimination H. pylori mais prolifération inhibée par la bactérie Données bibliographiques •[Vac-A purifiée] ↑ alors suppression de la prolifération des L •H. pylori ΔVacA non pas d’effet sur ce phénotype •Chez les patients, pas d’effet sur l’inflammation gastrique pour des souches exprimant VacA Résultats précédents de l’équipe •Des produits secrétés par H. pylori inhibent la prolifération des LT indépendamment des facteurs de virulence connus dont certains ayant une taille de (29-66 kDa) en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 Le pouvoir pathogènede la bactérie Helicobacter pylori Objetif de l’étude: Purifier dans des surnageants de culture ce facteur d’immunosuppressif Résultats obtenus Identification du GGT ou γ-glutamyl transpeptidase comme nouveau médiateur de H.pylori, agissant à faible dose sur les cellules T Mode d’action supposé du GGT: disruption du signal Ras –dépendant des LT conduisant à l’arrêt du cycle en G1 Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine putative d’inhibition de la prolifération des LT -Purification du facteur de virulence à partir de surnageant de H.pylori souche G27 par chromatographie d’exclusion de taille: fraction 30 kDa - 66 kDa présentant une activité « pip » -Analyse du protéome des protéines sécrétées et recherche des protéines candidates, -Comparaison des fractions obtenues sur chromatographie par SDS-PAGE pour leur capacité à inhiber la prolifération Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine putative d’inhibition de la prolifération des LT Identification de 4 protéines candidates dont 2 correspondants à de la GGT sécrétée 61kDa: proforme de la GGT et 38 kDa: grosse sous-unité de la GGT -Test d’activité de la HPGGT sur les fractions de surnageants Présence de l’activité GGT uniquement dans les fractions d’inhibition Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -Génération de mutants H.pylori ΔGGT pas d’effets sur la croissance bactérienne in vitro -Effets des surnageants de culture de la souche wt et ΔGGT sur la prolifération des cellules T et PBMC (cellule mononucléaire du sang périphérique) préalablement activées (anti-CD3/CD28; PMA /ionomycin) cellules T PBMC La délétion de la GGT permet la prolifération cellulaire après activation Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -Contrôle de l’absence d’activité de la GGT L’absence d’inhibition de croissance est bien corrélée: à une activité GGT – à l’absence de protéine native GGT La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -Génération d’une H.pylori GGT taggée HIS recombinante dans E.coli purification sur colonne et contrôle qualité (taille, épitope, activité) AgNO3 Ac anti αGGT Proforme 66kDa LSU 38 kDa SSU 20 kDa La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -Génération d’une H.pylori GGT taggée HIS recombinante dans E.coli La prolifération est inhibée à 50% avec environ 0.5µg rHPGGT et est dose dépendante (vs VacA). Les différences d’activités entre GGT et VacA sont aussi observées avec les surnageants de culture. L’activité enzymatique est fonctionnelle même à un pH acide c.à.d. au site d’infection La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -Recherche d’Ac anti GTT en milieu clinique Patients malades La GGT est reconnu par le système immunitaire des patients infectés. Patients sains L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GGT -La GGT est également exprimée par les cellules de mammifères: La GGT équine purifiée est fonctionnelle mais ne permet pas l’inhibition de la prolifération des PBMC. Mutagenèse dirigée du site actif de la rHPGGT (S451/452A) L’inhibition de la prolifération est corrélée à l’activité catalytique de la HPGGT. L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GGT -Validation par l’utilisation d’un inhibiteur irréversible et compétitif de la GGT: l’acivicin sur la rHPGGT et les surnageants de culture L’inhibition de l’activité catalytique de la HPGGT par l’acivin, induit une absence d’inhibition de la prolifération des PBMC. La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. -L’effet observé de la HPGGT sur la prolifération des lymphocytes peut-il résulter d’une interaction avec la sécrétion de cytokines? Mesure par dosage ELISA de la sécrétion d’IL2 et d’ IFN-γ par des PBMC activées En présence de HPGGT, aucune diminution dans la production d’IL2 et d’IFN-γ n’est observée dans les PBMC. La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. Est-elle due à une induction de l’apoptose dans les LT par la HPGGT? -Marquage de cellules Jurkat T à l’annexin V-FITC, en présence de surnageant de culture de H.pylori En présence de HPGGT à des concentrations entraînant l’inhibition de la prolifération, aucune activation de l’apoptose n’est observée. Annexine: affinité pour les phosphatidylsérines membranaires qui ne sont situées que sur la face interne de la membrane Marqueur de l’apoptose avec une présence sur les 2 faces Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T Qu’en est-il du cycle cellulaire? -Marquage de cellules Jurkat T au bromodeoxyuridine- FITC (analogue de la tymidine)/Propidium Iodide (intercalant), en présence de surnageant de culture de H.pylori S G1 G2 La HPGGT induit un arrêt en phase G1 de la prolifération cellulaire. Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T La HPGGT induit un arrêt en phase G1 de la prolifération cellulaire. Validation par immunoblotting sur des protéines spécifiques du cycle cellulaire (cellule Junkat) -induit durant la phase G1: passage à la phase S -activé par cdk2 durant la phase G1: passage plus rapide en phase S -rôle en phases S et G2 -régulateur de l’activité cdk2 dans la zone de prolifération de l’épithélium intestinale PBMC 24h PBMC 48h En présence de HPGGT à une concentration suffisante, les cyclines D3 et E1 sont inhibées et le répresseur p27 est surexprimé. Ces résultats sont en accord avec un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 des LT. Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T Quelles voies d’activation cellulaire pourraient être impliquées? -Observation des voies Ras et PI3K ( phosphatinylinositol 3- kinase) par immunobloting sur des protéines spécifiques Ras PI3K En présence de HPGGT, les protéines c-myc et c-Raf sont réprimées. Les signaux Ras dépendant sont perturbés dans les cellules. Résultats -Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine d’inhibition de la prolifération des LT -Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GGT -La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. -Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T -Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T Discussion -Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine d’inhibition de la prolifération des LT -représentée chez les vertébrés, les plantes et les bactéries -protéine hétéro-dimérique subissant une maturation post-traductionnelle (clivage en 2 sous unités) -localisation cellulaire différente entre les mammifères et les bactéries protéine associée à la membrane, exprimée sur la surface luminale des glandes et tubules protéine sécrétée chez certaines bactéries - homologie de séquences très faible selon le genre ( env.20%) mais plus importante intra-genre perte de résidus GY en C-ter -facteur important de la colonisation in vivo -Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GGT -La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. -Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T -Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T Discussion -Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine d’inhibition de la prolifération des LT -Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GGT -la GGT de mammifère n’ a pas l’effet inhibiteur de la HPGGT -différence d’activité catalytique -rôle majeur de l’intégrité catalytique de la HPGGT (mutation, inhibiteur spécifique) dans l’activité immunosuppressive -Enzyme active à des pH acide présent dans la muqueuse gastrique -La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. -Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T -Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T Discussion -Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine d’inhibition de la prolifération des LT -Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GG -La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. Comment la HPGGT peut interagir avec le SI de l’autre côté de la barrière épithéliale? induction de l’apoptose des cellules épithéliales VacA et GGT induction activité uréase de H. pylori suite à la lésion des jonctions épithéliales (VacA et CagA) et à une augmentation du transport des protéines transcytotiques augmentation de la présence des protéines de H. pylori dans la lamina propria et donc contact avec le SI. L’induction ou non d’apoptose par la HPGGT peut dépendre des cellules cibles (cellules T- et épithéliales+) -Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T -Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T Discussion -Identification de la GGT d’ H. pylori comme une protéine d’inhibition de la prolifération des LT -Des mutants H. pylori Δ GGT sont incapables d’inhiber la prolifération des LT -La HPGGT recombinante inhibe la prolifération des LT de façon dose dépendante -L’effet inhibiteur de la HPGGT est spécifique d’espèce et dépend de l’activité catalytique de la GG -La HPGGT inhibe la prolifération des Lymphocytes sans réduire la sécrétion d’IL2 et de l’IFN-γ et sans induire l’apaptose. -Effet de la HPGGT sur la progression du cycle cellulaire dans les cellules T -Interférence de la HPGGT avec le signal Ras dépendant des cellules T arrêt du cycle cellulaire en phase G1: ↑ du répresseur Cdk p27 et ↓ des cyclines. voie Ras (↑ des cyclines D) par les cascades et c-raf, c-myc effet additionnel sur les voies normales de régulation Discussion Hypothèse du mode d’action de la HP GGT HPGGT ↑ [cAMP] dans les LT Activation de la protéine kinase A ↑ p27 et ↓ cycline D3 Arrêt en G1 Inhibition de la prolifération par blocage des facteurs de croissance dépendant du signal ↓ facteurs de transcription: c-myc et кB L’effet immunosuppressif de la HPGGT doit être confirmer in vivo. La HPGGT est une excellente cible thérapeutique pour le traitement des infections à H. pylori. Discussion -l’effet inhibiteur de la GGT est régulé indirectement par la formation de métabolites durant la transpeptidation (glutamine). -l’effet de la GGT est plus prononcé que pour d’autres facteurs de virulence (seuil de 1 vs 300 bactéries par cellule pour l’induction apoptose). -il existe un effet inhibiteur de la prolifération avec la protéine cytoplasmique arginase qui n’a pas été observé dans cette étude qui s’intéresse aux protéines sécrétées. -la HPGGT est suffisante pour induire une inhibition de la prolifération des LT . L’effet immunosuppressif de la HPGGT doit être confirmer in vivo. La HPGGT est une excellente cible thérapeutique pour le traitement des infections à H. pylori. Cyclins and Cell Cycle Regulation Non-dividing (quiescent) cells (Go) enter the cell division cycle at G1, the period when the cell grows and prepares for replication. Progression of the cell cycle requires that cell pass a restriction point in G1. Cells that do not pass through this restriction point re-enter Go. Cell cycles typically involve three additional phases, S, G2 and M. During S phase, DNA is synthesized and the centrosome is duplicated. During the M phase the cell divides (mitosis). G2 which follows the S phase is the period when the cell prepares for mitosis. Members of the cyclin family of proteins are key regulators of the cell cycle. Cyclins bind and activate members of the cyclin-dependent kinase (Cdk) family to effect cell cycle progression. Cell cycle progression is controlled by the relative levels of individual cyclin family members. Progression through the G1-S-G2-M cycle follows successive oscillations in the levels of cyclins, D, E, A and B. Cyclins are grouped into classes that relate to the phase of the cell cycle they regulate. Cyclin D family members are G1 phase cyclins that regulate the entry of cells into G1 from Go. Cyclin D is upregulated by growth factor and external signals through the Ras GTPase signaling pathway. Cyclin D couples with Cdk4 and Cdk6. The cyclin-D-dependent kinases enforce commitment to enter S-phase. Cyclin D-Cdk4 hypophosphorylates retinoblastoma protein (pRB) and facilitates the expression of cyclin E. Cyclin E and Cyclin A are able to bind Cdk2 and promote the cell cycle progression through G1/S transition. Cyclin E-Cdk2 and Cyclin A-Cdk2 hyperphosphorylate and inactivate pRb. The inactivation of pRb leads to activation of E2F transcription factors. Cyclin E stimulates replication complex assembly through interaction with Cdc6. Cyclin A activates DNA synthesis by the replication complex already assembled and inhibits assembly of new replication complex. Cyclin E reinitiates the replication complex that is blocked by cyclin A. Cyclins B1 and B2 are M-phase cyclins. Cyclin B1 and cyclin B2 and their catalytic partner, Cdk1 (cdc2, p34 kinase), are components of the M phase/maturation promoting (MPF) factor that regulates processes that lead to assembly of the mitotic spindle and sister-chromatid pair alignment on the spindle. PathFinder. Sur sigma.com www.unice.fr/inserm-toxin-bacteria/Vaca2.html La cytotoxine VacA d' Helicobacter pylori H.pylori (Fig 1) est la seule bactérie classée comme agent carcinogène de type 1. Sept millions de nouveaux cas de cancers gastriques apparaissent chaque année dans le monde, causant le décès de plusieurs centaines de milliers de personnes. L'infection à H.pylori touche aujourd'hui 50 à 60 % de la population mondiale. H.pylori entraîne, chez tous les patients infectés, une gastrite. Cette gastrite évolue, dans 20 à 30 % des cas, vers quatre types de pathologies plus importantes : l'ulcère duodénal et l'ulcère gastrique, mais surtout, des adénocarcinomes gastriques et le lymphome du MALT (" Mucosa Associated Lymphoïd Tissue "). Dans l'estomac, H.pylori s'adapte grâce à de puissants facteurs de virulence comme l'uréase, la protéine CagA et la cytotoxine VacA. Notre laboratoire étudie le mode d'action de VacA, toxine protéique sécrétée par la bactérie. Le gène de VacA, présent dans toutes les souches, est variable. Les régions de plus grande diversité sont localisées près de la région 5' du gène (allèles, s1a, s1b, s1c ou s2) et dans sa région médiane (allèles m1 ou m2) (Fig2) . Les souches d' H-pylori s1/m1, que nous étudions au laboratoire, sont les souches les plus virulentes pour un risque de survenue de cancers. De plus, dans toutes les régions du monde où le taux de cancer distal gastrique est élevé (en particulier en Colombie et au Japon), la plupart des souches sont de génotype VacA s1/m1. VacA s1/m1 est donc associée à un pronostic péjoratif pour la survenue de cancers gastriques. Figure 2: Les effets de VacA A) VacA induit la vacuolisation des cellules mise en culture. Les cellules HeLa intoxiquées avec VacA et mise en présence de 1 mM de chloroquine ont été filmées pendant deux heures à 37°C avec un vidéomicroscope inversé (voir aussi vidéo) B) VacA induit l'apoptose des cellules. Les cellules HeLa intoxiquées ou non avec VacA sont analysées par la technique « tunel » en microscopie confocale à fluorescence. Après 36 heures, les cellules intoxiquées présentent un noyau très rouge. Cette observation se traduit par une fragmentation de l'ADN signe de l'apoptose des cellules (les brins libres d'ADN incorporant la sonde). VacA (pour "Vacuolating Toxin A") a été découverte par sa capacité à induire de larges vacuoles dans les cellules en culture (Fig3 et vidéo) . Ces vacuoles sont issues d'un gonflement des compartiments tardifs d'endocytose (Fig 3 et 4) . Cette activité vacuolisante serait due à l'activité canal chlorure de la toxine (Fig 3 et 4) . Cependant, aucun lien bien défini n'a été trouvé entre la vacuolisation et la réalité physiopathologique d' H.pylori . Notre laboratoire cherche à comprendre le rôle de VacA dans l'infection à H.pylori et a montré que VacA induisait l'apoptose de cellules épithéliales en culture (Fig 3 ) . En effet, une fois dans le cytoplasme, VacA cible la mitochondrie, provoquant la fuite de cytochrome c, l'activation de la caspase 3 et la mort cellulaire (Fig 3 et 5) . Depuis ce travail, l'effet apoptotique de VacA sur la cellule gastrique a été confirmé par plusieurs équipes. Enfin il a été montré in situ dans des cellules de la muqueuse gastrique de singes infectés expérimentalement par H.pylori que la caspase 3 était activée vraisemblablement par VacA. Pour une toxine soluble, comme VacA, sécrétée par la bactérie, et non injectée directement dans le cytoplasme, un grand problème se pose : comment rejoindre sa cible intracellulaire ? La pénétration d'une toxine dans les cellules représente une étape clef dans le processus d'intoxication. Notre laboratoire a montré que VacA est endocytosée par une voie indépendante de la clathrine. Son internalisation est favorisée par la présence de pGPIs (protéines ancrées au feuillet externe de la membrane plasmique par un lien glycosyl-phosphatidylinositol). Mais ces molécules ne sont pas directement responsables de la liaison de la toxine aux cellules. Ceci laisse supposer que la toxine VacA utilise les rafts (domaines lipidiques insolubles aux détergents) où sont concentrés les pGPIs pour pénétrer dans les cellules. Figure 3: Les étapes de la maturation de VacA La cytotoxine est initialement produite par la bactérie sous la forme d'une préprotoxine ayant une masse moléculaire de 140 kDa. La préprotoxine possède à son extrémité amino-terminale une séquence signal assurant le franchissement de la membrane interne de la bactérie. Cette séquence signal est clivée dans le périplasme. Une séquence d'exportation de 40 kDa permet le passage de la toxine à travers la membrane externe de la bactérie. Une fois sur la surface de la bactérie, la toxine VacA est libérée par un clivage qui élimine la portion carboxy-terminale et libère la toxine mature d'environ 90kDa. La toxine possède un site sensible de clivage par des protéases pouvant libérer les fragments p34 amino-terminal et p58 carboxyterminal. Figure 4: Modèle de la vacuolisation induite par VacA Helicobacter pylori secrète VacA pendant que l'uréase bactérienne produit de l'ammoniaque (pour les expériences avec des cellules en culture, des bases faibles sont ajoutées comme le NH4Cl). Après purification, la toxine est oligomérique et perd de son activité. Le traitement de VacA par un choc acide ou alcalin restaure son activité vacuolisante. Les monomères de VacA se lient aux cellules. Ils formeront ensuite un canal anionique par hexamérisation dans le plan de la membrane plasmique. Les canaux sont alors endocytosés et transférés dans l'endosome tardif (Rab7) où ils vont enrichir la lumière de l'endosome en ions chlorure. VacA augmente l'activité de la v-ATPase et l'acidité de l'endosome. Ceci permet à de faible concentration de bases faibles de s'accumuler dans les endosomes tardifs ou elles sont séquestrées après protonation, induisant ainsi un gonflement osmotique par entrée d'eau. Le NPPB, un inhibiteur spécifique des canaux chlorure et la bafilomycine A1, un inhibiteur spécifique de la v-ATPasa bloquent la vacuolisation. Figure 5 : VacA cible la mitochondrie, machinerie centrale de la mort cellulaire Interaction de VacA (ou du fragment p34) avec la mitochondrie. VacA ou p34 (mais pas p58) se concentrent dans la matrice mitochondriale. Ils déclanchent le relargage de cytochrome c entraînant, in fine, l'apoptose des cellules Nos travaux au laboratoire ont quatre objectifs 1 mettre en évidence le role des pGPIs et des rafts dans la formation du canal 2 définir la voie d'entrée de VacA dans les cellules et le role du canal dans cette entrée 3 iIdentifier le mode de translocation de VacA pour rejoindre la mitochondrie 4 iIdentifier la (ou les) cible(s) potentielle(s) de VacA dans la mitochondrie.
