I. Principe de fonctionnement
Leurs fonctionnements peuvent être très simplifiés mais nécessitent néanmoins une série
d'étapes incontournables : la construction de puces, la préparation des sondes,
l'hybridation avec les cibles et la lecture de l'empreinte d'hybridation suivie du traitement
du signal.
La réaction cardinale qui s'opère dans les puces à ADN est celle là même qui, découverte par
Watson et Crick a fondé la biologie moléculaire, à savoir, l'hybridation entre séquences
nucléotidiques complémentaires. Une fois synthétisés, des oligonucléotides (simple brin)
greffés sur la puce constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles
complémentaires, marquées par fluorescence et présentes dans le mélange complexe à
analyser. Les sondes sont, soit déposées par une tête d'impression commandée par un robot,
soit synthétisées in situ. L'élément principal de la puce à ADN est l'unité d'hybridation
appelée Plot lequel, présent en un grand nombre d'exemplaire, possède une adresse connue et
correspond, par exemple, à un gène indexé dans un catalogue. Après hybridation et lavage, le
signal moyen de chaque plot est enregistré grâce à un microscope confocal. Enfin le
traitement numérique du signal permet d'établir la concentration exacte des cibles duplexées
et forme l'empreinte d'hybridation.
Les dimensions du plot représente actuellement l'une des limites des puces à ADN qui se
répercute sur leur densité (Nombre de plot/unité de surface), ainsi que leur complexité
(nombre de gènes ciblés) (3) .
Par exemple, les procédés mis au point à ce jour permettent d'obtenir des densités de plot de
l'ordre de 10^15 à 10^16 plots/cm_ et dont l'équivalent en ARNm peut correspondre à
l'ensemble des ARNm d'un type cellulaire donné (10 000 à 50 000). La taille des sondes
représente une seconde limite à ce procédé (aujourd'hui 10-20 nt/sondes). En effet, l'utilisation
de sondes de tailles supérieures conduit à la formation de boucles (autohybridation) qui
empêche l'hybridation avec les cibles (7) .
II. La Phase de fabrication et de fixation des sondes
Le fonctionnement des puces à ADN est basé sur le phénomène d'hybridation, à savoir,
l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences de nucléotides. Cette
hybridation forme un duplex (double brin).Le brin dont on connait la séquence, intégrale ou
partielle, constitue la sonde et celui que l'on souhaite caractériser est la cible. L'utilisation de