document 10
publicité
2006-2007 Enseignement de M1 « Physiologie des épitheliums » Bases structurales, Modèles animaux et physiologie Robert DUCROC Inserm Unité 773 Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon • Importance des mouvements d’électrolytes dans l’activité fonctionnelle des cellules épithéliales digestives • Méthode de la chambre de Ussing • Application à un problème d’endocrinologie digestive : le contrôle du transport intestinal de glucose Estomac: sécrétion acide Mucus, FI, pepsinogène Duodénum: sécrétion de bicarbonate et mucus Jéjunum: absorption des sucres Iléon : absorptions des acides aminés eau, électrolytes Côlon : Sécrétion de mucus Carbohydrates : butyrate, propionate..) Segmentation intestinale et fonctions selon l’axe proximo-distal Duodénum Jéjunum (25 cm) Iléon ( 200 cm) Sécrétion bicarbonate Sucres (300 cm) Cecum Fe, Ca rongeurs Aminoacides fermentation Sphyncter pylorique Canal pancréatique Canalicule biliaire Côlon (180 cm) Equilibre Hydro minéral bactéries rectum Plaques de Peyer Goblet cells Hauteur des villosités Ph acide, peu de bactéries Ph alkalin, flore ++ Organisation des tuniques Structure polarisée (cf épithélium) Repliement : augmentation de la surface d’échange Cellules Caco2 Différenciation de l’intestin selon un axe crypto-villositaire Mort cellulaire,desquamation Types cellulaires Matures : Cellules absorbantes Cellules entéro-endocrine Cellules en gobelet cellules M Compartiment d’amplification Cellules souches Cellules de Paneth villosité Migration et différenciation crypte Facteurs impliqués dans la différenciation des cellules intestinales Cellule souche Notch Wnt (c-myc) Cellule progénitrice entérocyte HNF1 Cdx2 GATA4 HNF4 Cellule épithéliale absorptive mature HES1 Math1 Cellule de Paneth Cellule sécrétoire Klf4 Elf4 Cellule en gobelet NGN3 Cellule entéroendocrine BETA2 PAX4, PAX6 Pdx1 12 phénotypes distincts : G, I, K… Transports ioniques dans les entérocytes < gradient électrochimique << Absorption de Na+ Sécrétion de Chlore ENAc Na+ H+ Na+ Na+ NHE2, NHE3 glucose K+ ~ Na+ Na K ATPase H+ Amino acides sang K+ CFTR Cl lumière Transports ioniques dans une cellule intestinale < gradient électrochimique << Cellule « au repos » Cellule « absorbante » pH H2O CO2 Na+ K+ ~ Na K ATPase Na+ ClK+ H+ Na+ NHE2, NHE3 AC carbohydrates Na+ H+ Amino acides H+ Na K 2Cl Di-peptides K+ sang lumière mouvements ioniques dans les cellules épitheliales intestinales DIDS di-isothiocyanostilbene-disulfonic acid Bumétamide Na+ K+ ~ carbohydrates Na+ AC HCO3Cl- Na K ATPase DIDS Échangeur Cl/Bicarbonate Cl- Na K 2Cl K+ sang H+ NHE2 H2O CO2 Na+ ClK+ amiloride Na+ Na+ ouabaine ENAc Cl- HCO3 Na+ DPC CFTR Diphenylamineacrboxylate CaCl Cllumière Solute Carrier Family , From HUGO The Human Genome Organization (HUGO) Nomenclature Committee Database includes more than 40 transporter families of the so-called SLC (solute carrier) gene ... SLC1: The high affinity glutamate and neutral AA transporter family SLC2: The facilitative GLUT transporter family SLC3: The heavy subunits of the heteromeric amino acid transporters 7 14 2 SLC22: The organic cation/anion/zwitterion transporter family 18 SLC23: The Na+-dependent ascorbic acid transporter family 4 SLC24: The Na+/(Ca2+-K+) exchanger family 5 SLC4: The bicarbonate transporter family 10 SLC25: The mitochondrial carrier family 29 SLC5: The sodium glucose cotransporter family 11 SLC26: The multifunctional anion exchanger family 11 SLC6: The sodium- chloride- dependent neurotransmitter transporter family 16 SLC27: The fatty acid transport protein family 6 SLC7: The cationic amino acid transporter/glycoprotein-associated family 13 SLC28: The Na+-coupled nucleoside transport family 3 SLC8: The Na+/Ca2+ exchanger family 3 SLC29: The facilitative nucleoside transporter family 4 SLC9: The Na+/H+ exchanger family 9 SLC30: The zinc efflux family 9 SLC10: The sodium bile salt cotransport family 5 SLC31: The copper transporter family 2 SLC11: The proton coupled metal ion transporter family 2 SLC32: The vesicular inhibitory amino acid transporter family 1 SLC12: The electroneutral cation-Cl cotransporter family 9 SLC33: The Acety-CoA transporter family 1 SLC13: The human Na+-sulfate/carboxylate cotransporter family 5 SLC34: The type II Na+-phosphate cotransporter family 3 SLC14: The urea transporter family 2 SLC35: The nucleoside-sugar transporter family SLC15: The proton oligopeptide cotransporter family 4 SLC36: The proton-coupled amino acid transporter family 4 14 SLC37: The sugar-phosphate/phosphate exchanger family 4 6 SLC16: The monocarboxylate transporter family 23 SLC17: The vesicular glutamate transporter family 8 SLC38: The System A & N, Na+-coupled neutral amino acid transporter family SLC18: The vesicular amine transporter family 3 SLC39: The metal ion transporter family SLC19: The folate/thiamine transporter family 3 SLC40: The basolateral iron transporter family 1 SLC20: The type III Na+-phosphate cotransporter family 2 SLC41: The MgtE-like magnesium transporter family 3 SLC42: The Rh ammonium transporter family (pending) 3 SLC43: Na+-independent, system-L like amino acid transporter family 3 SLC21/SLCO: The organic anion transporting family 20 14 Total Hediger MA, Romero MF, Peng JB, Rolfs A, Takanaga H, Bruford EA. Pflugers Arch. 447(5) : 465-8, 2004; 319 Low glucose SGLT1 : sodium glucose transporter 1 apical membrane 3 Na+ ATP 2 K+ basolateral membrane Na+/K+-ATPase K+channel Glut2 High glucose Glut2 SGLT1 apical membrane 3 Na+ ATP 2 K+ basolateral membrane Na+/K+-ATPase K+channel Glut2 ( fructose ) Low glucose Glut5 SGLT1 apical membrane 3 Na+ ATP 2 K+ basolateral membrane Na+/K+-ATPase K+channel Glut2 le gradient de sodium généré par l’ATPase Na+,K+ constitue un moteur pour l’activité de plusieurs transporteurs : - Transport Na-dépendant d’hexose (glucose, galactose..) jéjunum -Transport Na+-dépendant d’acides aminés (glutamine, alanine..) Ileum -Transport Na+-dépendant d’acides gras à chaînes courtes (butyrate, lactate.. Côlon Ces transports ont lieu dans des segments différents du tube digestifs Ils peuvent être étudié sur le tissu isolé en suivant les mouvements de sodium Importance des mouvements ioniques à travers l’épithélium intestinal : - les pompes constituent des moteurs pour l’entrée des nutriments -les mouvements d’eau sont indispensables aux fonctions d’échanges (dilutions des enzymes, pH..) de défense (sécrétion de chlore, rinçage de la lumière.), de transit du bol alimentaire.. Transport intestinal des sucres fructose, glucose, galactose.. Fructose fructose Glut2 Glut 5 Fructose glucose Glucose Glucose ATP ase sang Na+ K+ SGLT1 Na+ Lumière intestinale Etudes des mouvements ioniques à travers le tissus isolé Méthode de la chambre de Ussing La chambre de Ussing un outil classique de la physiologie… - Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradient électrochimique) Principe = pas de forces s’exerçant sur le mouvement des ions (gradient de concentration, pH, gradient de pression, de température.. Donc seul l’activité des transporteurs est en cause = transport actif - Permet la mesure qualitative et quantitative des mouvements ioniques Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 23: 110, 1951 Schultz SG and Zalusky R. Ion transport in isolated rabbit ileum. I. : Short circuit current and Na fluxes. J Gen Physiol 47: 567, 1964 La chambre de Ussing … un outil classique de la physiologie… -Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradient électrochimique) : - Mesures qualitative et quantitative des mouvements ioniques - Accès aux faces séreuse et muqueuse de l’épithélium (application pharmacologiques..) - Application aux tissus, biopsies, cellules en culture sur filtre … Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 23: 110, 1951 Chambre de Ussing séreux muqueux Intestin, biopsie.. O mV Isc ddp (mV) Mélange gazeux (carbogène) Tissu Système thermostatée Chambre 1 Chambre 2 Electrode « potentiel » I2 V2 I1 V1 Electrode « courant » Boitier « relai » avec le millivoltmètre et le microampéremètre Oxygénation Un poste complet de mesure des courants de court-circuit.. Interface avec microordinateur Bain-marie Micro-voltmètre et Micro-ampèremètre réunis dans un Voltage Clamp automatique Microordinateur Oxygène, 95% CO2, 5% Chambres de Ussing Low glucose SGLT1 : sodium glucose transporter 1 apical membrane 3 Na+ ATP 2 K+ basolateral membrane Na+/K+-ATPase K+channel Glut2 Etude de la régulation du transport actif de glucose 60 Isc (μA) 50 ± treatment ± peptide 40 30 Carbachol, 100 µM 20 Glucose, 10 mM 40 45 50 55 60 time (min) 65 Application à l’étude de la régulation de l’absorption de glucose par des peptides La leptine luminale inhibe l’absorption active de glucose dans l’intestin Equipe de Physiologie Digestive Inserm U. 773 Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon, CRB3 Faculté de Médecine Xavier Bichat, Paris Leptine : Une protéine non glycosylée de 16KDa Produite par l’adipocyte, secrétée dans la circulation, libérée tardivement après le repas Cible principale : l’hypothalamus Fonction : contrôle de la masse adipeuse L’estomac est également une source de leptine…. Leptine adipocytaire vs. leptine digestive Leptine digestive : Cellules gastriques, sécrétée dans la lumière digestive, augmente rapidement après le repas Ob-R Leptine digestive J Clin Invest 2001 Leptine digestive Leptine ? Ob-R ? Pool intracellulaire de SGLT1 ATP ase Na+ K+ ? SGLT1 Glut2 sang Glucose Na+ Glucose lumière Chambre de Ussing leptine leptine Isc séreux muqueux ~ Na+ Glucose 2 Δ Isc (μA/cm ) modulation du transport de glucose Na+-dependant + GLP-2 75 50 25 0 * + CCK-8 * + leptine (mucosal) * La leptine inhibe le transport d’un sucre non métabolisé, le methyl D glucopyranoside Methyl D Gluc Δ Isc (μA/cm ) 2 35 30 25 20 15 10 5 0 Leptin (10 nM) + Methyl D Gluc Quelles sont les caractéristiques de cette inhibition par la leptine luminale ? Inhibition du transport actif de glucose dépendant de la concentration glucose-induced Isc (%) 100 80 60 40 IC50 : 0.13 nM 20 0 -11 -10 -9 -8 -7 leptin [- log M] 40 2 Glucose induced Isc (Δ, μA/cm ) La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose concentration différentes de glucose 35 30 25 20 15 10 5 0 1 10 50 Glucose (mmol/L) 2 Δ Isc (μA/cm ) La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose action directe, récepteurs fonctionnels 25 20 15 * 10 5 0 Fat (fa/fa) Lean (Fa/fa) Zucker rats Quel est le mécanisme de l’inhibition de l’absorption de glucose par la leptine luminale ? Leptine digestive ? ?? ? Ob-R Pool intracellulaire de SGLT1 ATP ase Na+ K+ Na+ SGLT1 Glut2 sang Glucose Glucose lumière La leptine luminale réduit l’abondance de SGLT-1 dans la bordure en brosse Protéines de la bordure en brosse Protéines totales SGLT-1 75 kd β-actin 45 kd 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 CTRL glucose Leptine + glucose CTRL glucose Leptine + glucose Δ Isc (μA/cm 2 ) La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose implication de la PKC 50 Inhibiteur isoformes classiques Inhibiteur isoformes ‘nouvelles’ Gö6976 Rottlenin 25 * * * 0 CTRL leptine CTRL leptine En résumé, La leptine digestive contrôle le transport actif de glucose dans la lumière de façon rapide, directe et physiologique La présence de récepteurs fonctionnel est requise Le mécanisme de l’inhibition vise la translocation de SGLT1 dans la bordure en brosse en impliquant une voie PKC dépendante (βII ?) Quel est l’effet de la leptine administrée du côté séreux ? Effet de la leptine après 2 minutes Δ Isc (μA/cm 2 ) serosal 35 30 25 20 15 10 5 0 mucosal Cinétique de l’inhibition du transport de glucose par la leptine muqueuse vs. séreuse Glucose-induced Isc (% of controls) 100 Leptine séreuse 75 50 Leptine muqueuse 25 0 0 2 5 10 15 20 min la CCK est sécrétée par les cellules endocrines I duodéno-jéjunales en réponse à la leptine (Guilmeau et al Diabetes 2003) Question : cet effet du coté séreux est-il dépendant de la CCK ? Leptine (Sx) glucose Récepteur leptine Cellule épitheliale intestinale Récepteur CCK lumière ?? Cellule endocrine type I ?? Antagonistes récepteurs CCK Type 1 ou type 2 ?? Récepteur leptine Adipocyte Leptine (Sx) Δ Isc (μA/cm 2 ) antagonistes des récepteurs CCK-2 50 antagoniste des récepteurs CCK-1 25 0 Leptine YM 022 L 365 260 L 364 718 - + - + + + - + - - - - + - + glucose Leptine (Sx) Récepteur leptine lumière Cellule épitheliale intestinale Récepteur CCK Cellule endocrine (I) Récepteur leptine Leptine (Sx) L’effet ‘séreux’ de la leptine sur le transport de glucose apparaît indirect, médié par le récepteur CCK-2 Ceci suggère une implication de la CCK dans l’inhibition induite par la leptine. Cette action pourrait prolonger l’effet inhibiteur direct de la leptine… Conclusion, la leptine digestive joue un rôle majeur, à la fois direct et indirect, dans le contrôle de l’absorption intestinale de glucose Cette fonction nouvelle de la leptine digestive doit être considérée dans le contexte : - de l’activité de signalisation de SGLT-1 (PKC, regulatory protein RS1) - de la sécrétion de leptine par l’adipocyte - du rôle important de l’intestin dans l’homéostasie du métabolisme énergétique lumière Cellule épitheliale intestinale Récepteur 1 Cellule endocrine (I, L, ..) Neurones entériques (CCK.. CCK Leptin etc insulin GLP-2 etc
