k - ESI

É
ÉT
TU UD DE ES S D DE E C CI IN NÉ ÉT TI IQ QU UE ES S R RA AP PI ID DE ES S
Les études cinétiques à l’état stationnaire vis à déterminer les paramètres Vmax et
Km (le dernier ne représente que dans certains cas une constante de dissociation
réelle). En cas des réactions à plusieurs substrats, l’analyse des données cinétiques en
état stationnaire permet de proposer un mécanisme d’action plausible (« ping-pong, au
hasard, ordonné, etc.). Toutefois, ces méthodes d’analyse à l’état stationnaire ne nous
permettent pas de suivre l’évolution des intermédiaires de réaction. Ces intermédiaires
sont pourtant ce qu’il y a de plus indicatifs des mécanismes moléculaires impliqués
dans la réaction enzymatique.
Les études cinétiques rapides ou d’état pré-stationnaire consistent à étudier
l’apparition ou la disparition d’un ou de plusieurs intermédiaires impliqués dans une
réaction enzymatique donnée.
E + S ES ES' EP E + P
Une considération importante est le temps de vie des intermédiaires. Le
turnover, kcat, dans beaucoup des enzymes est de l’ordre 100 s-1 ; cela veut dire 100
molécules de produites sont générés par seconde par une molécule d’enzyme,
impliquant que l’étape la plus lente de la réaction possède une demi-vie seulement de
l’ordre de quelques millisecondes.
EB + A
EA'
E + A + B EA EAB EAB' EPQ E + P + Q
Cinétique d’état pré-stationnaire
Exemple d’une réaction d’un seul substrat impliquant un seul intermédiaire:
k1 k2
E + S ⇌ ES ⇌ E + P
k-1 k-2
Le taux avec lequel [ES] change en fonction du temps, t, s’exprime par la relation
suivante :
S’il est assumé que [S]0 >> [E]0 et [P] est négligeable pour la période, t, dans ces
]][[][][]][[ 2211 PEkESkESkSEk
t d
] [ES d
−− +−−=
BCM 2504 Cinétique pré-stationnaire Page 1 / 1

conditions, l’équation possède une solution analytique qui est montrée dans la figure
ci bas
● il y a deux parties dans ce graphique : la région stationnaire (a) et pré-
stationnaire (b)
o la partie linéaire en (a) de [P] vs temps représente la région stationnaire
et possède la pente correspondante à la vitesse de la réaction donc :
o dans la partie pré-stationnaire en (b), il est possible de calculer la
quantité qui représente le temps d’induction de la période stationnaire
k
+
k
+ S
k
1
1-2
0
1]
[
SK
S E
k
0
M
00
2
]
[
]
[
]
[
+
Temps
Partie
linéaire
(a)
S
P
E ES
[Concentration]
(b)
pré-stationnaire stationnaire
Temps
[Concentration]
Période
d’induction
P
E
ES
BCM 2504 Cinétique pré-stationnaire Page 2 / 2

o à partir de cette quantité, qui est mesurée typiquement en milliseconde, il
est possible d’estimer les constantes microscopiques ki en tenant compte
de kcat et KM
Dans le cas d’un système plus compliqué, il n’y a plus de solution analytique et
la détermination de constantes cinétiques se fait par approximation en utilisant des
méthodes spectroscopiques qui détectent seulement des intermédiaires caractéristiques
d’une certaine étape de la réaction
o Rappel du « burst » de la cinétique de la chymotrypsine
Pour pouvoir étudier l’apparition de ces complexes intermédiaires, les
conditions expérimentales suivantes doivent être remplies :
¾ La quantité d’enzyme disponible doit être suffisante pour étudier les
espèces enzymatiques en concentration saturable de substrat. En effet, c’est
l’interaction de l’enzyme avec un ou plusieurs substrats et non la formation de
produits qui est étudiée.
¾ On doit disposer d’une méthode de détection spectrophotométrique,
radioisotopique ou autre pour suivre l’apparition ou la disparition de l’intermédiaire.
¾ On doit pouvoir faire les mesures très rapidement puisque les vitesses de
réaction peuvent être de l’ordre de 10-7 sec. Il nous faut donc pouvoir suivre la
réaction presque instantanément après le mélange des réactifs (enzyme + substrat(s)).
Plusieurs méthodes ont été développées pour pouvoir satisfaire cette dernière
condition :
Mesure en flot continu
En 1923, Hartridge et Roughton introduisent la technique de mesure en flot
continu qui est illustrée ci-dessous.
d
t = d / x
Points d’observation
Ainsi, plusieurs points d’observation sont aménagés à la sortie de la chambre de
mélange, ce qui permet de suivre l’évolution de la réaction dans le temps, et ce,
presque instantanément après le mélange. À une vitesse d’écoulement constante, l’âge
BCM 2504 Cinétique pré-stationnaire Page 3 / 3

de la solution du point de mixage est proportionnel de façon linéaire avec la distance
écoulée. Si la vitesse d’écoulement est 10 m s-1, alors à 1 cm de distance de la chambre
du mélangeur, la solution possède un âge de 1milliseconde, 10 cm de la chambre,
l’âge est 10 ms, etc. Le déplacement du fluide est laminaire (absence de turbulence)
dans le canal d’écoulement à condition que la vitesse d’écoulement ne dépasse pas une
vitesse critique et ceci afin d’éviter le mixage par turbulence. En bas de la vitesse
critique, le mixage sera seulement par diffusion dans le canal d’écoulement, ce qui est
comparativement très lent.
Le « temps mort » qui correspond au temps entre le mixage et la première
observation peut être très court lorsque cette technique est utilisée. Ce temps mort
peut être de l’ordre de micro-secondes. Cependant, il est nécessaire d’utiliser de
grandes quantités d’enzymes et de substrats pour réaliser cette technique.
Mesure en flot arrêté
Cette technique a été mise au point pour minimiser les quantités d’enzymes et
de substrats nécessaires. L’enzyme et le substrat sont d’abord acheminés dans la
chambre de mixage, mais le flot est immédiatement interrompu. Le parcours de la
réaction est donc suivi dans le temps en un point unique d’observation. Le « temps
mort » associé à cette technique est de l’ordre de 500 micro-secondes. Cependant, la
réaction peut être observée pour de longues périodes de temps sans les problèmes
techniques de la mesure en flot continu (longueur démesurée du tube).
BCM 2504 Cinétique pré-stationnaire Page 4 / 4

« Quenching » rapide
Les deux techniques décrites plus haut présupposent que l’on peut suivre la
modification (spectrophotométrie ou radio-isotope) découlant de la réaction
enzymatique, par observation directe, ce qui n’est pas toujours le cas. Le
« quenching » rapide consiste à arrêter la réaction à un temps donné par l’addition
d’un troisième réactif (ex. acide), ce qui permet l’analyse ultérieure de l’échantillon.
Des « quenchs » à plusieurs temps différents permettent de suivre le développement
de la réaction.
« Flash photolyse »
Cette technique, qui ne peut être utilisée que dans certains cas bien précis,
permet d’initier la réaction enzymatique littéralement à la vitesse de la lumière. Cette
technique tire avantage de l’existence de liens chimiques photosensibles. Le
précurseur inactif d’un substrat est mis en présence de l’enzyme et le substrat est
activé par une photolyse lors d’un « flash » lumineux. La réaction ainsi initiée peut
donc être suivie dès son initiation.
BCM 2504 Cinétique pré-stationnaire Page 5 / 5