Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche

J. Solassol
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 31
Correspondance : Jérôme Solassol
Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - 191 Avenue du Doyen Giraud - 34295 Montpellier Cedex 5 - France
Identification de marqueurs tumoraux sériques
par approche protéomique.
Jérôme Solassol Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - Montpellier
Résumé
Les développements récents dans la séparation des protéines, l’analyse des modifications
post-traductionnelles et la protéomique à haut débit et des protéines arrays marquent le début de
l’ère post-génomique. L’avènement récent de nouveaux outils de protéomique, faisant appel à des
techniques de biopuces à protéines, a totalement modifié les perspectives dans ce domaine et a
permis l’émergence du concept de profil d’expression protéique, véritable signature moléculaire
de la tumeur. L’approche protéomique par la technologie SELDI-TOF permet d’identifier des
protéines fonctionnelles et vise, par l’analyse différentielle, à rechercher et préciser leur spécificité
pour la découverte de nouveaux marqueurs tumoraux potentiellement utiles au diagnostic, au
pronostic, au suivi thérapeutique et à l’appréciation prédictive de la réponse au traitement. Les
limites technologiques et le défi analytique de gestion de données à grande échelle sont encore
manifestes. C’est par une approche complémentaire et structurante de la génomique et de la
protéomique que les progrès immédiats peuvent être attendus dans les nouvelles approches dia-
gnostiques et thérapeutiques des cancers.
Protéomique / Marqueurs tumoraux
!Les connaissances en biologie des
cancers ont considérablement évolué
ces vingt dernières années. Parallèle-
ment aux innovations technologi-
ques, de nouvelles définitions molé-
culaires et fonctionnelles des tu-
meurs solides sont apparues aboutis-
sant au concept de signature molé-
culaire des tumeurs, reflet de l’en-
semble des événements moléculai-
res survenant lors du processus tu-
moral. Ces événements résultent de
l’implication directe des produits de
l’activité de certains gènes, des fonc-
tions intégrées provenant des molé-
cules organiques synthétisées par la
cellule, d’une dérégulation de l’ho-
méostasie tumorale par des phéno-
mènes inflammatoires et/ou des mo-
difications d’activité enzymatique.
L’oncogénèse correspond ainsi à un
processus multi-étapes d’accumula-
tion au sein des cellules, d’altérations
moléculaires propres à chaque stade
du développement tumoral. Dans le
domaine des altérations génétiques,
les puces à ADN ont permis d’analy-
ser l’expression génique à l’échelle
du génome et d’identifier un nom-
bre très élevé d’événements molécu-
laires associés à la tumorigénèse. Mais
ces gènes ne sont que les supports

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Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1
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de l’information et par définition le
génome est statique alors que les pro-
téines exprimées sont des principes
actifs doués de fonctions au sein de
la machinerie cellulaire. Le niveau
d’expression des ARNm n’est pas for-
cément le reflet de la nature de l’en-
semble des protéines contenues dans
la cellule tumorale. La traduction des
ARNm en protéines est en effet sou-
mise à un grand nombre de régula-
tions post-transcriptionnelles et post-
traductionnelles (glycosylation,
phosphorylation, acétylation…) dont
le rôle est déterminant pour le pou-
voir oncogénique. Ainsi, il a été dé-
montré que des transformations en-
tre tumeur bénigne et maligne sont
parfois dues a des modifications post-
traductionnelles non détectées par
l’analyse des ARNm [1].
L’ensemble des protéines contenues
dans la cellule tumorale est encore
plus vaste et plus complexe que le
génome. L’étude de leur nature, de
leur dynamique et de leurs interac-
tions (cellule tumorale vs cellule
stromale) est donc essentielle pour
une meilleure compréhension des
mécanismes d’initiation, de progres-
sion tumorale et de dissémination
métastatique.
LES MÉTHODES D’ANALYSE
PROTÉOMIQUE
!Le protéome, terme proposé en
1995 par M.R. Wilkins, désigne l’en-
semble des protéines exprimées par
le génome d’une cellule, d’un tissu
ou d’un organe, à un instant donné
et dans un environnement donné.
Son analyse permet une description
dynamique de la régulation de l’ex-
pression des gènes. Elle associe l’étu-
de des protéines et de leurs modifi-
cations post-traductionnelles, l’iden-
tification des protéines constituant un
complexe protéique (interaction pro-
téine-protéine), la recherche et l’iden-
tification de protéines impliquées
dans les voies de signalisation.
L’approche protéomique est fondée
sur le couplage de trois technologies
de pointe :
- l’électrophorèse bi-dimensionnelle
(2-DE) qui permet de séparer plu-
sieurs milliers de protéines d’un
même échantillon,
- la spectrométrie de masse (MS) qui
permet d’identifier ces protéines et
de mettre en évidence leurs modifi-
cations post-traductionnelles,
- la bioinformatique qui permet la
quantification du niveau des protéi-
nes et la constitution de bases de
données.
Méthode classique de
protéomique
!La méthode classique d’électropho-
rèse bi-dimensionnelle associée à la
spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
repose sur la séparation des protéi-
nes en fonction de deux caractéristi-
ques biochimiques : le point isoélec-
trique (PI) et la masse moléculaire.
La première dimension sépare les
protéines contenues dans l’échan-
tillon biologique par isoélectro-foca-
lisation selon leur PI dans un gel à
gradient de pH immobilisé large (pH
3-10) ou étroit (pH 4-7) ou étroit (pH
4-5). La deuxième dimension utilise
l’électrophorèse dénaturante en gel
de polyacrylamide en présence de
SDS qui sépare les protéines selon
leur masse. Une fois la 2-DE réalisée,
les protéines sont révèlées selon dif-
férentes méthodes de détection et les
images, captées par le scanning des
gels, sont traitées par des logiciels
d’analyse d’image dédiés à la
protéomique. Ces logiciels permet-
tent l’acquisition des données, la di-
minution du bruit de fond, l’élimi-
nation des défauts sur les gels, le dé-
nombrement des taches, leur compa-
raison en analyse différentielle, leur
quantification par les mesures d’in-
tensité et de volume. Les taches d’in-
térêt, chacune pouvant contenir une
ou plusieurs protéines, sont décou-
pées des gels et traitées individuelle-
ment selon des protocoles précis
d’hydrolyse trypsique : déshydrata-
tion du gel, extraction des peptides,
dessalage de l’hydrolysat peptidique
déposé sur plaque spéciale et séché.
L’identification des protéines se fait
par spectrométrie de masse de type
MALDI-MS (Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionisation–Mass
Spectrometry) ou ESI-MS (Electro-
spray ionisation) couplée à la chro-
matographie liquide (LC). La tache du
mélange séché est bombardée sous
vide par un laser pulsé à 337nm qui
excite les molécules et ionise les
peptides entraînés dans le champ
électrique d’un aimant, qui accélère
les ions vers un détecteur. Tous les
MALDI-MS actuels permettent une
acquisition automatique des données
et des bombardements programma-
bles. Ils sont équipées du mode de
détection en Temps de Vol (TOF ou
Time ou Flight) et du mode
Réflectron, l’arrivée des peptides
chargés se faisant dans le détecteur
TOF dans l’ordre croissant de masse,
les plus lourds étant ralentis voir éli-
minés, le Réflectron permettant de
focaliser la distribution isotopique et
d’améliorer la résolution en dimi-
nuant la dispersion isotopique. L’auto-
matisation de toutes ces étapes, de la
2DE à l’analyse par MALDI-MS corres-
pond à ce que l’on appelle la
protéomique à haut débit menant à
identifier plusieurs centaines de pro-
téines dans un même échantillon.
Deux logiciels MASCOT et
PROFOUND fondés sur des algorith-
mes différents permettent d’interro-
ger les principales banques de don-
nées protéiques SWISSPROT,
PROTSITE et celle de la NCBI (US
National Center for Biology Informa-
tion) qui contiennent les traductions
des séquences d’ADN de la GeneBank
et les résultats de clivage par les
protéases de séquences peptidiques
connues. La masse des peptides gé-
nérés par la trypsine est comparée
aux cartes peptidiques massives théo-
riques déduites des séquences de
chaque protéine présentes dans les
banques de données. Mais la masse
d’un seul peptide ne permet pas
d’identifier la protéine dont il est issu.
Il en faut au moins cinq identiques
aux séquences trouvées dans la pro-
téine. Le logiciel donne dans l’ordre
statistique décroissant la probabilité
d’identifier la protéine. Dans une ta-
che de 2-DE, plusieurs protéines peu-
vent coexister et le MALDI-MS est ca-
pable de les découvrir en même
temps, le logiciel triant les peptides

J. Solassol
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appartenant aux unes et aux autres.
Lorsque la protéine n’est pas présente
dans la banque de données, il est pos-
sible d’obtenir des informations sur
la séquence en acides aminés des
peptides trypsiques en mode MS/MS
(double spectrométrie) à l’aide d’un
spectromètre de masse de type nano-
electro-spray.
Méthode de "puces" à protéines
!Une nouvelle méthode est apparue
appelée SELDI-TOF pour Surface
Enhanced Laser Desorption Ionisation
- Time of Flight. Développée par
Ciphergen biosystems, cette
plateforme protéomique associe le
principe de "puce" à la spectrométrie
de masse. La séparation, la détection
et l’analyse des protéines se font di-
rectement à partir de l’échantillon
biologique avec une sensibilité de
l’ordre de la femtomole. En pratique,
quelques microgrammes de protéi-
nes issues d’échantillonf variés (liqui-
des biologiques, extraits cellulaire ou
tissulaire) sont directement adsorbés
sur une surface de 2 mm2 (spot) pré-
sentant des propriétés chromatogra-
phiques variées. En fonction de la
surface chromatographique, le mé-
lange protéique subit un fractionne-
ment qui dépend de la propriété chi-
mique (anionique, cationique, hydro-
phobe, hydrophile ou d’affinité aux
métaux) ou biologique (liaison à un
anticorps, un peptide, un récepteur,
un ligand ou un acide nucléique).
Après une série d’étapes de lavage, la
puce à protéine est introduite dans
un spectromètre de masse. Sous l’ac-
tion du rayonnement laser, les pro-
téines liées à la "puce" sont
désorbées/ionisées et analysées en
terme de masse sur charge (m/z)
d’après leur temps de vol pour attein-
dre le détecteur. Les signaux traités
par des moyens informatiques sont
traduits en spectre d’abondance rela-
tive vs la masse moléculaire des es-
pèces détectées. Au final, on obtient
une vue d’ensemble de peptides et
de protéines présents dans l’échan-
tillon sous la forme de profils protéi-
ques. Ces derniers sont ensuite nor-
malisés et calibrés afin de limiter les
biais liés à l’opérateur, à la surface
chromatique ou à l’instrumentation
elle-même.
Ce système est particulièrement in-
téressant en analyse différentielle de
type patient/témoin pour mettre en
évidence des profils d’expression
spécifiques. L’analyse statistique de
l’ensemble de ces données est une
des étapes les plus importantes de
l’étude protéomique. Si l’on traite suf-
fisamment d’échantillons en parallèle,
le logiciel permettant la superposi-
tion de profils pourra établir une sta-
tistique en fonction d’une multitude
d’algorithmes informatiques basés
sur des analyses statistiquement
multivariées (analyse discriminante,
classification hiérarchique…). Ces
algorithmes permettent d’analyser
des données complexes et d’extraire
des spectres de masse la meilleure
combinaison de marqueurs capables
de discriminer chacun des groupes
patient/témoin. Par la suite, l’identifi-
cation de marqueurs potentiels né-
cessite des étapes de purification sup-
plémentaires par des méthodes
électrophorétiques ou chromatogra-
phiques classiques afin de caractéri-
ser précisément des protéines d’in-
térêt.
Cette dernière méthode d’analyse
protéique par SELDI-TOF est une ap-
proche d’accès assez facile sur le plan
technique et de coût acceptable. Mé-
thode de microanalyse réalisée à par-
tir de faibles quantités protéiques de
l’ordre du microgramme, elle a une
capacité d’analyse à haut débit des
échantillons, elle permet l’établisse-
ment de profils d’expression protéi-
que à partir de mélanges complexes,
ce qui facilite son application clini-
que. Elle est toutefois encore limitée
dans la taille des protéines qu’elle
peut analyser.
PROTÉOMIQUE ET
APPLICATIONS CLINIQUES DE
LA PLATEFORME SELDI-TOF
!Les premiers travaux publiés par
Petricoin et coll. en 2002 utilisant les
puces à protéines ont consisté à ana-
lyser le sérum de malades atteints de
cancer de l’ovaire et de cancer de la
prostate [2, 3]. Ils rapportaient qu’un
profil protéique spécifique sans iden-
tification de marqueur d’intérêt était
capable de diagnostiquer ce cancer
au stade infra-clinique avec une spé-
cificité de 95%, une sensibilité de
100% et une valeur prédictive posi-
tive de 94% et de différentier le can-
cer de la prostate de l’hyperplasie
bénigne [3]. D’autres exemples pou-
vaient être donnés dans le cancer
colo-rectal [4], le cancer du sein [5-
8], l’hépatocarcinome [9], le méla-
nome [10] et le cancer du pancréas
[11]. Dans le cancer de la vessie, l’ana-
lyse de protéines urinaires a permis
d’améliorer le diagnostic précoce en
comparaison de l’analyse cytologique
standard des urines [12].
Ces premiers résultats apparemment
spectaculaires et prometteurs ont été
rapidement critiqués, en particulier
par Diamandis, le principal défaut de
la technologie SELDI résidant dans sa
faible reproductibilité [13]. Plusieurs
groupes de recherche utilisant les
mêmes approches expérimentales et
travaillant sur la même pathologie
n’ont pas mis en évidence les mêmes
pics permettant de discriminer le tissu
normal du tissu pathologique et ont
proposé des marqueurs ou des pro-
fils protéiques différents [14]. Les dif-
férences observées dans les profils
protéiques entre sérum contrôle et
sérum des malades porteurs de can-
cer n’étaient donc pas exclusivement
liés au cancer. Diamandis a mis en
exergue de nombreux paramètres
qui affectent la reproductibilité de
cette technique : la variabilité dans le
recueil des échantillons, leur traite-
ment, le type de conservation, la di-
versité des groupes de patients, leur
statut hormonal, leurs habitudes ali-
mentaires, l’usage de médicament,
ainsi que les biais statistiques ou la
variation de la stabilité des spectro-
mètres de masse et /ou des puces à
protéines [15]. De même la com-
plexité des outils informatiques aug-
mente la probabilité d’interprétation
erronée et de résultats non reproduc-
tibles.
Par ailleurs, la sensibilité de la détec-
tion n’atteint pas les concentrations
inférieures à un microgramme par mL
alors que les marqueurs tumoraux

Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1
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usuels sont à des concentrations
beaucoup plus faibles et ne sont donc
pas suffisamment détectés. De sorte
que jusqu’à présent, dans les quel-
ques cas où la caractérisation des
marqueurs a été effectuée, les protéi-
nes identifiées correspondent à des
protéines majoritaires du sérum. Il
s’agit de l’Apolipoprotéine A, des for-
mes tronquées de la transthyrétine,
de la chaîne lourde de l’inhibiteur de
l’alpha trypsine dans le cancer de
l’ovaire [14], de la sous-unité alpha
de l’haptoglobine dans une autre
étude sur le cancer de l’ovaire [16],
de l’hepatocarcinoma Intestine-Pan-
créas/Pancreatitis-associated Protein-
I dans le cancer du pancréas [9, 17],
des alpha 1 et alpha 2 défensine dans
la cancer de la vessie [12] ou encore
d’une protéine de liaison à la Vita-
mine D dans le cancer de la prostate
[18]. Une des questions posée est de
savoir si ces marqueurs ont leur ex-
pression altérée spécifiquement en
réponse à la prolifération tumorale ou
de manière non spécifique en ré-
ponse à des épiphénomènes dépen-
dant de la tumeur.
Les biomarqueurs identifi2s jusqu’ici
par SELDI-TOF s’avèrent pour la plu-
part être des protéines majoritaires de
la réponse inflammatoire produites
par l’environnement peri-tumoral ou
par les cellules immunitaires plutôt
que par la tumeur elle-même [15, 19,
20]. Ces protéines sont néanmoins
potentiellement instructives s’il est
démontré qu’il s’agit de fragments
protéolytiques dérivés des protéines
inflammatoires de la tumeur, spécifi-
ques de chaque tumeur en fonction
de son contenu enzymatique [20].
L’observation par Liotta et coll. que
certain des marqueurs identifiés par
SELDI-TOF sont des formes clivées de
protéines sériques de plus haut poids
moléculaire, fait avancer l’hypothèse
que l’abondance de ces marqueurs
clivés est le reflet direct d’événe-
ments pathologiques induits par le
microenvironnement tumoral [21].
Des études récentes montrent que
l’équilibre entre des protéases et
leurs inhibiteurs cellulaires est mo-
difié dans le sérum et le tissu des
patients en réponse à la prolifération
tumorale [22]. Différentes familles de
protéases comme les métallo-
protéases ou kallikréines plasmati-
ques et tissulaires ont leur expression
augmentée ou diminuée dans cer-
tains cancers [23-25]. Ces modifica-
tions de l’expression auraient alors
un retentissement direct sur la capa-
cité des protéases à cliver des protéi-
nes sériques et à générer ainsi une
signature moléculaire spécifique.
Diamendis stipule que le rapport en-
tre les protéines majoritaires telles
que l’albumine et les immunoglobu-
lines et les protéines minoritaires est
tel qu’il est impossible en l’état ac-
tuel de détecter ces protéines mino-
ritaires, malgré la bonne sensibilité de
la technique SELDI-TOF [15]. Ainsi, le
PSA qui fait partie des protéases dont
l’expression est augmentée dans les
cancers de la prostate [26], n’a jamais
pu être identifiée par le SELDI-TOF. En
fait, il existe d’autres méthodes qui
permettent d’augmenter la concentra-
tion relative des protéines faiblement
représentées. Elles passent par des
étapes successives de pré-fractionne-
ment, de chromatographie, de préci-
pitation sélective et de déplétion des
protéines majoritaires [27-30]. Ces
techniques "d’enrichissement" des
protéines peu représentées doivent,
pour être efficaces, éviter l’introduc-
tion de biais supplémentaires. La dé-
tection de cette fraction "mineure" du
sérum, véritable face cachée de l’ice-
berg, est un défi technologique qu’il
faut relever pour assurer le dévelop-
pent fiable du diagnostic des formes
précoces des cancers.
CONCLUSION
!Les nouvelles technologies d’ana-
lyse protéomique prennent leur place
dans l’ère post-génomique. Les pre-
miers résultats mettent en évidence
le potentiel des analyses à large
échelle en particulier pour l’identifi-
cation des profils protéiques diffé-
rents dont il est nécessaire d’établir
le rapport avec les mécanismes
physiopathologiques du processus
tumoral. Les limitations technologi-
ques et les défis analytiques sont en-
core élevés et des progrès importants
s’imposent pour établir la complé-
mentarité entre protéomique d’ex-
pression et protéomique d’interac-
tion.
A l’instar du programme visant à éta-
blir la Carte d’Identité des Tumeurs
Humaines par l’analyse du
transcriptome, l’approche complé-
mentaire, du gène à la protéine fonc-
tionnelle, alliant génomique et
protéomique, devrait faire l’objet de
programmes nationaux coordonnés
entre les diverses plateformes
protéomiques cancérologiques pour
concrétiser dans les meilleurs délais
la caractérisation des marqueurs et le
développement de tests non invasifs
prédictifs et diagnostiques des for-
mes précoces de cancer les plus ac-
cessibles aux moyens thérapeutiques
actuels.

J. Solassol
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 35
Proteomic approach to tumor marker discovery
A key challenge in clinical proteomic of cancer is the identification of biomarkers that
would allow early detection, diagnosis and monitor progression of the disease to improve long-
term survival of patients. Recent advances in proteomic instrumentation and computational
methodologies offer unique chance to rapidly identify these new candidate markers or pattern of
markers. The combination of retentate affinity chromatography and surfaced-enhanced laser
desorption/ionization time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry is one of the most interesting
new approaches for cancer diagnosis using proteomic profiling. This review aims to summarize
the results of studies that have used this new technology method for the early diagnosis of human
cancer. Despite promising results, the use of the proteomic profiling as a diagnostic tool brought
some controversies and technical problems and still requires some efforts to be standardised and
validated.
Proteomic / Tumor biomarkers
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