J. Solassol Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique. Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - Montpellier Jérôme Solassol Résumé Les développements récents dans la séparation des protéines, l’analyse des modifications post-traductionnelles et la protéomique à haut débit et des protéines arrays marquent le début de l’ère post-génomique. L’avènement récent de nouveaux outils de protéomique, faisant appel à des techniques de biopuces à protéines, a totalement modifié les perspectives dans ce domaine et a permis l’émergence du concept de profil d’expression protéique, véritable signature moléculaire de la tumeur. L’approche protéomique par la technologie SELDI-TOF permet d’identifier des protéines fonctionnelles et vise, par l’analyse différentielle, à rechercher et préciser leur spécificité pour la découverte de nouveaux marqueurs tumoraux potentiellement utiles au diagnostic, au pronostic, au suivi thérapeutique et à l’appréciation prédictive de la réponse au traitement. Les limites technologiques et le défi analytique de gestion de données à grande échelle sont encore manifestes. C’est par une approche complémentaire et structurante de la génomique et de la protéomique que les progrès immédiats peuvent être attendus dans les nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques des cancers. Protéomique / Marqueurs tumoraux !Les connaissances en biologie des cancers ont considérablement évolué ces vingt dernières années. Parallèlement aux innovations technologiques, de nouvelles définitions moléculaires et fonctionnelles des tumeurs solides sont apparues aboutissant au concept de signature moléculaire des tumeurs, reflet de l’ensemble des événements moléculaires survenant lors du processus tu- moral. Ces événements résultent de l’implication directe des produits de l’activité de certains gènes, des fonctions intégrées provenant des molécules organiques synthétisées par la cellule, d’une dérégulation de l’homéostasie tumorale par des phénomènes inflammatoires et/ou des modifications d’activité enzymatique. L’oncogénèse correspond ainsi à un processus multi-étapes d’accumulation au sein des cellules, d’altérations moléculaires propres à chaque stade du développement tumoral. Dans le domaine des altérations génétiques, les puces à ADN ont permis d’analyser l’expression génique à l’échelle du génome et d’identifier un nombre très élevé d’événements moléculaires associés à la tumorigénèse. Mais ces gènes ne sont que les supports Correspondance : Jérôme Solassol Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - 191 Avenue du Doyen Giraud - 34295 Montpellier Cedex 5 - France Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 31 Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique de l’information et par définition le génome est statique alors que les protéines exprimées sont des principes actifs doués de fonctions au sein de la machinerie cellulaire. Le niveau d’expression des ARNm n’est pas forcément le reflet de la nature de l’ensemble des protéines contenues dans la cellule tumorale. La traduction des ARNm en protéines est en effet soumise à un grand nombre de régulations post-transcriptionnelles et posttraductionnelles (glycosylation, phosphorylation, acétylation…) dont le rôle est déterminant pour le pouvoir oncogénique. Ainsi, il a été démontré que des transformations entre tumeur bénigne et maligne sont parfois dues a des modifications posttraductionnelles non détectées par l’analyse des ARNm [1]. L’ensemble des protéines contenues dans la cellule tumorale est encore plus vaste et plus complexe que le génome. L’étude de leur nature, de leur dynamique et de leurs interactions (cellule tumorale vs cellule stromale) est donc essentielle pour une meilleure compréhension des mécanismes d’initiation, de progression tumorale et de dissémination métastatique. LES MÉTHODES D’ANALYSE PROTÉOMIQUE !Le protéome, terme proposé en 1995 par M.R. Wilkins, désigne l’ensemble des protéines exprimées par le génome d’une cellule, d’un tissu ou d’un organe, à un instant donné et dans un environnement donné. Son analyse permet une description dynamique de la régulation de l’expression des gènes. Elle associe l’étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles, l’identification des protéines constituant un complexe protéique (interaction protéine-protéine), la recherche et l’identification de protéines impliquées dans les voies de signalisation. L’approche protéomique est fondée sur le couplage de trois technologies de pointe : 32 - l’électrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) qui permet de séparer plusieurs milliers de protéines d’un même échantillon, - la spectrométrie de masse (MS) qui permet d’identifier ces protéines et de mettre en évidence leurs modifications post-traductionnelles, - la bioinformatique qui permet la quantification du niveau des protéines et la constitution de bases de données. Méthode classique de protéomique !La méthode classique d’électrophorèse bi-dimensionnelle associée à la spectrométrie de masse (MALDI-TOF) repose sur la séparation des protéines en fonction de deux caractéristiques biochimiques : le point isoélectrique (PI) et la masse moléculaire. La première dimension sépare les protéines contenues dans l’échantillon biologique par isoélectro-focalisation selon leur PI dans un gel à gradient de pH immobilisé large (pH 3-10) ou étroit (pH 4-7) ou étroit (pH 4-5). La deuxième dimension utilise l’électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide en présence de SDS qui sépare les protéines selon leur masse. Une fois la 2-DE réalisée, les protéines sont révèlées selon différentes méthodes de détection et les images, captées par le scanning des gels, sont traitées par des logiciels d’analyse d’image dédiés à la protéomique. Ces logiciels permettent l’acquisition des données, la diminution du bruit de fond, l’élimination des défauts sur les gels, le dénombrement des taches, leur comparaison en analyse différentielle, leur quantification par les mesures d’intensité et de volume. Les taches d’intérêt, chacune pouvant contenir une ou plusieurs protéines, sont découpées des gels et traitées individuellement selon des protocoles précis d’hydrolyse trypsique : déshydratation du gel, extraction des peptides, dessalage de l’hydrolysat peptidique déposé sur plaque spéciale et séché. L’identification des protéines se fait par spectrométrie de masse de type Médecine Nucléaire - MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation–Mass Spectrometry) ou ESI-MS (Electrospray ionisation) couplée à la chromatographie liquide (LC). La tache du mélange séché est bombardée sous vide par un laser pulsé à 337nm qui excite les molécules et ionise les peptides entraînés dans le champ électrique d’un aimant, qui accélère les ions vers un détecteur. Tous les MALDI-MS actuels permettent une acquisition automatique des données et des bombardements programmables. Ils sont équipées du mode de détection en Temps de Vol (TOF ou Time ou Flight) et du mode Réflectron, l’arrivée des peptides chargés se faisant dans le détecteur TOF dans l’ordre croissant de masse, les plus lourds étant ralentis voir éliminés, le Réflectron permettant de focaliser la distribution isotopique et d’améliorer la résolution en diminuant la dispersion isotopique. L’automatisation de toutes ces étapes, de la 2DE à l’analyse par MALDI-MS correspond à ce que l’on appelle la protéomique à haut débit menant à identifier plusieurs centaines de protéines dans un même échantillon. Deux logiciels MASCOT et PROFOUND fondés sur des algorithmes différents permettent d’interroger les principales banques de données protéiques SWISSPROT, PROTSITE et celle de la NCBI (US National Center for Biology Information) qui contiennent les traductions des séquences d’ADN de la GeneBank et les résultats de clivage par les protéases de séquences peptidiques connues. La masse des peptides générés par la trypsine est comparée aux cartes peptidiques massives théoriques déduites des séquences de chaque protéine présentes dans les banques de données. Mais la masse d’un seul peptide ne permet pas d’identifier la protéine dont il est issu. Il en faut au moins cinq identiques aux séquences trouvées dans la protéine. Le logiciel donne dans l’ordre statistique décroissant la probabilité d’identifier la protéine. Dans une tache de 2-DE, plusieurs protéines peuvent coexister et le MALDI-MS est capable de les découvrir en même temps, le logiciel triant les peptides Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 J. Solassol appartenant aux unes et aux autres. Lorsque la protéine n’est pas présente dans la banque de données, il est possible d’obtenir des informations sur la séquence en acides aminés des peptides trypsiques en mode MS/MS (double spectrométrie) à l’aide d’un spectromètre de masse de type nanoelectro-spray. Méthode de "puces" à protéines !Une nouvelle méthode est apparue appelée SELDI-TOF pour Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation - Time of Flight. Développée par Ciphergen biosystems, cette plateforme protéomique associe le principe de "puce" à la spectrométrie de masse. La séparation, la détection et l’analyse des protéines se font directement à partir de l’échantillon biologique avec une sensibilité de l’ordre de la femtomole. En pratique, quelques microgrammes de protéines issues d’échantillonf variés (liquides biologiques, extraits cellulaire ou tissulaire) sont directement adsorbés sur une surface de 2 mm2 (spot) présentant des propriétés chromatographiques variées. En fonction de la surface chromatographique, le mélange protéique subit un fractionnement qui dépend de la propriété chimique (anionique, cationique, hydrophobe, hydrophile ou d’affinité aux métaux) ou biologique (liaison à un anticorps, un peptide, un récepteur, un ligand ou un acide nucléique). Après une série d’étapes de lavage, la puce à protéine est introduite dans un spectromètre de masse. Sous l’action du rayonnement laser, les protéines liées à la "puce" sont désorbées/ionisées et analysées en terme de masse sur charge (m/z) d’après leur temps de vol pour atteindre le détecteur. Les signaux traités par des moyens informatiques sont traduits en spectre d’abondance relative vs la masse moléculaire des espèces détectées. Au final, on obtient une vue d’ensemble de peptides et de protéines présents dans l’échantillon sous la forme de profils protéiques. Ces derniers sont ensuite normalisés et calibrés afin de limiter les biais liés à l’opérateur, à la surface Médecine Nucléaire - chromatique ou à l’instrumentation elle-même. Ce système est particulièrement intéressant en analyse différentielle de type patient/témoin pour mettre en évidence des profils d’expression spécifiques. L’analyse statistique de l’ensemble de ces données est une des étapes les plus importantes de l’étude protéomique. Si l’on traite suffisamment d’échantillons en parallèle, le logiciel permettant la superposition de profils pourra établir une statistique en fonction d’une multitude d’algorithmes informatiques basés sur des analyses statistiquement multivariées (analyse discriminante, classification hiérarchique…). Ces algorithmes permettent d’analyser des données complexes et d’extraire des spectres de masse la meilleure combinaison de marqueurs capables de discriminer chacun des groupes patient/témoin. Par la suite, l’identification de marqueurs potentiels nécessite des étapes de purification supplémentaires par des méthodes électrophorétiques ou chromatographiques classiques afin de caractériser précisément des protéines d’intérêt. Cette dernière méthode d’analyse protéique par SELDI-TOF est une approche d’accès assez facile sur le plan technique et de coût acceptable. Méthode de microanalyse réalisée à partir de faibles quantités protéiques de l’ordre du microgramme, elle a une capacité d’analyse à haut débit des échantillons, elle permet l’établissement de profils d’expression protéique à partir de mélanges complexes, ce qui facilite son application clinique. Elle est toutefois encore limitée dans la taille des protéines qu’elle peut analyser. PROTÉOMIQUE ET APPLICATIONS CLINIQUES DE LA PLATEFORME SELDI-TOF !Les premiers travaux publiés par Petricoin et coll. en 2002 utilisant les puces à protéines ont consisté à analyser le sérum de malades atteints de cancer de l’ovaire et de cancer de la prostate [2, 3]. Ils rapportaient qu’un Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 profil protéique spécifique sans identification de marqueur d’intérêt était capable de diagnostiquer ce cancer au stade infra-clinique avec une spécificité de 95%, une sensibilité de 100% et une valeur prédictive positive de 94% et de différentier le cancer de la prostate de l’hyperplasie bénigne [3]. D’autres exemples pouvaient être donnés dans le cancer colo-rectal [4], le cancer du sein [58], l’hépatocarcinome [9], le mélanome [10] et le cancer du pancréas [11]. Dans le cancer de la vessie, l’analyse de protéines urinaires a permis d’améliorer le diagnostic précoce en comparaison de l’analyse cytologique standard des urines [12]. Ces premiers résultats apparemment spectaculaires et prometteurs ont été rapidement critiqués, en particulier par Diamandis, le principal défaut de la technologie SELDI résidant dans sa faible reproductibilité [13]. Plusieurs groupes de recherche utilisant les mêmes approches expérimentales et travaillant sur la même pathologie n’ont pas mis en évidence les mêmes pics permettant de discriminer le tissu normal du tissu pathologique et ont proposé des marqueurs ou des profils protéiques différents [14]. Les différences observées dans les profils protéiques entre sérum contrôle et sérum des malades porteurs de cancer n’étaient donc pas exclusivement liés au cancer. Diamandis a mis en exergue de nombreux paramètres qui affectent la reproductibilité de cette technique : la variabilité dans le recueil des échantillons, leur traitement, le type de conservation, la diversité des groupes de patients, leur statut hormonal, leurs habitudes alimentaires, l’usage de médicament, ainsi que les biais statistiques ou la variation de la stabilité des spectromètres de masse et /ou des puces à protéines [15]. De même la complexité des outils informatiques augmente la probabilité d’interprétation erronée et de résultats non reproductibles. Par ailleurs, la sensibilité de la détection n’atteint pas les concentrations inférieures à un microgramme par mL alors que les marqueurs tumoraux 33 Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique usuels sont à des concentrations beaucoup plus faibles et ne sont donc pas suffisamment détectés. De sorte que jusqu’à présent, dans les quelques cas où la caractérisation des marqueurs a été effectuée, les protéines identifiées correspondent à des protéines majoritaires du sérum. Il s’agit de l’Apolipoprotéine A, des formes tronquées de la transthyrétine, de la chaîne lourde de l’inhibiteur de l’alpha trypsine dans le cancer de l’ovaire [14], de la sous-unité alpha de l’haptoglobine dans une autre étude sur le cancer de l’ovaire [16], de l’hepatocarcinoma Intestine-Pancréas/Pancreatitis-associated ProteinI dans le cancer du pancréas [9, 17], des alpha 1 et alpha 2 défensine dans la cancer de la vessie [12] ou encore d’une protéine de liaison à la Vitamine D dans le cancer de la prostate [18]. Une des questions posée est de savoir si ces marqueurs ont leur expression altérée spécifiquement en réponse à la prolifération tumorale ou de manière non spécifique en réponse à des épiphénomènes dépendant de la tumeur. Les biomarqueurs identifi2s jusqu’ici par SELDI-TOF s’avèrent pour la plupart être des protéines majoritaires de la réponse inflammatoire produites par l’environnement peri-tumoral ou par les cellules immunitaires plutôt que par la tumeur elle-même [15, 19, 20]. Ces protéines sont néanmoins potentiellement instructives s’il est démontré qu’il s’agit de fragments protéolytiques dérivés des protéines inflammatoires de la tumeur, spécifiques de chaque tumeur en fonction de son contenu enzymatique [20]. L’observation par Liotta et coll. que certain des marqueurs identifiés par 34 SELDI-TOF sont des formes clivées de protéines sériques de plus haut poids moléculaire, fait avancer l’hypothèse que l’abondance de ces marqueurs clivés est le reflet direct d’événements pathologiques induits par le microenvironnement tumoral [21]. Des études récentes montrent que l’équilibre entre des protéases et leurs inhibiteurs cellulaires est modifié dans le sérum et le tissu des patients en réponse à la prolifération tumorale [22]. Différentes familles de protéases comme les métalloprotéases ou kallikréines plasmatiques et tissulaires ont leur expression augmentée ou diminuée dans certains cancers [23-25]. Ces modifications de l’expression auraient alors un retentissement direct sur la capacité des protéases à cliver des protéines sériques et à générer ainsi une signature moléculaire spécifique. Diamendis stipule que le rapport entre les protéines majoritaires telles que l’albumine et les immunoglobulines et les protéines minoritaires est tel qu’il est impossible en l’état actuel de détecter ces protéines minoritaires, malgré la bonne sensibilité de la technique SELDI-TOF [15]. Ainsi, le PSA qui fait partie des protéases dont l’expression est augmentée dans les cancers de la prostate [26], n’a jamais pu être identifiée par le SELDI-TOF. En fait, il existe d’autres méthodes qui permettent d’augmenter la concentration relative des protéines faiblement représentées. Elles passent par des étapes successives de pré-fractionnement, de chromatographie, de précipitation sélective et de déplétion des protéines majoritaires [27-30]. Ces techniques "d’enrichissement" des protéines peu représentées doivent, pour être efficaces, éviter l’introduction de biais supplémentaires. La dé- Médecine Nucléaire - tection de cette fraction "mineure" du sérum, véritable face cachée de l’iceberg, est un défi technologique qu’il faut relever pour assurer le développent fiable du diagnostic des formes précoces des cancers. CONCLUSION !Les nouvelles technologies d’analyse protéomique prennent leur place dans l’ère post-génomique. Les premiers résultats mettent en évidence le potentiel des analyses à large échelle en particulier pour l’identification des profils protéiques différents dont il est nécessaire d’établir le rapport avec les mécanismes physiopathologiques du processus tumoral. Les limitations technologiques et les défis analytiques sont encore élevés et des progrès importants s’imposent pour établir la complémentarité entre protéomique d’expression et protéomique d’interaction. A l’instar du programme visant à établir la Carte d’Identité des Tumeurs Humaines par l’analyse du transcriptome, l’approche complémentaire, du gène à la protéine fonctionnelle, alliant génomique et protéomique, devrait faire l’objet de programmes nationaux coordonnés entre les diverses plateformes protéomiques cancérologiques pour concrétiser dans les meilleurs délais la caractérisation des marqueurs et le développement de tests non invasifs prédictifs et diagnostiques des formes précoces de cancer les plus accessibles aux moyens thérapeutiques actuels. Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 J. Solassol Proteomic approach to tumor marker discovery A key challenge in clinical proteomic of cancer is the identification of biomarkers that would allow early detection, diagnosis and monitor progression of the disease to improve longterm survival of patients. Recent advances in proteomic instrumentation and computational methodologies offer unique chance to rapidly identify these new candidate markers or pattern of markers. The combination of retentate affinity chromatography and surfaced-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry is one of the most interesting new approaches for cancer diagnosis using proteomic profiling. This review aims to summarize the results of studies that have used this new technology method for the early diagnosis of human cancer. Despite promising results, the use of the proteomic profiling as a diagnostic tool brought some controversies and technical problems and still requires some efforts to be standardised and validated. Proteomic / Tumor biomarkers RÉFÉRENCES 1. Bertucci F, Nasser V, Houlgatte R, Birnbaum D. Gene expression profiling using cDNA arrays and prognosis of breast cancer. Bull cancer 2002;89:571-4. 2. 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