gdr pseudomonas

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CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
GROUPEMENT DE RECHERCHE
2008-2011
GDR PSEUDOMONAS
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RESPONSABLE : Patrick PLESIAT
EA3186
Laboratoire de Bactériologie
Faculté de Médecine
2, place Saint Jacques
25030 Besançon cedex
2
INTRODUCTION
I. Contexte général
Pseudomonas aeruginosa peut être considéré à bien des égards comme l’exemple-type
des bactéries pathogènes opportunistes. Pratiquement inoffensif chez l'individu sain, ce bacille
à Gram négatif de l’environnement, isolé pour la première fois par Schroeter en 1872, se
révèle en effet redoutable chez les sujets immuno-déficients, les malades intubés-ventilés des
services de réanimation ou ceux souffrant d'affections chroniques comme la mucoviscidose, la
dilatation des bronches, etc... L'enquête de prévalence organisée par l’InVS (Institut de Veille
Sanitaire) dans les hôpitaux français en 2001 lui attribuait la responsabilité de 11% de
l'ensemble des infections nosocomiales, 9,6% des infections urinaires, 9,7% des infections du
site opératoire, 15,5% des infections cutanéo-muqueuses et 21,7% des infections respiratoires
hautes et basses (http://www.invs.sante.fr). Une enquête similaire réalisée en 2006 est arrivée
au même constat : P. aeruginosa représente aujourd’hui un véritable problème de santé
publique.
Les raisons de cette situation préoccupante sont nombreuses et complexes. La
multiplication des gestes médicaux invasifs comme le cathétérisme, la chirurgie ou
l’endoscopie sur des patients de plus en plus fragiles (polytraumatisés, immunodéprimés
profonds, cancéreux, personnes âgées...) explique en partie le succès de cette espèce
saprophyte à l’hôpital. De même, la structure des établissements de soins où sont concentrés
malades et soignants favorise la propagation des bactéries les plus adaptables. L’utilisation
massive d’antiseptiques et d’antibiotiques tend, par ailleurs, à sélectionner un environnement
microbien peu diversifié où seules les espèces les plus résistantes survivent. En tout état de
cause, P. aeruginosa a trouvé à l’hôpital une niche écologique particulièrement favorable à
son développement.
Outre un arsenal assez impressionant de facteurs de virulence, P. aeruginosa possède les
mécanismes lui permettant de résister naturellement à de nombreux agents antibactériens, de
coloniser les surfaces inertes et les épithéliums, de former des biofilms protecteurs. Cette
capacité d'adaptation hors du commun, la bactérie le doit à la très grande taille de son génome
(5 à 7 Mb, soit dix fois celle d'un mycoplasme), son extrême versatilité métabolique et sa
capacité à percevoir son environnement grâce à de multiples senseurs membranaires
spécifiques.
De manière encore plus inquiétante, l’administration répétée d’antibiotiques chez des
patients fragilisés (réanimation, hématologie/oncologie) ou souffrant de mucoviscidose a
favorisé ces dernières années l’émergence de souches de P. aeruginosa résistantes à tous les
antibiotiques commercialisés. Le nombre croissant de ces souches dites “toto-résistantes” fait
craindre un retour à l’ère pré-antibiotique où les moyens thérapeutiques étaient presque
inexistants. Cette évolution s’inscrit, par ailleurs, dans un contexte actuel peu favorable où les
recherches et les innovations pharmaceutiques en matière d’antiinfectieux se font de plus en
plus rares. Il est admis aujourd’hui que la mise au point de nouveaux agents antibactériens
doit dorénavant s’appuyer sur une meilleure connaissance de la physiologie et de la génétique
bactérienne, de façon à identifier les cibles cellulaires dont l’inactivation entrainera une baisse
de la pathogénicité sans pour autant imposer une pression de sélection. C’est un défi que la
recherche publique doit relever. A l’échelle européenne, une incitation forte à travers le 7ème
programme cadre a été lancée afin de favoriser les actions multidisciplinaires (HEALTH2007-2.3.1-1 : “Novel targets for drugs against Gram negative bacteria ; HEALTH-20072.3.1-4 : “Molecular epidemiology to control nosocomial and community spreading of highly
virulent multi-drug resistant strains of bacterial pathogens” ; HEALTH-2007-2.3.1-5 : “Health
and economic cost of antimicrobial resistance” ; HEALTH-2007-2.1.2-5 : “Multidisciplinary
3
fundamental genomics and molecular biology approaches to study basic biological processes
relevant to health and diseases”).
II. Le modèle P. aeruginosa
A l’instar de quelques autres espèces (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis...), P. aeruginosa représente un modèle
d’étude spécifique. C’est aussi l’enjeu d’une compétition internationale intense, tant sur le
plan de la recherche fondamentale que sur celui de la recherche appliquée, notamment
thérapeutique. Cette bactérie est considérée, en effet, comme le paradigme des espèces
environnementales pathogènes opportunistes de l’homme. A ce titre, elle intéresse des
spécialistes de formations très différentes (microbiologistes, biochimistes, chimistes,
structuralistes, médecins, vétérinaires, épidémiologistes, etc...) conscients du fait qu’il est plus
que jamais nécessaire de réunir les compétences pour pouvoir mieux appréhender un modèle
aussi complexe. Elle intéresse aussi le monde industriel pour des applications diagnostiques.
Le séquençage complet du génome de la souche de référence PAO1 (C.K. Stover et al.,
Nature 2000, 406 : 959-964) et de celui de plusieurs autres isolats (PA14, 2192, C3719,
PACS2) a ouvert récemment de nouvelles perspectives dans le domaine de la génomique
comparative. Les études transcriptomiques globales sont désormais facilitées par la
commercialisation de puces à ADN représentatives de la totalité du génome de la souche
PAO1 (Affymetrix®). Enfin, l’intérêt croissant des firmes de biotechnologie pour cette espèce
s’est traduit par la mise au point de nouveaux outils d’analyse (par exemple, Clondiag
chips®).
Au niveau international, une recherche dynamique s’est organisée autour de plusieurs
grands thèmes dont certains se recouvrent en partie :
-
L’habitat : écosystèmes naturels et hospitaliers ;
-
La structure et l’évolution des populations : génomique comparative, plasticité
génomique, clones hypermutateurs ;
-
L’épidémiologique des souches : marqueurs génotypiques, réservoirs, modes de
transmission ;
-
Les communautés microbiennes : quorum sensing, biofilm ;
-
Les bases de la pathogénicité : adhésion, facteurs de virulence, îlots de pathogénicité,
captation du fer ;
-
La réponse aux stress biotiques et abiotiques : interaction avec l’hôte, résistance aux
agents antiinfectieux ;
-
L’optimisation thérapeutique : modèles infectieux expérimentaux, drug design,
vaccins, études cliniques.
Projet de GDR Pseudomonas
Notre projet prévoit de créer un réseau de ressources et de compétences au niveau
national sur le thème principal P. aeruginosa. Compte tenu de la proximité phylogénétique de
cette espèce avec d’autres Pseudomonas fluorescents du sol (P. putida et P. fluorescens), le
GDR bénéficiera de l’expertise de microbiologistes environnementaux travaillant sur ces
bactéries. Le réseau aura pour mission de promouvoir les recherches multidisciplinaires sur
des sujets ciblés hautement compétitifs en favorisant les interactions entre des équipes
4
complémentaires, reconnues pour leur excellence scientifique. Outre le fait de créer une
dynamique de recherche, une telle organisation contribuera à rendre plus visible la
communauté scientifique et médicale travaillant sur les Pseudomonas en France. Elle devrait
également faciliter la réponse aux appels d’offre nationaux et européens (financements dans le
cadre du 7ème PCRD). A cet égard, il serait souhaitable de faire évoluer à terme ce GDR vers
un GDR européen en multipliant les partenariats avec d’autres pays, le Royaume-Uni
notamment (Alain Filloux, Londres).
Le rapprochement des équipes se fera à travers des collaborations scientifiques, la tenue
de réunions régulières (partage de savoir-faire et d’informations), des échanges de chercheurs
(doctorants, stagiaires), une conférence annuelle, l’enseignement d’un module de Master 2
intitulé “P. aeruginosa et états infectieux graves” (Université de Lille 2, M2 “Maladies
Transmissibles et Pathologies Tropicales”) et des services communs (plateformes de
génomique et de protéomique, analyses bioinformatiques). La formation doctorale sous la
forme de thèses en co-tutelle sera également favorisée par le GDR avec la prise en charge des
frais de déplacement et d’hébergement des étudiants concernés.
Onze équipes se sont portées candidates pour constituer un GDR Pseudomonas (8 CNRS,
2 universitaires, 1 INRA), autour de trois thèmes de travail (Work Packages 1, 2 et 3) :
-
WP1 : Identification et étude des voies de signalisation impliquées dans la virulence en
réponse aux modifications de l’environnement (responsable : Sophie de Bentzmann
UPR 9027) ;
-
WP2 :
Assemblage
dynamique
et
fonctionnel
membranaires (responsable : Arnaud Ducruix UMR 8015);
-
WP3 : Adhésion et biofilm (responsable : Thierry Jouenne UMR 6522).
des
systèmes
La contribution de chacune des équipes à ces différents thèmes (résumée page 6) est
détaillée ci-après. Il est important de souligner que ces équipes ont, pour la plupart, des
collaborations entre elles qu’elles souhaitent voir intensifiées par une organisation en GDR.
Interactions hôte-Pseudomonas
WP 1
Perception-transduction des
signaux
Systﾪes �deux composants
Coordination des rﾪonses cellulaires
[cdiGMP]
WP 2
Rﾪctions dﾪdaptation
Captation-transport du fer
Efflux actif des inhibiteurs
Cytotoxicit�dﾪendante du SSTT
WP 3
Adhﾪence
Formation de biofilm
Colonisation, infection aigu�ou chronique
6
RESUME DES ACTIONS AU SEIN DU GDR PSEUDOMONAS
EQUIPE
WP1
WP2
WP3
UPR9027 CNRS
Marseille
(Sophie de Bentzman)
Systèmes à deux
composants, c-di-GMP :
génétique moléculaire,
profils transcriptionnels,
tests biochimiques et
phénotypiques
Analyse de la stucture
des biofilms, banque de
mutants PA14, analyse
fonctionnelle des
sécrétines XcpQ et HxcQ
Pili de type VIa et
systèmes Cup : génétique
moléculaire, puces
adhésion, tests sur
cultures cellulaires
UMR6522 CNRS
Rouen
(Thierry Jouenne)
Croissance en biofilm :
tests d’adhésion sur
supports inertes ou
cellulaires
UMR7175 CNRS
Strasbourg
(Isabelle Schalk)
Localisation subcellulaire
des EAL, drug design
PA3729-PA3731 :
fonction et rôle dans la
formation du biofilm
Analyse structurale et
fonctionnelle des
systèmes de transport du
fer, design d’inhibiteurs
Etude structurale et
moléculaire de
l’interaction lectinesligands ou pili-ligands,
design d’inhibiteurs
UPR5301 CNRS
Grenoble
(Anne Imberty)
UMR8015 CNRS
Paris
(Arnaud Ducruix)
Analyse structuralefonctionnelle des EAL
Analyse structuralefonctionnelle des pompes
d’efflux Mex et des
sécrétines XcpQ et HxcQ
UMR5092 CNRS
Grenoble
(Ina Attrée)
Mesure de la cytotoxicité
TTSS-dépendante
Analyse structurale et
fonctionnelle du TTSS
(assemblage, interaction
cellules eucaryotes
design d’inhibiteurs)
UMR 5075 CNRS
Grenoble
(Andrea Dessen)
Analyse structurale de
protéines recombinantes ;
interactions protéineprotéine
Analyse structurale et
fonctionnelle du TTSS
UMR 5100 CNRS
Toulouse
(Gwennaele Fichant)
Analyses
bioinformatiques
(génomique)
Analyses
bioinformatiques
(génomique)
EA2698
Lille
(Benoît Guery)
Evaluation de la
virulence-résistance de
mutants EAL dans des
modèles animaux
Evaluation de la
virulence de mutants
TTSS ou d’efflux dans
des modèles animaux
EA3186
Besançon
(Patrick Plésiat)
Etude de l’activité in
vitro des antibiotiques sur
des mutants EAL
Fonctionalité et
régulation génétique des
pompes d’efflux actif de
type Mex
UMR 1229 INRA
Dijon
(Philippe Lemanceau)
Fonctionnalité des
sidérophores dans les
interactions microbesplantes
Evaluation d’une
approche vaccinale et de
la virulence de mutants
chez l’animal
7
WORK PACKAGE 1 (responsable Sophie de Bentzmann)
Identification et étude des voies de signalisation
impliquées dans la virulence de P. aeruginosa en
réponse aux modifications de l'environnement
I. Les mécanismes de virulence de P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste à large spectre
d'hôtes, responsable de nombreuses infections nosocomiales chez l'homme et en particulier
chez les patients immunodéprimés ou atteints de mucoviscidose. Les infections générées par
P. aeruginosa peuvent être divisées en deux grands types : les infections aiguës, caractérisées
par la sécrétion de nombreuses toxines et les infections chroniques caractérisées par la
formation d'une communauté bactérienne persistante organisée en biofilm au niveau du site
d'infection. Au cours des infections aiguës, P. aeruginosa va sécréter par l'intermédiaire de
différents systèmes de sécrétion un grand nombre d'enzymes hydrolytiques, de toxines et de
facteurs cytotoxiques. La virulence de P. aeruginosa au cours des infections aigües est
particulièrement associée au mécanisme de sécrétion de type III (TTSS), dans lequel les
effecteurs sont injectés directement dans le cytoplasme des cellules hôtes (voir pour détails
WP2). Ces facteurs sécrétés vont entraîner une réponse inflammatoire sévère et une nécrose
des tissus infectés pouvant provoquer une septicémie à l'issue fatale. Lors des infections
chroniques, la persistance de P. aeruginosa au niveau des sites d'infection est due à sa
capacité à former une structure appelée biofilm. Ce biofilm est une communauté bactérienne
organisée et englobée dans une matrice extracellulaire complexe. La structure et le mode de
vie en biofilm offrent aux bactéries une résistance accrue face au système immunitaire de
l'hôte mais également face aux composés thérapeutiques tels que les antibiotiques (voir pour
détails WP3). La persistance de cette communauté bactérienne au niveau du site d'infection
entraîne une inflammation chronique et localisée qui conduit peu à peu à la destruction du
tissu ou de l'organe sous jacent.
I. Adaptation des processus de virulence en fonction de l'environnement
8
environnementales. En effet, l'établissement d'une infection va dépendre de sa capacité à
clairement percevoir son environnement afin d'aboutir à l’expression des mécanismes de
virulence les plus adaptés pour échapper aux défenses immunitaires de l'hôte par
l’enclenchement de programmes génétiques adaptés. Les voies de signalisation qui
déterminent le choix du mode de virulence de P. aeruginosa le plus adapté aux conditions
environnementales sont encore mal connues. Deux principaux types de systèmes de vigilance
permettent à la bactérie, la perception des variations environnementales et l'enclenchement
d'une réponse physiologique adaptée. Il s'agit des systèmes de chimiotactisme et des
systèmes à deux composants (TCS). P. aeruginosa est une bactérie particulièrement
réactive aux changements environnementaux si l’on en juge par le nombre extrêmement élevé
de ces deux types de systèmes, à savoir 64 systèmes à deux
composants codés par 129 gènes et 5 systèmes de
chimiotactisme qui perçoivent un signal extérieur et le
transduisent par une voie de signalisation vers une réponse
cellulaire adaptée. Les systèmes à deux composants appelés
aussi phosphorelais sont les systèmes les plus utilisés par
les bactéries pour détecter les modifications de leur
environnement (Figure 1).
Figure 1 : Représentation des systèmes à deux composants
chez P. aeruginosa (Rodrigue et al., 2000 ; Ventre et al.,
2004)
Ces systèmes comportent dans leur forme la plus
simple deux protéines : un senseur qui détecte un ou plusieurs signaux environnementaux et
un régulateur de réponse qui est, dans la majorité des cas, un régulateur transcriptionnel.
Lorsqu'un signal est perçu par le senseur, localisé le plus souvent au niveau de la membrane
interne, ce dernier va s'autophosporyler et transférer son phosphate au régulateur de réponse
par une interaction protéine-protéine transitoire. Le transfert de phosphate se fait alors en
deux étapes. Le régulateur une fois activé va réguler l'expression des gènes cible grâce à son
domaine de fixation à l’ADN. Dans de nombreux cas, le transfert de phosphate entre le
senseur et le régulateur de réponse ne s’effectue pas en deux étapes mais en quatre. Dans ce
cas, deux domaines additionnels sont requis : (i) un second domaine receveur fusionné au
senseur, homologue au domaine receveur des régulateurs de réponse, et (ii) un domaine
appelé Histidine Phosphotransfert (Hpt) qui peut être également fusionné au niveau du
senseur ou libre dans le cytoplasme. Les senseurs portant les deux domaines additionnels sont
appelés senseurs non-orthodoxes et les senseurs portant uniquement le domaine receveur sont
appelés senseurs hybrides. Dans la classe des phosphorelais de type hybride, le transfert du
phosphate entre le senseur et le régulateur de réponse partenaire nécessite l’intervention d’une
protéine Hpt (au nombre de 3, sur le génome HptA, B, et C) qui va recevoir le groupement
phosphate du senseur et va ensuite le transférer au régulateur de réponse (Figure 1). Ces
dernières années, plusieurs gènes codant pour des protéines appartenant à des systèmes à deux
composants ont été identifiés comme jouant un rôle important dans la régulation de
l'expression des facteurs de virulence de P. aeruginosa (Voir revue Ventre et al., 2007). Il
existe des systèmes à deux composants dont on connaît le senseur mais dont on ne connaît pas
les régulateurs de réponse associés malgré le fait que l’on ait pu associer à ces senseurs des
gènes cible. C’est le cas des senseurs hybrides LadS et RetS (Ventre et al., 2006 ; Goodman
et al., 2004) (Voir Figure 2). Ces deux senseurs gouvernent de façon antagoniste l’expression
des gènes impliqués dans le biofilm et dans la cytotoxicité médiée par le système de sécrétion
de type III (TTSS) et donc composent un switch moléculaire d’adaptation entre deux
9
modes de vie bactériens différents. Si ces deux senseurs LadS et RetS sont des protéines
différentes et indépendantes, il semble que la voie de signalisation enclenchée par l’un ou
l’autre converge vers l’expression d’un gène codant pour un petit ARN régulateur non codant
appelé RsmZ. Ce gène rsmZ est régulé de manière opposée par ces deux senseurs. En effet, le
senseur LadS induit la transcription de rsmZ et au contraire, le senseur RetS réprime la
transcription de ce gène (Ventre et al., 2006, Goodman et al. , 2004). Cet ARN régulateur
RsmZ adopte une structure secondaire en tige boucle dont la fonction est de titrer la protéine
RsmA, un répresseur RNA-binding. Ce régulateur post-transcriptionnel non associé à RsmZ a
la capacité d’activer le TTSS (Mulcahy et al., 2006) et de réduire le taux d’ARNm des gènes
impliqués dans la sécrétion de matrices exopolysaccharidiques (Burrowes et al., 2006). Le
lien direct entre RsmA et le réseau de protéines régulatrices décrites pour contrôler le master
régulateur du TTSS, ExsA, reste à définir. En effet la synthèse du TTSS est régulée de façon
extrêmement complexe et se trouve sous la dépendance stricte du facteur de transcription
ExsA. L’activité de ExsA est inhibée par interaction avec des ligands protéiques. Deux
ligands ont été identifiés à ce jour: PtrA, petite protéine synthétisée en réponse à un stress
cuivrique, et l’anti-activateur ExsD qui appartient à une cascade couplant
« sécrétion/synthèse ». Cette cascade comprend aussi les protéines ExsC (anti-anti-activateur)
et ExsE (sécrétée). Cependant le mécanisme d’activation de la transcription par ExsA reste à
éclaircir en particulier les interactions moléculaires existant entre les différentes protéines
régulatrices et leurs retombées en terme de régulation de la virulence.
L’action dichotomique des senseurs LadS et RetS sur le contrôle de la virulence via
l’action de RsmZ et Y nécessite l’intervention du TCS GacA-GacS, le régulateur GacA étant
essentiel à la transcription des gènes codant pour les petits ARN régulateurs non codant rsmZ
et rsmY (Kay et al., 2006). RsmY et RsmZ agissent de concert pour titrer RsmA et moduler
l’activité régulatrice post-transcriptionnelle de RsmA. Le niveau d’intrication de ces voies de
signalisation Gac/Lad/Ret reste à déterminer.
Figure 2 : Le switch moléculaire LadS-RetS chez P. aeruginosa
Phosphodiesterases
La
majorité
des
contrôle directement l'expression
au
niveau
des
régions
régulateurs
de réponse
des gènes cible en se fixant
promotrices de ces derniers.
Biofilm
Formation
Biofilm
Dispersion
Diguanylate cyclases
10
Néanmoins tous les régulateurs de réponse ne portent pas le motif de fixation à l'ADN et
certains régulent l'expression des gènes cible par l'intermédiaire d'une activité enzymatique
qui génère un composé chimique agissant comme second messager intracellulaire, le diGuanosyl monophosphate cyclique (c-di-GMP). Cette concentration intracellulaire de c-diGMP est contrôlée par deux activités enzymatiques antagonistes : l'activité diguanylate
cyclase (DGC) et l'activité phosphodiesterase (PDE). Les enzymes portant une activité DGC
présentent un motif GGDEF conservé et sont impliquées dans la biosynthèse du c-di-GMP.
Au contraire les enzymes portant une activité PDE présentent un motif conservé EAL et sont
impliquées dans la dégradation du c-di-GMP en GMP. Le taux de c-di-GMP intracellulaire
semble être un indicateur cellulaire par lequel la bactérie va choisir un mode de vie en biofilm
ou planctonique (D’argenio et al., 2004 ; voir Figure 3).
Figure 3 : Contrôle du pool intracellulaire de c-di-GMP par les activités
antagonistes PDE et DGC et impact sur le mode de vie planctonique ou en biofilm
L'identification d'un lien direct entre les systèmes à deux composants et les variations
du pool de c-diGMP est illustrée par le système RocS1/RocA1/RocR (Figure 4). Ce système
décrit pour réguler les gènes impliqués dans la formation du biofilm comporte le senseur
RocS1 qui, en réponse à un signal, s'autophosporyle et transfère son phosphate au régulateur
de réponse RocA1, ce dernier une fois activé va réguler l'expression des gènes cible
directement par son domaine de fixation à l’ADN de type HTH (pour Hélice-Tour-Hélice),
comme cupB et cupC, gènes dont la fonction
est de favoriser la vie en biofilm (Kulasekara
et al., 2005, Ruer et al., 2007).
Figure 4 :
Le système Roc chez P. aeruginosa
Cependant ce senseur est capable de
transférer son phosphate à un second régulateur de réponse appelé RocR qui ne comporte pas
en position C-terminale un motif de fixation à l'ADN mais un domaine enzymatique de type
phosphodiestérase (PDE) contenant un motif EAL. Ce motif EAL est impliqué dans la liaison
11
et l'hydrolyse du c-di-GMP (Kulasekara et al., 2005) et la diminution du pool intracellulaire
de c-di-GMP a une action antagoniste, visant à réduire la capacité de la bactérie à former un
biofilm.
Si la production de c-di-GMP peut être l'étape finale de l'activation d'un phosphorelais,
on observe que de nombreuses protéines présentent sur le génome de P. aeruginosa
possèdent, soit un domaine PDE, soit un domaine DGC, soit les deux, (au total 38 protéines)
(Kulasekara et al., 2006) et qu'elles ne semblent pas toujours liées à un système à deux
composants. Ce constat suggère donc que d'autres voies de signalisation ne faisant pas
intervenir de système à deux composants mais des protéines impliquées dans le métabolisme
du c-di-GMP joueraient un rôle important dans l'adaptation de P. aeruginosa à son
environnement. Cette indépendance entre systèmes à deux composants et pool intracellulaire
de c-di-GMP est illustrée par la relation entre le mode de vie en biofilm et la résistance aux
antibiotiques. Des études récentes montrent que la concentration intracellulaire de c-di-GMP
agirait comme un second messager important dans la formation du biofilm et permettrait
d’établir un lien direct entre la formation d'un biofilm et la résistance aux antibiotiques
(Römling and Amikam, 2006). C’est le cas du phénotype RSCV (Rough Small Colony
Variant) (Drenkard and Ausubel, 2002) qui associe une forte capacité à former des biofilms et
une résistance élevée aux aminosides. La réversion de ce phénotype en fonction de la
composition du milieu de croissance suggère un contrôle sous la dépendance des conditions
environnementales. La fréquence de réversion est augmentée chez des mutants invalidés dans
le gène pvrR codant pour une protéine contenant un motif EAL et donc une activité PDE
(Drenkard and Ausubel, 2002). Par ailleurs, il a été montré que l'exposition à des
concentrations subinhibitrices d'aminoside comme la tobramycine entraîne chez P.
aeruginosa une capacité accrue à former des biofilms. Chez des patients atteints de
mucoviscidose fréquemment traités par la tobramycine, des souches résistantes à cet
aminoside sont isolées de façon extrêmement fréquente et le gène responsable de cette
résistance induite à la tobramycine désigné arr (aminoglycoside response regulator) a été
identifié. Ce gène arr code pour une protéine de la membrane interne qui comprend, d’une
part, un domaine périplasmique n'ayant aucune homologie de séquence avec les protéines
présentes dans différentes bases de données et, d’autre part, un domaine EAL cytoplasmique
en position C-terminale (Hoffman et al., 2005). Cette protéine Arr a été clairement mise en
cause dans la formation des biofilms en réponse à des concentrations subinhibitrices
d'aminoside. L'activité phosphodiestérase de Arr est indispensable à sa fonction puisque la
mutation de son site actif EAL supprime la réponse biofilm aux aminosides. Cette observation
semble être en contradiction avec le modèle général d’action du c-di-GMP dans lequel
l'augmentation de la concentration de c-di-GMP conduit à la formation de biofilm. Les
partenaires et le mode de fonctionnement de cette protéine Arr sont encore inconnus et en
particulier la fonction de son domaine périplasmique dans la détection direct ou indirect des
aminosides.
I. Objectifs du travail
Les voies de signalisation que P. aeruginosa utilise pour adapter sa physiologie aux
conditions environnementales auxquelles il est exposé font intervenir des systèmes à deux
composants, des systèmes de chimiotactisme et des messagers intracellulaires comme le c-diGMP dont le taux est contrôlé par des activités enzymatiques antagonistes de type PDE et
DGC, certains de ces systèmes pouvant avoir des liens entre eux ou être indépendants les uns
des autres. Nous avons donc choisi de caractériser des systèmes à deux composants
particulièrement impliqués dans la virulence et la pathogénicité de P. aeruginosa, incluant des
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systèmes contrôlant le pool de c-di-GMP, mais également des systèmes contrôlant le pool
intracellulaire de c-di-GMP certainement de façon indépendante des systèmes à deux
composants et reliant le mode de vie en biofilm à la résistance aux antibiotiques.
Notre objectif est d'une part d'identifier ces différentes voies de signalisation
impliquées dans la virulence de P. aeruginosa (protéines impliquées et leur position dans la
cascade de transduction) et d'autre part de déterminer leur impact sur le pouvoir pathogène de
la bactérie. Les équipes impliquées associent une combinaison d'approches pluridisciplinaires
englobant la biologie structurale, la génomique, la bioinformatique, la génétique moléculaire,
la biologie cellulaire ou encore la microbiologie clinique. En raison du grand nombre de
protéines pouvant être impliquées dans ces voies de signalisation (64 systèmes à deux
composants, 5 systèmes de chimiotactisme et 38 protéines ayant une activités PDE ou DGC)
nous allons en parallèle à cette recherche de nouvelles voies de régulation tenter de
caractériser les voies déjà décrites.
Nos objectifs seront :
- la recherche de l’implication du système GacS/GacA dans l’action dichotomique des
senseurs LadS et RetS sur le contrôle la virulence de P. aeruginosa (TTSS/biofilm). Ceci
impliquera d’une part l’identification des protéines Hpt partenaires des senseurs LadS et RetS
mais également des candidats régulateurs de réponse et d’autre part les interactions entre cette
voie LadS ou RetS et leurs partenaires respectifs et la voie GacS/GacA.
- L’identification des mécanismes d’activation de la transcription du TTSS par ExsA,
son master régulateur et l’implication de protéines régulatrices dans ce mécanisme. Ceci
impliquera, d’une part l’étude des interactions moléculaires existant entre les différentes
protéines régulatrices Exs ou PtrA et leur répercussion sur la virulence TTSS-dépendante et,
d’autre part, la recherche d’un lien moléculaire direct entre l’ensemble RsmA-RsmY-RsmZ et
le réseau de protéines régulatrices qui contrôle le TTSS.
- La définition du rôle de la protéine Arr dans la résistance aux aminosides et le
contrôle du biofilm. Nous rechercherons quelle est la fonction du domaine périplasmique
d’Arr afin de déterminer si ce domaine joue le rôle direct de senseur aux aminosides. Par
ailleurs, nous nous intéresserons à comprendre comment la diminution locale de la
concentration en c-di-GMP conduit à une réponse globale sur la formation du biofilm.
1) Identifier les partenaires protéiques de chacune des voies de signalisation.
L'identification des partenaires d'une cascade de régulation sera réalisée en utilisant
des stratégies diversifiées et complémentaires. Plusieurs protéines appartenant à des systèmes
à deux composants impliquant des histidines kinases non-orthodoxes ou hybrides ont déjà été
identifiées dans la régulation de la virulence chez P. aeruginosa, en particulier les senseurs
LadS, RetS et les systèmes GacS/GacA. L’étude des interactions entre la voie LadS ou RetS
(et leurs partenaires respectifs) et la voie GacS/GacA sera menée grâce aux stratégies
suivantes :
•
Stratégie bioinformatique:
Les interactions entre les différents candidats des voies de signalisation pourront être
prédites par des approches génomiques et phylogéniques. Alternativement, l’analyse des
13
profils de divergence/conservation entre les séquences des différents domaines protéiques
impliqués dans l'interaction senseur/régulateur de réponse, senseur/protéine Hpt et protéine
Hpt/ régulateur de réponse devraient permettre de prédire potentiellement de nouvelles
interactions entre de nouveaux partenaires (UMR 5100, Toulouse).
Dans la mesure des données disponibles sur d'autres modèles bactériens, nous
chercherons à élargir la liste des partenaires protéiques des voies de signalisation sur la base
de similarité de séquences. Les résultats des études de transcriptome seront enrichis par la
recherche de motifs conservés dans les régions promotrices des gènes présentant des profils
similaires. La méthode envisagée est celle développée par T. Bailey (MEME et MAST suite
Bailey and Elkan, 1995 ; Grundy et al., 1997). Les données issues de la génomique
comparative (conservation de voisinage de gènes, fusion de domaines, profils
phylogénétiques ainsi que l’ensemble des informations disponibles sur des sites WEB comme
STRING (von Mering et al., 2005) seront systématiquement exploitées afin d'analyser les
relations fonctionnelles entre les partenaires déjà identifiés et avec l'espoir d'identifier de
nouveaux partenaires.
Un aspect plus méthodologique, concerne la mise en oeuvre de méthodes
bioinformatiques pour l'identification des interactions protéines/protéines. Plusieurs méthodes
ont été proposées : elles reposent sur l'hypothèse que les protéines en interaction doivent coévoluer de façon à maintenir leur complémentarité au niveau de leur surface d'interaction
(Pazos et al., 2005; Jothi et al., 2006). Cette contrainte se traduit par des trajectoires
évolutives congruentes. Il est donc possible, à partir des alignements multiples réalisés sur
une paire de familles de protéines d'estimer le degré de co-évolution de ces familles. Comme
la comparaison directe d'arbres phylogénétiques n'est pas une tâche aisée (Jothi et al., 2005) et
facilement automatisable, l'alternative généralement choisie, consiste à calculer un coefficient
de corrélation entre les matrices de distances. En répétant la procédure sur l'ensemble de
paires possibles, on peut en déduire les paires qui présentent les co-évolutions les plus
marquées. Elles sont de bonnes candidates pour des paires de protéines en interaction. Dans le
cas de protéines constituées de plusieurs domaines, il est préférable de réaliser ces calculs sur
les domaines pris indépendamment. Ce type d'approche peut être réalisée à l'échelle d'un
génome avec des résultats d'une qualité similaire à des approches expérimentales mais pour
un plus faible coût et une mise en oeuvre plus rapide. Les prédictions présentant les meilleurs
scores seront testées expérimentalement.
Une alternative à ces approches globales est de rechercher des co-évolutions entre
sites sur les alignements multiples des deux familles de protéines. En effet, les contacts entre
protéines n'impliquent pas forcément un nombre élevé de résidus mais des résidus spécifiques
dispersés le long de la séquence. Or par des approches globales, l'information apportée par ces
résidus peut se retrouver noyée dans un ensemble de sites ne présentant pas de contraintes
fonctionnelles liées à l'interaction (Pazos et Valencia, 2002; Tillier et al., 2006; Kim et al.,
2006). En outre, ces méthodes présentent l'avantage de prédire précisément les acides aminés
impliqués dans l'interaction.
Ce type de méthode a également un autre intérêt dans le cadre de ce projet. En effet,
les systèmes à deux composants renferment un nombre significatif de systèmes orphelins
appartenant à deux (trois) familles de gènes (senseur et régulateur de réponse) constituées de
nombreux paralogues. Il existe donc un nombre élevé de combinaisons possibles entre ces
14
différents systèmes et la question est de trouver la combinaison la plus probable. Le critère à
maximiser peut être, par exemple, la corrélation entre les distances des deux ensembles de
protéines comme dans la méthode TSEMA (Izarzugaza et al., 2006).
Nous proposons donc de tester et si nécessaire d'adapter ces différents types de méthodes
à l'analyse des partenaires protéiques des voies de signalisation de P. aeruginosa.
•
Stratégie génétique et génomique :
Cette stratégie repose sur l'hypothèse que des protéines partenaires impliquées dans
une même voie de signalisation doivent participer à la régulation des mêmes gènes cible.
Nous allons donc chercher de manière expérimentale à identifier les différents partenaires
d'une même cascade de régulation en comparant les phénotypes et les profils de transcriptome
des souches délétées ou de souches surexprimant, soit de façon ciblée un gène candidat
obtenu par l’approche bioinformatique, soit de façon systématique les gènes codant les
protéines Hpt et les régulateurs orphelins. Les profils de transcriptome seront réalisés grâce
aux puces pangénomiques développées à Marseille (UPR 9027, Marseille) et nous tirerons
partie de l’analyse des phénotypes des souches délétées ou des souches surexprimant l'un des
gènes candidats afin d’identifier de possibles partenaires d’une voie de signalisation. Cette
stratégie a déjà permis d’identifier ou de confirmer plusieurs couples de systèmes à deux
composants tels que le système GacS/GacA, le système RocS1/RocA1/RocR. Cette approche
s’est également révélée extrêmement puissante pour identifier des interconnexions entre les
senseurs LadS, RetS et le système GacS/GacA (Ventre et al., 2006 ; Goodman et al., 2004).
•
Stratégie interactions protéine-protéine
La transduction du signal entre la protéine réceptrice et la protéine effectrice nécessite
l'interaction spécifique de ces deux partenaires. Afin d'identifier les protéines partenaires
d'une même voie de signalisation, nous allons rechercher les interactions entre toutes les
protéines identifiées. Ceci pourra être entrepris par une approche utilisant un système double
hybride chez E. coli. Dans le cadre de l'identification des partenaires dans les voies
impliquant les systèmes à deux composants, les interactions entre senseur/régulateur,
senseur/protéine Hpt et protéine Hpt/ régulateur de réponse seront prioritairement recherchées
(UPR 9027, Marseille). Cette stratégie a déjà permis par le passé l'identification des
interactions existant entre le senseur non orthodoxe RocS1 et les deux régulateurs de réponse
RocA1 et RocR (Kulasekara et al., 2004). Cette approche sera rapidement appliquée à l’étude
des voies de signalisation impliquant les senseurs LadS et RetS afin d’identifier leurs
partenaires spécifiques dans la cascade de transduction du signal. Nous rechercherons une
interaction entre les domaines receveurs (D1) de LadS et RetS et les trois protéines Hpt
codées par le génome de P. aeruginosa. Pour compléter la cascade de régulation, nous
rechercherons ensuite par cette même approche les régulateurs de réponse capables d’interagir
avec les protéines Hpt partenaires de LadS et RetS.
Une approche plus ciblée sera réalisée sur les interactions moléculaires existant entre
les différentes protéines régulatrices (complexes ExsA/PtrA, ExsA/D et aussi ExsD/C,
ExsC/E) et leurs retombées en terme de régulation de la virulence. Ainsi les protéines seront
surproduites, seules ou en présence de leur partenaire, puis purifiées, seules ou en complexes,
les domaines interagissant seront définis, ainsi que les affinités d’interaction. Les approches
interdisciplinaires de génétique, biochimie et biologie structurale (RMN et cristallographie)
seront employées (UMR5092, Grenoble). Le lien direct entre RsmA et le réseau de protéines
15
régulatrices décrites pour contrôler le master régulateur du TTSS, ExsA, sera également
envisagé grâce aux approches citées plus haut.
2) Caractériser les voies de signalisation qui gouvernent la virulence de
P. aeruginosa.
Nous allons caractériser les phénotypes de souches délétées ou de souches
surexprimant l'un des gènes candidats supposés appartenir à la voie LadS/RetS /GacS. Cette
caractérisation phénotypique des souches inclura :
- L'évaluation de leur capacité à former des biofilms (UPR9027, Marseille ; UMR
6522, Rouen) et à injecter des effecteurs cytotoxiques dans les cellules eucaryotes par
l'intermédiaire du système de sécrétion de type III (UMR5092, Grenoble).
- L'évaluation de leur virulence sur le modèle animal Caenorhabditis elegans (UPR 9027,
Marseille) et sur un modèle d'infection pulmonaire murin (EA 2689, Lille). Ces modèles
présentent l’avantage d’évaluer directement le rôle et l’importance des différentes voies de
signalisation identifiées dans la virulence de P. aeruginosa et ainsi de permettre une
classification de ces voies de signalisation basée sur leur impact au niveau du pouvoir
pathogène de la bactérie.
- Plusieurs voies de régulation de P. aeruginosa semblent réguler, en plus des facteurs
directement impliqués dans la virulence, l’expression de gènes impliqués dans la résistance
aux agents antibiotiques. En effet, il a été montré que la protéine Arr est impliquée dans la
résistance aux aminosides et que le senseur RetS contrôle le gène de résistance à la
kanamycine. Nous allons donc mesurer la résistance des souches délétées ou surexprimant
l'un des gènes d’intérêt vis-à-vis de différents inhibiteurs de type antibiotiques, antiseptiques
et métaux (EA3186, Besançon).
3) Rechercher les inhibiteurs chimiques capables de bloquer l'activation des
cascades de signalisation.
La colonisation de l'hôte par P. aeruginosa va dépendre de sa capacité à percevoir via
ses voies de signalisation, son environnement. Le blocage d'une ou plusieurs de ces voies de
signalisation peut empêcher l'établissement de l'infection. Nous nous proposons de rechercher
des composés chimiques capables d'interférer avec le fonctionnement des voies de
signalisation identifiées en réalisant le criblage haut débit d'une chimiothèque. Pour cela, nous
allons tirer parti des résultats de l'analyse du transcriptome afin de rechercher un gène
rapporteur spécifiquement régulé en réponse à l'activation d'une des voies de signalisation. La
création de fusions transcriptionelles entre le promoteur de ces gènes et le gène lacZ
permettra d'identifier les composés capables d'interférer avec l'activation de la voie de
signalisation spécifique du gène rapporteur choisi (UMR 7175, Strasbourg).
Cette stratégie sera rapidement mise en œuvre afin d’identifier les composés chimiques
capables de perturber le fonctionnement des senseurs LadS et RetS. Ces deux protéines
contrôlent de manière opposée l’expression du petit ARN non codant RsmZ, mais également
l’expression de la machinerie Pel. La machinerie Pel, codée par l’opéron pelABCDEFG est
impliquée dans la synthèse d’une molécule de type sucre qui compose une grande partie de la
matrice extracellulaire du biofilm (Vasseur et al., 2005). L’action du senseur LadS est
d’induire l’expression du gène rsmZ et de la machinerie Pel alors qu’au contraire le senseur
16
RetS réprime l’expression de rsmZ et de la machinerie Pel. Ainsi, nous allons construire des
fusions transcriptionelles entre la région promotrice de ces deux unités de transcription (rsmZ
et pel) et le gène rapporteur lacZ. Ces fusions transcriptionelles seront introduites sur le
chromosome de P. aeruginosa et utilisées comme rapporteur de l’activité des voies de
signalisation LadS/RetS. L’identification des composés chimiques capables d'interférer avec
le fonctionnement des senseurs LadS et RetS se traduira par une modification de l’expression
des fusions transcriptionelles en réponse à l’ajout d’un composé dans le milieu de culture.
4) Résoudre la structure des protéines appartenant aux voies de signalisation
identifiées
L’ensemble des études de cristallographie ayant permis la compréhension du mécanisme
d’action de plusieurs protéines montre l’importance de pouvoir accéder à l’architecture
précise d’une protéine native. Ainsi certains éléments des voies de transduction du signal que
nous avons identifiées seront produits sous forme de protéines recombinantes chez E. coli
dans le but de réaliser des études de cristallogenèse et d'analyses structurales (UMR8015,
Paris ; UMR 5075, Grenoble). L'accent sera mis en premier sur des protéines à domaine EAL
potentiellement impliquées dans la résistance aux aminosides et plus particulièrement sur la
protéine Arr. L'analyse structurale du domaine périplasmique d’Arr permettra de prédire s'il
existe des sites de fixation aux aminosides et l’analyse de son site actif EAL sera utilisée pour
réaliser du drug-design afin de concevoir un inhibiteur chimique de cette protéine (UMR
7175, Strasbourg). Cet inhibiteur présenterait l'avantage de limiter la formation d'un biofilm
par P. aeruginosa en réponse aux traitements antibiotiques. Cette approche structurale sera
également couplée à la localisation subcellulaire de Arr par microscopie de fluorescence.
Dans ce but, les protéines seront clonées et exprimées avec un « tag » fluorescent (mCherry
par exemple) (UMR7175, Strasbourg).
Nous entreprendrons également la cristallisation des domaines périplasmiques des
senseurs LadS et RetS. En effet, ces deux senseurs bien qu’agissant de manière antagoniste
sur l’expression des gènes de la virulence, présentent une structure très similaire. Une analyse
bioinformatique de la région détectrice de ces deux senseurs montre qu’ils sont ancrés au
niveau de la membrane interne par huit segments transmembranaires et qu’ils présentent tout
deux un domaine T7DISMED2 entre les deux premières hélices transmembranaires (Figure
2). La cristallisation de ces domaines détecteurs et plus particulièrement du domaine
T7DISMED2 permettra de mieux comprendre le mécanisme d’activation des deux senseurs et
dans ce cas aussi de concevoir un inhibiteur chimique capable de bloquer leur action (UMR
7175, Strasbourg). Cet inhibiteur présenterait l'avantage de limiter, voire de bloquer, les
infections liées à P. aeruginosa en brouillant sa capacité à clairement percevoir son
environnement et à contourner les défenses immunitaires de l’hôte.
I. Perspectives
L'ensemble de ces travaux devrait permettre de mettre en évidence les voies de
signalisation indispensables à P. aeruginosa pour réussir l'infection de son hôte. Nous
espérons ainsi développer des stratégies thérapeutiques visant des points chauds de ces voies
de signalisation pour lutter contre cette bactérie pathogène opportuniste capable d’échapper
aux traitements chimiothérapeutiques les plus agressifs.
17
V. Références
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19
WORK PACKAGE 2 (responsable : Arnaud Ducruix)
Assemblage dynamique et fonctionnel des systèmes
membranaires
Le workpackage 2 se focalisera sur quatre axes de recherche:
•
Captation et transport du Fer
•
Efflux et transport membranaire
•
Structure et fonction du système de sécrétion de type III
•
Etude structurale comparative des domaines N-terminaux des sécrétines XcpQ et
HxcQ de P. aeruginosa
I. Captation et transport du Fer
P. aeruginosa, comme tout organisme vivant, a besoin de fer pour croître car ce métal
est impliqué dans de nombreux processus métaboliques. Pour pallier à la faible
biodisponibilité du fer(III) dans les milieux physiologiques, P. aeruginosa synthétise et
excrète dans le milieu extracellulaire deux sidérophores fluorescents : la pyoverdine et la
pyochéline. Ces sidérophores chélatent le fer(III) pour le transporter à l'intérieur des cellules
bactériennes. Ce système fonctionne aussi bien dans le milieu naturel des microorganismes (le
sol et l'eau) qu'à l'intérieur de l'être humain où la quantité de fer libre est normalement trop
faible pour permettre la croissance bactérienne. La première étape (Figure 1) du processus de
transport est la reconnaissance du complexe sidérophore-fer (ou ferrisidérophore) par un
récepteur spécifique de la membrane externe (appelé FpvA pour pyoverdine-Fe et FptA pour
pyochéline-Fe). Ces récepteurs sont constitués d'un tonneau en feuillet β obturé par la région
N-terminal qui s'y replie en formant un bouchon (Buchanan et al., 1999; Cobessi et al.,
2005a; Cobessi et al., 2005b; Ferguson et al., 1998; Ferguson et al., 2002; Locher et al.,
1998; Yue et al., 2003 ).
O
O
N
H
H
C
+
N
O
O
H
H
2
O
H
O
C
N
C
H
H
N
N
N
N
C
N
H
O
H
O
H
C
S
2
O
H
N
O
H
H
C
N
C
O
H
N
H
H
O
H
N
H
C
O
O
N
N
H
O
O
H
N
N
N
O
S
N
pyoverdineFe
H
O
O
C
H
O
O
C
N
O
H
H
C
O
O
H
pyochéline-Fe
Figure 1.
Q u i c k T im e ﾪ e t u n
d ﾪ c o m p r e s s e u r T IF F ( L Z W )
s o n t r e q u is p o u r v i s io n n e r c e t t e i m a g e .
Q u ic k T im e ﾪ e t u n
d ﾪ c o m p r e s s e u r T IF F ( L Z W )
s o n t r e q u is p o u r v i s i o n n e r c e t t e i m a g e .
Membrane
externe
PBP
FpvA
TonB
transporteur
ABC
ATP
ExbD
Ex
bB
?
ADP
FptA Périplasme
Membrane
interne
20
Le transport à travers la membrane externe via les récepteurs de sidérophores est un
transport actif. Les récepteurs de sidérophores sont activés par un complexe de trois protéines,
TonB, ExbB et ExbD localisées dans la membrane cytoplasmique (Moeck and Coulton,
1998). Le complexe TonB-ExbB-ExbD interagit avec les récepteurs de ferrisidérophores et
assure le couplage énergétique entre les deux membranes via la différence de potentiel
électrochimique de proton de la membrane cytoplasmique. L’assimilation du fer chez les
bactéries à Gram négatif fait aussi intervenir un transporteur ABC au niveau de la membrane
interne (Braun, 2003). Dans le cas de P. aeruginosa, ce transporteur n’a pas encore été
identifié à ce jour (Poole and McKay, 2003).
L'objectif de cette étude est d’élucider les mécanismes d’assimilation du fer utilisant la
pyoverdine et la pyochéline par une approche multidisciplinaire. Dans ce but, différents outils
ont été développés et sont couramment utilisés :
-
-
-
-
-
Sidérophores tritiés. Nous disposons de pyoverdine tritiée, synthétisée en
collaboration avec le CEA (Schalk et al., 2001). La pyoverdine est le sidérophore
majoritaire produit par P. aeruginosa. Dans ce contexte, la synthèse de pyochéline
tritiée est également prévue.
Propriétés de fluorescence de la pyoverdine et de la pyochéline. Ces
sidérophores sont fluorescents en absence de métal. Cette fluorescence peut être
modulée selon la nature du métal complexé par le sidérophore. Dans le cas des
complexes de fer ou de chrome (Folschweiller et al., 2002; Schalk et al., 1999), la
fluorescence est éteinte alors qu’avec le gallium ou l’aluminium, elle est
augmentée (Folschweiller et al., 2002).
FRET entre la pyoverdine et les tryptophanes. La pyoverdine présente des
propriétés spectrales idéales pour faire du FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer) avec les tryptophanes des protéines comme le récepteur FpvA spécifique
de la pyoverdine (Folschweiller et al., 2002; Schalk et al., 1999). Cet outil a déjà
été amplement utilisé dans notre laboratoire et permet de suivre in vivo ou in vitro
et en temps réel les interactions entre la pyoverdine et son transporteur.
Des marquages des différentes protéines impliquées dans le transport du fer, par
des sondes fluorescentes (Flashtag, mCherry, …), sont en cours actuellement
L’organisation de ces protéines dans la paroi bactérienne pourra ensuite être
étudiée par microscopie de fluorescence.
Différents mutants de P. aeruginosa disponibles au laboratoire ou issus de notre
réseau de collaborations.
Si ces outils nous ont permis d’accroître considérablement nos connaissances dans le
domaine de l’assimilation du fer médié par les sidérophores chez P. aeruginosa sous sa forme
planctonique, certaines subtilités des mécanismes mis en jeu sont loin d’être totalement
élucidées. Nos objectifs dans le cadre du GDR sont :
1. Elucider le mécanisme par lequel, le complexe sidérophore-Fe est transporté au
travers de la membrane externe via son récepteur. Les récepteurs de sidérophores ont une
structure en tonneau β avec la région N-terminale qui se replie pour former un bouchon
obturant le pore du tonneau (Cobessi et al., 2005a; Cobessi et al., 2005b). Deux hypothèses
concernant le transport du complexe sidérophore-Fe peuvent donc être émises. La première
hypothèse est que le bouchon se retire du tonneau pour permettre le passage du complexe
21
sidérophore-Fe. La seconde hypothèse évoque un changement de conformation important
dans le transporteur permettant ainsi la formation d’un canal entre le tonneau et le bouchon.
2. Étudier un transporteur ABC que nous avons cloné et que nous supposons être
impliqué dans l’assimilation du fer au niveau de la membrane interne chez P. aeruginosa.
Nous venons de montrer que le complexe pyoverdine-Fe se dissociait dans le périplasme avec
un mécanisme impliquant une réduction du fer ferrique en fer ferreux. En parallèle, nous
avons également montré que le substrat du transporteur ABC cloné était le fer et non le
complexe sidérophore-Fe. Nous allons essayer maintenant de comprendre comment
fonctionne ce transporteur ABC, comment le substrat est transporté au travers de la
membrane interne en nous interrogeant en particulier sur les interactions entre les différentes
protéines (protéine périplasmique, perméase et ATPase) constituant ce transporteur.
3. Repérer, identifier et étudier les complexes multiprotéiques membranaires
impliqués dans l’assimilation du fer et la synthèse de la pyoverdine et de la pyochéline.
Les récepteurs FpvA et FptA, la protéine TonB, ainsi que la protéine périplasmique du
transporteur ABC de la voie pyoverdine vont être marqués par des sondes fluorescentes
(mCherry, Flashtag, …) et nous étudierons l’organisation de toutes ces protéines impliquées
dans le transport au niveau de la paroi bactérienne par microscopie de fluorescence. Les
interactions entre les protéines durant le transport du fer seront étudiées par fluorescence en
solution et lorsque les propriétés spectrales des sondes le permettent le FRET seront utilisées.
Les techniques de crosslinking sont envisagées également pour compléter l’étude.
4. Etudier le transport du fer via la pyoverdine dans les biofilms bactériens. Cette
étude sera réalisée en collaboration avec l’UPR9027 (Marseille) dont l’expertise pour ce type
de culture est reconnue. Les différents stades de formation des biofilms à partir de bactéries
sous forme planctonique ont été étudiés, montrant clairement que l’état physiologique des
cellules bactériennes est modifié au cours de cette transition (Sauer et al., 2002). Ces
observations suggèrent que le transport du fer et les mécanismes de régulation connexes sont
probablement différents pour des bactéries en culture planctonique et celles inclues au sein
d’un biofilm. Les propriétés de fluorescence de la pyoverdine devraient permettre d’étudier le
transport du fer via ce sidérophore dans les biofilms bactériens.
Dans le cadre de l’activité de biologie structurale du WP2, nous envisageons de
cristalliser et de résoudre les structures de différentes protéines impliquées dans l’assimilation
du fer. Au nombre de ces projets se trouvent :
- La résolution fine de la structure de FpvA (Cobessi et al., 2005a) ;
- La résolution des structures de FptA (Cobessi et al., 2005b) co-cristallisé avec des
ligands synthétisés dans notre département comme par exemple des inhibiteurs ;
- L’étude structurale du transporteur ABC impliqué dans le transport du fer au
niveau de la membrane interne et plus particulièrement de la protéine
périplasmique (PBP), l’un des composants de ce système.
- L’étude structurale de la protéine PelC, une lipoprotéine localisée dans la
membrane externe de P. aeruginosa et impliquée probablement dans le transport
d’exopolysaccharides (Vasseur et al., 2007)
Une des applications de ces études vise à élaborer une nouvelle génération
d'antibiotiques ayant pour cible les voies d'assimilation du fer. Dans ce contexte, deux
approches sont étudiées : d’une part, l’utilisation de sidérophores comme motif de spécificité
pour des prodrogues vectorisant un antibiotique et, d’autre part, la mise au point d’inhibiteurs
du récepteur FptA. La stratégie prodrogue développée consiste à faire pénétrer dans la cellule
22
à détruire un antibiotique sous forme inactive en utilisant une voie de transport naturelle.
Ainsi, la cellule va internaliser le conjugué puis les enzymes autochtones ou, plus
simplement, les conditions physiologiques vont alors démasquer l’activité antibiotique du
composé. Des pyochélines fonctionnalisées servent ainsi de structure de base pour la
préparation de prodrogues ciblées pour la voie de transport du fer pyochéline-dépendant. En
effet, si chaque souche de P. aeruginosa produit une pyoverdine qui lui est propre, la
pyochéline est par contre un sidérophore commun à toutes ces souches ainsi qu’à la plupart
des souches de Burkholderia cepacia. Nous cherchons ainsi à synthétiser des prodrogues
constituées d’une pyochéline fonctionnalisée connectée à un antibiotique par deux types de
bras espaceurs, hydrolysables ou stables in vivo.
Bien que le fer soit un élément essentiel au métabolisme bactérien, il n’existe à l’heure
actuelle aucune molécule antibiotique qui cible spécifiquement l’une des composantes des
systèmes d’approvisionnement en fer. Comme nous l’avons précisé précédemment, la
pyochéline est l’un des sidérophores majeurs de P. aeruginosa mais en cas de déficience de
son système de transport d’autres sidérophores peuvent prendre le relais et assurer le transport
du fer. Des études récentes semblent cependant montrer que ces bactéries déficientes poussent
moins bien et font montre d’une moindre virulence. Notre étude n’a ainsi aucunement la
prétention de découvrir un véritable antibiotique sensu stricto, nous espérons cependant que
ces inhibiteurs soient capables de potentialiser l’action d’antibiotiques reconnus en
affaiblissant la population bactérienne. Cette stratégie a d’ailleurs été envisagée pour le
traitement de formes résistantes de peste ou de tuberculose (Ferreras et al., 2005). Dans ce
contexte, la structure cristallographique à haute résolution du récepteur FptA chargé avec
pyochéline-Fe que nous avons obtenue (Cobessi et al., 2005b) constitue une base de choix
pour la conception d’inhibiteurs du récepteur. Ces données structurales viennent en outre
s’ajouter aux résultats d’une étude sur les relations structure-activité entre des analogues de la
pyochéline et le récepteur FptA (Mislin et al., 2004; Mislin et al., 2006). L’ensemble de ces
données nous a permis de modéliser, concevoir et synthétiser des molécules susceptibles
d’inhiber la voie d’assimilation du fer pyochéline-dépendante. Lorsque ces candidatsantibiotiques (prodrogues, inhibiteurs) auront été synthétisés, leur activité bactéricide pourra
alors être testée sur des souches pathogènes de P. aeruginosa dans les équipes de Besançon
(EA3186) et Lille (EA2689).
5. Etudier la captation du fer dans l’environnement. L'objectif du projet de recherche
est d'analyser le rôle du fer dans les interactions plantes-microorganismes et dans leur
évolution contribuant à la structuration de la communauté de P. fluorescens et de P. putida
dans la rhizosphère (UMR 1229, Dijon). Le fer est choisi car l'ion ferrique est essentiel au
métabolisme des organismes aérobies alors que pourtant sa concentration est très faible dans
la plupart des sols et qu'il est soumis à une forte compétition. Ce projet sera conduit en
conditions gnotobiotiques avec la plante modèle Arabidopsis thaliana et des souches modèles
de P. fluorescens et P. putida, dont les stratégies d'acquisition du fer sont bien connues et
pour lesquelles nous disposons de mutants. Ces stratégies reposent sur (i) la synthèse de
pyoverdines et de protéines membranaires réceptrices pour les Pseudomonas et sur (ii)
l'extrusion de protons, la synthèse de réductases et de transporteurs du fer ferreux pour A.
thaliana (stratégie I). Nos travaux antérieurs suggèrent que (i) la compétition pour le fer dans
la rhizosphère est un facteur structurant majeur de la communauté microbienne où les
populations les plus compétitives deviennent dominantes et que (ii) l'acquisition du fer par
P. fluorescens et P. putida peut interférer avec celle de la plante et réciproquement.
La stratégie de recherche envisagée est basée sur une variation de la concentration en fer
biodisponible dans la rhizosphère grâce à la culture de génotypes d'A. thaliana transgéniques
23
surexprimant la synthèse de ferritines et donc suraccumulant le fer. Les conséquences de ces
variations sur l'évolution de la structure génétique d'une communauté simplifiée de
Pseudomonas seront évaluées en conditions gnotobiotiques. Plus précisément, l'abondance
relative de chaque population introduite sera quantifiée par PCR quantitative. L'évolution de
la structure de la communauté bactérienne en réponse aux variations de disponibilité en fer
sera analysée en regard de (i) l'affinité pour le fer des pyoverdines des différentes populations
(dominantes et minoritaires) et (ii) du rapport coût-bénéfice que représente la synthèse de
pyoverdines et l'incorporation de pyoverdines hétérologues pour ces populations. Les
pyoverdines seront caractérisées par spectrométrie de masse. L'étude de ces rapports coûtbénéfice sera conduite pour chaque population en utilisant des mutants affectés dans la
synthèse de pyoverdine et en évaluant l'aptitude des bactéries à incorporer leur propre
pyoverdine ainsi que celles des autres populations (essais d'incorporation croisée de 59Fepyoverdines). De même, le rapport coût-bénéfice que représente pour la plante les
populations de Pseudomonas sera apprécié en caractérisant le flux des rhizodépots (coûts), en
comparant l'efficacité de l'acquisition du fer basée sur la stratégie I et sur l'incorporation de
Fe-pyoverdine et en mesurant la protection de la plante contre un champignon
pythopathogène modèle associée à la réduction de sa croissance saprophyte due à la
compétition pour le fer (bénéfices). Les flux de rhizodépôts et l'incorporation de fer seront
quantifiés par marquage isotopique. Les bénéfices pour la plante seront appréciés in fine par
la mesure de sa croissance et sa production de graines.
Le thème de la captation du fer chez les Pseudomonas étant commun aux UMR 7175
(Strasbourg) et 1229 (Dijon), des collaborations sont envisagées dans le cadre du GDR.
6. Références
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II. Les systèmes d’efflux actif chez P. aeruginosa
Au cours des quinze dernières années, de nombreux systèmes d’efflux actifs ont été
identifiés chez les bactéries. Si leur rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et la
protection contre les xénobiotiques ne fait plus guère de doute, leurs fonctions spécifiques et
leur intégration dans des processus physiologiques complexes restent toutefois à préciser. En
effet, ces mécanismes sont souvent redondants au sein d’une même espèce. Ainsi, pas moins
de 37 systèmes différents ont été dénombrés chez Escherichia coli dont beaucoup sont
réprimés dans les conditions standard de culture au laboratoire. Les circonstances ou les
signaux à l’origine de leur activation demeurent encore pratiquement inconnus. La situation
est identique chez P. aeruginosa. Sur les huit systèmes de la famille RND (Resistance
Nodulation cell Division family) caractérisés à ce jour chez la souche de référence PAO1,
quatre ont été plus particulièrement étudiés pour leur rôle significatif dans la résistance aux
antibiotiques, à savoir MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM
(Piddock, 2006).
1. Structure des systèmes d’efflux de la famille RND
25
Dans leur configuration fonctionnelle, les pompes Mex ( pour Multiple efflux) sont des
assemblages supramoléculaires complexes composés d’au moins trois éléments : (i) un
transporteur localisé dans la membrane cytoplasmique (MexB, MexD, MexF, MexY), (ii) un
canal traversant la membrane externe (OprM, OprJ, OprN) et (iii) une protéine adaptatrice
(MexA, MexC, MexE, MexX) censée mettre en rapport les deux composants précédents pour
permettre le transport des substrats du milieu intracellulaire vers le milieu extérieur. Les
principales informations concernant la structure des systèmes de type RND proviennent
d’études cristallographiques menées sur la pompe AcrAB-TolC de E. coli et sur les protéines
MexA et OprM de P. aeruginosa (Figure 2).
Le transporteur est l’élément dynamique du système (Murakami et al, 2002). C’est un
homotrimère inséré dans la membrane cytoplasmique grâce à des piliers hydrophobes (12
segments transmembranaires en hélices α par sous-unité) et dont la partie supérieure formée
par le repliement de 6 grandes boucles périplasmiques (2 par sous-unité) délimite une cavité
qui s’ouvre dans sa partie supérieure par un conduit en forme d’entonnoir. Des vestibules
latéraux (1 par sous-unité) situés à la jonction membranaire permettent la captation des
substrats à partir du feuillet externe de la membrane cytoplasmique et leur acheminement
jusque dans la cavité centrale. Dans la famille RND, le transporteur fonctionne grâce à
l’énergie fournit par le gradient électrochimique de la membrane cytoplasmique, selon un
mécanisme antiport proton-substrat. La polyspécificité des systèmes Mex, c’est à dire leur
capacité à transporter des substrats de nature très diverse, est restée longtemps une énigme.
Grâce à des expériences de co-cristallisation de la protéine AcrB de E. coli avec différents
substrats, il est acquis maintenant que la cavité centrale comporte des sites de liaison
multiples et flexibles capables de créer des interactions hydrophobes et électrostatiques avec
de nombreux ligands (une molécule par monomère). Il a été suggéré, par ailleurs, que la
bicouche lipidique membranaire pourrait occuper la cavité centrale d’AcrB, ce qui permettrait
une interaction entre les ligands cationiques et les têtes polyanioniques des phospholipides de
la membrane. La nature des acides aminés tapissant l’entrée des vestibules serait, quant à elle,
déterminante pour la spécificité de substrats du système. Enfin, dans un travail récent, il a été
proposé que le transporteur AcrB pourrait fonctionner comme une pompe péristaltique,
chaque monomère se trouvant dans une configuration différente correspondant à l’une des
trois étapes fonctionnelles du processus de transport (Murakami S. et al., 2006).
Figure 2.
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OprM/Pore
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MexA/Adapteur
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AcrB/Transporteur
26
Le pore du système est un homotrimère constitué de feuillets ß-plissés antiparallèles
traversant la membrane externe et dont la base se prolonge dans l’espace périplasmique par
une torsade d'α-hélices jusqu’au sommet du transporteur auquel il s’adapte (Koronakis et al.,
2000 ; Broutin et al., 2005 ; Phan et al., in preparation). En l’absence de substrat, la partie
inférieure en contact avec le transporteur est obturée par trois paires d’hélices arrangées selon
une structure “coiled-coil” en forme de diaphragme. Cette région de constriction est supposée
s’ouvrir pour permettre le passage des molécules provenant de la cavité centrale.
L’élément adaptateur comprend un nombre indéterminé de sous-unités d’une
lipoprotéine périplasmique ancrée à la membrane cytoplasmique par sa partie N-terminale. Il
a pour rôle d’assurer le recrutement du pore par le transporteur et son ouverture pour
permettre le rejet des substrats dans le mileu extracellulaire. Chaque sous-unité comporte un
tonneau ß susceptible d’interagir avec les substrats, un domaine lipoyl et une épingle en
hélices α de structure “coiled coil” responsable de l’oligomérisation (Akama et al., 2004 ;
Mikolosko et al., 2006). Cet élément participerait lui aussi à la reconnaissance des substrats et
définirait avec le transporteur la spécificité du système. La protéine TonB pourrait également
participer au fonctionnement des pompes Mex.
2. Pompes Mex et résistance aux antibiotiques
Les pompes d’efflux MexAB-OprM et MexXY-OprM contribuent de façon importante
à la résistance naturelle de P. aeruginosa aux antibiotiques et antiseptiques (Poole, 2005).
Toutes deux sont capables de transporter un large éventail d’agents antibactériens appartenant
à différentes familles dont les fluoroquinolones, les ß-lactamines, les aminosides, les
tétracyclines, les phénicolés, etc... Alors que MexAB-OprM est produit constitutivement par
les bactéries sauvages, assurant ainsi une protection permanente contre un grand nombre
d’antibiotiques, MexXY-OprM n’est exprimé qu’en situation de stress, lorsque la synthèse
protéique est perturbée (aminosides, tétracyclines, chloramphénicol, macrolides)(Jeannot et
al., 2005). Il existe donc un lien fonctionnel entre la machinerie ribosomale et l’efflux actif
médié par MexXY-OprM. Cette relation est confirmée par le fait que l’inductibilité de
l’opéron mexXY en présence d’antibiotique dépende d’un locus de deux gènes (PA5470PA5471) dont l’un (PA5470) code pour un peptide chain release factor auxillaire (Morita et
al., 2006). Le rôle de ce RF n’a pas encore été précisé mais divers arguments suggèrent son
implication dans le sauvetage du ribosome lorsque l’élongation du néopeptide est bloquée,
ceci en hydrolysant la liaison peptidyl-ARNt. La fonction première de MexXY-OprM
pourrait donc ne pas être l’export des antibiotiques mais l’élimination de métabolites
secondaires issus de la dégradation des protéines (di- ou tripeptides).
Dans le contexte hospitalier, l’efflux actif a une signification toute particulière car il
permet aux souches cliniques de développer en une seule étape une résistance élevée vis-à-vis
de nombreux antibiotiques non apparentés. En effet, la survenue de mutations dans divers
gènes régulateurs (nalB, nalC, nalD, mexZ) peut entraîner la surproduction stable des
systèmes MexAB-OprM et/ou MexXY-OprM se traduisant par une augmentation des niveaux
de résistance à l’encontre des substrats de chaque pompe (CMI x 4-16) (Llanes et al., 2004).
La fréquence de ces mutants multirésistants est aujourd’hui élevée chez les patients
hospitalisés ou atteints de mucoviscidose. Des travaux de plus en plus nombreux mettent en
cause la surconsommation et le mauvaise usage des antibiotiques dans l’avénement de cette
situation critique. Aussi, dans un contexte international où les innovations thérapeutiques en
matière d’antibiotiques se font rares, il devient urgent de rechercher de nouvelles cibles
antibactériennes, notamment des produits capables d’enrayer la résistance par efflux actif.
27
3. Objectifs du travail
a. Analyse fonctionnelle des pompes Mex
Parce que toutes les informations obtenues sur le système AcrAB-TolC de E. coli ne
sont pas forcément applicables aux autres systèmes d’efflux RND, il paraît intéressant
aujourd’hui de déterminer la structure et l’assemblage des systèmes Mex de P. aeruginosa.
Leurs spécificités de substrats étant différentes les unes des autres, ils constituent en effet un
excellent modèle pour mieux appréhender les mécanismes de transport des pompes d’efflux.
Pour cela, en collaboration avec l'équipe de W. Urbach (ENS, Paris), nous utiliserons un
système multilamellaire qui permet de mimer un système Gram négatif dans la mesure où la
distance entre les bicouches peut être ajustée. Des expériences préliminaires ont permis de
montrer la faisabilité de l'étude.
b. Adaptation structurale des pompes
L’étude d’isolats cliniques provenant de patients atteints de mucoviscidose a récemment
montré que P. aeruginosa pouvait développer de très hauts niveaux de résistance aux
aminosides (tobramycine, amikacine) en surproduisant un système d’efflux MexXY-OprM
remanié par des mutations (EA3186, Besançon). Deux substitutions d’acide aminé dans le
transporteur MexY ont attiré plus particulièrement l’attention. Si on se réfère à la structure de
la protéine homologue AcrB de E. coli, la première de ces substitutions (F1018L) se situerait
dans le segment transmembranaire 12 du transporteur MexY ; la deuxième (F29S) serait
localisée dans le vestibule par lequel transitent les substrats pour rejoindre la cavité centrale
(UMR8015, Paris). F1018L pourrait avoir pour conséquence de modifier, soit le flux de
protons, donc le degré d’énergisation de la pompe, soit le transport de substrats à partir du
cytoplasme. En remplaçant un résidu d’acide aminé hydrophobe par un hydrophile, F29S
pourrait de son côté grandement favoriser la captation des aminosides par le système. Des
expériences de mutagénèse dirigée sont actuellement réalisées (EA3186, UMR5092) sur un
opéron mexXY recombinant afin d’introduire isolément les mutations observées dans mexX et
mexY chez les souches cliniques hautement résistantes.
Le but poursuivi est de mesurer l’impact de chaque mutation et ainsi mieux appréhender
un mécanisme de résistance encore inédit chez les bactéries, à savoir une optimisation de
l’efficacité des systèmes d’efflux vis-à-vis d’une classe d’antibiotiques particulière (ici, les
aminosides). Un travail en cours vise à cristalliser les mutants de MexY ayant été caractérisés
cliniquement par l'équipe de P. Plésiat (UMR8015, Paris). En ayant une meilleure
connaissance du fonctionnement de ces systèmes de transport sophistiqués, on peut espérer
trouver à terme les moyens de les enrayer. Ainsi, une collaboration avec la société Mpex, à
SanDiego CA, a été initiée pour évaluer l’efficacité d’inhibiteurs du système MexXY-OprM
(EA3186, Besançon). Une évaluation de la réponse antibiotique in vivo sera réalisée dans un
modèle de pneumonie aiguë chez la souris en utilisant les souches les plus résistantes par
mécanisme d’efflux actif (EA2689, Lille).
c. Régulation du système d’efflux MexXY-OprM
Comme cela a été décrit plus haut, le système MexXY-OprM est produit en situation de
stress, lorsque la bactérie est exposée à des agents inhibant la synthèse protéique. Le même
effet est observé lorsqu’on perturbe la synthèse protéique par des mutations altérant des
constituants ribosomaux comme la protéine L25 (EA3186, Besançon) ou inhibant la
formylation du Met-ARNt. Afin de mieux comprendre le rôle du locus PA5470-PA5471 dans
la régulation du système MexXY-OprM, nous avons entrepris de comparer la réponse
28
transcriptionnelle globale de la souche de référence PAO1 à des concentrations
subinhibitrices d’antibiotique inhibant la synthèse protéique (chloramphénicol, tobramycine,
azithromycine). Les premières analyses avec des puces Affymetrix® ont montré une réponse
transcriptionnelle complexe mobilisant plusieurs centaines de gènes.
Ainsi, l’adaptation de la bactérie à la présence de chloramphénicol implique la
surexpression (+ 3fois) de 165 ORF et la sous-expression (- 3 fois) de 248 autres. Nous avons
le projet de comparer le transcriptome “chloramphénicol” aux transcriptomes “tobramycine”
et “azithromycine” afin d’identifier quels gènes, en dehors de mexXY et PA5470-PA5471,
sont essentiels dans l’adaptation de P. aeruginosa aux inhibiteurs ribosomaux (EA3186,
Besançon). Après validation des données par analyse bioinformatique et contrôle des
variations d’expression génique par RT-PCR quantitative en temps réel, nous examinerons
l’effet de l’inactivation des gènes les plus intéressants sur la sensibilité aux antibiotiques. Les
mutants dérivant de la souche PAO1 seront obtenus du University of Washington Genome
Center et ceux issus de la souche PA14 de l’UPR9027 (Marseille). La recherche de
la fonction présumée des gènes d’intérêt sera réalisée par l’UMR5100
(Toulouse).
Parallèlement à cela, nous avons entrepris d’identifier les gènes dont l’expression est,
comme mexXY, dépendante du locus PA5470-PA5471 (EA3186, Besançon). Dans un premier
temps, le transcriptome de la souche PAO1 cultivée dans un milieu sans antibiotique sera
comparé à celui d’un mutant insertionnel surproduisant constitutivement PA5470-PA5471
(+ 15 fois). Dans une seconde étape, le transcriptome de PAO1 exposé au chloramphénicol
sera comparé à celui d’un mutant ∆PA5471 cultivé dans les mêmes conditions. Nous pensons
ainsi pouvoir identifier les gènes dont l’expression est modulée positivement ou négativement
lorsque le locus PA5470-PA5471 est surexprimé artificiellement ou inactivé. L’ensemble de
ces résultats devrait apporter des informations significatives sur les processus physiologiques
co-régulés avec le système MexXY-OprM et donc indirectement renseigner sur la fonction
physiologique de cette pompe.
Enfin, l’analyse longitudinale des souches pulmonaires de P. aeruginosa isolées dans le
cadre de la mucoviscidose (EA3186, Centre de Ressource et de Compétence de la
Mucoviscidose, Besançon) montre qu’un même clone persiste souvent pendant de
nombreuses années chez un malade. Sous la pression des cures répétées d’antibiothérapie,
incluant notamment des aminosides (tobramycine), le clone initial s’adapte en surexprimant
constitutivement puis en modifiant la structure de la pompe MexXY-OprM (voir plus haut).
Avec le temps, d’autres mécanismes encore indéterminés viennent se surajouter à l’efflux
actif pour rendre la bactérie totalement insensible aux antibiotiques, ôtant toute efficacité aux
traitements. Afin de caractériser ces mécanismes, nous avons sélectionné chez plusieurs
patients mucoviscidosiques des isolats séquentiels issus d’un même clone, depuis la
primocolonisation (souche sensible sauvage) jusqu’au stade de l’infection bronchopulmonaire
chronique (souche multirésistante). Par une approche transcriptomique, nous nous proposons
d’analyser l’évolution de ces souches en comparant leur réponse en présence d’un aminoside
(1:2 CMI de tobramycine). Nous formons l’hypothèse que l’accumulation de mutations au
cours du temps optimise l’adaptation de la cellule bactérienne aux inhibiteurs. La
connaissance de ces modifications sur le long terme peut, là aussi, aider à définir des
stratégies antibactériennes, notamment dans la mucoviscidose. La perte de grandes régions
génomiques (> 100-kb) fréquente chez les souches associées à cette pathologie sera
également recherchée par des hybridations ADN-biopuces (Affymetrix®) et analysée par
l’UMR5100 de Toulouse.
29
En parallèle, la résistance de chacune de ces souches in vivo sera comparée à leur
virulence dans un modèle aigu d’infection chez la souris (modèle dérivé du modèle de Cash
utilisant l’inclusion du pathogène dans des billes d’agar) par l’EA2689 (Lille).
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III. Structure et fonction du système de sécrétion de type III (TTSS)
1. Introduction
Le génome de P. aeruginosa code pour cinq types de systèmes de sécrétion (SS)
protéique permettant ainsi l’export d’un grand nombre de protéines dans le milieu
extracellulaire. Les TTSS et SST6 ont la particularité de non seulement exporter les substrats,
mais également de les injecter dans la cellule eucaryote cible. Ces deux systèmes d’injection
des toxines présentent, en dehors de la formation du biofilm, les mécanismes majeurs de la
virulence de P. aeruginosa. Ces nanomachines moléculaires sont composées d’une vingtaine
de protéines assemblées pour traverser les trois membranes : deux membranes bactériennes et
la membrane plasmique eucaryote. Nos études portent sur la composition, le fonctionnement
30
et l’assemblage de ces systèmes d’export au cours de l’infection, en particulier nous étudions
l’assemblage du SST3 (UMR5092, IBS). Un projet sur la composition, fonction et la structure
du SST6, sera développé également (UMR5092, IBS).
2. TTSS: composition, fonction, assemblage
TTSS est une organelle multi-protéique assemblé sur la surface bactérienne suite à un
contact physique entre le pathogène et la cellule-hôte. La majorité des pathogènes des plantes
et des animaux utilisent cette nanomachine, qui ressemble à un flagelle, pour injecter les
protéines bactériennes directement dans le cytoplasme de la cellule eucaryote en une seule
étape continue. À l’aide des modèles cellulaires d’infection nous avons d'abord montré que la
majorité des souches de P. aeruginosa est capable d'induire une mort cellulaire rapide par
oncose (nécrose) dépendant d’un TTSS actif.
Notre projet principal est l’étude de l’assemblage du complexe translocon-aiguille
présent à la surface de la bactérie et inséré dans la membrane cytoplasmique de la cellule hôte.
Les protéines PcrV, PopB et PopD participent à l’assemblage d’un complexe multimoléculaire nécessaire à la translocation des toxines à travers la membrane plasmique des
cellules eucaryotes. Les protéines PopB et PopD ont été produites dans la forme sous laquelle
elles sont présentes natives dans le cytoplasme bactérien : complexées à leur chaperon
commun, PcrH. Les études biochimiques et structurales montrent que PopB et PopD, dans
certaines conditions, libèrent leur chaperon et s’insèrent dans des liposomes en formant un
canal multimérique visible en microscopie électronique. Nous avons également montré que
l'antigène V protecteur est un "chaperonin" extracellulaire impliqué dans la formation du pore
de translocation. De plus, les anticorps anti-PcrV, ajoutés au cours de l’infection, sont
capables d’inhiber l’hémolyse induite par P. aeruginosa en perturbant l’assemblage du pore
B/D dans les membranes de la cellule-hôte. Les résultats récents montrent que ces protéines
purifiées in vitro sont capables de former, en synergie, les pores d’un diamètre bien défini
dans les liposomes. L’effet des différents lipides, charges et pH sur la liaison et la formation
du pore a été également étudié.
Le composant majeur de l’aiguille de sécrétion a été identifié comme étant PscF, une
petite protéine de 9 kDa qui polymérise à la surface de la bactérie et forme une structure de 80
nm de long permettant la sécrétion des toxines. Notamment, le processus de polymérisation de
PscF, hautement régulé pour empêcher que PscF ne subisse une polymérisation à l’intérieur
du cytoplasme bactérien, compte sur la stabilisation de PscF par deux chaperonnes
différentes, PscE et PscG (Quinaud et al., 2005). Les souches de P. aeruginosa mutantes,
incapables d’exprimer soit PscE, PscF ou PscG NE SONT PAS CYTOTOXIQUES (Figure 3),
ce qui démontre l’importance centrale de ce complexe ternaire pour le processus d’infection
de ce pathogène.
Nous avons ensuite exploité nous résultats structuraux (figure 4) pour étudier
l’importance des interfaces entre PscF et chacune de ces deux chaperonnes. Des mutations ont
été introduites dans la région hydrophobe de PscG qui stabilise PscF, ainsi que dans la région
N-terminale de PscE, et des souches de P. aeruginosa capables d’exprimer ces protéines
mutantes ont été construites. Chaque souche mutante a été testée pour sa cytotoxicité vis-à-vis
des macrophages, ce qui nous a permis d’identifier une région clé dans PscG (notamment
autour des résidus Trp 73 et Phe 105) qui est très sensible aux mutations. Les souches portant
deux mutations dans cette région ont largement PERDU LEUR POTENCIEL CYTOTOXIQUE
(Figure 5). Ces résultats ont valu une publication dans le journal Proceedings of the National
Academy of Sciences (PNAS), USA (Quinaud et al., 2007).
31
Figure 3. (A) Des souches de P. aeruginosa qui n’expriment pas PscE perdent une grande
partie de leur pouvoir d’intoxiquer des cellules cible ; le même résultat a été obtenu avec des
souches ∆pscF et ∆pscG. (B) Exprimée en absence de ces partenaires, PscF polymérise pour
former des longues fibres, identifiées par microscopie électronique (Quinaud et al., 2005).
Barre = 20 nm.
Figure 4. Structure tri-dimensionelle du complexe ternaire entre PscE, PscF, et PscG.
Figure 5. (A) Détail de l’interface
entre PscG et PscF qui montre les
résidus hydrophobes de PscG qui
ont été mutés dans le cadre des
expériences de cytotoxicité ; (B)
cytotoxicité de souches mutantes de
P.
aeruginosa
vis-à-vis
des
macrophages. Les double mutants
L43/W73 et W73/F105 ne secrètent
pas des effecteurs et sont beaucoup
moins cytotoxiques que la souche
parentale (CHA) (Quinaud et al.
(2007), PNAS).
32
2. Objectifs
Les objectifs dans le cadre du GDR concernent quatre axes d'étude d'injectisome :
- Caractérisation structurale des composants impliqués dans l'assemblage du canal de
sécrétion (PscE, PscF, PscG, et le complexe isolé PscEFG) et les composants formant le
"translocon" (PcrV, PopB et PopD). Les approches de biophysique, de cristallisation et de la
RMN seront employées (UMR5092, IBS) ;
- Caractérisation fonctionnelle des composants du complexe PscEFG, rôle de l'ATPase
spécifique du TTSS dans la polymérisation du canal de sécrétion et l'étude fonctionnelle de
l'antigène V en relation avec l'assemblage du translocon et du canal de sécrétion (UMR5092,
IBS) ;
- Etudes d'interaction de P. aeruginosa avec la cellule eucaryote dans le contexte d'injection
des toxines par le TTSS. Recherche des composants cellulaires impliqués dans l'assemblage
du translocon et dans la transmission du signal vers une activation du TTSS (voir aussi l'axe
Adaptation/Régulation) (UMR5092) ;
- Evaluation du pouvoir immunoprotecteur de certains anticorps dirigés contre les composants
d'injectisome dans le modèle d'infection in vitro (modèle macrophage et érythrocytes) et dans
le modèle souris (développé par l'équipe de Benoît Guery, Lille). Développement de tests
moléculaires et cellulaires pour effectuer les criblages d'inhibiteurs à haut débit.
3. Références
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IV. Etude structurale comparative des domaines N-terminaux des sécrétines
XcpQ et HxcQ de P. aeruginosa
Parmi les différents systèmes de sécrétion présents chez P. aeruginosa, la voie de type
II Xcp permet de libérer dans le milieu extracellulaire plusieurs toxines et enzymes
dégradatives (Filloux et al., 2004). Récemment, grâce au séquençage du génome, une
deuxième voie de type II, le système Hxc, a été découverte au laboratoire (Ball et al., 2002).
Cette nouvelle voie permet la sécrétion spécifique d’au moins une protéine, la phosphatase
alcaline LapA. Parmi les constituants de la machinerie de type II susceptibles d’intervenir
dans la spécificité de substrats, le composant de membrane externe (la sécrétine) est un bon
candidat. C’est, en effet, la seule protéine du système pour laquelle une interaction directe a
été mise en évidence avec un substrat sécrété (Shevchik et al., 1997).
Les sécrétines forment des complexes homomultimériques de 12 à 14 sous-unités dans
la membrane externe des bactéries Gram négatives. Dans chaque monomère, on distingue
deux domaines principaux, un domaine conservé en C-terminal, impliqué dans la formation
du pore de membrane externe et un domaine N-terminal périplasmique, probablement
impliqué dans l’interaction avec le substrat.
Afin de d’étudier le rôle du domaine N-terminal des sécrétines XcpQ et HxcQ dans la
spécificité de reconnaissance de leurs substrats respectifs, nous construirons des sécrétines
chimères entre HxcQ et XcpQ et analyserons la nature des substrats reconnus et sécrétés par
chacune de ces chimères.
De plus, nous envisageons de produire et de purifier les domaines solubles de ces deux
sécrétines afin d’en résoudre la structure tridimensionnelle, ceci en collaboration avec le
groupe d’A. Ducruix (UMR8015, Paris).
Jusqu'à présent, aucune structure à haute résolution de sécrétine n’a encore été obtenue.
Seule les études en microscopie réalisées sur des particules purifiées ont permis de montrer
l’existence d’un pore constitué de l’assemblage de 12 à 14 domaines C-terminaux (Bitter
2003). La détermination de la structure tridimensionnelles à haute résolution des domaines Nterminaux des sécrétines XcpQ et HxcQ de P. aeruginosa devrait apporter des informations
générales sur les sécrétines et leur positionnement au sein de la machinerie. De plus, les
différences structurales entre les domaines N-terminaux de XcpQ et HxcQ devraient révéler
des motifs potentiellement impliqués dans la spécificité de substrats. L’implication de ces
motifs sera ensuite confirmée par mutagénèse.
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34
Bitter, W (2003). Secretins of Pseudomonas aeruginosa: large holes in the outer membrane.
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WORK PACKAGE 3 (responsable Thierry Jouenne)
Adhésion et biofilms
I. Introduction
Jusqu’à ces dernières années, on estimait que les activités sociales étaient restreintes
aux animaux et ne concernaient pas les micro-organismes. En conséquence, les lois qui
gouvernaient l’évolution des animaux supérieurs ne s’appliquaient pas aux bactéries. Une des
grandes découvertes de la bactériologie de cette dernière décennie, est la mise en évidence de
relations sociales entre les bactéries capables de construire de véritables communautés et de
communiquer entre elles. Ces communautés bactériennes sont appelées biofilms.
Biofilm de P. aeruginosa en formation sur un
pneumocyte (photo UMR CNRS 6522)
Un biofilm est défini comme un agrégat de micro-organismes (majoritairement des
bactéries), fixés à une surface, et englués dans une gangue d’exopolymères fabriqués par ces
mêmes organismes (Costerton et al. 1989). On s’accorde aujourd’hui pour affirmer que plus
de 90% de l’activité microbiologique dans un écosystème (environnement aquatique, sol,
corps humain,..) provient en majeure partie d’une flore sédentaire adhérant aux surfaces dans
une structure de type biofilm. La présence de biofilms est de plus en plus souvent identifiée
comme la source récurrente de problèmes à la fois de santé publique, industriels et sociétaux
35
souvent lourds de conséquences et parfois dramatiques. Ces biofilms sont ainsi impliqués
dans plus de la moitié des infections bactériennes chez l’homme et dans la grande majorité
des infections nosocomiales. Ils sont en particulier directement responsables de toutes les
infections prothétiques. P. aeruginosa est la bactérie à Gram négatif la plus fréquemment
rencontrée dans les infections prothétiques ; les biofilms à P. aeruginosa sont responsables
des bronchites chroniques chez les patients atteints de mucoviscidose. Si ces biofilms sont
omniprésents, c’est dû à leur exceptionnelle résistance aux inhibiteurs et donc aux
antibiotiques. Dans ce contexte, l’objectif développé par les équipes collaborant dans ce WP3
est l’identification des mécanismes moléculaires impliqués i) dans l’adhésion de la bactérie à
un substrat abiotique ou biotique, ii) dans la structuration de la communauté bactérienne, iii)
dans l’interaction avec l’hôte et iv) dans la résistance aux antimicrobiens.
II. Caractérisation de gènes de fonction inconnue impliqués dans la formation de
biofilm
Le développement de nouvelles approches dites « post-génomiques » telles que les
puces à ADN, la protéomique et l'hybridation soustractive d'ADNc ont permis de dresser un
premier inventaire des différences d'expression génique entre les bactéries des biofilms et les
bactéries planctoniques Ainsi, par une étude protéomique globale (Vilain et al., 2004 2,3), les
chercheurs de l’UMR CNRS 6522 (Rouen), en collaboration avec l’EA 2689 (Lille) ont
identifié un gène (PA3731) dont le produit d’expression semble fortement impliqué dans
l’adhésion de la bactérie , sa virulence et sa résistance à la tobramycine. Ce gène appartient à
un cluster de 4 gènes (PA3729-PA3732) qui codent tous pour des protéines hypothétiques.
La séquence de la protéine PA3731 présente un motif très proche des protéines
constituant la famille des PspA/IM30. Elle contient en particulier un énorme domaine
hélicoïdal. Le système Psp est conservé chez de nombreuses bactéries à Gram négatif. Il fait
partie de ces systèmes de réponse aux stress extracytoplasmiques dont le plus connu est le
système Cpx (impliqué dans la formation de biofilms).
Nous proposons donc d’identifier la fonction du cluster PA3729-PA3732 et plus
particulièrement celui de la protéine PA3731. Pour cela nous envisageons :
(i)
d’identifier les protéines capables d’interagir avec PA3731 au moyen d’une approche
interactomique (UMR CNRS 6522, Rouen). Pour cela différentes stratégies seront utilisées :
biochimiques (SPR et chromatographie d’affinité) et immunochimiques (far-western,
immunoprécipitation, électrophorèse Blue-Native).
(ii) d’étudier la faisabilité d’essais thérapeutiques au moyen d’une approche vaccinale
grâce à l’obtention d’anticorps anti –PA3731 (EA 2689, Lille).
III. Interactions protéines-sucres
Les interactions entre les sucres et les protéines jouent un rôle crucial dans de
nombreux processus de reconnaissance moléculaire ayant lieu lors de l’infection bactérienne
ou virale. Les microorganismes, pour s’attacher aux cellules de leur hôte, utilisent les
glycanes présents sur la surface membranaire (glycolipides et glycoprotéines des membranes
plasmiques, protéoglycanes des matrices extracellulaires, mucines des mucus). Ces étapes de
reconnaissance et d’adhésion sont essentielles aux processus d’invasion et de colonisation.
Les bloquer par des analogues du ligand serait un moyen de lutter contre l’infection comme le
36
montre la protection des nouveaux nés contre les infections microbiennes grâce aux
oligosaccharides présents dans le lait humain (Perret et al. 2005).
P. aeruginosa, dont la virulence est due à une forte capacité d’adhésion et de formation
de biofilms, utilise plusieurs ancres protéiques – ou lectines –capables d’interagir avec les
sucres de son hôte. Les lectines sont des protéines ubiquitaires d’origine non-immune, qui
reconnaissent spécifiquement et de façon réversible les sucres sans les modifier. Elles
permettent de lire le glycocode à la surface des cellules. L’arsenal de P. aeruginosa est
composé de deux lectines solubles PA-IL (gène lecA) et PA-IIL (gène lecB) ayant une
spécificité respectivement pour le D-galactose et le L-fucose (Imberty et al. 2006). Ces
lectines, principalement intracellulaires, ont été également identifiées sur la membrane
externe des bactéries et seraient impliquées dans la reconnaissance de l’hôte, la virulence mais
aussi dans la formation ou la maturation du biofilm (Tielker et al. 2005, Diggle et al. 2006).
P. aeruginosa possède aussi des adhésines (ou lectines liées à des organelles) situées à
l’extrémité d’organelles extracellulaires (flagelle, pili et fimbriae). Par exemple, la protéine de
coiffe du flagelle FliD reconnaît les mucines (Arora et al. 2000) et les pilines assemblées par
les pili de type IVa interagissent avec les glycolipides de type asialo-GM1 et -GM2. Trois
opérons cupA, cupB et cupC codant pour des systèmes chaperone/usher (Cup) capables
d’assembler des fimbriae ont été caractérisés chez P. aeruginosa et leur rôle dans la formation
de biofilm démontré (Vallet et al. 2001 , Ruer et al. 2007). Dans ces opérons, on identifie
principalement une protéine de membrane externe au travers de laquelle s’assemble un
fimbriae homopolymérique (CupC) ou un fimbriae hétéropolymérique constitué d’une sous
unité majeure à l’apex duquel est assemblée une adhésine (CupA et CupB) . Les deux
adhésines en question sont Cup A4 et CupB6.
Il est aujourd’hui nécessaire de connaître toutes les stratégies de la bactérie pour
adhérer à son hôte afin de mieux comprendre les mécanismes de reconnaissance et de
pathogénicité. Bloquer une seule lectine s’est, en effet, révélé jusqu’ici inefficace contre les
souches pathogènes d’Escherichia coli. Il semble que le développement de cocktails
d’inhibiteurs bloquant plusieurs lectines serait plus approprié.
Nous nous proposons donc de caractériser les interactions lectines –sucres :
(i)
Par la construction de souches délétées pour les gènes d’intérêt ou de
souches surexprimant ces gènes (UPR CNRS 9027, Marseille) ;
(ii)
Par l’analyse de la capacité de ces souches à produire des biofilms et à
adhérer à différentes surfaces modèles: surfaces plastiques et cultures de cellules
d’épithélium de voies respiratoires ;
(iii)
Par la production chez E. coli de protéines recombinantes correspondant
aux gènes codant pour des « lectines » (UPR 5301, Grenoble) dans le but de
déterminer la structure de ces « lectines » comme cela a été réalisé pour les lectines
solubles PA-IL et PA-IIL. Une difficulté concernant ces lectines réside dans le fait
qu’elles ne sont pas solubles sous forme entière et qu’il faudra soit produire le
domaine N-terminal responsable des interactions avec les sucres, soit produire la
protéine entière et sa chaperone, pour les adhésines des Cup (N-ter CupA4 et N-ter
CupB6, et/ou CupA4 et sa chaperone CupA5 et CupB6 et sa chaperone CupB4 (UPR
9027, Marseille) et pour les deux types antigéniques différents de FliD
(Collaboration avec R. Ramphal, University of Florida, Gainesville, USA) ;
(iv)
Par des méthodes de chromatographie classiques et d’affinité grâce à une
queue histidine N-terminale clivable. L’homogénéité de l’échantillon sera vérifiée
par des expériences de diffusion de la lumière ;
37
(v)
Par des études de spécificité en utilisant les outils du ‘Consortium for
Fonctional Glycomics’ qui permettent de tester près de 300 ligands naturels
monosaccharidiques ou oligosaccharidiques par des technologies de type GlycoChips
(www.functionalglycomics.org) après marquage fluorescent de la « lectine ». A
partir du criblage effectué par le Consortium, l’analyse fine de la spécificité et de
l’affinité avec les oligosaccharides disponibles sera reprise au CERMAV par
calorimétrie de titration isotherme (ITC) et par résonnance plasmonique de surface
(SPR). La détermination de la structure des adhésines avec leurs ligands sera
essentielle à la localisation et à l’étude des sites de fixation et se fera par
cristallographie aux rayons X. L’analyse structurale et la modélisation permettront la
conception d’inhibiteurs qui seront synthétisés par des chimistes des sucres et qui
pourraient être à la base de nouveaux médicaments anti-infectieux ;
(vi)
Par l’analyse de leur capacité d’inhibition testée par ELLA et pour les
meilleurs par ITC. Les bases moléculaires de l’inhibition seront déterminées par
cristallographie. Les candidats les plus prometteurs seront utilisés pour des tests
d’inhibitions in vitro et in vivo ;
(vii)
Par l’étude de la pathogénicité de différentes souches mutantes et de leurs
homologues pour lesquels la mutation sera trans-complémentée (EA 2689, Lille) en
physiopathologie sur un modèle murin développé par le groupe pour l’étude des
infections par P. aeruginosa. Le modèle d’infection des rats et l’étude de l’inhibition
de la formation de biofilm seront également utilisés pour évaluer l’intérêt préventif
ou thérapeutique des glycomimétiques de synthèse conçus. L’étude sera réalisée à la
fois sur un modèle aigu afin d’évaluer la virulence de chacune de ces lectines, mais
aussi dans un modèle d’infection chronique (pathogène enrobé dans des billes
d’agar) afin de se rapprocher des conditions obtenues en biofilm.
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39
Composition du GDR
et
Expertises
40
UPR9027­CNRS Marseille
Laboratoire ingénierie des systèmes macromoléculaires
Responsable : Sophie de Bentzmann(CR1, INSERM)
Email : [email protected]­mrs.fr
Adresse : 31, chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille cedex 20
Tél : 04 91 16 41 25
Fax : 04 91 71 21 24
Personnel engagé sur le projet :
Christophe Bordi (MCU, UII), Romé Voulhoux (CR1 CNRS), Marie­Cécile Lamy (Post Doctorante ANR), Geneviève Ball (AI CNRS), Steve Garvis (IR CNRS), Elise Termine (IE INSERM), Ségolène Ruer (Etudiante en thèse, 2ème année), Christophe Bernard (Etudiant en thèse, 2ème année), Caroline Giraud (Etudiante M2), Véronique Viarre (Etudiante en thèse, 1ème année).
Thématique de recherche :
Le laboratoire possède une grande expertise dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la virulence de P. aeruginosa. Historiquement le laboratoire a initié sa recherche sur la dissection du complexe macromoléculaire TT2S impliqué dans la sécrétion d’exoproduits et par la synchronisation de cette sécrétion par une régulation dépendante de la densité cellulaire ou quorum sensing. La publication du génome de ce microorganisme a permis au groupe de diversifier sa recherche vers d’autres aspects de la pathogénicité de ce microorganisme. Par des approches de génomique fonctionnelle, nous nous sommes intéressés à caractériser de nouveaux loci génétiques impliqués dans (i) la sécrétion d’exoproduits (autre TT2S dont l’expression est contrôlée par des signaux environnementaux spécifiques), d’effecteurs (TT6S, TTS3 et plus particulièrement pour ce dernier sa régulation dépendante du quorum sensing), (ii) le développement et la structuration du mode vie en biofilm, communauté bactérienne se comportant comme un organisme muticellulaire doué de propriétés métaboliques et physiologiques spécifiques (iii) les réseaux de régulation qui en réponse à des changements dans la composition des signaux environnementaux activent des voies de signalisation adaptant ainsi la réponse cellulaire à ces variations via les systèmes à deux composants ou TCS.
Cette recherche en Microbiologie Moléculaire nécessite des approches de génétique à grande échelle : (i) l’acquisition de la collection complète des ORF de la souche de référence PAO1 (5570 gènes) constituant la Pseudothèque pouvant être clonés dans des vecteurs d’expression pour obtenir des protéines recombinantes chez E. coli ou des vecteurs réplicatifs chez P. aeruginosa, (ii) le développement de puces pangénomiques pour les études de transcriptomes (iii) l’acquisition d’une banque ordonnée de mutants d’insertion dans la souche PA14 comprenant 5459 mutants non­redondants (soit une couverture du génome de 92.6%). Ces nouveaux acquis viennent renforcer la grande 41
maîtrise du laboratoire dans la génétique de P. aeruginosa incluant la construction de mutants propres, de fusions transcriptionnelles plasmidiques ou chromosomiques, la complémentation de mutations en trans sur plasmides ou sur le chromosome. La mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit permetttant de caractériser la virulence de souches de P. aeruginosa in vivo dans le modèle de nématode Caenorhabditis elegans constitue un atout supplémentaire pour tester l’implication de gènes dans la pathogénicité de P. aeruginosa.
Mots clés : système à deux composant – adhérance – interaction hôtepathogène – sécrétion.
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. S. Ruer, S. Stender, A. Filloux, S. de Bentzmann. 2007. Assembly of fimbrial structures in Pseudomonas aeruginosa: functionality and specificity of chaperone­usher machineries. J Bacteriol. 189: 3547­55. 2. A. Filloux, I. Ventre. 2006. Two sensors to control bacterial life style: the choice between chronic or acute infection. Med Sci (Paris). 22: 811­4.
3. S. de Bentzmann, M. Aurouze, G. Ball, A. Filloux. 2006. FppA, a novel Pseudomonas aeruginosa prepilin peptidase involved in assembly of type IVb pili. J Bacteriol. 188: 4851­60.
4. I. Ventre, A.L. Goodman, I. Vallet­Gely, P. Vasseur, C. Soscia, S. Molin, S. Bleves, A. Lazdunski, S. Lory, A. Filloux. 2006. Multiple sensors control reciprocal expression of Pseudomonas aeruginosa regulatory RNA and virulence genes.Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 171­6. 5. P. Vasseur, I. Vallet­Gely, C. Soscia, S. Genin, A. Filloux. 2005. The pel genes of the Pseudomonas aeruginosa PAK strain are involved at early and late stages of biofilm formation. Microbiology. 151: 985­97.
6. H.D. Kulasekara, I. Ventre, B.R. Kulasekara, A. Lazdunski, A. Filloux, S. Lory. 2005. A novel two­component system controls the expression of Pseudomonas aeruginosa fimbrial cup genes. Mol Microbiol. 55(2):368­80.
7. I. Vallet, S.P. Diggle, R.E. Stacey, M. Camara, I. Ventre, S. Lory, A. Lazdunski, P. Williams, A. Filloux. 2004. Biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: fimbrial cup gene clusters are controlled by the transcriptional regulator MvaT. J Bacteriol. 186: 2880­90.
42
8. C. Bordi, L. Theraulaz, V. Mejean, C. Jourlin­Castelli. 2003. Anticipating an alkaline stress through the Tor phosphorelay system in Escherichia coli. Mol Microbiol. 48: 211­23.
9. C.L. Kurz, S. Chauvet, E. Andres, M. Aurouze, I. Vallet, G.P. Michel, M. Uh, J. Celli, A. Filloux, S. de Bentzmann, I. Steinmetz, J.A Hoffmann, B.B Finlay, J.P. Gorvel, D. Ferrandon, J.J Ewbank. 2003. Virulence factors of the human opportunistic pathogen Serratia marcescens identified by in vivo screening. EMBO J. 22: 1451­60.
10. I. Vallet, J.W. Olson, S. Lory, A. Lazdunski, A. Filloux. 2001. The chaperone/usher pathways of Pseudomonas aeruginosa: identification of fimbrial gene clusters (cup) and their involvement in biofilm formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 6911­6. Epub 2001 May 29.
43
UMR6522­CNRS Rouen
Laboratoire Polymères, Biopolymères, Membranes – Groupe « BRICS » BIofilms,
Résistance et Intercations Cellules-Surfaces
Responsable : Thierry Jouenne
Email : thierry.jouenne@univ­rouen.fr
Adresse : Laboratoire Polymeres, Biopolymères, Membranes (« BRICS »), Université de Rouen
Tél : 02 35 61 42 80
Fax : 02 35 14 67 04
Personnel engagé sur le projet :
Cosette P. (MC HDR), De E. (Pr), Jouenne T. (DR), Bonato H. (Technicienne IATOS Univ.), Coquet L. (IE CNRS), Mace C. (Doctorant Bourse MRT).
Thématique de recherche :
L’objectif majeur des chercheurs du groupe BRICS de l’UMR CNRS 6522 est d’élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans l’adhésion des bactéries et dans la résistance des biofilms aux antibiotiques, afin d’identifier de nouvelles cibles moléculaires. La stratégie privilégiée est une approche protéomique, qui consiste à comparer l’expression protéique (donc le protéome) des bactéries cultivées classiquement au laboratoire (en milieu liquide) avec celle de ces mêmes bactéries cultivées sous la forme de biofilm. La fabrication de mutants KO sur les gènes candidats permet ensuite de valider ou non ces cibles potentielles. Le groupe possède également une expertise dans la reconstitution membranaire en bicouche lipidique plane permettant de mettre en évidence des propriétés formeuses de pores des protéines membranaires. Différents micro­organismes sont étudiés dont Pseudomonas aeruginosa, espèce formant des biofilms dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Un autre axe de recherche développé par les chercheurs du groupe BRICS est le développement de matériaux anti­adhésifs c'est­à­dire moins susceptibles d’être colonisés par les bactéries. Pour cela différentes stratégies sont étudiées comme par exemple la fonctionnalisation des matériaux par des peptides antibactériens.
Mots clés : Biofilms-protéomique-protéines membranaires-résistance
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10 références les plus significatives depuis 2004 :
1. P.Y. Litzler, L. Benard, N. Barbier­Frebourg, S. Vilain, T. Jouenne, E. Beucher, C. Bunel, J.F. Lemeland and J.P. Bessou. Biofilm formation on pyrolytic carbon heart valves: influence of surface free energy, roughness and bacterial species. J. Thor. Cardiovascul. Surg., in press.
2. A. Siroy, P. Cosette, D. Seyer, C. Lemaître­Guillier, D. Vallenet, A. Van Dorsselaer, M. Pestel­Caron, T. Jouenne T. and E. Dé. 2006. Global comparison of the membrane subproteomes between a MDR Acinetobacter baumannii and a reference strain. J. Prot. Res. 5: 3385­3398.
3. L Coquet, P. Cosette, E. Dé, L. Galas, H. Vaudry, C. Rihouey, P. Lerouge, G.A. Junter G.A. and T. Jouenne. 2005. Immobilization induces alterations in the outer membrane protein pattern of Yersinia ruckeri. J. Prot. Res. 4: 1988­1998.
4. A. Siroy, V. Molle, C. Lemaître­Guillier, D. Vallenet, M. Pestel­Caron, A.J. Cozzone, T. Jouenne and E. Dé. 2005. Channel formation by CarO, an outer membrane protein involved in the imipenem resistance of Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4876­4883.
5. D. Seyer, P. Cosette, A. Siroy, E. Dé, C. Lenz, H. Vaudry, L. Coquet and T. Jouenne. 2005. Proteomic comparison of outer membrane protein patterns of sessile and planktonic Pseudomonas aeruginosa cells. Biofilms 2: 27­36.
6. T. Jaouen, E. Dé, S. Chevalier, N. Orange. 2004. Pore size dependence on growth temperature is a common characteristic of the major outer membrane protein OprF in psychrotrophic and mesophilic Pseudomonas. Appl. Environ. Microbiol. 70 : 6665­6669.
7. S. Vilain, P. Cosette, M. Hubert, C. Lange, G.A. Junter and T. Jouenne. 2004. A proteomic analysis of agar gel entrapped Pseudomonas aeruginosa. Proteomics 4 : 1996­
2004.
8. G.A. Junter and T. Jouenne. 2004. Immobilized viable microbial cells: from the process to the proteome… Or the cart before the horse. Biotechnol. Advances 22, 633­658.
9. S. Vilain, P. Cosette, M. Hubert, C. Lange, G.A. Junter and T. Jouenne. 2004. Comparative proteomic analysis of planktonic and immobilized Pseudomonas aeruginosa cells: a multivariate statistical approach. Anal. Biochem. 329: 120­130.
10. S. Vilain, P. Cosette, I. Zimmerlin, J.P. Dupont, G.A. Junter and T. Jouenne. 2004. The biofilm proteome: homogeneity or versatility? J. Prot. Res. 3: 133­136.
UMR7175-LC1 -CNRS Strasbourg 45
Laboratoire des Métaux et Microorganismes : Chimie, Biologie et Applications
Responsable : Isabelle Schalk (DR2, CNRS)
Email : [email protected]­strasbg.fr
Adresse : UMR7175­LC1, ESBS, Université Louis Pasteur­CNRS, Bld Sébastien Brandt, 67400 Illkirch
Tél : 03 90 24 47 19
Fax : 03 90 24 48 29
Personnel engagé sur le projet :
Isabelle Schalk (DR2 CNRS), Mislin Gaëtan (CR1 CNRS), Journet Laure (CR1 CNRS), Hoegy Françoise (AI CNRS), Brault Armelle (postdoctorante ANR), Nader Mirella (doctorante BDI CNRS), Yeterian Emilie (doctorante MRT).
Thématique de recherche :
Notre équipe présente la particularité peu commune d’être composée de biochimistes, de biologistes moléculaires et de chimistes organiciens. Ces différentes compétences sont associées dans le cadre d’une approche pluridisciplinaire focalisée sur l’étude du transport membranaire du fer et d’autres métaux chez les bactéries et chez Pseudomonas aeruginosa plus particulièrement. Le fer est un élément essentiel à la vie d’une majorité d’organisme mais, paradoxalement, ce métal très abondant sur Terre est peu biodisponible. En effet, en milieu aérobie, dans l’eau et à pH physiologique, le fer(III) est très peu soluble et son assimilation par les microorganismes implique la production de petites molécules appelées sidérophores, capables de chélater le fer. Chez les bactéries à Gram négatif, le transport du complexe sidérophore­Fe à travers la membrane externe implique différentes protéines membranaires et une voie de signalisation régulant l’expression des gènes codant pour les protéines impliquées dans l’acquisition du fer.
­ Notre équipe essaie d’élucider les différents mécanismes de transport impliqués dans l’assimilation du fer chez P. aeruginosa au niveau moléculaire. Cette étude s’intéresse à chaque protéine impliquée dans le transport mais également à la machinerie membranaire de transport impliquant toutes les protéines de transport et les protéines régulatrices. ­ Nous étudions également la spécificité des voies de transport du fer utilisant des sidérophores, vis­à­vis de nombreux métaux toxiques. L’objectif est de valider l’utilisation des voies d’assimilation du fer dans de nouveaux procédés de bioremédiation. ­ Le fer étant essentiel à la vie des bactérie, les voies de transports du fer sont des cibles prometteuses pour concevoir une nouvelle génération d’antibiotiques. Deux stratégies sont développées en parallèle. ­Synthèse d’inhibiteurs des protéines impliquées dans le transport du fer. 46
Le blocage de certaines de ces protéines inhibe le transport du fer et par conséquent inhibe la prolifération bactérienne
­ Synthèse de conjugués sidérophore­antibiotique se comportant comme des « chevaux de Troie » capables d’utiliser les voies d’assimilation du fer pour s’introduire dans la bactérie à détruire.
Mots clés : Transport du fer, sidérophore, protéines membranaires,
antibiotiques, bioremédiation
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1.. J. Greenwald, F. Hoegy, M. Nader, L. Journet, G. L. A. Mislin, P. L. Graumann and I. J. Schalk. 2007. Real­time FRET Visualization of ferric­pyoverdine uptake in Pseudomonas aeruginosa: a role for ferrous iron. J Biol Chem. 282 :2987­95.
2. R. Voulhoux, A. Filloux and I. J. Schalk. 2006. Role of the TAT System in the Pyoverdine­Mediated Iron Acquisition in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol, 188:3317­
23.
3. G. L. A. Mislin, F. Hoegy, D. Cobessi, K. Poole, D. Rognan and I. J. Schalk. 2006. The structure­activity relationship of pyochelin and analogues to FptA in Pseudomonas aeruginosa. J. Mol. Biol, 357 :1437­48.
4. V. Schons, R. A. Atkinson, C. Dugave, R. Graff, G. L. A. Mislin, L. Rochet, B. Kieffer, M. A. Abdallah and I. J. Schalk. 2005. Study of the structure­activity relationship between apo and ferric­pyoverdin and their binding site on Pseudomonas aeruginosa outer membrane receptor FpvA. Biochemistry 44 :14069­14079.
5. Hoegy, H. Célia, G. Mislin, M. Vincent, J. Gallay and I. J. Schalk. 2005. Binding of iron­free siderophore, a common feature for siderophore outer membrane receptors of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. J. Biol. Chem. 280 :20222­20230.
6. D. Cobessi, H. Célia, N. Folschweiller, I. J. Schalk, M. A. Abdallah and F. Pattus. 2005. The crystal structure of the pyoverdin outer membrane receptor FpvA from Pseudomonas aeruginosa at 3.6 Å resolution. J. Mol. Biol. 347 :121­134.
7. E. Clément, P. J. Mesini, F. Pattus and I. J. Schalk. 2004. The binding mechanism of pyoverdin with the outer membrane receptor FpvA in Pseudomonas aeruginosa is dependent on its iron­loaded status. Biochemistry 43 :7954­7965.
47
8. N. Folschweiller, J. Gallay, M. Vincent, M. A. Abdallah, F Pattus and I. J. Schalk. 2002. Pyoverdin and Pyoverdin­Metal binding properties on Pseudomonas aeruginosa outer membrane receptor FpvA : a time­resolved fluorescence study. Biochemistry 41 :14591­14601. 9. I. J. Schalk , M. A. Abdallah and F. Pattus. 2002. Pyoverdin Recycling via the FpvA Receptor after Ferric­Pyoverdin Uptake and Dissociation in Pseudomonas aeruginosa. Biochemistry 41 :1663­1671.
10. I. J. Schalk, C. Hennard, C. Dugave, K. Poole, M.A. Abdallah and F. Pattus. 2001. Iron­Free Pyoverdin Binds to its Outer Membrane Receptor FpvA in Pseudomonas aeruginosa. A New Mechanism for Membrane Iron Transport. Mol. Microbiol. 39 :351­
360.
48
UPR5301-CERMAV -CNRS Grenoble
Laboratoire de Glycobiologie Moléculaire
Responsable : Christelle Breton
Email : [email protected]
Adresse : CERMAV­CNRS – UPR5301, 601 rue de la Chimie, BP 53,
38041 Grenoble cedex 9
Tél : 04 76 03 76 36
Fax : 04 76 54 72 03
Personnel engagé sur le projet :
Anne Imberty (DR1 CNRS section 16), Annabelle Varrot (CR1, CNRS section 16), Catherine Gautier (AI CNRS), Emilie Lameignère (thèse), Bertrand Blanchard (thèse).
Directeur du CERMAV : Redouane Borsali ([email protected])
Thématique de recherche :
Le groupe de Glycobiologie Moléculaire du CERMAV à Grenoble étudie les interactions protéines­sucres et particulièrement celles qui impliquent les glycosyltransférases et les lectines. Les glycosyltransférases sont impliquées dans la biosynthèse des oligosaccharides et des polysaccharides et participent à la mise en place de la paroi bactérienne. Les lectines, qui ne font pas partie du système immunitaire, sont capables de reconnaître des glucides complexes, de manière spécifique et réversible sans les modifier. Les bactéries, par exemple, utilisent les lectines pour se lier spécifiquement aux glycoconjugués à la surface de leurs cellules hôtes. Elles jouent donc un rôle essentiel dans la reconnaissance des tissus ainsi que dans l'adhésion, étape essentielle à l’invasion bactérienne. Les lectines d’intérêt sont principalement produites sous forme recombinante au laboratoire. Leur spécificité est déterminée et étudiée par ELLA (Enzyme­Linked Lectin Assay), par résonance plasmonique de surface et par utilisation de puces à sucres. L’affinité fine et la caractérisation thermodynamique des interactions sont réalisées grâce à la méthode de microcalorimétrie de titration. La détermination de la structure cristallographique par rayons X de complexes lectines /carbohydrates permet l’analyse des interactions à un niveau moléculaire en vue de développer de nouveaux médicaments anti­infectieux. Le groupe a débuté l’étude systématique des relations structure­fonction de toutes les lectines de Pseudomonas aeruginosa 49
Mots clés : Glycobiologie, lectines, cristallographie, microcalorimétrie,
résonance plasmonique de surface
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Marotte, K., C. Sabin, C. Préville, M. Moumé­Pymbock, M. Wimmerova, E. P. Mitchell, A. Imberty, and R. Roy. X­ray structures and thermodynamic of interaction of PA­IIL from Pseudomonas aeruginosa with disaccharide derivatives. ChemMedChem. in press.
2. Adam, J., M. Pokorna, C. Sabin, E. P. Mitchell, A. Imberty, and M. Wimmerova. 2007. Engineering of PA­IIL lectin from Pseudomonas aeruginosa ­ Unravelling the role of the specificity loop for sugar preference. BMC Struct. Biol. 7: 36.
3. Imberty, A., M. Wimmerova, C. Sabin, and E. P. Mitchell. 2006. Structures and roles of Pseudomonas aeruginosa lectins, p. 30­48. In C. Bewley (ed.), Protein­Carbohydrate Interactions in Infectious Disease. The Royal Society of Chemistry, Cambridge.
4. Sabin, C., E. P. Mitchell, M. Pokorná, C. Gautier, J.­P. Utille, M. Wimmerová, and A. Imberty. 2006. Binding of different monosaccharides by lectin PA­IIL from Pseudomonas aeruginosa: Thermodynamics data correlated with X­ray structures. FEBS Lett. 580: 982­987.
5. Imberty, A., E. P. Mitchell, and M. Wimmerová. 2005. Structural basis for high affinity glycan recognition by bacterial and fungal lectins. Curr. Opin. Struct. Biol. 15: 525­534.
6. Perret, S., C. Sabin, C. Dumon, M. Pokorná, C. Gautier, O. Galanina, S. Ilia, N. Bovin, M. Nicaise, M. Desmadril, N. Gilboa­Garber, M. Wimmerova, E. P. Mitchell, and A. Imberty. 2005. Structural basis for the interaction between human milk oligosaccharides and the bacterial lectin PA­IIL of Pseudomonas aeruginosa. Biochem. J. 389: 325­332.
7. Mitchell, E. P., C. Sabin, L. Šnajdrová, M. Pokorná, S. Perret, C. Gautier, C. Hofr, N. Gilboa­Garber, J. Koča, M. Wimmerová, and A. Imberty. 2005. High affinity fucose binding of Pseudomonas aeruginosa lectin PA­IIL: 1.0 Å resolution crystal structure of the complex combined with thermodynamics and computational chemistry approaches. Proteins: Struct. Funct. Bioinfo. 58: 735­748.
50
8. Imberty, A., M. Wimmerova, E. P. Mitchell, and N. Gilboa­Garber. 2004. Structures of the lectins from Pseudomonas aeruginosa: Insights into molecular basis for host glycan recognition. Microb. Infect. 6:222­229.
9. Cioci, G., E. P. Mitchell, C. Gautier, M. Wimmerova, D. Sudakevitz, S. Pérez, N. Gilboa­Garber, and A. Imberty. 2003. Structural basis of calcium and galactose recognition by the lectin PA­IL of Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 555: 297­301.
10. Mitchell, E., C. Houles, D. Sudakevitz, M. Wimmerova, C. Gautier, S. Pérez, A. M. Wu, N. Gilboa­Garber, and A. Imberty. 2002. Structural basis for oligosaccharide­
mediated adhesion of Pseudomonas aeruginosa in the lungs of cystic fibrosis patients. Nature Struct. Biol. 9:918­921. 51
UMR8015 CNRS, Université Paris Descartes
Equipe Signalisation et transport membranaire
Responsable : Arnaud Ducruix
Email : arnaud.ducruix@univ­paris5.fr
Adresse : Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques,
UMR 8015 CNRS, Faculté de Pharmacie,
4, Avenue de l'Observatoire, 75270 Paris cedex 06
Tél : 01 53 73 98 36
Fax : 01 53 73 99 25
http://lcrbw.pharmacie.univ­paris5.fr
http://www.univ­paris5.fr
Personnel engagé sur le projet :
Arnaud Ducruix, Isabelle Broutin (CR), Stéphane Rety (CR), P. Benas (IR).
Thématique de recherche :
L’équipe « Signalisation et transport membranaire », présente au sein de l’Unité Mixte de Recherche 8015, est composée de cinq chercheurs/enseignants­chercheurs permanents, deux doctorants et un ingénieur de recherche. Le laboratoire est implanté sur le site de la faculté de Pharmacie de Paris dans l'IFR71 "Sciences du médicament". L’équipe bénéficie de nombreuses plates­formes présentes sur le site (biologie structurale, imagerie, animalerie, spectrométrie de masse…).
L’équipe participera à deux workpackages. • Dans le premier (AD, IB, PB), les études porteront sur assemblages et la régulation des pompes à efflux de P. aeruginosa. Les pompes à efflux des bactéries gram­négatives sont des systèmes complexes à trois composants dont deux sont situés dans les membranes (interne et externe) de la bactérie et le troisième dans le périplasme (tout en possédant une ancre lipidique). Leur fonctionnement est assuré par un gradient de protons. Ces pompes à efflux sont l'un des mécanismes principaux responsables de la résistance de la bactérie aux divers antibiotiques. • Dans le second (SR) les études porteront sur la formation de biofilms. Il a été mis en évidence que l’exposition de P. aeruginosa à des doses d’aminoglycosides inférieures à la concentration minimale inhibitrice conduit à la formation de biofilm. Cette réponse fait intervenir une protéine appelée Arr (aminoglycoside response regulator), de structure inconnue, qui intervient dans la régulation de la concentration cellulaire en c­di­GMP, un second messager bactérien. Les compétences de l’équipe dans le domaine de la biologie structurale sont polyvalentes : biologie moléculaire, biochimie, biophysique, cristallographie et RMN biologiques.
52
Mots clés : cytotoxicité, interaction cellule eucaryote, nanomachines
moléculaires, toxines
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Moncoq K, Broutin I, Larue V, Perdereau D, Cailliau K, Browaeys­Poly E, Burnol AF, DUCRUIX A. 2003. The PIR Domain of Grb14 is an intrinsically unstructured protein: implication in insulin signaling. FEBS LETT. 554: 240­6.
2. K. Moncoq, I. Broutin , CT. Craescu, P. Vachette, A. Ducruix, D. Durand. 2004. SAXS study of the PIR domain from the Grb14 molecular adaptor: a natively unfolded protein with a transient structure primer. Biophys. J. 87: 4056­64.
3. A. Le Maire, T. Weber , S. Saunier, I. Broutin, C. Antignac, A. Ducruix, F. Dardel. 2005. Solution NMR structure of the SH3 domain of human nephrocystin and analysis of a mutation­causing juvenile nephronophthisis. Proteins­structure function and bioinformatics. 59: 347­355 4. I. Broutin, H. Benabdelhak, X. Moreel, M.­B. Lascombe, D. Lerouge, A. Ducruix. 2005. Expression, purification, crystallization and preliminary X­ray studies of the outer membrane efflux proteins OprM and OprN from Pseudomonas aeruginosa. Acta Cryst. 61: 315­318
5. O. Lambert, H. Benabdelhak, M. Chami, L. Jouan, E. Nouaille, A. Ducruix, A. Brisson. 2005. Trimeric structure of OprN and OprM efflux proteins from Pseudomonas aeruginosa by 2D electron crystallography. Journal of Structural Biology. 150: 50–57
6. de Mol NJ, Dekker FJ, Broutin I, Fischer MJ, Liskamp RM. 2005. Surface plasmon resonance thermodynamic and kinetic analysis as a strategic tool in drug design. Distinct ways for phosphopeptides to plug into Src­ and Grb2 SH2 domains. J Med Chem. 48: 753­63.
7. S. Grizot, Mi. Salem, V. Vongsouthi, L.Durand, F. Moreau, H. Dohi, S. Vincent , S. Escaich , A. Ducruix. 2006. Structure of the Escherichia coli heptosyltransferase WaaC: binary complexes with ADP and ADP­2­deoxy­2­fluoro heptose. J. Mol. Biol. 363: 383­
394
8. Jacquot Y, Broutin I, Miclet E, Nicaise M, Lequin O, Goasdoue N, Joss C, Karoyan P, Desmadril M, Ducruix A, Lavielle S. 2006. High affinity Grb2­SH3 domain ligand incorporating C(beta)­substituted prolines in a Sos­derived decapeptide. Bioorg Med Chem. 5: 1439­47.
9. Gauss GH, Benas P, Wiedenheft B, Young M, Douglas T, Lawrence CM. 2006. 53
Structure of the DPS­like protein from Sulfolobus solfataricus reveals a bacterioferritin­
like dimetal binding site within a DPS­like dodecameric assembly. Biochemistry. 45:10815­27.
10. S. Trépout, S. Mornet, H. Benabdelhak, A. Ducruix, A. R. Brisson, O. Lambert. 2007. Membrane protein selectively oriented on solid support and reconstituted into a lipid membrane. Langmuir. 23: 2647­2654
UMR5092-CNRS, CEA Grenoble
54
Equipe Interaction bactérie pathogène­hôte
Responsable : Ina Attrée
Email : [email protected]
Adresse : UMR5092 CNRS, CEA, Université Joseph Fourier, LBBSI
Equipe Interaction bactérie pathogène­hôte, iRTSV, CEA/Grenoble
17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble cedex 9
Tél : 04 38 78 34 83
Fax : 04 38 78 44 99
http://www­dsv.cea.fr/bbsi/pseudo
Personnel engagé sur le projet :
Ina Attrée (CNRS), Sylvie Elsen (CNRS), Eric Faudry (CEA).
Thématique de recherche :
L’équipe « Interaction bactérie pathogène­hôte », présente au sein de l’Unité Mixte de Recherche 5092 dirigée par Dr F Boulay, est actuellement composée de trois chercheurs permanents, deux doctorants et deux post­doctorants. Le laboratoire est implanté dans l’Institut de Recherche en Technologies et Sciences du Vivant, CEA/Grenoble. L’équipe bénéficie de nombreuses plate­formes présentes sur le site du CEA (microscopie confocale, microscopie électronique en transmission, criblage à haut débit, spectrométrie de masse…).
Le projet de l’équipe portera sur les études des assemblages et de la régulation de deux mécanismes majeurs de la virulence de Pseudomonas aeruginosa que sont les systèmes de sécrétion de type III et de type VI. Ces systèmes d’export protéique sont particuliers, car ils sont capables de transloquer directement les substrats toxiques dans la cellule eucaryote­cible. En effet, ce sont des assemblages multimoléculaires qui traversent trois membranes (les deux membranes de la bactérie Gram négative et celle de la cellule cible), et ils sont composés d’une dizaine de protéines, souvent membranaires.
Les compétences de l’équipe dans le domaine de la virulence bactérienne sont polyvalentes : microbiologie moléculaire et cellulaire, biochimie et biophysique. Différents modèles cellulaires d’infection à P. aeruginosa (macrophages, érythrocytes, drosophile..) ont été développés et sont couramment utilisés.
55
Mots clés : cytotoxicité, interaction cellule eucaryote, nanomachines
moléculaires, toxines
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Quinaud, M., Ple, S., Job, V., Contreras­Martel, C., Simorre, P., Attree, I., & Dessen, A. 2007. Structure of the heterotrimeric complex which regulates type III secretion needle formation. Proc Natl Acad Sci USA, 104: 7803­7808.
2. Faudry E, Vernier G, Neumann, E., Forge V. & Attree I. 2006. Synergistic pore formation by type III toxin translocators. Biochemistry, 45 : 8117­8123.
3. Quinaud, M., Chabert, J., Faudry, E., Neumann, E., Lemaire, D., Pastor, A., Elsen, S., Dessen, A. & Attree, I. 2005. The PscE­PscF­PscG complex controls type III secretion needle biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. J Biol Chem 280: 36293­300.
4. Goure, J., Broz, P., Attree, O., Cornelis, G. R. & Attree, I. 2005. Protective anti­V antibodies inhibit Pseudomonas and Yersinia translocon assembly within host membranes. J Infect Dis 192: 218­25.
5. Avet­Rochex, A., Bergeret, E., Attree, I., Meister, M. & Fauvarque, M. O. 2005. Suppression of Drosophila cellular immunity by directed expression of the ExoS toxin GAP domain of Pseudomonas aeruginosa. Cell Microbiol 7: 799­810.
6. Von Gotz, F., Haussler, S., Jordan, D., Saravanamuthu, S. S., Wehmhoner, D., Strussmann, A., Lauber, J., Attree, I., Buer, J., Tummler, B. & Steinmetz, I. 2004. Expression analysis of a highly adherent and cytotoxic small colony variant of Pseudomonas aeruginosa isolated from a lung of a patient with cystic fibrosis. J Bacteriol 186: 3837­47.
7. Goure, J., Pastor, A., Faudry, E., Chabert, J., Dessen, A. & Attree, I. 2004. The V antigen of Pseudomonas aeruginosa is required for assembly of the functional PopB/PopD translocation pore in host cell membranes. Infect Immun 72, 4741­50.
8. Schoehn, G., Di Guilmi, A. M., Lemaire, D., Attree, I., Weissenhorn, W. & Dessen, A. (2003). Oligomerization of type III secretion proteins PopB and PopD precedes pore formation in Pseudomonas. Embo J 22: 4957­67.
9. Berthelot, P., Attree, I., Plesiat, P., Chabert, J., de Bentzmann, S., Pozzetto, B. & Grattard, F. 2003. Genotypic and phenotypic analysis of type III secretion system in a cohort of Pseudomonas aeruginosa bacteremia isolates: evidence for a possible association between O serotypes and exo genes. J Infect Dis 188: 512­8.
56
10. Dacheux, D., Goure, J., Chabert, J., Usson, Y. & Attree, I. 2001. Pore­forming activity of type III system­secreted proteins leads to oncosis of Pseudomonas aeruginosa­
infected macrophages. Mol Microbiol 40: 76­85.
57
UMR 5075
Pathogénicité bactérienne
Responsable : Andréa Dessen (DR2, CNRS)
Email : [email protected]
Adresse : Institut de Biologie Structurale Jean­Pierre Ebel, CEA Grenoble, 41 rue Jules Horowitz, 38027 Grenoble cedex 1
Tél : 04 38 78 95 90
Fax : 04 38 78 54 94
Personnel engagé sur le projet :
Viviana Job (Ing­chercheur CEA) ; Alexandre Martins dos Santos (Techn. supérieur CEA) ; Cécile Dahout­Gonzalez (postdoc CNRS) ; Pierre­Jean Matteï (stagiarie M2, thésard à partir du mois d’octobre 2007).
Thématique de recherche :
L’équipe “Pathogenicité bacterienne”, qui fait partie du Laboratoire des Protéines Membranaires dirigé par Eva Pebay­Peyroula, possède une grande expertise dans la détermination de structures protéiques par cristallographie aux rayons X. Elle s’est concentrée ces dernières années sur l’étude de mécanismes d’infection chez des pathogènes humains majeurs. L’équipe est constituée au total de 8 personnes qui travaillent, d’une part, sur le mécanisme moléculaire du système de sécrétion de type III (TTSS) de P. aeruginosa et, d’autre part, sur les protéines de virulence du pneumocoque. L’équipe bénéficie de nombreux équipements essentiels pour la biologie structurale, comme deux générateurs de rayons X (Nonius, Rigaku) et des detecteurs MAR 345mm, ainsi que la possibilité de collecter des données de diffraction d’excellente qualité grâce au synchrotron ESRF de Grenoble.
Dans le cadre du GDR, nous nous intéresserons aux mécanismes qui permettent la translocation des toxines sécrétées par le TTSS à travers les membranes des cellules eucaryotes. En particulier, nous nous focaliserons sur le mécanisme de formation de l’aiguille de sécrétion. Chez P. aeruginosa, l’aiguille du TTSS est formée par la protéine PscF qui est produite dans le cytoplasme bactérien sous forme soluble et qui, après transport à l’extérieur de la bactérie, subit un processus de polymérisation. Nous avons récemment montré que ce processus, hautement régulé pour empêcher que PscF ne subisse une polymérisation à l’intérieur du cytoplasme bactérien, nécessite que PscF soit stabilisé par deux chaperonnes différentes, PscE et PscG (Quinaud et al., 2005). La structure cristallographique du complexe ternaire entre PscE, PscF et PscG, résolue à l’IBS, nous a permis d’identifier des surfaces d’interaction essentielles pour la stabilité du complexe et, par conséquent, pour la cytotoxité bactérienne (Quinaud et al., 2007).
Nous continuerons à nous intéresser au mécanisme de formation de l’aiguille, avec la possible interaction entre les molécules PscG, PscE et l’ATPase localisée à la base du système de sécrétion. En outre, nous continuerons nos études sur les protéines 58
PopB et PopD qui forment le pore de translocation de ce système chez P. aeruginosa (Schoehn et al., 2003 ; Faudry et al., 2007). Les expériences de biochimie et cristallogenèse pour identifier des interactions et cristalliser les complexes sont en cours.
Mots clés : cristallographie, études structure-fonction, repliement
protéique, rayons X
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Macheboeuf, P., Fischer, D., Zervosen, A., Luxen, A., Joris, B., Dessen, A.* and Schofield, C.* 2007. Structural and mechanistic basis of penicillin­binding protein inhibition by lactivicins. Nature Chem. Biol., revised version submitted. (*corresponding authors).
2. Faudry, E., Job, V., Dessen, A., Attree, I., & Forge, V. 2007. Type III secretion system translocator has a molten globule conformation both in its free and chaperon­bound forms. FEBS J., in press.
3. Quinaud, M., Ple, S., Job, V., Contreras­Martel, C., Simorre, J.­P., Attree, I., and Dessen, A. 2007. Structure of the heterotrimeric complex which regulates type III secretion needle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104: 7803­7808.
4. Contreras­Martel, C., Job, V., Di Guilmi, A.M., Vernet, T., Dideberg, O., and Dessen, A. 2006. Structural basis for ﾪ­lactam resistance by a class A penicillin­binding protein from Streptococcus pneumoniae. J. Mol. Biol. 544: 684­696.
5. Quinaud, M., Chabert, J., Faudry, E., Neumann, e., Lemaire, D., Pastor, A., Elsen, S., Dessen, A., and Attree, I. 2005. The PscE­PscF­PscG complex controls type III secretion needle biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 280: 36293­36300.
6. Macheboeuf, P., Di Guilmi, A.M., Job, V., Vernet, T., Dideberg, O., and Dessen, A. 2005. Active site restructuring regulates ligand recognition in class A penicillin­
binding proteins (PBPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 577­582.
7. Nanao, M.H., Tcherniuk SO, Chroboczek J, Dideberg O, Dessen A, Balakirev MY. 2004. Crystal structure of human otubain 2. EMBO Rep. 5: 783­788.
8. Gouré, J., Pastor, A., Faudry, E., Brochier, G., Chabert, J., Dessen, A., and Attree, I. 2004. The V antigen of Pseudomonas aeruginosa is required for assembly of the 59
functional type III translocation pore in host cell membranes. Infect. Immun. 72: 4741­
4750.
9. Dessen, A. 2004. A new catalytic dyad regulates anchoring of molecules to the Gram­positive cell wall by sortases. Structure. 12: 6­7.
10. Schoehn, G., DiGuilmi, A.M.., LeMaire, D., Attree, I., Weissenhorn, W., and Dessen, A. 2003. Oligomerization of type III secretion proteins PopB and PopD precedes pore formation in Pseudomonas. EMBO J. 22: 4957­4967.
60
UMR5100­CNRS Toulouse
Laboratoire de Génomique des système intégrés
Responsable : Gwennaele Fichant
Email : [email protected]
Adresse : Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires (UMR 5100)
Université Paul Sabatier, BAT. IBCG
118, route de Narbonne, 31062 Toulouse CEDEX 9, France
Tél : 05 61 33 58 26
Fax : 05 61 33 58 86
Personnel engagé sur le projet :
Yves Quentin (CR1 CNRS), Gwennaele Fichant (Professeur, Université Paul Sabatier).
Thématique de recherche :
De nombreuses fonctions biologiques nécessitent la participation coordonnées de plusieurs partenaires protéiques sous la forme d'un assemblage macromoléculaire (appelé système intégré) permanent ou sous forme de contacts épisodiques. La thématique de l'équipe est centrée sur l'identification, la reconstruction et l'analyse de ces assemblages dans les génomes bactériens complètement séquencés, au moyen d'approches bio­informatiques. Nous nous intéressons plus particulièrement aux systèmes bactériens constitués de protéines appartenant à des familles multigéniques et impliqués dans les échanges de la bactérie avec le milieu extérieur. L'obtention des répertoires de ces différents systèmes et leur comparaison entre les différents organismes permettent d'aborder les questions liées à l'évolution de ces systèmes et à leur implication dans l'adaptation de la bactérie à son environnement. Nos premières études ont porté sur la famille des transporteurs ABC, systèmes impliqués dans l'import et l'export de différentes molécules à travers la membrane cytoplasmique et ont conduit à la création d'une base de données publique (ABCdb). Ces stratégies sont actuellement étendues à l’analyse de processus biologique complexes en prenant comme modèle la transformation génétique naturelle qui serait présente chez de nombreuses espèces bactériennes. Ce processus fait intervenir des systèmes macromoléculaires complexes (machinerie d’entrée de l’ADN, procesosome) et est finement régulé. L’approche de génomique comparative entreprise vise à élucider les trajectoires évolutives, la mise en place et la régulation de ce processus. Un autre aspect de notre travail concerne l’étude des réarrangements chromosomiques entre génomes d’espèces proches ou appartenant à la même espèce. L’originalité de notre approche est de replacer ces évènements sur un arbre phylogénétique afin de pouvoir analyser, à chaque nœud, les réarrangements qui se sont produits entre le 61
génome ancêtre inféré et ses deux plus proches descendants. Notre plate­forme d’exploration est disponible sur le site de la génopole de Toulouse.
Mots clés : ABC transporteur, , système intégré, génomique
comparative, bio-informatique, base de données.
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Fremez, R., T. Faraut, G. Fichant, J. Gouzy, and Y. Quentin. 2007. Phylogenetic exploration of bacterial genomic rearrangements. Bioinformatics 23: 1172­1174.
2. Louarn, J.M., and Y. Quentin. 2007. FtsK controls metastable recombination provoked by an extra Ter site in the Escherichia coli chromosome terminus. Mol. Microbiol. 64: 207­219.
3. Martin, B., Y. Quentin, G. Fichant, and J.­P. Claverys. 2006. Independent evolution of competence regulatory cascades in streptococci ?. Trends Microbiol. 14: 339­345.
4. Fichant, G., M.­J. Basse, and Y. Quentin. 2006. ABCdb: an online resource for ABC transporter repertories from sequenced archaeal and bacterial genomes. FEMS Microbiol. Lett. 256: 333­339. 5. Chabalier, J., C. Capponi, Y. Quentin, and G. Fichant. 2005. ISYMOD: a knowledge warehouse for the identification, assembly and analysis of bacterial integrated systems. Bioinformatics 21: 1246­1256. 6. Joseph, P., G. Fichant, Y. Quentin, and F. Denizot. 2002. Regulatory relationship of two­component and ABC transport systems and clustering of their genes in the Bacillus/Clostridium group, suggest a functional link between them. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4: 503­513. 7. Quentin, Y., J. Chabalier, and G. Fichant. 2002. Strategies for the identification, the assembly and the classification of integrated biological systems in completely sequenced genomes. Comput. Chem. 26: 447­457.
8. Capponi, C., J. Chabalier, Y. Quentin, and G. Fichant. 2001. A Knowledge Base for Integrated Biological Systems. IEEE Intelligent Systems 16(6): 52­60. 9. Rodrigue, A., Y. Quentin, A. Lazdunski, V. Mejean, and M. Foglino. 2000. Two­
component systems in Pseudomonas aeruginosa: why so many? Trends Microbiol. 8: 498­504.
62
10. Wu, L.F., B. Ize, A. Chanal, Y. Quentin, and G. Fichant. 2000. Bacterial twin­
arginine signal peptide­dependent protein translocation pathway: evolution and mechanism. J. Mol. Microbiol . Biotechnol. 2: 179­189.
63
EA 2689 ­ Lille
Laboratoire de Biologie et Physiologie des états septiques
Responsable : Benoît Guery
Email : [email protected]
Adresse : Laboratoire de Physiologie ­ Faculté de Médecine H Warembourg, Pôle Recherche, 1 Place de Verdun ­ 59045 Lille Cedex
Tél : 03 20 44 49 48
Fax : Personnel engagé sur le projet :
Karine Faure (Dr), Benoît Guéry (PU), Chanez Chamani (doctorante).
Nom du responsable EA 2689 : Pr Régis Matran
Responsable Axe broncho­pulmonaire : Pr Benoit Guery
Thématique de recherche :
Les axes de recherche de notre EA sur l’aspect broncho­pulmonaire se déclinent en 3 objectifs spécifiques : -
Objectifs spécifique n°1 : Individualiser les caractéristiques et les facteurs pouvant influencer la réponse épithéliale bronchique et alvéolaire à l’agression par P. aeruginosa : rôle du système de sécrétion de type III et du quorum sensing. Nous utilisons pour cette recherche des souches mutées de façon dirigées sur les déterminants du système de sécrétion de type III, ou d’autres facteurs associés (quorum sensing, facteurs issus du type I ou du type II).
-
Objectif spécifique n°2 : Etudier le rôle respectif du système de deux autres facteurs de virulence de Pseudomonas : les lectines PAIL et PAIIL, le flagelle. De la même manière cet aspect réalisé à la fois in vitro sur cellules A549 et in vivo permet d’une part d’étudier la réponse physiopathologique à chacun de ces facteurs mais aussi de proposer des pistes thérapeutiques novatrices.
-
Objectif spécifique n°3 : Etudier les conséquences d’une infection chronique à P. aeruginosa, évaluation du rôle potentiel d’anomalies de l’hôte (mucoviscidose). Nous avons développé un modèle d’infection chronique par Pseudomonas et avons focalisé notre recherche sur le rôle des acides gras poly­insaturés dans la réponse à l’agression. Une transposition du modèle sur souris modifiées génétiquement sur le CFTR est actuellement en cours de réalisation. 64
Mots clés : virulence, adhésion, acides gras polyinsaturés,
pseudomonas aeruginosa, mucoviscidose
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. F. Ader, R. Le Berre, S. Lancel, K. Faure, N.B. Viget, E. Nowak, R. Neviere, B. Guery. 2007. Inhaled nitric oxide increases endothelial permeability in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Intensive Care Med. [Epub ahead of print].
2. M. Pierre, M.O. Husson, R. Leberre, J.L. Desseyn, C. Galabert, L. Beghin, C. Beermann, A. Dagenais, Y. Berthiaume, B. Cardinaud, P. Barbry, F. Gottrand, B. Guery. 2007. Omega 3 polyunsaturated fatty acids improve host response in chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. [Epub ahead of print].
3. L. Robriquet, F. Collet, A. Tournoys, T. Prangere, R. Neviere, F. Fourrier and B. Guery. 2006. Intravenous administration of activated protein C in Pseudomonas­
induced lung injury in the rat: impact on the lung fluid balance and the inflammatory response. Respiratory Research. 7:41.
4. F. Ader, R. Le Berre, K. Faure, P. Gosset, O. Epaulard, B. Toussaint, B. Polack, E. Nowak, N.B. Viget, B. Guery. 2005. Alveolar response to Pseudomonas aeruginosa: the role of the type III secretion system. Infection Immunity 73(7):4263­71.
5. S. Boyer, K. Faure, F. Ader, M.O. Husson, E. Kipnis, T. Prangere, X. Leroy, B. Guery. 2005. Chronic pneumonia with Pseudomonas aeruginosa and impaired alveolar fluid clearance. Respir Res. 6(1):17.
6. S. Auvin, F. Collet, F. Gottrand, M.O. Husson, X. Leroy, C. Beermann, B. Guery. 2005. Long chain polyunsaturated fatty acids modulate lung inflammatory response induced by Pseudomonas aeruginosa in mice. Pediatric Research. 58(2):211­5.
7. E. Kipnis, B. Guery, A. Tournoys, R. Le Berre, O. Joulin, T. Prangere, X. Leroy, N. Viget, R. Neviere, F. Fourrier. 2004. Recombinant Human Antithrombine III worsens P. aeruginosa­induced lung injury. Shock. 21(5):444­51.
8. R. Le Berre, F. Faure, H. Fauvel, N. Viget, F. Ader, T. Prangère, A.M. Thomas, X. Leroy, J.F. Pittet, P. Marchetti, B. Guery. 2004. Apoptosis influences lung fluid movement in P.aeruginosa­induced lung injury. Int Care Med. 30(6):1204­11.
65
9. D. Dacheux, O. Epaulard, A. de Groot, B. Guery, R. Leberre, I. Attree, B. Polack, B. Toussaint. 2002. Activation of the Pseudomonas aeruginosa type III secretion system requires an intact pyruvate dehydrogenase aceAB operon. Infect Immun. 70(7):3973­7.
10. N. Viget, B. Guery, F. Ader, R. Nevière, S. Alfandari, C. Creusy, M. Roussel­
Delvallez, C. Foucher, C. M. Mason, G. Beaucaire, and J. F. Pittet. 2000. Keratinocyte Growth Factor protects against Pseudomonas aeruginosa­induced lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 279: L1199­L1209.
66
EA3186
Pathogénie, Epidémiologie, Résistance des Agents Infectieux
Responsable : Patrick Plésiat (PU­PH)
Email : patrick.plesiat@univ­fcomte.fr
Adresse : Laboratoire de Bactériologie, Faculté de médecine, 2 place Saint Jacques, 25030 Besançon cedex
Tél : 03 63 08 22 06
Fax : 03 81 66 82 86
Personnel engagé sur le projet :
Catherine Llanes­Barakat (MCU), Didier Hocquet (MCU­PH), Katy Jeannot (AHU 3ème année), Lucie Vettoretti (doctorante 3ème année), Cyril Amstutz (doctorant 2ème année).
Thématique de recherche :
L’activité de l’EA3186 est étroitement associée à celle du laboratoire de Bactériologie du CHU de Besançon (chef de service Patrick Plésiat) et du Centre de Ressource et de Compétence de la Mucoviscidose (CRCM) de la région Franche­Comté (Dr Marie­Laure Dalphin). L’équipe est connue au plan international pour ses travaux sur les mécanismes de résistance de Pseudomonas aeruginosa aux antibiotiques, notamment les mécanismes d’efflux actif. Sur le plan national, cette expertise a été reconnue par l’InVS (Institut de Veille Sanitaire) qui a accordé au laboratoire, pour la période 2006­2009, le statut de Centre National de Référence associé à l’Institut Pasteur (Pr Patrice Courvalin) pour la caractérisation des mécanismes de résistance émergents chez cette bactérie. Cette mission de veille et d’alerte consiste à analyser les souches multirésistantes à caractère épidémique recueillies par différents réseaux de laboratoires hospitaliers (par exemple l’Observatoire National de l’Epidémiologie de la Résistance aux Antibiotiques, l’ONERBA). De par sa localisation hospitalière et son activité de CNR, le laboratoire reçoit un grand nombre de souches cliniques de P. aeruginosa et a accès à l’historique des patients. Cette position stratégique permet de mieux appréhender la virulence des isolats, le contexte clinique des infections et les problèmes thérapeutiques.
Dans le cadre du GDR, notre contribution concernera essentiellement l’analyse des systèmes d’efflux de type Mex. Au cours de travaux antérieurs, nous avons montré que deux systèmes (MexAB­OprM et MexXY­OprM) contribuent de façon significative à la résistance naturelle de P. aeruginosa aux antibiotiques et peuvent être à l’origine d’échecs thérapeutiques lorsqu’ils sont surproduits sous l’effet de mutations touchant divers gènes régulateurs. Plus récemment, nous nous sommes intéressés à la régulation et la fonction physiologique du système MexXY­OprM dont l’expression est induite par des stress ribosomaux. L’étude d’isolats successifs provenant de malades atteints de mucoviscidose nous a également permis de montrer que l’efficacité de transport de la pompe elle­même pouvait être optimisée pour certains antibiotiques 67
(aminosides) par la bactérie. Les modifications de structure du transporteur MexY à l’origine de cette adaptation sont en cours d’étude.
Notre expertise concerne donc essentiellement la caractérisation d’isolats cliniques de P. aeruginosa par des approches de biologie moléculaire et de transcriptomique.
Mots clés : P. aeruginosa, résistance, antibiotiques, efflux actif,
ribosome
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Hocquet D., C. Vogne, F. El’Garch, A. Vejux, N. Gotoh, A. Lee, O. Lomovskaya, and P. Plésiat. 2003. MexXY­OprM efflux pump is necessary for adaptive resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47: 1371­1375.
2. Hocquet D., X. Bertrand, T. Köhler, D. Talon, and P. Plésiat. Genetic and phenotypic variations of a resistant Pseudomonas aeruginosa epidemic clone. 2003. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47: 1887­1894.
3. Berthelot P., I. Attree, P. Plésiat, J. Chabert, S. de Bentzmann, B. Pozzetto, and F. Grattard. Genotypic and phenotypic analysis of type III secretion system in a cohort of Pseudomonas aeruginosa bacteremia isolates: evidence for a possible association between O serotypes and exo genes. 2003. Journal of Infectious Diseases. 188: 512­518.
4. Llanes C., D. Hocquet, C. Vogne, D. Benali­Baitich, C. Neuwirth, and P. Plésiat. Clinical strains of Pseudomonas aeruginosa overproducing MexAB­OprM and MexXY efflux pumps simultaneously. 2004. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48: 1797­1802.
5. Vogne C., J. Ramos Aires, C. Bailly, D. Hocquet, and P. Plésiat. Role of multidrug efflux system MexXY in the emergence of moderate resistance to aminoglycosides among cystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa. 2004. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48: 1676­1680.
6. Sobel M.L., D. Hocquet, L. Cao, P. Plésiat, and K. Poole. Mutations in PA3574 (nalD) lead to increased MexAB­OprM expression and multidrug resistance in laboratory and clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. 2005. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49: 1782­1786.
7. Jeannot K., M.L. Sobel, F. El Garch, K. Poole, and P. Plésiat. Induction of the MexXY efflux pump in Pseudomonas aeruginosa is dependent on drug­ribosome interaction. 2005. Journal of Bacteriology. 187: 5341­5346.
68
8. Llanes­Barakat C., C. Neuwirth, F. El Garch, D. Hocquet, and P. Plésiat. Genetic analysis of a multiresistant strain of Pseudomonas aeruginosa producing PER­1 beta­
lactamase. 2006. Clinical Microbiology and Infection. 12: 270­278.
9. Hocquet D., P. Nordmann, F. El Garch, L. Cabanne, and P. Plésiat. Involvement of the MexXY­OprM efflux system in emergence of cefepime resistance in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa. 2006. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50: 1347­
1351.
10. El’Garch F., K. Jeannot, D. Hocquet, C. Llanes­Barakat, and P. Plésiat. Cumulative effects of several non­enzymatic mechanisms on the resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides. 2007. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51: 1016­1021.
69
UMR1229 INRA ­Dijon
Microbiologie du Sol et de l’Environnement
Responsable : Philippe Lemanceau (Directeur de recherche INRA, Directeur UMR MSE)
Email : [email protected]
Adresse : INRA­Université de Bourgogne, CMSE, BP 86510, 21065 Dijon cedex
Tél : 03 80 69 30 56
Fax : 03 80 69 32 24
Personnel engagé sur le projet :
P. Lemanceau (DR), S. Mazurier (CR), C. Mougel (CR), G. Vansuyt (IR), T. Corberand (TR). Doctorants: B. Pivato & A. Viollet. Thématique de recherche :
Les recherches menées au sein de l'équipe “dynamique des interactions plantes­
microorganismes” portent sur l'écologie moléculaire des Pseudomonas spp. fluorescents dans la rhizosphère et leurs interactions avec la plante. Ces recherches sont conduites aux niveaux de populations et de souches modèles ; elles visent à caractériser (i) l'effet du génotype de la plante sur les Pseudomonas spp. fluorescents et en retour (ii) l'effet de ces bactéries sur la croissance et la santé de la plante. L'étude de ces interactions est focalisée sur (i) leur système d'acquisition du fer basé sur la synthèse de pyoverdines et de protéines membranaires réceptrices ainsi que sur (ii) leurs systèmes de sécrétion de type trois (TTSS). Les résultats obtenus montrent que les plantes sélectionnent dans leur rhizosphère des populations de Pseudomonas bien adaptées au stress ferrique. Cette adaptation résulte de la synthèse de pyoverdines particulières conférant à ces bactéries une forte compétitivité intra­ et inter­spécifique. La forte affinité pour le fer de ces pyoverdines réduit la disponibilité en fer en particulier pour les champignons phytopathogènes ; cette compétition pour le fer se traduit par une diminution de la croissance saprophyte fungique (antagonisme microbien) et donc de la fréquence des infections racinaires. Outre cet effet favorable sur la santé de la plante (bioprotection), ces pyoverdines contribuent à la nutrition en fer de la plante qui semble avoir développé une stratégie permettant l'incorporation des complexes Fe­pyoverdines. Plus récemment, la présence de TTSS a été décrite par notre équipe chez des souches saprophytes dont certaines sont mutualistes. Des recherches sont poursuivies pour déterminer la signification biologique de ces TTSS, connus jusqu'à présent pour être impliqués dans le pouvoir pathogène des bactéries phytopathogènes lors de relations compatibles, ou de réactions d'hypersensibilité lors de relations incompatibles.
L'équipe a acquis une réputation internationale dans le domaine de l'écologie moléculaire des Pseudomonas spp. fluorescents, comme en atteste les publications, 70
édition d'ouvrages et coordination de programmes nationaux et internationaux (4ième PCRD, programme bilatéral France/Pays­Bas van Gogh). Dans le GDR, nos recherches s'intègrent dans le thème 2 relatif aux “Réactions d'adaptation” liées au système d'acquisition du fer basé sur les pyoverdines et au SSTT.
Mots clés : P. fluorescens, P. putida, biologie des populations,
pyoverdines, SSTT, interactions plantes-microorganismes, rhizosphère,
protection biologique
10 références les plus significatives depuis 2000 :
1. Mirleau P., Delorme S., Philippot L., Meyer J­M., Mazurier S., and P. Lemanceau. 2000. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34: 35­44.
2. Mirleau P., Philippot L., Corberand T., and P. Lemanceau. 2001. Involvement of nitrate reductase and pyoverdine in competitiveness of Pseudomonas fluorescens strain C7R12 in soil. Applied Environmental Microbiology. 67: 2627­2635.
3. Delorme S., Philippot L., Edel­Hermann V., Deulvot C., Mougel C., and P. Lemanceau. 2003. Comparative genetic diversity of the narG, nosZ and 16S rRNA genes in fluorescent pseudomonads. Applied Environmental Microbiology. 69 : 1004­
1012.
4. Gamalero E., Lingua G., Capri F.G., Fusconi A., Berta G., and P. Lemanceau. 2004. Colonization pattern of tomato primary roots by Pseudomonas fluorescens A6RI characterized by dilution plating, flow cytometry, fluorescence, confocal and scanning electron microscopy. FEMS Microbiology Ecology. 48: 79­87. 5. Mazurier S., Lemunier M., Siblot S., Mougel C., and P. Lemanceau. 2004. Distribution and diversity of type III secretion system­like genes in saprophytic and phytopathogenic fluorescent pseudomonads. FEMS Micobiology Ecology. 49: 455­467.
6. Mazurier S., Lemunier M., Hartmann H., Siblot S., and P. Lemanceau. 2006. Conservation of type III secretion system genes in Bradyrhizobium isolated from soybean. FEMS Micobiological Letters. 259: 317­325.
7. Mougel C., Offre P., Ranjard L., Corberand T., Gamalero E., Robin A., and P. Lemanceau. 2006. Dynamic of the genetic structure of bacterial and fungal communities at different developmental stages of Medicago truncatula Gaertn. cv. Jemalong line J5. New Phytologist. 170: 165­175.
71
8. Robin A., Mougel C., Siblot S., Vansuyt G., Mazurier S., and P. Lemanceau. 2006. Effect of ferritin over­expression in tobacco on the structure of bacterial and pseudomonad communities associated with the roots. FEMS Micobiology Ecology. 58: 492­502.
9. Robin A., Mazurier S., Mougel C., Vansuyt G., Corberand T., Meyer J.­M., and P. Lemanceau. 2007. Diversity of root­associated fluorescent pseudomonads as affected by ferritin over­expression in tobacco. Environmental Microbiology. 9: 1724–1737.
10. Vansuyt G. , Robin A., Briat J.­F., Curie C., and P. Lemanceau. 2007. Iron acquisition from Fe­pyoverdine by Arabidopsis thaliana. Molecular Plant­Microbe Interactions. 20: 441­447.
72
PARTICIPANTS AU GDR “PSEUDOMONAS”
CNRS
Sophie de Bentzmann (UPR9027)
“Laboratoire ingénierie des systèmes macromoléculaires”
31, Chemin Joseph Aiguier
13402 Marseille cedex 20
Tel: 04 91 16 41 25
Fax: 04 91712124
[email protected]
Thierry Jouenne (UMR6522)
“Polymères, biopolymères, membranes”
Université de Haute-Normandie Rouen
Bvd Maurice de Broglie
76821 Mont Saint Aignan cedex
Tel: 02 35 61 42 80
Fax :02 35 14 67 04
[email protected]
Isabelle Schalk (UMR7175)
“Biomolécules, biotechnologie, innovation thérapeutique”
Institut Gilbert-Laustriat - ESBS, Université Louis Pasteur Strasbourg 1
Boulevard Sébastien Brandt
BP 10413, 67412 ILLKIRCH cedex
Tel : 03 90 24 47 19
Fax : 03 90 24 48 29
[email protected]
Anne Imberty (UPR5301)
“Centre de recherches sur les macromolécules végétales”
Domaine Universitaire Grenoble
601, rue de la chimie
BP 53, 38041 Grenoble cedex 9
Tel : 04 76 03 76 36
Fax : 04 76 54 72 03
[email protected]
Arnaud Ducruix (UMR8015)
“Laboratoire de cristallographie et RMN biologiques”
Université René Descartes Paris V
Faculté de Pharmacie - Case 48
4, avenue de l'Observatoire
75270 Paris cedex 06
Tel : 01 53 73 98 36
Fax : 01 53 73 99 25
[email protected]
Ina Attrée (UMR5092)
“Biochimie et biophysique des systèmes intégrés”
IRTSV/BBSI, CEA Grenoble
17, rue des Martyrs
38054 Grenoble cedex 9
Tel : 04 38 78 34 83
Fax : 04 38 78 44 99
[email protected]
73
Andrea Dessen (UMR 5075)
“Laboratoire des protéines membranaires”
Institut de Biologie Structurale (IBS)
CEA Grenoble
41, Rue Jules Horowitz
38027 Grenoble cedex 1
Tel : 04 38 78 95 90
Fax : 04 38 78 54 94
[email protected]
Gwennaele Fichant (UMR5100)
“Laboratoire de microbiologie et génétique moléculaires”
118, route de Narbonne
31062 Toulouse cedex 4
Tel : 05 61 33 58 26
Fax : 05 61 33 58 86
[email protected]
INRA
Philippe Lemanceau (UMR1229)
“Microbiologie du sol et de l'environnement”
INRA/Université de Bourgogne
CMSE
BP 86510
21065 Dijon cedex France
Tel : 03 80 69 30 56
Fax : 03 80 69 32 24
[email protected]
Université de Lille 2
Benoît Guery (EA 2689)
“Biologie et physiologie des états septiques”
Laboratoire de Physiologie
Faculté de Médecine H. Warembourg
Pôle Recherche
1, Place de Verdun
59045 Lille Cedex
Tel : 03 20 44 49 48
[email protected]
Université de Franche-Comté
Patrick Plésiat (EA3186)
“Physiopathologie, épidémiologie, résistance des agents infectieux”
Laboratoire de Bactériologie
Faculté de Médecine
2, place Saint Jacques
25030 Besançon cedex
Tel : 03 63 08 22 06
Fax : 03 81 66 89 14
[email protected]