Absorbance croissance

AGREGATION DE
BIOCHIMIE - GENIE BIOLOGIQUE
Session 1999
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TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE
« Détection rapide de Salmonella spp dans un produit alimentaire »
CADRE DE L'ÉTUDE
Les salmonelloses demeurent la première cause de maladies d'origine alimentaire dans les
pays développés. Elles sont en particulier responsables des toxi-infections alimentaires
collectives (TIAC). Les produits alimentaires les plus souvent mis en cause sont les
ovoproduits, les viandes et les produits laitiers.
La recherche des Salmonella se pratique lorsqu'il y a survenue d'une TIAC, mais aussi en
routine, sur les chaînes de production agro-alimentaire concernées, dans le cadre de
démarches de type HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point). Le critère
microbiologique relatif aux Salmonella est : « absence dans 25 grammes d'aliment ».
L'objectif de l'analyse microbiologique est donc de rechercher la présence d'au moins une
Salmonella dans un échantillon de produit. La faible quantité et le faible pourcentage de
Salmonella par rapport aux autres bactéries dans les produits alimentaires nécessite plusieurs
étapes de culture : préenrichissement, enrichissement, isolement sélectif et identification. Ces
étapes sont décrites dans la méthode de référence pour la recherche de Salmonella (NF ISO
6579). L’analyse selon cette méthode impose donc un délai de réponse important
Au cours de la manipulation, nous déterminerons, dans des conditions simples, pour l'étape de
préenrichissement :
- la durée de la phase de latence λ,
- la vitesse spécifique de croissance en phase exponentielle Qx expo et la durée de cette phase.
- la croissance maximale Xmax
Ces paramètres ont été choisis par analogie avec ceux pris en compte en microbiologie
prévisionnelle. Ils permettent de quantifier le développement d'un microorganisme
contaminant par l'étude de sa croissance, dans des conditions fixées et contrôlées conduisant à
une modélisation.
Pour l'étape d'enrichissement, nous étudierons l'évolution du pourcentage de Salmonella dans
une culture mixte.
Une approche plus récente combinant rapidité et sensibilité de détection fait appel à la
technologie PCR (Polymerase Chain Reaction). Elle consiste à amplifier un fragment
spécifique du génôme des Salmonella spp, puis à détecter l'amplicon par méthode immunoenzymatique (de type ELISA). On se propose ici de réaliser un protocole rapide qui met en
jeu trois opérations successives :
- préenrichissement,
- amplification sélective in vitro (PCR),
- détection immuno-enzymatique (ELISA) de l'amplification.
TRAVAIL DU PREMIER JOUR
Il est indispensable de prévoir une organisation horaire précise des manipulations à
effectuer
A- Étude des étapes de la méthode de référence
Les trois manipulations de cette partie sont indépendantes mais doivent être menées en
parallèle.
1- Phase de latence de l'étape de préenrichissement
Vous disposez d'un échantillon de crème anglaise contaminée par Salmonella Enteritidis à
raison de 1.104 bactéries par mL et conservée à 4°C pendant 24 heures. Le milieu de
préenrichissement utilisé est l'eau peptonée tamponnée (EPT).
Manipulation
- Ensemencer, au temps 0, un tube contenant 9 mL de milieu EPT par 1 mL de crème
contaminée.
- Homogénéiser.
- Incuber en bain thermostaté à 37°C.
- Toutes les 10 minutes à partir du temps 0 jusqu'au temps 90 minutes, réaliser un
dénombrement en surface :
prélever 0,1 mL de culture non diluée,
étaler en surface d'une gélose trypticase soja (GTS) à l'aide d'un étaleur stérile,
réaliser 2 essais pour chaque temps.
Pour le dernier temps (90 minutes), réaliser un dénombrement sur le prélèvement non
dilué et sur une dilution 10-1 en eau physiologique de celui-ci.
- Incuber 24 heures à 37°C.
Cultures et milieux
- un échantillon de crème anglaise contaminée, en tube à essais ("crème n° ")
- un tube contenant 9 mL d'eau peptonée tamponnée ("EPT 9 mL n° ")
- un tube contenant 9 mL d'eau physiologique (bouchon doré noté 9 )
- 22 boîtes de gélose trypticase soja (GTS)
2- Phase exponentielle de croissance de l'étape de préenrichissement
Vous disposez d'une préculture de 18 heures de Salmonella Enteritidis en eau peptonée
tamponnée La croissance est suivie par turbidimétrie. La correspondance entre absorbance et
concentration bactérienne sera vérifiée par dénombrement direct au microscope.
2-1 Vérification de la relation entre absorbance et concentration bactérienne
8
Classiquement, il est établi qu'une unité d'absorbance à 600 nm correspond à 5.10 UFC par
mL (UFC : unité formant colonie, correspondant à une cellule bactérienne revivifiable ou à un
amas de cellules).
La méthode utilisée pour le dénombrement direct est la méthode D.E.F.T. (Direct
Epifluorescent Filter Technique).
Dénombrement
Observer au microscope à épifluorescence la préparation fournie.
Faire contrôler par un examinateur.
Cette préparation a été préalablement réalisée par filtration sur membrane d'une dilution au
1/500ème de la préculture de Salmonella, selon le mode opératoire présenté en annexe 1.
L’absorbance de la préculture à 600 nm a été évaluée à 1,2.
Compte-rendu
1- Décrire qualitativement l'aspect de la préparation.
2- Justifier la différence de fluorescence des bactéries revivifiables et des bactéries "mortes".
3- Etablir la formule de calcul de la concentration de la préculture en « unités revivifiables »
par mL.
4- A partir du dénombrement effectué, vérifier la relation énoncée ci-dessus, entre
l’absorbance à 600 nm et la concentration bactérienne.
2-2 Etude de la phase exponentielle
Le suivi de la croissance est réalisé par turbidimétrie à 600 nm, toutes les lectures se font
directement en semi-microcuves contre le milieu de culture, le prélèvement de la culture est
donc de 1 mL au maximum.
Manipulation
- Effectuer une mesure d’absorbance de la préculture diluée au 1/4 en eau peptonée
tamponnée.
- Ensemencer l'erlen contenant 50 mL d'EPT avec la préculture, de façon à démarrer la culture
à 0,05 unité d’absorbance à 600 nm.
Mesurer l'absorbance initiale, à t = 0 en présence d'un examinateur.
- Incuber en bain thermostaté à 37°C non agité.
- Prélever toutes les 10 minutes pendant 1 heure 30.
- Prélever ensuite toutes les 30 minutes jusqu'au temps t = 4 heures.
La limite de linéarité de la relation liant l'absorbance à 600 nm et la concentration
bactérienne est de 0,6.
Cultures et milieux
- un tube contenant 12 mL de préculture de 18 heures de Salmonella Enteritidis ("S.Enteritidis EPT n° ")
- un flacon de 20 mL d'EPT ("EPT 20 mL")
- un erlen de 100 mL contenant 50 mL d'EPT, préchauffé en bain thermostaté à 37°C ("EPT 50 mL n°
")
Compte-rendu
1- Justifier la prise d’essai effectuée.
2- Tracer sur papier semi-logarithmique la courbe de croissance de Salmonella Enteritidis.
3- Analyser la courbe obtenue.
4- Déterminer graphiquement le temps de génération ; en déduire la vitesse spécifique de
croissance pendant la phase exponentielle en heure-1.
5- Déterminer graphiquement la durée de la phase exponentielle de croissance.
6- Estimer le facteur d'amplification des cellules lors du préenrichissement.
7- Calculer Xmax (UFC.mL-1).
3- Efficacité de la phase d'enrichissement
Vous disposez d’une préculture de Salmonella Enteritidis en bouillon nutritif ajustée à 1 unité
d'absorbance à 600 nm et d'une préculture d'Escherichia coli en bouillon nutritif également
ajustée à 1 unité d'absorbance à 600 nm.
La manipulation consiste à réaliser une suspension mixte calibrée en bouillon au sélénite
(dont la composition est donnée en annexe 2) et à suivre l'évolution du pourcentage de
chacune des 2 espèces lors de cette étape d'enrichissement, par dénombrement sur deux
milieux sélectifs : Hektoën et Rambach (dont les compositions sont données en annexe 2).
Manipulation
- Préchauffer le tube de bouillon au sélénite à 37°C.
- Réaliser un mélange des deux précultures en ensemençant les 10 mL de ce bouillon au
sélénite avec :
100 µL de préculture de Salmonella Enteritidis,
900 µL de préculture d'Escherichia coli.
- Homogénéiser.
- Incuber à 37°C en bain thermostaté le bouillon au sélénite ensemencé.
- Effectuer au temps 0, au temps 2 heures et au temps 4 heures un dénombrement sur chacun
des 2 milieux sélectifs de la façon suivante :
A partir de 0,1 mL de culture, effectuer deux dilutions successives au 1/100 puis
une
dilution au 1/10 en eau physiologique
-4
étaler 0,1 mL de la dilution 10 sur un milieu Hektoen à l'aide d'un étaleur stérile.µ
-5
étaler 0,1 mL de la dilution 10 sur un milieu Rambach à l'aide d'un étaleur stérile.
- Incuber les milieux d'isolement 24 heures à 37°C.
Cultures et milieux
- tube contenant 12 mL de préculture de 18 heures de S. Enteritidis .("S.Enteritidis A600=1 n° "),
- un tube contenant 10 mL de préculture de 18 heures de Escherichia coli ("E.coli A600=1 n° "),
- un tube contenant 9 mL de bouillon au sélénite ("sélénite n° "),
- 3 boîtes de gélose Rambach,
- 3 boîtes de gélose Hektoën,
- 6 tubes d’eau physiologique de 9,9 mL ( bouchons rose, notés 9,9),
- 3 tubes d’eau physiologique de 9 mL (bouchons dorés, notés 9).
Compte rendu
1- Expliquer le rôle de l’étape d’enrichissement en bouillon au sélénite.
2- Quelle évolution du pourcentage des deux espèces peut-on prévoir ?
3- En utilisant les données de l’annexe 2, dégager l’intérêt du milieu de Rambach par rapport
au milieu Hektoën pour la différenciation de Salmonella.
B- Détection des Salmonella par « PCR-ELISA »
La méthode consiste à amplifier une séquence de 340 paires de bases d’un gène impliqué dans
le pouvoir invasif de Salmonella spp, le gène iag A. On utilise pour cela deux amorces :
- une amorce « sens », de séquence 5’-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3’, marquée à
son extrémité 5’ par la biotine,
- une amorce « anti-sens », de séquence 5’-CGT GGG CAA CCA GCA CTA AC-3’, marquée
à son extrémité 5’ par de la digoxigénine (DIG).
La présence éventuelle d’un amplicon sera mise en évidence par une technique immunoenzymatique (ELISA) utilisant un support sensibilisé par de l’avidine.
1- Amplification par méthode PCR
L’ADN matrice utilisé est préparé à partir de la préculture de Salmonella Enteritidis ajustée à
1 unité d’absorbance à 600 nm ou de dilutions réalisées à partir de cette préculture, afin
d’étudier la sensibilité de la méthode.
Deux témoins sont effectués, l’un à partir de la préculture Salmonella Enteritidis en absence
d’amorce, l’autre à partir de la préculture d’Escherichia coli ajustée à 1 unité d’absorbance à
600 nm.
Les amplifications à réaliser sont présentées dans le tableau du paragraphe 1-3 ci-dessous.
Manipulation
1-1 lavage des précultures
Pour chaque préculture ajustée :
- Prélever 0,5 mL dans un microtube de 1,5 mL.
- Centrifuger 2 minutes en microcentrifugeuse, à 13000 g.
- Eliminer le surnageant
- Remettre le culot en suspension dans 500 µL d’eau distillée, en vortexant.
1-2 Dilutions
A partir de la suspension de Salmonella Enteritidis précédemment réalisée, préparer en
microtubes de 1,5 mL des dilutions décimales en série en eau distillée stérile jusqu'à la
dilution 10-4, dans un volume final de 1 mL.
1-3 Préparation de l’ADN matrice
Dans chacun des tubes concernés (suspensions et dilutions, indiquées dans le tableau cidessous) :
- Ajouter 2 gouttes d’huile minérale.
- Placer le tube à 100°C pendant 10 minutes, sur portoir flottant.
- Le stocker ensuite dans la glace jusqu'à utilisation.
1-4 Réalisation des milieux d’amplification
Les amplifications sont effectuées en microtubes de 0,2 mL, dans un volume de milieu
réactionnel final de 50 µL.
Les 5 réactions d’amplification réalisées sont les suivantes :
code
bleu : coli
blanc : sans
vert : SE4
jaune : SE2
orange : SE0
ADN matrice préparé à partir
de
Escherichia coli non dilué
Salmonella Enteritidis non dilué
dilution 10-4 de Salmonella
Enteritidis
dilution 10-2 de Salmonella
Enteritidis
Salmonella Enteritidis non dilué
Mix-PCR
Mix-PCR (+)
Mix-PCR (-)
Mix-PCR (+)
Mix-PCR (+)
Mix-PCR (+)
Les milieux réactionnels sont obtenus en réalisant le mélange suivant pour chaque ADN matrice préparé :
Mix-PCR (+) ou (-) :
ADN matrice :
40 µL,
10 µL,
Remarque : traverser la surcouche d’huile minérale puis homogénéiser la solution aqueuse
d’ADN matrice par aspiration-refoulement avant de la prélever.
Les solutions de Mix-PCR contiennent :
- Tris-HCl 10 mmol.L-1 pH 8,3 ; KCl 50 mmol.L-1; MgCl2 1,5 mmol.L-1;
- dNTPs : 200 µmol.L-1 chacun ;
- Taq polymérase : 2 unités ;
- amorces :
Mix-PCR (+)
0,2 µmol.L-1 chacune
Mix-PCR (-)
absence d'amorce
1-4 Amplification
Placer les tubes dans le thermocycleur, réglé à 4°C.
Le programme d’amplification qui sera mis en œuvre est le suivant :
2 cycles :
94°C : 1 minute ;
57°C : 3 minutes ;
72°C : 1 minute
30 cycles :
94°C : 30 secondes ;
57°C : 30 secondes ;
72°C : 30 secondes
Les produits de PCR seront conservés jusqu'au lendemain à 4°C dans le thermocycleur.
Cultures et réactifs
- tube contenant 12 mL de préculture de 18 heures de Salmonella Enteritidis ("S.Enteritidis A600= 1 n°"),
- tube contenant 12 mL de préculture de 18 heures de Escherichia coli ("E;coli A600=1 n° "),
- eau distillée : 20 mL en flacon ("eau distillée 20 mL"),
- huile minérale en flacon compte-gouttes,
- Mix-PCR (+) : 200 µL,
- Mix-PCR (-) : 50 µL.
Compte-rendu
1- Sur quels critères le fragment d'ADN génomique amplifié a-t-il été choisi ?
2- Préciser l’intérêt de la réaction de l’amplification en présence d’ADN de E.coli.
3- Pourquoi chauffe-t-on les cultures 10 minutes à 100°C ?
4- Evaluer le nombre de copies du gène iag A dans le milieu de PCR, avant amplification
d'une part, après amplification d'autre part.
5- Chaque cycle d'amplification comporte une étape à 57°C. Quel est son rôle ? Comment a-ton choisi cette valeur de 57°C ?
6- Exposer sous forme d'un schéma le principe de la révélation immuno-enzymatique
(ELISA) de l'amplicon obtenu ici.
ANNEXE 1
Méthode D.E.F.T.
(direct epifluorescent filter technique)
Principe
• Après filtration sous vide d’une susension bactérienne, toutes les bactéries sont retenues sur
membrane filtrante plane microporeuse en polycarbonate. La taille des pores de cette
membrane est très régulière et les pores se situent tous dans un même plan. Il est donc
possible de dénombrer au microscope toutes les bactéries retenues, car celles-ci se trouvent
toutes sur le même plan focal
• La membrane est ensuite colorée par un fluorochrome, l’acridine orange, puis observée à
l’aide d’un microscope à épifluorescence. L’acridine orange excitée à 490 nm, émet une
lumière dont la longueur d’onde dépend de la structure secondaire de l’acide nucléique sur
lequel il s’est fixé:
- l'ADN, bicaténaire, émet une fluorescence verte,
- les ARN, monocaténaires, émettent une fluorescence orangée.
Mode opératoire (préalablement réalisé par le jury)
- Filtrer sous vide une prise d’essai de 1 mL d’une dilution de la suspension à analyser sur une
membrane de surface totale Smembrane adaptée au système de filtration.
- Mettre en contact deux minutes 2 mL de solution d’acridine orange à 0,25 mg/L en tampon
pH 6,6 puis percoler à travers la membrane.
- Laver avec 4 mL d'isopropanol.
- Sécher la membrane.
- Sur une lame propre, déposer successivement une goutte d’huile à immersion, la membrane,
une goutte d’huile à immersion, une lamelle.
- Observer à l’objectif 100 sous huile à immersion.
Dénombrement des bactéries revivifiables
Afin d’obtenir une bonne corrélation avec la méthode de référence, seules les bactéries
revivifiables sont comptées et les amas sont comptés comme une seule unité. Compter
rapidement sur un champ les unités revivifiables dont la couleur de fluorescence est nette.
La surface de la membrane est de 3,2 cm2, le diamètre réel du champ à l’objectif 100 est de
0,135 mm.
ANNEXE 2
Composition des milieux d'enrichissement et d'isolement
Composition du bouillon au sélénite en g par L
tryptone
5
lactose
hydrogénophosphate de sodium décahydraté
hydrogénosélénite de sodium
L-cystine
Composition du milieu
Hektoën
en g par L
peptone
saccharose
salicine
lactose
Na2HPO4
thiosulfate de sodium
citrate ferrique ammoniacal
1,5
sels biliaires
bleu de bromothymol
0,06
NaCl
fuchs
4
9,9
4
0,01
Composition du milieu
Rambach
en g par L
15
14
2
14
0,6
5
propylène glycol
peptone
extrait de levure
desoxycholate de sodium
rouge neutre
10
5
3
1
0,03
1,5
(5 bromo-4-chloro-3-indoyl-βDgalactopyranoside)
2 agar
15
X-Gal
5
Rq : Le catabolisme du
propylène glycol
ine acide
0,04
agar agar
13,5
conduit à une acidification du
milieu.
Quelques caractères d’identification de différentes entérobactéries
saccharose salicine H2S uréase
Salmonella
spp
Escherichia
coli
Proteus
Morganella
Shigella
Citrobacter
-
-
+/-
-
ßgalactosidase
-
+/-
-
-
-
+
-
+/-
-
+
+/-
+
+
-
+
-/+
-
propylène
glycol
+
AGRÉGATION DE BIOCHIMIE - GÉNIE
BIOLOGIQUE
SESSION 1999
ÉPREUVE PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE
Sujet proposé par Mesdames C. BONNEFOY, F. GUILLET, B. SALLEN
et Messieurs F. DUCANCEL, D. LONCLE
TRAVAIL DU DEUXIEME JOUR
A- Étude des étapes de la méthode de référence
1- Phase de latence de l'étape de préenrichissement
Pour chaque temps, dénombrer les colonies obtenues sur chacune des boîtes.
Compte-rendu
Répondre aux questions à l’aide de l’annexe 3.
1- A chaque temps, calculer la concentration bactérienne en UFC par mL ou moyenne
pondérée N
2- Pour les temps 10 minutes, 20 minutes, 80 minutes et 90 minutes, calculer la valeur de
l’intervalle : ∆δ = δ2 - δ1, en déduire la valeur de l’intervalle exprimée en pourcentage en
divisant ∆δ par la moyenne pondérée.
3- Discuter ces résultats.
4- Tracer la courbe N= f(t) sur papier semi-logarithmique représentant l'évolution de la
concentration bactérienne en fonction du temps, en figurant pour chaque point l'intervalle de
confiance donné par ∆δ.
5- Déterminer graphiquement la durée de la phase de latence.
6- D'après les résultats obtenus, une durée de préenrichissement de 16-18 heures vous semblet-elle nécessaire ?
2- Phase exponentielle de l'étape de préenrichissement
Vérifier l’absence de contamination visible de la culture en erlen, en effectuant une coloration
de Gram.
Présenter l’observation et son compte-rendu à un examinateur.
3- Efficacité de la phase d'enrichissement
Effectuer la lecture des milieux d'isolement.
Compte rendu
1- Décrire et identifier sur chaque milieu les colonies obtenues.
2- Pour chaque temps d'incubation, donner les résultats en nombre de colonies puis en
pourcentage.
3- Que peut-on conclure de ces résultats ?
B- Détection des Salmonella par "PCR-ELISA"
2- Réaction immuno-enzymatique
La présence de la séquence amplifiée le premier jour est détectée par méthode immunoenzymatique via un conjugué anti-DIG-AP (anticorps anti-digoxigénine conjugué à la
phosphatase alcaline).
Le 4-nitrophénylphosphate (pNPP) est le substrat chromogène utilisé.
La barette de microtitration fournie a été préparée de la façon suivante :
- Dépôt de 200 µL par puits d'avidine (extravidine) à 10 µg.mL-1 (en PBS)
- Incubation 72 heures à 4°C.
- Dépôt de 200 µL par puits de sérum albumine bovine à 3% (en PBS)
- Incubation 2 heures à 37°C.
Manipulation
Procéder selon le protocole ci-dessous, en respectant l'ordre suivant pour les différents puits.
1
puits
A1
B1
C1
D1
E1
F1
G1
E1
amplifiat ou
tampon
TBS
TBS
TBS
bleu : coli
blanc : sans
vert : SE4
jaune : SE2
rouge : SE0
2
conjugué ou
tampon
TBS
TBS
anti-DIG-AP
anti-DIG-AP
anti-DIG-AP
anti-DIG-AP
anti-DIG-AP
anti-DIG-AP
3
substrat
Tris 9,5
pNPP
pNPP
pNPP
pNPP
pNPP
pNPP
pNPP
Chaque amplifiat est détecté selon le mode opératoire suivant :
- Vider les puits.
- Laver une fois en PBS-Tween et trois fois en PBS.
- Déposer 40 µL d'amplifiat + 60 µL de TBS ou 100 µL de TBS (cf tableau) ; couvrir.
- Incuber 30 minutes à 37°C.
- Vider les puits.
- Laver deux fois en TBS-Tween et quatre fois en TBS.
- Déposer 100 µL d'anti-DIG-AP ou 100 µL de TBS (cf tableau) ; couvrir.
- Incuber 30 minutes à 37°C.
- Vider les puits.
- Laver deux fois en TBS-Tween et quatre fois en TBS.
- Déposer 100 µL de mélange volume à volume de PNPP /Tris pH 9,5 ; couvrir.
- Incuber 20 minutes à 37°C.
- Déposer 50 µL de NaOH 2 mol.L-1 (mélanger par aspiration-refoulement).
- Lire à 405 nm en lecteur de microplaque.
Pour les lavages, remplir les puits d’environ 200 µL à l'aide d’une pipette ou d’un comptegouttes.
Pour les incubations, recouvrir les puits à l'aide de parafilm.
Réactifs
- un module de 16 puits à fond rond sur un support pour microplaque ; les 8 puits de la colonne marquée ont subi
le prétraitement indiqué précédemment.
- anti-DIG_AP : 1 mL en microtube (0,75 unités par mL)
- Tris 9,5 : 500 µL en microtube
(Tris-HCl pH 9,5 100 mmol.L-1 + NaCl 100 mmol.L-1 + MgCl2 50 mmol.L-1)
- pNPP : 500 µL en microtube (à 2 mg.mL-1 en H2O)
- NaOH 2 mol.L-1 : 500 µL en microtube
- PBS : un flacon de 20 mL
(Tp phosphate pH 7,4 10 mmol.L-1 + NaCl 150 mmol.L-1)
- PBS-Tween : un flacon de 20 mL
(PBS + Tween 20 à 0.05%)
- TBS : un flacon de 30 mL
(Tris-HCl pH 7,5 50 mmol.L-1 + NaCl 150 mmol.L-1)
- TBS-Tween : un flacon de 20 mL
(TBS + Tween 20 à 0,05%)
Compte-rendu
1- Fournir la feuille de résultats bruts des absorbances à 405 nm.
2- Exploiter les résultats et les présenter sous forme d'un tableau.
3- Discuter les résultats obtenus.
4- Quelle(s) hypothèse(s) peut-on formuler quant au résultat obtenu pour E.coli ?
5- Quels peuvent être les avantages et les inconvénients de la révélation par méthode ELISA
par rapport à la mise en évidence classique d'un amplicon par électrophorèse en gel
d'agarose ?
6- Un autre protocole de détection PCR-ELISA met en jeu les étapes suivantes :
- Amplification à l’aide d’amorces non marquées en présence d'un mélange des 4 dNTPs dont
l'un est marqué par la digoxigénine.
- Sensibilisation des puits par l'extravidine.
- Fixation d'une sonde de capture marquée à la biotine.
- Dépôt de l'amplifiat dénaturé.
- Ajout d'anticorps anti-digoxigénine.
- Ajout de substrat chromogène.
Faire un schéma du principe de cet autre protocole.
•
• Présenter les avantages de ce protocole par rapport à celui mis en œuvre lors de la
manipulation.
Conclusion
Au vu de l’ensemble des résultats, proposer sous forme d’un organigramme les différentes
étapes de la recherche de Salmonella dans un produit alimentaire permettant de vérifier dans
un délai de réponse minimum l’absence de Salmonella dans 25 grammes de produit.
Préciser ce délai.
Bibliographie
- Brevet Européen EP0721989A1 : Oligonucléotides pour la détection des Salmonella, 17-07-1996, Institut
Pasteur-Inserm, Popoff ...
- A PCR Enzyme Immuno-assay of Detection of Salmonella Typhi, M.C.Luk, Biotechniques, Vol.17, n°6, 1994.
- New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp from Proteus and over enteric bacteria ,
Applied and Environnemental Microbiology, Rambach., Janvier 1990.
ANNEXE 3
Calcul des limites de l’intervalle de confiance
Pour déterminer la concentration bactérienne dans la suspension initiale, il faut effectuer le
calcul de la moyenne pondérée donnée par la formule :
Ce calcul est effectué pour un dénombrement en milieu solide.
L’intervalle de confiance caractérise la dispersion microbienne. Ses limites sont établies[1]
pour un protocole prenant en compte deux dilutions décimales successives pour lesquelles les
boîtes contiennent un nombre de colonies compris entre 15 et 300.
Avec une probabilité de 95%, on peut connaître ces limites à l’aide de l’équation suivante :
et
∆δ = δ2 - δ1
: somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues,
B = V (n1+0,1n2),
n1: nombre de boîtes retenues à la première dilution,
n2 : nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution,
V : volume d’inoculum déposé sur chaque boîte (mL),
d : première dilution retenue.
FEUILLE DE RESULTATS
Phase de latence de l'étape de préenrichissement
temps
(minutes)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
dilution
N1(colonies)
N2(colonies)
N(UFC.mL-1)
∆δ(
∆δ UFC.mL-1)
∆δ/N(%)
∆δ
1
1
1
1
1
1
1
1
1
90
1
[1] d’après AFNOR 1996
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Ministère de l'éducation nationale, Ministère de la recherche
10-1