Transport et métabolisme d`un phospholipide structuré riche

Transport et métabolisme d’un phospholipide structuré riche en DHA.
Mme Olivia Bensadoun
Laboratoire RMND Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabètes
INSERM UMR 870/INSA de Lyon
Maîtres de stage :Pr.Guichardant et Dr. Picq
L’acide docosahexaénoïque (DHA) est un acide gras polyinsaturé de la famille des n-3 qui
est le plus représenté dans le cerveau et la rétine. Le DHA est apporté par l’alimentation sous la
forme de triglycérides ou bien de phospholipides. Des études ont montré son implication dans le
développement et la maturation du cerveau ainsi qu’une diminution de son taux cérébral dans la
dépression et dans les maladies neurodégénératives telles que les maladies de Parkinson ou
d’Alzheimer.
Le laboratoire s’intéresse depuis plusieurs années à l’accrétion du DHA au cerveau. Des
travaux dans les années 90 ont montré chez le rat que l’accrétion du DHA au cerveau est dix fois
plus efficace quand le DHA est estérifié en position 2 dans la 1-lysophosphatidylcholine (LPC-
DHA) en comparaison au DHA non estérifié, les deux étant liés à l’albumine.
La LPC-DHA est de plus capable de traverser une barrière hématoencéphalique reconstituée. En
effet, le DHA, toute comme les autres acides gras, atteindrait de cette façon le cerveau à partir de la
circulation sanguine.
Cependant cette LPC-DHA s’isomérise facilement en 1-DHA,2-lysophosphatidylcholine (Lagarde
et al, 2001 et Lagarde et al, 2008) où le DHA se retrouve en position 1 non physiologique. Afin
d’éviter la migration du DHA, le laboratoire a synthétisé la 1-acétyl-2-docosahexaénoyl-
glycérophosphocholine (AceDoPC) (voir figure) ayant des propriétés physico-chimiques et une
polarité proche de celles de la LPC.
L’AceDoPC a été obtenu par une réaction de transestérification enzymatique catalysée par
une lipase immobilisée en une étape à partir de PC comportant un DHA en position 2.
Ces PC-DHA sont produites au laboratoire à partir de cultures de microalgues
Crypthecodinium cohnii connue pour synthétiser des lipides riches en DHA.
L’étude réalisée au cours de mon stage a porté sur le transport du DHA dans le sang humain
sous forme d’AceDoPC marqué au 14C. Les PC-DHA marquées au 14C sont issues des microalgues
incubées avec de l’acétate de sodium marqué. L’AceDoPC a été incubée dans du sang humain et la
distribution de la radioactivité a été mesurée dans le plasma et dans les éléments figurés du sang.
La radioactivité est retrouvée majoritairement dans le plasma (93%) et une partie est incorporée
dans les globules rouges 5,08%. La radioactivité plasmatique est retrouvée majoritairement dans
l’albumine (55%) et dans les HDL (33%). Lorsque le sang est incubé avec de la PC-DHA
radioactive, la radioactivité se répartie dans le plasma (88%) et les plaquettes (9%) et faiblement
dans les globules rouges (2%). Elle se repartie de manière équivalente dans les fractions
plasmatiques à la différence de l’AceDoPC.
Les résultats montrent que l’AceDoPC se comporte comme les LPC. L’AceDoPC apparaît être un
bon candidat stable pour transporter le DHA au cerveau.
O
Structure de l’AceDoPC ou 1-acétyl, 2-docosahexaénoyl-glycérophosphocholine
P
OO
O
ON
O
O
H3C
O+
-

Modèle de l’α-glucosidase de Lactococcus
lactis IL 1403 (bleu : extrémité N-terminale ;
rouge : extrémité C-terminale)
Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon 1
2008-2009
Résistance aux infections : Etudes fonctionnelles et structurales de
deux α-glucosidases potentiellement productrices de prébiotiques
Mlle Magali DEJOB
Institut de Biologie et Chimie des Protéines
Unité Mixte de Recherche 5086 du C.N.R.S.- Université de Lyon ; Laboratoire de
Biocristallographie
Responsable de stage : Dr Nushin AGHAJARI Co-encadrant de stage : Dr Moez RHIMI
Les prébiotiques sont des sucres d’un intérêt
biomédical immense car ils stimulent la croissance
sélective de souches probiotiques présentes dans la
flore intestinale (Gibson et Roberfroid, 1995). En
effet, cette dernière contribue à la résistance aux
infections en étant la première barrière majeure de la
défense immune.
Les prébiotiques sont produits par des
biocatalyseurs comme les α-glucosidases. Ces
dernières ont un potentiel pharmacologique certain de
par leur spectre large d’action et leur profil de
dégradation.
Dans ce contexte, le but est d’identifier et
d’étudier les relations structure-fonction des
α-glucosidases ayant des intérêts biomédicaux.
Dans cette étude, nous avons réussi
l’identification, le clonage et l’expression de deux α-
glucosidases issues respectivement de Shewanella sp.
ANA-3 et de Lactococcus lactis IL 1403. Les
protocoles de surexpression et de purification de ces
deux enzymes sont en cours de mise au point. Une
caractérisation de l’enzyme provenant de Shewanella
sp. ANA-3 a pu être réalisée. Il a été également
intéressant de tester cette dernière sous forme
immobilisée pour mimer les conditions de la
production enzymatique industrielle de biomolécules puisque cette enzyme est
potentiellement attractive pour l’industrie pharmaceutique.
Les protéines purifiées permettront de déterminer leurs produits de dégradation, mais
également de déterminer leurs structures tridimensionnelles dans le but de comprendre les
mécanismes moléculaires de la formation des composés prébiotiques.
Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiotia: Introducing the concept of
prebiotics. J Nutr (1995). 125:1401-1412

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon 1
2008 – 2009
Etude du système télomères – télomérase – télosome dans l’hépatocarcinome
Lalla Manale EL IDRISSI
Unité d’Oncovirologie et Biothérapies, CNRS FRE3011
Pr WATTEL Eric
Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est un des
cancers les plus rependus dans le monde. Ce type
de cancer se développe habituellement sur des
foies cirrhotiques. Des infections chroniques,
telles que les hépatites B ou C, constituent des
facteurs de risque importants ainsi ue certaines
intoxications comme l’alcoolisme chronique. Un
système important dans la carcinogenèse
hépatique est le système télomères – télomérase –
télosome. Ce système est connu pour être
dérégulé dans la majorité des cancers. Dans ce
travail nous avons évalué les dérégulations du
système télomères – télomérase – télosome au
cours de la carcinogenèse hépatique in vivo. Pour
ce faire, nous avons mesuré l’activité télomérase
de même que l’expression des principaux gènes
du système dans des échantillons de foie
tumoraux, prétumoraux (cirrhotique) et normaux.
Des variations d’activité télomérase et des
modifications importantes de l’expression des
gènes on été observées aux différents stades de la
transformation maligne. Les deux résultats importants de ce travail sont que i. La majorité des
perturbations du système télomères – télomérase – télosome sont acquise dès le stade
cirrhotique et se maintiennent au stade tumoral ; ii. Il existe un patron de perturbations
spécifique de chacune des étiologies : infection par HBV ou HCV, alcoolisme ou cancer
développé sur foie sain.
Mots clés : Hépatocarcinome, cirrhose, virus hépatotropes, télomérase
Figure'1:'Représentation'des'dérégulations'du'
système'selon'le'type'de'cirrhose.'En'rouge'sont'
représentées'les'répressions'et'en'vert,'les'
activations.'

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon 1
2008-2009
« Etude d’une différence d’orientation de la 5α-dihydrotestostérone et de
l’œstradiol dans le site de liaison de la SHBG (Sex Hormone Binding Globulin)
par chimiomarquage d’affinité avec des dérivés stéroïdiens substitués en
positions 1 et 17α »
Elma EL KHOURI
INSERM U863- ‘Hormones Stéroïdes et Protéines de Liaison’
Responsables de stage : Mme Catherine Grenot et Mme Marie-Emmanuelle Million
Ce travail s’inscrit dans la poursuite de
recherches sur l’étude du site de liaison
des stéroïdes sur la protéine plasmatique
SHBG (Sex Hormone- Binding
Globulin). L’objectif du travail étant de
déterminer l’orientation de la 5α-
dihydrotestostérone (5α-DHT) et de
l’œstradiol (E2) dans le site de liaison de
la SHBG, nous avons envisagé un
chimiomarquage d’affinité par deux types
de chimimiomarqueurs stéroïdiens : les
premiers, substitués en position 17α ont
été précédemment synthétisés dans le
laboratoire et sont marqués au 14C; les
deuxièmes, substitués en position 1 sont
conçus pour permettre un suivi par
fluroescence par addition de
l’azidofluorescéine. Nous avons mené les
expériences de chimiomarquage avec les
dérivés substitués en position 17α sur la
SHBG plasmatique humaine que nous
avons purifiée. Après chimiomarquage,
l’adduit SHBG-stéroide a subi une digestion trypsique et les peptides ont été séparés par
HPLC. Les chimiomarqueurs étant marqués au 14C, un comptage de la radioactivité a permis
de déterminer les peptides sur lesquels le chimiomarquage s’était effectué. La spectrométrie
de masse a permis de mettre en évidence que les séquences peptidiques 136-154 et 135-140
sur lesquelles s’étaient liés respectivement les dérivés stéroïdiens en série 5α-DHT et E2
comportait la séquence HPIMR 136-140 commune aux deux peptides sur laquelle l’His136
possédant un centre nucléophile est la cible la plus probable. Ce résultat suggère que 5α-DHT
et E2 se lient avec la même orientation dans le site de liaison de la SHBG.

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon I
2008-2009
Interactions d’un fragment du collagène XVIII, l’endostatine, avec des protéines
matricellulaires
Marie FATOUX
Institut de Biologie et Chimie des Protéines
UMR 5086 CNRS - Université Lyon 1
Equipe Homéostasie, Dégénérescence et Thérapeutique des Tissus
Responsable de stage : Professeur Sylvie RICARD-BLUM
L’endostatine est un fragment du collagène XVIII localisé dans les lames basales vasculaires de
différents organes. Elle inhibe l’angiogenèse et la croissance tumorale mais son mécanisme
d’action reste mal connu. Nous avons étudié à l’aide du Biacore T100, basé sur la résonance
plasmonique de surface, l’interaction de l’endostatine avec deux protéines extracellulaires, la
protéine SPARC (Secreted Protein Acidic
and Rich in Cysteine) et la
thrombospondine-1. Ces protéines, dites
matricellulaires, régulent les interactions
entre les cellules et la matrice
extracellulaire mais ne jouent pas de rôle
structural. Elles sont également capables
d'interagir l'une avec l'autre.
La fixation de l’endostatine sur la protéine
SPARC nécessite la présence de calcium
et le complexe formé est modérément
stable. En revanche, l’endostatine forme
un complexe très stable (Figure ci-contre)
avec la thrombospondine-1. Les données
préliminaires montrent l'existence de deux
sites de fixation de l'endostatine sur la
thrombospondine-1.
L'endostatine, SPARC et la thrombospondine-1 sont toutes les trois impliquées dans le contrôle
de l'angiogenèse et elles pourraient former un complexe ternaire ou plusieurs complexes
bimoléculaires participant à ce processus. Cela nous conduira à étudier l'existence et la structure
de ces complexes potentiels par modélisation moléculaire. Une autre perspective consistera à
chercher si d'autres protéines matricellulaires sont capables de se lier à l'endostatine.
Interaction de la thrombospondine-1 trimérique
avec l’endostatine visualisée par résonance
plasmonique de surface