Chez Eimeria, deux sérine/thréonine kinases fonctionnelles sont prédites. Par RT-PCR, nous avons
vérifié qu’elles étaient spécifiquement transcrites chez le sporozoïte. L’objectif du projet est d’étudier
leur fonction (identifier leur cible, parasitaire ou cellulaire) et d’identifier d’autres protéines de
rhoptries propres au sporozoïte.
3. Plan de thèse
Le projet repose sur deux approches menées en parallèle :
1 - la recherche des protéines de rhoptries sera mise en œuvre à l’aide d’anticorps monoclonaux,
2 - d’autre part, une approche gène candidat sera développée. L’étude fonctionnelle des deux ROP
kinases sera entreprise (localisation, identification protéines partenaires, fonction des kinases).
4. Méthodes et techniques mises en œuvre
1. Afin d’identifier de façon plus exhaustive les protéines contenues dans les rhoptries, leur
purification à partir des sporozoïtes sera entreprise par fractionnement cellulaire à l’aide du
protocole publié (Kawazoe et al., 1992). Puis la production d’anticorps monoclonaux sera mise en
œuvre. Les surnageants de culture des hybridomes seront criblés sur sporozoïtes extra cellulaires
pour confirmer le marquage des rhoptries. Les surnageants seront aussi testés sur cellules MDBK
infectées par E. tenella, pour déterminer le devenir de la protéine au cours du développement intra
cellulaire. Les surnageants donnant les profils les plus intéressants seront caractérisés plus en détail.
2. L’étude des ROP kinases prédites pour être fonctionnelles suivra les étapes suivantes : des
anticorps polyclonaux seront produits contre ces sérine/thréonine kinases, afin de les localiser au
cours des étapes précoces d’invasion cellulaire par immunofluorescence. L’adressage des kinases au
noyau de la cellule ou à la membrane parasitophore sera évalué en système hétérologue (infection par
T. gondii de cellule eucaryote exprimant la protéine de rhoptrie). La fonction des kinases sera étudiée
en comparant le profil de phosphorylation des protéines cellulaires des cellules hôtes, transfectées
avec un vecteur d’expression codant la kinase fonctionnelle ou bien la forme mutée en son site
catalytique. Afin de déterminer si des protéines parasitaires sont phosphorylées par ces kinases,
chaque kinase recombinante sera incubée avec des extraits bruts parasitaires. Afin d’isoler les
protéines cibles des kinases, une approche de co-immunoprécipitation sera réalisée. Cette approche
a permis d’identifier avec succès la protéine cible de ROP16 et ROP18 (El Hajj et al., 2007; Ong et
al., 2010). Les approches de complémentation fonctionnelle en système hétérologue seront
entreprises en collaboration avec l’équipe de M. Lebrun (CNRS, Montpellier), pour son expertise
sur les rhoptries de T. gondii.
Les rhoptries renferment des protéines impliquées dans les mécanismes d’invasion cellulaire et
constituent de remarquables cibles thérapeutiques ou vaccinales. Plusieurs inhibiteurs de protéines
kinases ont une activité anti-parasitique sélective, contre les kinases des protozoaires. Ceci en fait des
candidats prometteurs dans le développement de molécules antiparasitaires (Johnson et al., 2012). Ce
projet de recherche permettra de mieux comprendre la biologie d’E. tenella, et les spécificités
cellulaires de protéines parasitaires propres au sporozoïte, le premier stade infectant d’Eimeria.
Références :
- Butcher, B.A., Fox, B.A., Rommereim, L.M., Kim, S.G., Maurer, K.J., Yarovinsky, F., Herbert, D.R., Bzik,
D.J., Denkers, E.Y., 2011. Plos Pathogens 7.
- El Hajj, H., Lebrun, M., Arold, S.T., Vial, H., Labesse, G., Dubremetz, J.F., 2007. Plos Pathogens 3, 200-211.
- Johnson, S.M., Murphy, R.C., Geiger, J.A., DeRocher, A.E., Zhang, Z.S., Ojo, K.K., Larson, E.T., Perera,
B.G.K., Dale, E.J., He, P.Q., Reid, M.C., Fox, A.M.W., Mueller, N.R., Merritt, E.A., Fan, E.K., Parsons, M.,
Van Voorhis, W.C., Maly, D.J., 2012. Journal of Medicinal Chemistry 55, 2416-2426.
- Kawazoe, U., Tomley, F.M., Frazier, J.A., 1992. Parasitology 104, 1-9.
- Ong, Y.C., Reese, M.L., Boothroyd, J.C., 2010. Journal of Biological Chemistry 285, 28731-28740.
- Steinfeldt, T., Konen-Waisman, S., Tong, L., Pawlowski, N., Lamkemeyer, T., Sibley, L.D., Hunn, J.P.,
Howard, J.C., 2010. Plos Biology 8.