Demande d`allocation – ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie

Demande d’allocation – ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV)
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : SILVESTRE Anne
Nom du co-encadrant :
Unité : INRA n°1282 Infectiologie Animale et Santé Publique (ISP)
Equipe : Pathogenèse des Coccidioses (PaCo)
Email de l’encadrant : [email protected]
2. Titre de la thèse : Etude de facteurs de virulence à domaine kinase chez Eimeria
3. Résumé :
1. Contexte scientifique
Les coccidies (Toxoplasma, Eimeria) sont des parasites Apicomplexes, intracellulaires obligatoires.
Eimeria tenella, agent de la coccidiose caecale aviaire, envahit les cellules épithéliales digestives. Le
sporozoïte, premier stade infectant, comporte diverses organelles au pôle apical (complexe
apical), propres aux parasites Apicomplexes : les micronèmes et les rhoptries, qui sont sécrétées de
façon séquentielle au cours de l’infection. Les protéines des micronèmes sont impliquées dans
l’adhésion cellulaire, les protéines des rhoptries (ROP) sont impliquées dans le dialogue
moléculaire entre le parasite et la cellule hôte. Les facteurs parasitaires impliqués dans ces étapes ne
sont pas encore connus chez Eimeria, et l’essentiel des connaissances ont été acquises avec le modèle
Toxoplasma gondii. Une fois sécrétées dans la vacuole parasitophore, certaines ROP sont adressées au
noyau de la cellule où elles vont modifier le profil d’expression de gènes cellulaires, d’autres ROP
sont associées à la membrane de la vacuole parasitophore. Certaines ROP ont des domaines kinases,
et peuvent s’auto-phosphoryler, ou bien phosphoryler des protéines du parasite ou de la cellule hôte.
ROP16 et ROP18 sont deux protéines kinases actives, qui constituent des facteurs de virulence
majeurs de T. gondii : ROP16 est adressée au noyau de la cellule et phosphoryle les facteurs de
transcription STAT3 et STAT6, qui régulent négativement la réponse inflammatoire (Butcher et al.,
2011; Ong et al., 2010), ROP18 est localisée à la membrane de la vacuole parasitophore et inactive des
interferon-inducible IRG (immunity related GTPase) permettant au parasite de se développer dans la
cellule hôte (Steinfeldt et al., 2010).
La comparaison des génomes des Apicomplexes ne permet pas d’identifier des gènes orthologues aux
ROP dans toutes les espèces (Bradley et al., 2005), ce qui suggère des rôles spécifiquement liés au
cycle de vie du parasite ainsi qu’aux types des cellules infectées.
2. Données préliminaires
Le génome d’E. tenella, espèce aviaire la plus pathogène, est disponible (ToxoDB.org). Très
récemment, la protéomique des rhoptries des sporozoïtes d’Eimeria a été obtenue (Fiona Tomley,
communication personnelle) : elle se compose d’une cinquantaine de protéines au moins,
hypothétiques et sans homologie de séquence avec des protéines connues.
Chez Eimeria, deux sérine/thréonine kinases fonctionnelles sont prédites. Par RT-PCR, nous avons
vérifié qu’elles étaient spécifiquement transcrites chez le sporozoïte. L’objectif du projet est d’étudier
leur fonction (identifier leur cible, parasitaire ou cellulaire) et d’identifier d’autres protéines de
rhoptries propres au sporozoïte.
3. Plan de thèse
Le projet repose sur deux approches menées en parallèle :
1 - la recherche des protéines de rhoptries sera mise en œuvre à l’aide d’anticorps monoclonaux,
2 - d’autre part, une approche gène candidat sera développée. L’étude fonctionnelle des deux ROP
kinases sera entreprise (localisation, identification protéines partenaires, fonction des kinases).
4. Méthodes et techniques mises en œuvre
1. Afin d’identifier de façon plus exhaustive les protéines contenues dans les rhoptries, leur
purification à partir des sporozoïtes sera entreprise par fractionnement cellulaire à l’aide du
protocole publié (Kawazoe et al., 1992). Puis la production d’anticorps monoclonaux sera mise en
œuvre. Les surnageants de culture des hybridomes seront criblés sur sporozoïtes extra cellulaires
pour confirmer le marquage des rhoptries. Les surnageants seront aussi testés sur cellules MDBK
infectées par E. tenella, pour déterminer le devenir de la protéine au cours du développement intra
cellulaire. Les surnageants donnant les profils les plus intéressants seront caractérisés plus en détail.
2. L’étude des ROP kinases prédites pour être fonctionnelles suivra les étapes suivantes : des
anticorps polyclonaux seront produits contre ces sérine/thréonine kinases, afin de les localiser au
cours des étapes précoces d’invasion cellulaire par immunofluorescence. L’adressage des kinases au
noyau de la cellule ou à la membrane parasitophore sera évalué en système hétérologue (infection par
T. gondii de cellule eucaryote exprimant la protéine de rhoptrie). La fonction des kinases sera étudiée
en comparant le profil de phosphorylation des protéines cellulaires des cellules hôtes, transfectées
avec un vecteur d’expression codant la kinase fonctionnelle ou bien la forme mutée en son site
catalytique. Afin de déterminer si des protéines parasitaires sont phosphorylées par ces kinases,
chaque kinase recombinante sera incubée avec des extraits bruts parasitaires. Afin d’isoler les
protéines cibles des kinases, une approche de co-immunoprécipitation sera réalisée. Cette approche
a permis d’identifier avec succès la protéine cible de ROP16 et ROP18 (El Hajj et al., 2007; Ong et
al., 2010). Les approches de complémentation fonctionnelle en système hétérologue seront
entreprises en collaboration avec l’équipe de M. Lebrun (CNRS, Montpellier), pour son expertise
sur les rhoptries de T. gondii.
Les rhoptries renferment des protéines impliquées dans les mécanismes d’invasion cellulaire et
constituent de remarquables cibles thérapeutiques ou vaccinales. Plusieurs inhibiteurs de protéines
kinases ont une activité anti-parasitique sélective, contre les kinases des protozoaires. Ceci en fait des
candidats prometteurs dans le développement de molécules antiparasitaires (Johnson et al., 2012). Ce
projet de recherche permettra de mieux comprendre la biologie d’E. tenella, et les spécificités
cellulaires de protéines parasitaires propres au sporozoïte, le premier stade infectant d’Eimeria.
Références :
- Butcher, B.A., Fox, B.A., Rommereim, L.M., Kim, S.G., Maurer, K.J., Yarovinsky, F., Herbert, D.R., Bzik,
D.J., Denkers, E.Y., 2011. Plos Pathogens 7.
- El Hajj, H., Lebrun, M., Arold, S.T., Vial, H., Labesse, G., Dubremetz, J.F., 2007. Plos Pathogens 3, 200-211.
- Johnson, S.M., Murphy, R.C., Geiger, J.A., DeRocher, A.E., Zhang, Z.S., Ojo, K.K., Larson, E.T., Perera,
B.G.K., Dale, E.J., He, P.Q., Reid, M.C., Fox, A.M.W., Mueller, N.R., Merritt, E.A., Fan, E.K., Parsons, M.,
Van Voorhis, W.C., Maly, D.J., 2012. Journal of Medicinal Chemistry 55, 2416-2426.
- Kawazoe, U., Tomley, F.M., Frazier, J.A., 1992. Parasitology 104, 1-9.
- Ong, Y.C., Reese, M.L., Boothroyd, J.C., 2010. Journal of Biological Chemistry 285, 28731-28740.
- Steinfeldt, T., Konen-Waisman, S., Tong, L., Pawlowski, N., Lamkemeyer, T., Sibley, L.D., Hunn, J.P.,
Howard, J.C., 2010. Plos Biology 8.