k - ESI

ÉTUDES DE CINÉTIQUES RAPIDES
Les études cinétiques à l’état stationnaire vis à déterminer les paramètres Vmax et
Km (le dernier ne représente que dans certains cas une constante de dissociation
réelle). En cas des réactions à plusieurs substrats, l’analyse des données cinétiques en
état stationnaire permet de proposer un mécanisme d’action plausible (« ping-pong, au
hasard, ordonné, etc.). Toutefois, ces méthodes d’analyse à l’état stationnaire ne nous
permettent pas de suivre l’évolution des intermédiaires de réaction. Ces intermédiaires
sont pourtant ce qu’il y a de plus indicatifs des mécanismes moléculaires impliqués
dans la réaction enzymatique.
Les études cinétiques rapides ou d’état pré-stationnaire consistent à étudier
l’apparition ou la disparition d’un ou de plusieurs intermédiaires impliqués dans une
réaction enzymatique donnée.
E+S
ES
ES'
EP
E+P
EA'
E+A+B
EA
EAB
EAB'
EPQ
E+P+Q
EB + A
Une considération importante est le temps de vie des intermédiaires. Le
turnover, kcat, dans beaucoup des enzymes est de l’ordre 100 s-1 ; cela veut dire 100
molécules de produites sont générés par seconde par une molécule d’enzyme,
impliquant que l’étape la plus lente de la réaction possède une demi-vie seulement de
l’ordre de quelques millisecondes.
Cinétique d’état pré-stationnaire
Exemple d’une réaction d’un seul substrat impliquant un seul intermédiaire:
k2
k1
E+S ⇌
ES ⇌
k-1
E+P
k-2
Le taux avec lequel [ES] change en fonction du temps, t, s’exprime par la relation
suivante :
d [ES ]
= k1[ E ][ S ] − k −1[ ES ] − k 2 [ ES ] + k − 2 [ E ][ P ]
dt
S’il est assumé que [S]0 >> [E]0 et [P] est négligeable pour la période, t, dans ces
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Cinétique pré-stationnaire
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conditions, l’équation possède une solution analytique qui est montrée dans la figure
ci bas
(b)
[Concentration]
[Concentration]
(a)
S
Partie
linéaire
E
P
P
ES
E
ES
Période
d’induction
Temps
pré-stationnaire
Temps
stationnaire
● il y a deux parties dans ce graphique : la région stationnaire (a) et préstationnaire (b)
o la partie linéaire en (a) de [P] vs temps représente la région stationnaire
et possède la pente correspondante à la vitesse de la réaction donc :
k 2 [ E ]0 [ S ]0
K M + [ S ]0
o dans la partie pré-stationnaire en (b), il est possible de calculer la
quantité qui représente le temps d’induction de la période stationnaire
1
k 1 [ S ]0 + k 2 + k -1
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Cinétique pré-stationnaire
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o à partir de cette quantité, qui est mesurée typiquement en milliseconde, il
est possible d’estimer les constantes microscopiques ki en tenant compte
de kcat et KM
Dans le cas d’un système plus compliqué, il n’y a plus de solution analytique et
la détermination de constantes cinétiques se fait par approximation en utilisant des
méthodes spectroscopiques qui détectent seulement des intermédiaires caractéristiques
d’une certaine étape de la réaction
o
Rappel du « burst » de la cinétique de la chymotrypsine
Pour pouvoir étudier l’apparition de ces complexes intermédiaires, les
conditions expérimentales suivantes doivent être remplies :
¾
La quantité d’enzyme disponible doit être suffisante pour étudier les
espèces enzymatiques en concentration saturable de substrat. En effet, c’est
l’interaction de l’enzyme avec un ou plusieurs substrats et non la formation de
produits qui est étudiée.
¾
On doit disposer d’une méthode de détection spectrophotométrique,
radioisotopique ou autre pour suivre l’apparition ou la disparition de l’intermédiaire.
¾
On doit pouvoir faire les mesures très rapidement puisque les vitesses de
réaction peuvent être de l’ordre de 10-7 sec. Il nous faut donc pouvoir suivre la
réaction presque instantanément après le mélange des réactifs (enzyme + substrat(s)).
Plusieurs méthodes ont été développées pour pouvoir satisfaire cette dernière
condition :
Mesure en flot continu
En 1923, Hartridge et Roughton introduisent la technique de mesure en flot
continu qui est illustrée ci-dessous.
t=d/x
d
Points d’observation
Ainsi, plusieurs points d’observation sont aménagés à la sortie de la chambre de
mélange, ce qui permet de suivre l’évolution de la réaction dans le temps, et ce,
presque instantanément après le mélange. À une vitesse d’écoulement constante, l’âge
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Cinétique pré-stationnaire
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de la solution du point de mixage est proportionnel de façon linéaire avec la distance
écoulée. Si la vitesse d’écoulement est 10 m s-1, alors à 1 cm de distance de la chambre
du mélangeur, la solution possède un âge de 1milliseconde, 10 cm de la chambre,
l’âge est 10 ms, etc. Le déplacement du fluide est laminaire (absence de turbulence)
dans le canal d’écoulement à condition que la vitesse d’écoulement ne dépasse pas une
vitesse critique et ceci afin d’éviter le mixage par turbulence. En bas de la vitesse
critique, le mixage sera seulement par diffusion dans le canal d’écoulement, ce qui est
comparativement très lent.
Le « temps mort » qui correspond au temps entre le mixage et la première
observation peut être très court lorsque cette technique est utilisée. Ce temps mort
peut être de l’ordre de micro-secondes. Cependant, il est nécessaire d’utiliser de
grandes quantités d’enzymes et de substrats pour réaliser cette technique.
Mesure en flot arrêté
Cette technique a été mise au point pour minimiser les quantités d’enzymes et
de substrats nécessaires. L’enzyme et le substrat sont d’abord acheminés dans la
chambre de mixage, mais le flot est immédiatement interrompu. Le parcours de la
réaction est donc suivi dans le temps en un point unique d’observation. Le « temps
mort » associé à cette technique est de l’ordre de 500 micro-secondes. Cependant, la
réaction peut être observée pour de longues périodes de temps sans les problèmes
techniques de la mesure en flot continu (longueur démesurée du tube).
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Cinétique pré-stationnaire
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« Quenching » rapide
Les deux techniques décrites plus haut présupposent que l’on peut suivre la
modification (spectrophotométrie ou radio-isotope) découlant de la réaction
enzymatique, par observation directe, ce qui n’est pas toujours le cas. Le
« quenching » rapide consiste à arrêter la réaction à un temps donné par l’addition
d’un troisième réactif (ex. acide), ce qui permet l’analyse ultérieure de l’échantillon.
Des « quenchs » à plusieurs temps différents permettent de suivre le développement
de la réaction.
« Flash photolyse »
Cette technique, qui ne peut être utilisée que dans certains cas bien précis,
permet d’initier la réaction enzymatique littéralement à la vitesse de la lumière. Cette
technique tire avantage de l’existence de liens chimiques photosensibles. Le
précurseur inactif d’un substrat est mis en présence de l’enzyme et le substrat est
activé par une photolyse lors d’un « flash » lumineux. La réaction ainsi initiée peut
donc être suivie dès son initiation.
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Cinétique pré-stationnaire
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Un exemple d’un tel substrat nous est donné par l’ATP « en cage ». Ce substrat
peut être utilisé pour étudier toutes les enzymes qui utilisent l’ATP comme substrat.
CH3
O
O
O
2 Adenine
CH O P O P O P O CH
O
O
O
O
H
H
NO2
HO OH
CH3
hγ
C
NO2
+ ATP
O
Technique de relaxation
[Concentration]
Il s’agit d’étudier le retour à l’équilibre (relaxation à l’équilibre) d’une réaction
suite à une perturbation de cet équilibre. Un changement de température de 5 ou 10
degrés, par laser infrarouge, perturbe l’équilibre réactionnel. Le rétablissement de
l’état d’équilibre sous les nouvelles conditions peut être assimilé à un nouvel état
stationnaire. La constant de la vitesse de relaxation à l’équilibre, désignée par le
symbole τ, est un paramètre
très utilisé dans l’analyse
mathématique des études de
T20
Concentration
cinétiques rapides.
du nouvel
équilibre
Cette méthode ne
s’applique pas à des
réactions enzymatiques qui
sont quasiment irréversibles.
Elle est utilisée dans les
situations où il s’agit de la
liaison simple par des
ligands (NAD+ par les
déshydrogénases), la liaison
d’inhibiteur ou changements
conformationnels.
Relaxation
exponentielle vers le
nouvel équilibre
Concentration
à l’équilibre
initial
T10
Saut en température de 5-10°C
en 0.1 à 1 μs
Temps
Voici comment se définit τ :
k
1.
A
2.
3.
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A
E+S
kf
kr
kon
koff
1
B
B
τ
1
τ
1
ES
τ
Cinétique pré-stationnaire
= k
= kf + kr
= koff + kon[S]
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Analyses des cinétiques pré-stationnaire et de relaxation
Théorie de la cinétique de l’état pré-stationnaire
La cinétique pré-stationnaire se concentre donc sur la détection et l’analyse des
espèces enzymatiques transitoires dans la partie précoce de la réaction
• les processus cinétiques sont généralement caractérisés par des vitesses de premier
ordre en concentration dans la transformation d’une espèce en une autre
o donc leur évolution en fonction du temps suit une relation exponentielle plutôt
qu’une relation linéaire
o à noter : pendant la phase pré-stationnaire, le « turnover » de l’enzyme n’est
pas multiple comme dans le cas de l’état stationnaire mais se fait seulement une
fois
Cas simple exponentiel
Dans une réaction réversible, A ne transforme pas complètement en B; il y a
une concentration d’A équilibre, Aeq
A
kf
B
kr
L’équation de vitesse est
o
avec Keq = [B]eq /[A]eq = kf / kr
o
et [A]t+[B]t=[A]0
d [A]
= - k f [A] + k r [B] = - k f [A] + k r ( [A]0 - [A])
dt
Si à t = 0, [A]t = [A]0, [B]t = 0 et à t = ∞, [A]∞ = [A]eq, la solution de cette
équation différentielle donne pour la disparition d’A et l’apparition d’B,
[A] 0 k f
k
( exp [- ( k f + k r ) t] + r )
kf
k f + kr
[ A] 0 k f
(1 − exp [- ( k f + k r ) t] )
[B] t =
k f + kr
[A] t =
Donc lorsque t = ∞ Æ [ B ]eq =
[ A]0 k f
k f + kr
−t τ
Représentation paramétrique, [ B ]t = amplitude ∗ (1 − e )
où 1/τ = kf + kr , et amplitude = [ A ] 0 k f ( k f + k r )
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Cinétique pré-stationnaire
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L’évolution de [B] dans le temps est divisée en deux facteurs :
1)
Le terme exponentiel avec une constante de vitesse ou relaxation, 1/τ,
2)
Le facteur d’amplitude, kf / (kf + kr)
• la vitesse avec laquelle le système atteint son équilibre est plus vite que prédit par
les constantes de vitesse individuelle, kf et kr, et dépend en effet de la somme de
ces constantes de vitesse
o Une réaction réversible approche l’équilibre plus vite qu’une réaction
irréversible parce que [A] ne doit pas diminuer autant
ƒ [A] = [A]eq vs [A] = 0
• à noter : il n’est pas possible de déterminer kf et kr individuellement à partir de la
forme de la courbe exponentielle sans connaissance du facteur d’amplitude
Association enzyme et substrat
Dans le cas de la réaction
kon
ES
E+S
koff
si [S] >> [E], la réaction est essentiellement de premier ordre puisque [S] ne change
pas.
kon[S]
On peut donc écrire
ES
E
koff
vu que
d [ ES ]
= k on [ S ][ E ] − k off [ ES ] et la quantité kon [S] est constante.
dt
• Si on identifie kf avec kon[S] et kr avec koff précédemment, on obtient une
constante de relaxation
1/τ = koff + kon [S] .
Deux points importants à noter :
1) Une dépendance sur la concentration qui permet la résolution de kon de koff sans
facteur d’amplitude parce que les constantes de vitesse sont quasi
unimoléculaires
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Cinétique pré-stationnaire
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2) La limite inférieure à 1/τ est koff. La détermination de cette valeur dépend de
l’instrumentation utilisée. Des valeurs de l’ordre de 1000 s-1 ou moins sont
mesurables; cependant, les constantes de dissociation de beaucoup d’enzymes
sont plus vites.
Exemple : Analyse de liaison E + S ⇌ ES. Figure montre l’évolution du complexe
binaire ES pour [ET] constante et [ST] variable. Évolution de [ES] en fonction de t
décrit par la relation [ES]=C (1-exp{-t/τ}) ou 1/τ ≡ kobs = koff + kon [S] et C=[ET] x
fraction de sites liée en état stationnaire
[Conc] où
densité
optique
normalisée
[S]
kobs
-1
125 s
20 µM
-1
10 µM
-1
5 µM
-1
2 µM
-1
1 µM
75 s
50 s
35 s
30 s
0
20
40
60
Millisecondes
Figure : Analyse de la
liaison de la tyrosine
au tyrosyl-tRNA
synthétase de Bacillus
stearothermophilus
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Figure : La relation
entre la constante
exponentielle 1/τ et
[S]
80
Courbes créées
avec les
constantes de
vitesse
koff = 25 s-1
kon = 5 x 106 M-1 s-1
100
Pente = kon
Cinétique pré-stationnaire
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Mesure des constantes cinétiques rapides
i) constantes de vitesse
Exemple de la lactate déshydrogénase : L-lactate + NAD+ ⇌ pyruvate +NADH + H+
La liaison de NADH à l'enzyme est couplée à une augmentation de la
fluorescence d’NADH
k1
E + NADH ⇌ E·NADH
k-1
La réaction commence par mixage à des concentrations égales des sites actifs et
de substrat (~8nM) et est suivie pendant 16ms par fluorescence
• Pour une réaction de deuxième ordre aux concentrations égales, le demi-temps de
liaison du substrat avec l’enzyme, t1/2 = 1/k1[S] où [S] représente la concentration
initiale du réactif et k1 est la constante de vitesse bimoléculaire
o Mettons k1 ~ 6 x 107 M-1 s-1 et [S] = 8nM, t1/2 ~ 2 ms ce qui correspond à
l'échelle de temps mesurable avec l'appareillage de flot arrêté
Pour le cas de l’isozyme-5 de la lactate déshydrogénase, avec l’analyse des
données en fonction d'un modèle d’association réversible, on obtient à partir d’une
analyse du facteur exponentiel, 1/τ = k-1 + k1[S],
o k1 = 6.3 X 107 M-1 s-1 et k-1 ~ 450 s-1
ƒ cependant k-1 diffère de kcat (80 s-1) déterminé pour la réaction
correspondante à la formation de NADH à partir de NAD+ et
lactate; donc l’étape de dissociation de NADH ne correspond pas
à la vitesse catalytique
Des travaux supplémentaires en flot arrêté avec des mutants de l’isozyme ont
démontré que l'étape lente de la réaction globale donc kcat correspond au mouvement
d’une boucle dans une région flexible de l'enzyme
o Ce mouvement a comme résultat de fermer le site actif lors de la liaison
NADH
o Ceci a était démontré par l’introduction d’un Trp dans la boucle par la
mutagenèse dirigée. La fluorescence de Trp est très intense et différente
que celle de NADH et dépend de son environnement permettant ainsi le
suivi du changement en environnement du Trp entre la position de la
boucle ouverte (hydrophilique) et fermée (hydrophobique).
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ii) Identification des espèces intermédiaires
La détection des espèces intermédiaires dépend de leur concentration sur
l'enzyme.
• Des concentrations de 10nM en intermédiaires enzymatiques peuvent être
facilement détectées par des méthodes spectroscopiques (fluorescence)
• Du point de vue temps, le balayage rapide d'un spectre de l'ordre de 200nm permet
l’identification des espèces ayant une demi-vie aussi courte que 1milliseconde
Autres variations sur la même approche :
1) Flot continu pour des réactions ayant des chromophores
2) « quench » rapides - l'addition de l'acide et suivi de la modification de
l’intermédiaire découlant de la réaction enzymatique due à l’acidification
« Analyse ultérieure de l'échantillon »
3) « flash » photolyse permet d'initier la réaction à des temps précis et très
rapides
ο Par exemple, quand le substrat sous forme de précurseur s'est lié à
l'enzyme, l'échantillon est exposé à un « flash » de lumière pour
cliver le lien entre le substrat et son précurseur afin d'initier la
réaction
Exemple : l’étude des réactions utilisant l’ATP en « cage »
iii) Exemples
Méthode « T – jump »
Un pulse de laser infrarouge peut augmenter la température d’une solution de 5
à 10 C en 1μs.
°
• La vitesse de relaxation a été suivie par une méthode spectroscopique.
• La constante d'association du NADH à la malate déshydrogénase a été mesurée et
une valeur de 5 x 108 M-1 s-1 a été obtenue ce qui est très proche de la constante de
diffusion ~ 109 M-1 s-1 Å la constante de vitesse d'association maximale.
o Donc, chaque collision entre enzyme et substrat donne lieu à un complexe
productif.
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Cinétique pré-stationnaire
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Exemple qui combine deux techniques - la phosphatase alcaline d’E.coli
L’enzyme catalyse l'hydrolyse de toutes sortes d'esters de phosphate R-O-P en
passant par la formation et la décomposition d'un phospho-enzyme intermédiaire E-P
dans le schéma réactionnel ci-bas
E + R O P
k1
E R O P
k2
E* R O P
k3
E
P
+ ROH
k4
Pi + E
Puisque la vitesse de la réaction catalysée est largement indépendante du type
de groupe substituant R, il a été postulé que l'hydrolyse du phosphate de
l'intermédiaire, k4, représente l'étape limitante de l'hydrolyse des phosphoestères
différents
• Par flot arrêté, l’étape k4 a été démontrée plus rapide que la vitesse de la
réaction, kcat
• L’étape lente de la réaction a été trouvée à partir des expériences « T-jump »
avec un analogue du substrat qui n’est pas hydrolysable
Lien non-hydrolysable
O
H
N
O
C
PO32-
H
ο L’analogue permet uniquement l'étude des deux premières réactions
ο Les résultats ont démontré qu'il y a un changement structural de
l'enzyme après la liaison de l'inhibiteur et c’est ce qui correspond à
l'étape lente de la réaction globale
Dans le schéma, c’est k2 qui représente l'étape lente et k2 ~ kcat
Les réactions chimiques sont généralement plus vites que
les changements conformationnels de l’enzyme en question.
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Cinétique pré-stationnaire
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Simplification des calculs de constantes de vitesse
Il est possible de réduire les constantes de vitesse pour une série de réactions en
une seule constante afin de simplifier les mécanismes réactionnels et isoler la
cinétique de l’étape en observation;
o mettons la séquence des réactions suivantes ;
k1
A
k2
B
k-1
k-2
k3
C
k4
D
k-3
k-4
k5
E
F
Il est possible de remplacer cette séquence par une réaction plus simplifiée en
considérant la réaction suivante
X
k1
k-1
Y
k2
Z
Dans ce cas, la vitesse d’X à être transformé en Z en passant par l’intermédiaire
Y correspond à la vitesse de convertir X en Y, soit k1[X], fois la probabilité d’Y à être
transformé en Z au lieu de retourner en X et qui est égal à k2 / (k-1 + k2).
Mathématiquement ceci revient à dire,
d [Y ]
d[Z ]
= k 2 [Y ] et dû à l’état stationnaire
= k1 [ X ] − k −1 [Y ] − k 2 [Y ] = 0
dt
dt
donc [Y ] =
d [ Z ] k 2 k1[ X ]
k2
k1
=
= k1[ X ]
[ X ] ce qui implique
ci-haut
dt
k −1 + k 2
k −1 + k 2
k −1 + k 2
• Si on veut remplacer la réaction réversible X ⇌ Y ci haut par une réaction
irréversible X Æ Y, la constante de vitesse nette, k’1 correspondante, est obtenue
en rappelant pour la réaction irréversible X Æ Y, l’équation s’écrit par
−
d[ X ]
= k 1' [ X ] .
dt
d[X ]
d [Z ]
d[X ]
d [Z ]
=−
= k1' [ X ] = −
, on obtient
et qui en substituent pour
dt
dt
dt
dt
d [Z ]
d[ X ]
kk
= 1 2 [ X ] qui veut dire que la constante de vitesse nette, k’1,
donne −
dt
k −1 + k 2
dt
Puisque
k1k 2
'
k
=
1
soit
k −1 + k 2
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.
Cinétique pré-stationnaire
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Par le même développement, les constantes de vitesse nettes s’expriment
pour D Æ E par k’4 = k4k5/(k-4+k5)
pour C Æ D par k’3 = k3k’4 / (k-3+k’4).
Ceci peut être répété jusqu’à la réaction A Æ B, k’1 = k1k’2 / (k-1+k’2). Donc on a
k'1
A
k'2
B
k'3
C
k'4
D
k5
F
E
Utilisation des temps de transit au lieu des constantes de vitesse
La valeur de Vmax ou kcat correspondant à une série de réactions séquentielles
peut être déterminé en considérant le temps de réaction de chaque étape
Les dimensions de vitesse, v, sont moles par seconde et les dimensions de 1/v
sont secondes par mole ou autrement dit le temps pour transformer une mole de
substrats en produits
• De façon similaire, 1 / kcat = [ET] / Vmax, possède les dimensions de temps,
secondes, et représente le temps pour une molécule pour traverser toute une
voie métabolique en état stationnaire et à des concentrations saturantes
o La constante réciproque représente par conséquent le temps de transit
Considérons la série des réactions suivantes,
EP1
k1
EP2
k2
EP3
k3
EP4
k4
kn-1
EPn
Le temps total pour un métabolite pour traverser de P1 jusque Pn est donc 1/k
qui est la somme des temps de transit pour chaque étape
1 1
1
1
1
1
= +
+
+
+K+
k k1 k 2 k 3 k 4
k n −1
où 1 / k = 1 / kcat = [ET] / Vmax pour des conditions saturantes tandis que quand les
conditions ne sont pas saturantes, le temps de transit devient = [ET] / v .
Cette approche permet d’écrire de façon très nette les équations cinétiques. Par
exemple, mettons la réaction
E+S
k1
k2
ES
E+P
k-1
Si [S] >> [E] et [S] reste assez constante (vitesse initiale), cette réaction se
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résume par le schéma réactionnel suivant
E
k1[S]
k-1
ES
k2
E+P
• La réaction E + S Æ ES est devenue de 1er ordre vu que la concentration de S n’est
pas influencée par la réaction.
Si on représente la même réaction en deux étapes irréversibles, par
E
k'1
ES
k2
E+P
'
• La constante de vitesse de la réaction nette, E Æ ES, est k1 =
k1[ S ] k 2
k −1 + k 2
1 1 1 [ ET ]
= + =
• Le temps total de transit est donc
k k1' k 2
v et qui est :
[ ET ] k -1 + k 2
1
=
+
v
k1[S ] k 2 k2
→
1 Km 1
1
=
+
v Vmax [ S ] Vmax
o Équation de Lineweaver-Burk
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