M I S E A U P O I N T Coût biologique de la résistance aux antibiotiques : vancomycine-dépendance, le prix ultime bactérien ? ! F. Van Bambeke*, P. Courvalin** RÉSUMÉ. Depuis quelques années, on isole chez des patients traités par les glycopeptides des entérocoques dépendant de la présence de vancomycine pour leur croissance. L’analyse moléculaire du mécanisme responsable de ce phénotype a révélé dans chaque cas une mutation inactivant la D-alanine:D-alanine ligase impliquée dans la synthèse des précurseurs du peptidoglycane. Ces bactéries requièrent donc la présence de vancomycine pour induire l’expression des gènes conférant la résistance aux glycopeptides en permettant la synthèse de précurseurs terminés par D-alanine-D-lactate. Les entérocoques dépendants posent donc de façon critique la question du prix que les bactéries sont prêtes à payer pour s’adapter aux modifications de leur environnement. De manière préoccupante, ces souches, a priori vulnérables en raison de leurs exigences de croissance, sont capables d’acquérir, par mutation supplémentaire, un phénotype de résistance de haut niveau tout en perdant leur caractère dépendant. En effet, ont été obtenus in vitro des révertants ayant recouvré une D-alanine:D-alanine ligase fonctionnelle, mais exprimant à un haut niveau les protéines de résistance, et des révertants constitutifs synthétisant du D-alanine-D-lactate en l’absence de vancomycine. Mots-clés : Entérocoques - Vancomycine-dépendance - Vancomycine-résistance - D-alanine:D-alanine ligase. L a résistance aux antibiotiques est un problème qui va sans cesse en s’aggravant. Toutes classes d’antibiotiques confondues, on assiste, en effet, à une constante progression non seulement de la proportion de souches résistantes, mais aussi du nombre de mécanismes conférant la résistance. Ces deux phénomènes sont d’ailleurs étroitement liés. Ainsi, la capacité de multiplication d’une souche résistante est l’indicateur du profit qu’elle retire de l’expression de cette résistance pour sa survie et sa propagation dans un environnement hostile. En contrepartie, les modifications génétiques et métaboliques nécessaires à la résistance sont une mesure de l’investissement concédé par la bactérie pour acquérir la capacité de multiplication en présence d’une concentration définie d’antibiotique. Mettant de côté les bactéries qui requièrent d’emblée une CMI élevée parce qu’elles sont intrinsèquement résistantes à un antibiotique, on peut distinguer celles qui montrent une CMI progressivement croissante, généralement par mutations successives de la cible de l’antibiotique, de celles pour lesquelles la CMI augmente par paliers suite à l’acquisition de matériel génétique étranger. l’homme impose à leur environnement. Devenues incapables de croître en l’absence de vancomycine, elles posent de façon critique la question du coût de la résistance : quel prix la bactérie est-elle prête à payer pour survivre aux antibiotiques ? Paradoxe de l’évolution, la dépendance pourrait n’être en fait qu’une étape transitoire vers une résistance de très haut niveau (figure 1). C’est du moins ce que suggère l’histoire d’une CMI Mutation Mutation 1 000 Transposon 100 10 1 Combinant ces deux modalités de modification génétique, les entérocoques vancomycine-dépendants représentent un exemple de l’adaptabilité des bactéries aux changements que * Unité de pharmacologie cellulaire et moléculaire, Université catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique. ** Unité des agents antibactériens, Institut Pasteur, Paris. La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 Vm S Vm r Vm D Vm R Figure 1. Antibiogramme avec un disque de vancomycine et CMI de la vancomycine pour un isolat clinique de Enterococcus faecalis présentant divers phénotypes : VmS, sensible aux glycopeptides ; Vmr, résistant de bas niveau à la vancomycine ; VmD, dépendant de la présence de vancomycine dans le milieu pour sa croissance ; VmR, révertant in vitro hautement résistant. 285 M I S E A U P O I N T patiente chez laquelle a été isolé un entérocoque dépendant de la vancomycine pour sa croissance [(1) pour la description clinique ; (2) pour la description mécanistique]. Cette patiente, hospitalisée pour une pancréatite fulminante compliquée d’une septicémie puis d’une pneumonie nosocomiale contractée dans une unité de soins intensifs, a reçu une antibiothérapie prolongée à large spectre comprenant de l’imipénème, de la gentamicine, de la ciprofloxacine et de la vancomycine. Cette dernière a été administrée de J14 à J61. À J68, un Enteroccocus faecalis résistant à la vancomycine, de génotype vanB (CMI de la vancomycine, 32 µg/ml ; CMI de la teicoplanine, < 1 µg/ml) est isolé des urines, des fèces, de plaies, d’abcès et des voies respiratoires. Le traitement par ciprofloxacine et gentamicine est maintenu, tandis que la vancomycine est, elle, réadministrée à nouveau de J74 à J150. À J79, la culture des urines est négative pour l’entérocoque résistant. Pourtant, l’examen microscopique direct des urines montre la persistance de coques à Gram positif. Une culture primaire des urines sur une gélose au sang permet de mettre en évidence quelques colonies, qui disparaissent à la première subculture. Ces colonies retrouvent leur capacité de croissance autour d’un disque imprégné de vancomycine ou de D-alanine-D-alanine (D-Ala-D-Ala). Le même organisme est isolé cinq fois dans les urines entre J79 et J145. À J145, on isole à nouveau un entérocoque résistant à la vancomycine dans le sang (CMI non déterminée). Le traitement par la vancomycine est alors interrompu et remplacé par de l’imipénème, qui éradique enfin l’infection. En parallèle, la mise en culture de l’entérocoque dépendant en l’absence de vancomycine a rapidement permis de sélectionner au laboratoire des révertants (c’est-à-dire des mutants de la souche dépendante ayant perdu le caractère dépendant, mais ayant conservé une résistance élevée à la vancomycine). tés D-Ala-D-Ala des précurseurs pentapeptidiques exposés à la face externe de la membrane. Elle s’y lie avec une haute affinité par l’intermédiaire de cinq ponts hydrogène, prévenant l’accès des enzymes qui catalysent les étapes de réticulation. Voie chromosomique de synthèse du peptidoglycane Voie acquise de synthèse du peptidoglycane D-alanine D-Ala:D-Ala ligase D-lactate D-Ala:D-Lac ligase VmS UDP UDP VmR UDP P-P P-P D-alanine 286 Acide muramique D-lactate N-acétylglucosamine Autre acide aminé Vancomycine CH3 O- H Vancomycine et activité antibiotique (3) Les glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) inhibent la synthèse de la paroi bactérienne en perturbant les réactions de réticulation (transpeptidation, transglycosylation) des précurseurs du peptidoglycane (figure 2). La synthèse du peptidoglycane commence dans le cytoplasme bactérien par la formation de pentapeptides terminés par un dimère d’acides aminés de la série D (D-Ala-D-Ala). La formation de ce dimère nécessite l’action d’une enzyme appelée la D-alanine:D-alanine ligase (Ddl). Le dimère se fixe ensuite sur un précurseur tripeptide-acide muramique qui, après addition d’une acétylglucosamine, se lie à un transporteur lipidique permettant son exposition sur la face externe de la membrane. Le précurseur est alors soumis à l’action de transglycosylases qui catalysent la formation de ponts entre glucides et de transpeptidases qui assurent la condensation des chaînes peptidiques en éliminant la D-alanine terminale. La vancomycine, incapable en raison de sa taille de pénétrer dans la bactérie, reconnaît les extrémi- P-P P-P H VANCOMYCINE-DÉPENDANCE OU LA GENÈSE D’UN PROCARYOTE “DROGUÉ” : MÉCANISMES MOLÉCULAIRES ÉTAPE PAR ÉTAPE UDP VmD O CH3 OH C N H O O NH CH3 O X D-Ala-D-Ala Liaison de forte affinité activité de l'antibiotique C O H O NH CH3 O X D-Ala-D-Lac Liaison de faible affinité résistance à l'antibiotique Figure 2. Comparaison des voies de synthèse des précurseurs du peptidoglycane chez des entérocoques vancomycine-sensibles (VmS), vancomycine-résistants (VmR) ou vancomycine-dépendants (VmD). Chez l’entérocoque sensible, la voie chromosomique de synthèse conduit à la production de précurseurs terminés par le dimère Dalanine-D-alanine (D-Ala-D-Ala) auquel la vancomycine se lie avec une forte affinité (panneau inférieur). Chez l’entérocoque résistant, une voie de synthèse alternative et inductible par de faibles concentrations de vancomycine permet la synthèse de précurseurs terminés par D-alanine-D-lactate (D-Ala-D-Lac) auxquels la vancomycine se lie avec une faible affinité (panneau inférieur). Chez l’entérocoque dépendant, la voie de synthèse chromosomique est non fonctionnelle suite à l’inactivation de l’enzyme dimérisant la D-alanine (Ddl ou D-Ala:D-Ala ligase). La synthèse des précurseurs n’est alors possible que par la voie alternative inductible par la vancomycine. La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 M Vancomycine et résistance bactérienne (génotype vanB) (4) Connaissant le mode d’action des glycopeptides, on comprend qu’une résistance puisse résulter de la production de précurseurs de faible affinité pour la vancomycine. Ainsi, le remplacement de la D-alanine terminale par un D-lactate suffit à réduire l’affinité de l’antibiotique pour sa cible d’un facteur 1 000, parce que la reconnaissance moléculaire ne met plus en jeu que quatre ponts hydrogène (figure 2). vanR vanS A U P O I N T La résistance résulte de l’acquisition de matériel génétique étranger codant pour des protéines qui doivent agir de manière coordonnée. L’ensemble des gènes correspondants (figure 3) est porté par un transposon, élément génétique mobile de onze kilobases, capable de s’intégrer dans le chromosome ou dans un plasmide. Sur la base de la séquence des gènes de résistance, on distingue actuellement cinq génotypes (vanA, vanB, vanC, vanD et vanE) qui diffèrent par le niveau de résistance conféré et le type de précurseur produit (D-Ala-D-Lac ou D-Ala-D-sérine). Le génotype vanB, qui nous concerne ici, confère une résistance de niveau variable à la vancomycine uniquement [le niveau de résistance dépend essentiellement du rapport entre la quantité de précurseurs terminés par D-Ala-D-Ala et ceux terminés par D-Ala-DLac, qui résulte du niveau d’expression des gènes de résistance ; la résistance à la teicoplanine n’apparaît que lorsque ce rapport est très largement en faveur du D-Ala-D-Lac (4)]. Outre les gènes codant pour les enzymes impliquées dans la résistance, le transposon porte aussi ceux responsables de la La synthèse de la paroi à partir de précurseurs terminés par D-Ala-D-Lac nécessite la mise en place d’une nouvelle voie métabolique (figure 3). Celle-ci requiert des enzymes, d’une part pour la synthèse des précurseurs terminés par D-Ala-DLac (produits des gènes vanH et vanB ; ce dernier, qui donne son nom au génotype de résistance, spécifie la ligase permettant la réaction de condensation de D-Ala avec D-Lac [figure 2]), et d’autre part pour la destruction des précurseurs terminés par D-Ala-D-Ala (produits des gènes vanX et vanY). Pyruvate VanH I S E vanY vanW vanH vanB vanX RÉSISTANCE RÉGULATION D-lactate Ddl VanB VanX UDP UDP P- Transpeptidase Pi UMP P-P- -P-P- UDP Transglycosylase UDP -P-P- P-PVanY P-PCytosol Membrane Paroi Figure 3. Structure de l’opéron conférant la résistance à la vancomycine de type VanB et activité des enzymes produites. vanS et vanR codent pour un système régulateur à deux composants dans lequel VanS est le senseur détectant la présence de vancomycine dans le milieu et VanR le régulateur activant la transcription des gènes conférant la résistance. VanX et VanY hydrolysent le dipeptide D-Ala-D-Ala et les précurseurs terminés par D-Ala-D-Ala, respectivement ; VanH et VanB permettent la synthèse du depsipeptide D-Ala-D-Lac. La fonction de VanW est inconnue. Les symboles sont les mêmes que dans la figure 2. La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 287 M I S E A U P O I N T régulation de leur expression. Dans ce système à deux composants, le senseur (produit du gène vanS) détecte la présence de vancomycine au contact de la bactérie et le régulateur (produit du gène vanR) active la transcription des gènes de résistance lorsqu’il est lui-même phosphorylé par le senseur. La résistance s’exprime donc de façon inductible. Une question qui se pose est l’origine des gènes constituant ce transposon. Une hypothèse, basée sur des comparaisons de séquences, suggère que ceux requis pour la résistance (vanH, vanB et vanX) pourraient provenir des micro-organismes producteurs de glycopeptides qui peuvent synthétiser leur paroi également à partir de précurseurs terminés par D-Ala-D-Lac (5) afin d’échapper à l’action antibiotique de leur propre métabolisme secondaire. ! Rapport coût-bénéfice. La présence de la résistance exige l’ac- quisition d’un opéron et donc une transmission de matériel génétique entre bactéries. Le niveau de résistance de la bactérie hôte dépend du niveau d’expression des gènes et de leur nombre de copies. Lorsque ces gènes sont intégrés dans le chromosome, présents en une copie par bactérie, la résistance est de plus bas niveau que s’ils sont portés par un plasmide présent en multicopies. Dans le type VanB, l’expression des gènes est étroitement régulée (4), entraînant des CMI relativement basses de la vancomycine ( 32 µg/ml) [figure 4] (2). La sensibilité à la teicoplanine est maintenue, car cet antibiotique n’est pas un inducteur. Le bilan coût-bénéfice est facile à établir : plus la bactérie investit en termes de production d’enzymes, plus les concentrations en vancomycine auxquelles elle peut résister seront élevées. BÉNÉFICE Phénotype COÛT CMI (Vm) CMI (Te) VmS Événement génétique <1 32 <1 transposon VmD 512 64 mutation ddI E mutation ddI EYK R S 512 8 R R 1 024 256 Vm Te Vm Te mutation vanS ADP D251 Niveau d'expression de l'opéron vanB Vm(-) Vm(+) DAK 1 r Vm Précurseurs produits Vm(-) Vm(+) Acides aminés de la DdI en 251-253 D-Ala-D-Ala-P DAK E E251 ADP D-Ala-D-Ala-P K253 D-Ala:D-Ala ligase fonctionnelle La charge (+) de K253 facilite le transfert du phosphate de l'ATP pour la dimérisation de la D-alanine D-Ala:D-Ala ligase non fonctionnelle En l'absence de K253, le transfert du phosphate de l'ATP et la dimérisation de la D-alanine ne peuvent se faire Figure 4. Phénotype et génotype d’un entérocoque résistant de bas niveau à la vancomycine (Vmr), d’un mutant vancomycine-dépendant (VmD) isolé in vivo, et de révertants de ce dernier obtenus in vitro (2, 9). Les révertants ont perdu le caractère dépendant et sont soit résistants de haut niveau à la vancomycine mais sensibles à la teicoplanine (VmR, TeS), soit résistants de haut niveau à la vancomycine et à la teicoplanine (VmR, TeR). Le bénéfice et le coût peuvent être déduits des CMI et de la nature des modifications génétiques et du niveau de production des protéines de résistance, respectivement. " Phénotype. Les CMI de la teicoplanine ont été déterminées en présence de 4 µg/ml (VmS, Vmr) ou de 10 µg/ml (VmD, VmR) de vancomycine comme inducteur. Les proportions relatives de précurseurs terminés par D-Ala-D-Ala ou D-Ala-D-Lac sont indiquées en vert et en rouge respectivement. L’activité des protéines de résistance (mesurée par l’activité de VanX) est présentée en fraction de l’activité maximale mesurée pour le révertant VmR TeR. " Génotype. Seules sont indiquées les modifications de séquence de la D-Ala:D-Ala ligase (Ddl) détectées en position 251-253 relatives à la séquence de l’enzyme parentale (Vmr). La modélisation moléculaire (panneau inférieur) de l’enzyme sauvage et celle du mutant dépendant indiquent comment la mutation DAK-E inactive la Ddl et comment la mutation E-EYK restaure son activité. .../... 288 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 M I S E A U P O I N T .../... Vancomycine et dépendance bactérienne L’entérocoque vancomycine-dépendant (phénotype VmD) se caractérise par son aptitude à pousser uniquement en présence de vancomycine, ce qui suggère qu’il ne peut synthétiser les précurseurs de sa paroi que si la vancomycine induit la production des protéines de résistance. Autrement dit, la voie de synthèse chromosomique “normale” des précurseurs du peptidoglycane doit être inactivée. De fait, si l’on identifie les précurseurs produits, on constate que la souche dépendante synthétise 100 % de précurseurs terminés par D-Ala-D-Lac en présence de vancomycine (figure 4). La comparaison des voies de synthèse des précurseurs (chromosomique sensible et alternative résistante) révèle que l’enzyme qui diffère est la ligase qui catalyse la dimérisation de la D-alanine dans les souches sensibles ou la fixation du D-lactate à la D-alanine dans les souches résistantes (figure 2). Le caractère dépendant doit donc être lié à une inactivation de la D-Ala:D-Ala ligase. La séquence du gène de structure de cette enzyme a été déterminée pour plusieurs souches dépendantes et a révélé dans chaque cas une mutation qui affecte un résidu hautement conservé (2, 6, 7) ou provoque l’apparition d’un codon d’arrêt conduisant à la production d’une protéine tronquée (8). Dans le cas choisi ici à titre illustratif (2), une délétion de six paires de bases conduit au remplacement par un glutamate (E) d’un triplet d’acides aminés comportant une lysine (K) hautement conservée parmi les D-Ala:D-Ala, D-Ala:D-Lac ou D-Ala:D-Sér ligases. La mutation entraîne donc la perte de deux acides aminés et la substitution d’un troisième acide aminé chargé positivement par un résidu chargé négativement. Au niveau moléculaire, ce changement a des répercussions majeures sur l’activité de l’enzyme. En effet, le résidu lysine joue un rôle important dans la réaction enzymatique, facilitant par sa charge le transfert du phosphate depuis l’ATP vers la D-alanine comme préliminaire à la réaction de dimérisation (9). ! Rapport coût-bénéfice. L’investissement génétique conduisant au phénotype dépendant est minime (une mutation), de même que l’effort métabolique (niveau d’expression des protéines de résistance très bas). Le bénéfice est majeur en termes de résistance, puisque la CMI de la vancomycine passe de 32 à 512 µg/ml et celle de la teicoplanine, en présence de vancomycine comme inducteur, atteint 64 µg/ml. Ce gain s’explique par le fait que seul le depsipeptide D-Ala-D-Lac est produit. L’activité des protéines de résistance, mesurée par celle de VanX, est cependant faible (figure 4). Toutefois, la bactérie se trouve fortement pénalisée dans sa croissance, puisqu’elle ne peut se multiplier qu’en présence de vancomycine. Vancomycine-dépendance et réversion La souche résistante isolée en fin de traitement chez la patiente n’ayant malheureusement pas été conservée, on ne peut affirmer qu’il s’agit d’un révertant de la souche dépendante. Cette éventualité mérite toutefois d’être retenue. En effet, in vitro, la culture de mutants dépendants en l’absence de vancomycine permet de sélectionner aisément des révertants ayant perdu leur caractère dépendant et acquis un niveau élevé de résistance à la vancomycine et, dans certains cas, à la teicoplanine (figures 1 et 4, tableau I). À ces deux phénotypes correspondent deux mécanismes, que l’on peut proposer sur la base de l’analyse des précurseurs produits et des niveaux d’expression des protéines de résistance. Le phénotype restant sensible à la teicoplanine (VmR TeS) est associé à la production de D-Ala-D-Ala en l’absence d’inducteur mais à la production essentiellement de D-Ala-D-Lac en présence d’inducteur, associée à une activité importante des protéines de résistance. Ces propriétés indiquent que la D-Ala:D-Ala ligase est à nouveau fonctionnelle. La séquence du gène ddl présente en effet une nouvelle mutation à la position altérée chez le mutant dépendant, restaurant un triplet d’acides aminés différent de celui de la souche sauvage mais présentant la lysine critique en position 253 (figure 4) (2). Le phénotype résistant à la vancomycine et à la teicoplanine (VmR TeR) est associé à la production exclusive de D-AlaD-Lac et à un niveau élevé d’expression des protéines de résistance, aussi bien en l’absence qu’en présence d’inducteur. Ces données indiquent que ces révertants conservent une ligase inactive, ce que confirme la détermination de la séquence du gène correspondant (figure 4), mais que l’expression de leurs gènes de résistance est désormais constitutive. Cela leur confère la possibilité d’exprimer leurs protéines de résistance, et donc de synthétiser du D-Ala-D-Lac, en l’absence de vancomycine. Ce phénotype est dû à une mutation ponctuelle au niveau du senseur VanS qui conduit à l’activation permanente de l’activateur de la transcription (figure 5, page 293) (2). ! Rapport coût-bénéfice. L’investissement génétique est à nouveau limité, impliquant dans les deux cas une seule mutation. L’investissement métabolique est cette fois important, imposant un niveau d’expression élevé des protéines de résistance. Cependant, le gain pour la bactérie est majeur, puisqu’il lui assure une résistance de haut niveau à la vancomycine et à la teicoplanine, tout en abolissant les contraintes de croissance de la cellule parentale dépendante (figure 4). Deux mutations successives (c’est-à-dire une première dans le gène ddl conférant le caractère dépendant et une seconde dans le gène vanS ou le gène ddl assurant la réversion) suffisent donc pour conférer à l’entérocoque au départ faiblement résistant un niveau de résistance très élevé aux glycopeptides. VANCOMYCINE-DÉPENDANCE : UNE CURIOSITÉ DE LABORATOIRE OU UNE MENACE POTENTIELLE EN CLINIQUE ? La nécessité de la présence d’antibiotique pour la croissance bactérienne est pour le moins un paradoxe étonnant. La littérature rapporte des exemples isolés de dépendance aux bêtalactamines (10), aux aminosides (11) ou à la polymyxine (12). Ces isolats ont été considérés comme des curiosités ne justifiant aucun effort diagnostique ou thérapeutique étant donné que leur mode de croissance particulier assure en principe leur élimination spontanée. Depuis la description du premier entérocoque dépendant des glycopeptides pour sa croissance en 1994 (1), de telles souches ont été isolées chaque année chez des patients qui, en général, ont reçu un traitement prolongé par la vancomycine (tableau I, page 292) et des antibiotiques .../... La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 291 292 fèces fèces E. faecium E. faecium sang E. faecalis fèces sang, urines E. faecalis E. faecium sang, urines, drain de dialyse E. faecium urines fèces E. faecium E. faecalis drain abdominal E. faecium sang sang E. faecium E. faecalis fèces E. avium sang sang E. faecium Non déterminé fèces E. faecium oncologie oncologie oncologie non précisé non précisé transplantation rénale, péritonite leucémie, pneumonie hémodialyse, bactériémie complications postopératoires, soins intensifs rupture œsophagienne, soins intensifs non précisé non précisé non précisé colite à Clostridium difficile transplantation hépatique insuffisance rénale cholécystite, pancréatite, pneumonie, septicémie ceftazidime ceftazidime ciprofloxacine non précisé non précisé quinupristine-dalfopristine triméthoprimesulfaméthoxazole, gentamicine, nitrofurane, pipéracilline/tazobactam amoxicilline céfotaxime, ciprofloxacine, ampicilline, kétoconazole céfotaxime, imipénème, métronidazole, érythromycine non précisé non précisé non précisé amoxicilline, ceftazidime, ciprofloxacine imipénème, amikacine non précisé imipénème, gentamicine, ciprofloxacine Antibiotique utilisé préalablement vancomycine (22 jours) vancomycine (5 jours) vancomycine (46 jours) vancomycine vancomycine vancomycine teicoplanine (32 jours) vancomycine (usage répété) vancomycine (8 jours) teicoplanine non précisé non précisé non précisé vancomycine (10 jours) vancomycine (14 jours) vancomycine vancomycine (45 jours) Glycopeptide utilisé préalablement 10-2 28 28 28 2 2 13 14 27 26 26 25 10 25 -7 25 24 15 23 1 Référence 10-6 10-2 10-6-7 10 -5-6 10-7 Taux de réversion A U urines urines E. faecalis Type de patient I S E Non déterminé Site d’isolement Espèce bactérienne Tableau I. Isolats cliniques d’entérocoques vancomycine-dépendants décrits dans la littérature. M P O I N T La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 M Phénotype I S E A U P O I N T Acides aminés de VanS en 232 247 S S F E E Vmr ou Vm D Vm R Te S Vm R Te R K Résistance inductible ATP VanS Résistance constitutive ADP H H-P H-P VanR D-P D D-P VanS H2 O Pi Activation de la transcription vanY vanW vanH vanB vanX Figure 5. Mécanisme d’acquisition in vitro d’une résistance constitutive chez des mutants de l’entérocoque VmD. " Génotype. Seules sont indiquées les modifications de séquences de VanS détectées en position 232 ou 247 relatives à la séquence de l’enzyme parentale (Vmr ou VmD). Les deux révertants VmR TeR étudiés présentent chacun une mutation affectant un résidu voisin de l’histidine (H), site d’autophosphorylation. Le domaine senseur de VanS est représenté en blanc, le domaine kinase en bleu clair avec ses cinq motifs conservés en bleu foncé. Dans une souche Vmr, VmD ou VmR TeS (partie gauche du schéma), le senseur est autophosphorylé en présence de vancomycine et d’ATP dans le milieu et transfère le phosphate activé sur un résidu aspartate (D) du régulateur VanR. VanR phosphorylé active la transcription des gènes codant pour les enzymes de résistance. En l’absence de vancomycine, VanS déphosphoryle VanR. Dans une souche VmR TeR (partie droite du schéma), le senseur muté permet la phosphorylation de VanR même en l’absence de vancomycine, entraînant l’activation permanente de la transcription des gènes codant pour les protéines de résistance. .../... à large spectre. La difficulté consiste à mettre ces souches en évidence puisqu’elles ne croissent qu’autour d’un disque de vancomycine ou si l’on ajoute dans leur milieu de culture le dipeptide D-Ala-D-Ala (1, 13). Au laboratoire, la recherche des entérocoques dépendants ne se justifie que chez les patients colonisés par une souche résistante (13). Elle doit s’effectuer par étalement direct du milieu biologique potentiellement infecté (sang et urines essentiellement en cas d’administration parentérale et fèces en cas d’administration orale), de manière à maintenir l’entérocoque en présence de glycopeptide (14). Il est, en effet, vraisemblable que la distribution du glycopeptide La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 dans l’organisme détermine les sites où peut se multiplier l’entérocoque dépendant. Un entérocoque de ce type peut être mis en évidence sur une gélose au sang pour l’isolement primaire, puis sur des géloses conventionnelles (BHI, Mueller-Hinton ou gélose au sang) additionnées de 10 µg/ml de vancomycine (1, 15). Le moyen le plus facile d’éviter la propagation des entérocoques vancomycine-dépendants consiste à arrêter le traitement par les glycopeptides, mais cela serait sans compter sur la capacité de la bactérie à réverter en un mutant plus résistant. La possibilité 293 M I S E A U P O I N T de voir émerger ces révertants pose donc la question de la manière de traiter les patients infectés par des entérocoques vancomycine-dépendants pour parvenir à une éradication complète. Les révertants décrits (tableau I, page 292) ont tous été isolés in vitro, mais cela ne veut pas dire qu’ils ne peuvent survenir in vivo. Le seul moyen d’établir leur filiation avec la souche résistante initiale et avec la souche dépendante consisterait en une analyse génétique impliquant un typage moléculaire et la recherche de mutations dans les gènes ddl et vanS. Cette dernière étude est difficile à mettre en œuvre en routine, et son intérêt serait d’ailleurs limité d’un point de vue clinique. La présence de révertants peut néanmoins être soupçonnée lorsque l’on isole des entérocoques résistants de haut niveau, surtout si leur génotype confère habituellement une résistance de bas niveau (par exemple, vanB). L’acquisition de ce niveau élevé de résistance peut toutefois s’observer aussi chez des mutants dans le senseur VanS de souches résistantes, et ne nécessite donc pas le passage transitoire par l’état de dépendance (6, 16). L’éradication des entérocoques VmD se heurte aux mêmes difficultés que celle des entérocoques VmR. L’association fréquente avec une résistance à d’autres classes d’antibiotiques (aminosides, bêtalactamines) impose, en effet, la sélection d’un traitement basé sur l’antibiogramme de l’entérocoque VmD. De façon à éviter toute interférence de la vancomycine avec les antibiotiques étudiés, il paraît plus approprié de déterminer la sensibilité à ces antibiotiques sur du milieu enrichi en D-Ala-D-Ala (1 mg/ml pour la détermination de CMI) (13). Par ailleurs, la recrudescence des infections dues à des coques à Gram positif a stimulé la recherche, de telle sorte que de nouveaux antibiotiques actifs sur ces bactéries sont en cours de développement ou de mise sur le marché : fluoroquinolones, glycylcyclines, synergistines, oxazolidinones, éverninimycines (17,18). Les glycopeptides bactéricides (LY333328) seront peut-être peu utiles dans la mesure où les entérocoques résistants aux glycopeptides peuvent acquérir la résistance à ces molécules (19). Malgré ces molécules nouvelles, l’exploration du mécanisme moléculaire conduisant à la dépendance et à la réversion nous a rappelé l’adaptabilité extrême des bactéries à leur environnement. Le meilleur moyen d’éviter l’apparition de bactéries hautement résistantes reste donc l’utilisation rationnelle des antibiotiques en général, et des glycopeptides en particulier, et le respect des règles visant à limiter la dissémination de souches résistantes (20). Dans le cas des glycopeptides comme dans celui d’autres familles d’antibiotiques, le développement de la résistance en milieu hospitalier semble lié à leur utilisation clinique (21, 22). À cet égard, la situation européenne, actuellement plutôt rassurante, doit nous encourager à persévérer dans la limitation stricte de l’usage de ces # antibiotiques. REMERCIEMENTS F. Van Bambeke est chargé de recherches du Fonds national belge de la recherche scientifique. Nous remercions pour ses commentaires le Pr P.M.Tulkens. R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 1. Fraimow HS, Jundkind DL, Lander DW, Delso DR, Dean JL. Urinary tract infection with an Enterococcus faecalis isolate that requires vancomycin for growth. Ann Intern Med 1994 ; 121 : 22-6. 2. Van Bambeke F, Chauvel M, Reynolds PE, Fraimow HS, Courvalin P. Vancomycin-dependent Enterococcus faecalis clinical isolates and revertant mutants. Antimicrob Agents Chemother 1999 ; 43 : 41-7. 3. Reynolds PE. Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics. Eur J Clin Microb Infect Dis 1989 ; 8 : 943-50. 4. Arthur M, Reynolds PE, Courvalin P. Glycopeptide resistance in enterococci. Trends Microbiol 1996 ; 4 : 401-7. 5. Marshall CG, Broadhead G, Leskiw BK, Wright GD. D-Ala:D-Ala ligases from glycopeptide antibiotic producing organisms are highly homologous to the enterococcal vancomycin resistance ligases VanA and VanB. Proc Natl Acad Sci (USA) 1997 ; 94 : 6480-3. 6. Baptista M, Depardieu F, Reynolds PE, Courvalin P, Arthur M. Mutations leading to increased levels of resistance to glycopeptide antibiotics in VanB-type enterococci. Mol Microbiol 1997 ; 25 : 93-105. 7. Gholizadeh Y, Van Bambeke F, Prévost M, Fraimow HS, Chachaty E, Dever LL, Tulkens PM, Courvalin P. Study of glycopeptide-dependent Enterococcus faecium clinical isolates by sequencing of the ddl gene and computer-aided modeling of the mutated D-Ala:D-Ala ligase. 39th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, San Francisco, États-Unis, 1999 ; abstract 1447. 8. Sifaoui F, Gutmann L. Vancomycin dependence in a VanA-producing Enterococcus avium strain with a nonsense mutation in the natural D-Ala:D-Ala ligase gene. Antimicrob Agents Chemother 1997 ; 41 : 1409. 9. Prévost M, Van Belle D, Tulkens PM, Courvalin P, Van Bambeke F. Modeling of the Enterococcus faecalis D-alanine:D-alanine ligase : structure-based study of the active site in the wild-type enzyme and in glycopeptide-dependent mutants. J Mol Microbiol Biotechnol 2000 ; 2 : 321-30. 10. Jackson FL. Penicillin-dependent staphylococci. Lancet 1973 ; 1 : 940-1. 11. Birge EA, Kurland CG. Altered ribosomal protein in streptomycin-dependent Escherichia coli. Science 1969 ; 166 : 1282-4. 12. Hayek L. Lettre à l’éditeur, sans titre. Lancet 1997 ; 349 : 429-30. 13. Sng LH, Cornish N, Knapp CC, Ludwig MD, Hall GS, Washington JA. Antimicrobial susceptibility testing of a clinical isolate of vancomycin-dependent Enterococcus using D-alanine-D-alanine as a growth supplement. Am J Clin Pathol 1998 ; 109 : 399-403. 14. Rossney AS, McConkey SJ, Keane CT. Vancomycin-dependent Enterococcus. Lancet 1997 ; 349 : 430. 15. Green M, Shlaes JH, Barbadora K, Shlaes DM. Bacteriemia due to vancomycin-dependent Enterococcus faecium. Clin Infect Dis 1995 ; 20 : 712-4. 16. Lefort A, Baptista M, Fantin B, Depardieu F, Arthur M, Carbon C, Courvalin P. Two-step acquisition of resistance to the teicoplanin-gentamicin combination by VanB-type Enterococcus faecalis in vitro and in experimental endocarditis. Antimicrob Agents Chemother 1999 ; 43 : 476-82. 17. Nicas TI, Zeckel ML, Brau DK. Beyond vancomycin : new therapies to meet the challenge of glycopeptide resistance. Trends Microbiol 1997 ; 5 : 240-9. 18. Endtz HP, van den Braak N, Verbrugh HA, van Belkum A. Vancomycin resistance : status quo and quo vadis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 ; 18 : 683-90. 19. Arthur M, Depardieu F, Reynolds PE, Courvalin P. Moderate level resistance to glycopeptide LY333328 mediated by genes of the vanA and vanB clusters in enterococci. Antimicrob Agents Chemother 1999 ; 43 : 1875-80. 20. Perl TM. The threat of vancomycin resistance. Am J Med 1999 ; 106 : 26S-37S. 21. Wegener HC. Historical yearly usage of glycopeptides for animals and humans : the American-European paradox revisited. Antimicrob Agents Chemother 1998 ; 42 : 3049. 22. Schouten MA, Voss A, Hoogkamp-Korstanje AA, the European VRE Study Group. Antimicrobial susceptibility patterns of enterococci causing infections in Europe. Antimicrob Agents Chemother 1999 ; 43 : 2542-6. 23. Woodford N, Johnson AP, Morrison D, Hastings JGM, Elliot TJ, Worthington A, Stephenson JR, Chin AT, Tolley JL. Vancomycin-dependent enterococci in the United Kingdom. J Antimicrob Chemother 1994 ; 33 : 1066. 24. Dever LL, Smith SM, Handwerger S, Eng RHK. Vancomycin-dependent Enterococcus avium isolated from stool following oral vancomycin therapy. J Clin Microbiol 1995 ; 33 : 2770-3. 25. Fraimow HS, Jundkind DL. Vancomycin-dependent enterococci : a clinical and laboratory assessment. Adv Exp Med Biol 1995 ; 390 : 97-107. 26. Farrag N, Eltringham I, Liddy H. Vancomycin-dependent Enterococcus faecalis. Lancet 1996 ; 348 : 1581-2. 27. Stewart B, Hall L, Duke B, Ball D. Vancomycin-dependent enterococci : curious phenomenon or serious threat ? J Antimicrob Chemother 1997 ; 40 : 734-5. 28. Kirkpatrick BD, Harrington SM, Smith D, Marcellus D, Miller C, Dick J, Karanfil L, Perl TM. An outbreak of vancomycin-dependent Enterococcus faecium in a bone marrow transplant unit. Clin Infect Dis 1999 ; 29 : 1268-73. .../... 294 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 M I S E A U P O I N T .../... F ormation M édicale C ontinue M C ? I. Une souche d’entérocoque vancomycine-dépendante : II. Une résistance ? de haut niveau à la teicoplanine : III. Au laboratoire : ? a. b. c. d. e. est un mutant d’une souche vancomycine-résistante peut rester sensible à la teicoplanine en présence de vancomycine présente une mutation inactivant la ligase chromosomique peut être isolée dans les fèces si le patient a reçu la vancomycine par voie orale peut transférer le caractère dépendant à un autre entérocoque a. b. c. d. est toujours associée à une résistance de haut niveau à la vancomycine s’observe si les précurseurs terminés par D-Ala-D-Lac sont largement majoritaires s’observe dans les souches de type VanB s’observe dans les souches de type VanB chez des dérivés ayant subi deux mutations successives dans la ligase chromosomique e. s’observe chez des mutants constitutifs de souches de type VanB a. les entérocoques vancomycine-dépendants peuvent être isolés par étalement direct d’un milieu biologique infecté sur gélose au sang b. il est approprié de déterminer la CMI vis-à-vis d’antibiotiques appartenant à d’autres classes que les glycopeptides dans du bouillon supplémenté avec 1 mg/ml de D-Ala-D-Ala d’une souche vancomycine-dépendante c. les entérocoques vancomycine-dépendants peuvent réverter si on les cultive en l’absence de vancomycine d. il est justifié de rechercher un entérocoque vancomycine-dépendant chez tout patient infecté par un entérocoque e. la CMI de la teicoplanine vis-à-vis d’un entérocoque vancomycine-dépendant sera inchangée si le bouillon est additionné de vancomycine ou de D-Ala-D-Ala Voir réponses page 310 & À découper ou à photocopier Tarif 2000 Merci d’écrire nom et adresse en lettres majuscules % Collectivité ................................................................................. à l’attention de .............................................................................. % Particulier ou étudiant Dr, M., Mme, Mlle ........................................................................... Prénom .......................................................................................... Pratique : % hospitalière % libérale FRANCE / DOM-TOM / Europe ÉTRANGER (autre qu’Europe) $ 580 F collectivités (88,42 €) $ 700 F collectivités (127 $) (105 $) $ 460 F particuliers (70,12 €) $ 580 F particuliers $ 290 F étudiants (44,21 €) $ 410 F étudiants (75 $) joindre la photocopie de la carte % autre.......................... POUR RECEVOIR LA RELIURE Adresse.......................................................................................... ...................................................................................................... $ 70 F avec un abonnement ou un réabonnement $ 140 F par reliure supplémentaire (franco de port et d’emballage) (10,67 €, 13 $) (21,34 €, 26 $) Code postal ................................................................................... MODE DE PAIEMENT Pays................................................................................................ Tél.................................................................................................. Avez-vous une adresse E-mail : oui % non % Si oui, laquelle : ............................................................................. Sinon, êtes-vous intéressé(e) par une adresse E-mail : oui % non % Merci de joindre votre dernière étiquette-adresse en cas de réabonnement, changement d’adresse ou demande de renseignements. $ par carte Visa N° ou Eurocard Mastercard Signature : Date d’expiration $ par virement bancaire à réception de facture (réservé aux collectivités) $ par chèque (à établir à l'ordre de La Lettre de l’Infectiologue) EDIMARK - 62-64, rue Jean-Jaurès - 92800 Puteaux Tél. : 01 41 45 80 00 - Fax : 01 41 45 80 25 - E-mail : [email protected] Votre abonnement prendra effet dans un délai de 3 à 6 semaines à réception de votre ordre. Un justificatif de votre règlement vous sera adressé quelques semaines après son enregistrement. 1 abonnement = 21 revues “On line” LI TOME XV - N° 7 Ville ................................................................................................