Chapitre3 Clonage et expression hétérologue

Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf
Chapitre3
Clonage et expression hétérologue
Vecteurs et cellules hôtes
-Eléments dans la construction d’un ADN recombinant
-ADN à cloner = « insert »
N’importe quel fragment d’ADN db peut être cloné et amplifié dans un système
bactérien : ADNc, fragment ADN génomique, produits de PCR, fragment de restriction…
En fonction de la taille du fragment, la technique de clonage choisie et du but
recherchée on définira le vecteur et la cellule hôte.
•Vecteurs
Il existe plusieurs méthodes pour faire entrer un fragment d’ADN dans une cellule :
entré par l’intermédiaire d’un plasmide, d’un phage ou d’un virus, entrée d’ADN nu.
Quel est le devenir de cet ADN ?
Il peut être reconnu par la machinerie cellulaire s’il porte des signaux de
reconnaissances.
Si signaux réplications -- réplication
Si signaux transcription/ traduction -> traduction transcription
1 les cellules hôtes utilisées en génie génétique
-procaryote : E coli (DHSα, BL21,…)
-eucaryote : levure : Saccharomyces, pichia pastoris
cellule d’insecte sf9
cellule CHO : chinese hamster ovarian cells
HEK 293 : human embryonic kidney cells
Œuf fécondé
Cellule souche embryonnaire ES
Pour le clonage : E Coli
Pour l’expression : l’un ou l’autre des types cellulaires en fonction de la protéine et de
l’utilisation de la protéine.
Remarque : certaines protéines sont produites à partir d’animaux transgéniques : lait de vache,
chèvre
Avantage et inconvénient des différents types cellulaire : Cf chap V

Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf
2 Vecteurs
2.1 Rôles
→Permettent de flanquer l’ADN de séquence de signalisation qui seront reconnue par les
facteurs cellulaires.
Si l’on souhaite recopier (multiplier) l’ADN→ vecteur de clonage
Si l’on souhaite produire une protéine→ vecteur d’expression
Si les signaux sont reconnus par la machinerie procaryote → vecteur procaryote
Si les signaux sont reconnus par la machinerie eucaryote → vecteur eucaryote
2.2 Les vecteurs procaryotes
2.2.1 Généralités et quelques exemples de vecteurs
Les premiers vecteurs utilisés étaient des phages puis des plasmides
Vecteurs couramment utilisés : plasmide, phage, cosmide (hybride phage/plasmide), BACS
(bacterial artificial chromosomes)
2.2.2 Caractéristiques essentielles pour le clonage et l’expression
-origine de réplication
-site de coupure par les enzymes de restriction
-repérage facile des bactéries transformées
Souvent présence de marqueurs conférant un phénotype nouveau à la bactérie
3 Plasmides
3.1 Généralités
Plasmide : ADN circulaire extra chromosomique.
-plasmide conjugatif permettant l’échange d’information entre bactérie : facteurs F (94Kb)
-résistance aux antibio : facteur R
-résistance aux métaux lourds : facteur R
Il existe des bases de données des plasmides présents à l’état naturel dans différentes
bactéries.
Les caractéristiques pour qu’un plasmide constitue un bon vecteur de clonage : taille, site de
restriction (varié mais unique), le nombre de copie / cellule, présence de marqueur génétique.
Les plasmides utilisé comme vecteur en génie génétique sont des hybrides.

Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf
3.2 Exemple de plasmide
3.2.1 Plasmide de clonage
3.2.1.1 Plasmide pBR 322
Boliver et rodriguez, 1979
4361 pb
Amp : inhibe la synthèse de la paroi bactérienne
Amp R : synthèse d’une enzyme hydrolysant le cycle bêta lactame qui dégrade amp
Tet : liaison a la sous unités 30s
Tet R : empêche entrée de l’antibiotique
Carte restriction :
-site unique : ECO RI et BAM H1
-origine pMB9 : présence de rop
AmpRtetR
pMB9
colE1

Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf
Contrôle de la réplication à partir des origines Col E1 / pMB9 :
•Réplication unidirectionelle à partir de Ori V
•Synthèse RNA II ( qui peut servir d’amorce) et RNA I ( qui régule la structure de
RNA II)
Le complexe d’ARN II / ARN I est défavorable à l’initiation de la réplication.
L’interaction entre ARN II et ARN I stabilise par protéine rop donc défavorable à la
réplication
La mutation de rop baisse la stabilité, et donc il y aura une augmentation du nombre de copie
Groupe d’incompatibilité : 2 plasmides ayant la même origine de réplication
appartiennent aux même groupes d’incompatibilité et ne peuvent pas co-exister
simultanément dans la même cellule hôte. Ex : pMB8 et col E1
Utilisation de pBR 322 pour le clonage :
3.2.1.2 Vecteur puc
Il contient tous les éléments pour l’expression d’une protéine mais ce n’est pas un vecteur
d’expression typique.
tet
Eco Ri
BamH1
Amp
tet +
PBR 322 PBR 322 hybrid
DNA insert
Cells will survive
in ampicillin
and tetracyclin
Cells will survive
in ampicillin but
not tetracyc lin
Cells w ill not
survive in
am picillin
or tetracyclin

Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf
•Propriété de la β galactosidase
On appelle cela : α-complémentation
•Mise en évidence de l’activité béta galactosidase
Substrat chromogène γ gal (incolore) : 5 bromo 5 chloro 3 indonyl αβ galactosidase.
Réaction : γ gal en présence de β gal donne un produit bleu, donc on peut conclure à la
présence d’activité β gal.
-site de clonage multiple ds PUC : polylinker, polycloning site.
Plasmide puc :
-marqueur de selection : amp R
-origine de réplication modifiée
-nombreux sites unique de restriction
On réalise une sélection bleu blanc pour les recombinants
L’utilisation de PUC : vecteur de clonage facilitant grandement la sélection des vrais
recombinants.
N-term C-term
active
active
inactive inactive
Codé par les lac Z
(plasmide puc)
Codé par lac Z
(génome cellule hôte
β galactosidase
N-term β -gal C-term β gal