I. Principe de fonctionnement Leurs fonctionnements peuvent être

I.
Principe de fonctionnement
Leurs fonctionnements peuvent être très simplifiés mais nécessitent néanmoins une série
d'étapes incontournables : la construction de puces, la préparation des sondes,
l'hybridation avec les cibles et la lecture de l'empreinte d'hybridation suivie du traitement
du signal.
La réaction cardinale qui s'opère dans les puces à ADN est celle là même qui, découverte par
Watson et Crick a fondé la biologie moléculaire, à savoir, l'hybridation entre séquences
nucléotidiques complémentaires. Une fois synthétisés, des oligonucléotides (simple brin)
greffés sur la puce constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles
complémentaires, marquées par fluorescence et présentes dans le mélange complexe à
analyser. Les sondes sont, soit déposées par une tête d'impression commandée par un robot,
soit synthétisées in situ. L'élément principal de la puce à ADN est l'unité d'hybridation
appelée Plot lequel, présent en un grand nombre d'exemplaire, possède une adresse connue et
correspond, par exemple, à un gène indexé dans un catalogue. Après hybridation et lavage, le
signal moyen de chaque plot est enregistré grâce à un microscope confocal. Enfin le
traitement numérique du signal permet d'établir la concentration exacte des cibles duplexées
et forme l'empreinte d'hybridation.
Les dimensions du plot représente actuellement l'une des limites des puces à ADN qui se
répercute sur leur densité (Nombre de plot/unité de surface), ainsi que leur complexité
(nombre de gènes ciblés) (3) .
Par exemple, les procédés mis au point à ce jour permettent d'obtenir des densités de plot de
l'ordre de 10^15 à 10^16 plots/cm_ et dont l'équivalent en ARNm peut correspondre à
l'ensemble des ARNm d'un type cellulaire donné (10 000 à 50 000). La taille des sondes
représente une seconde limite à ce procédé (aujourd'hui 10-20 nt/sondes). En effet, l'utilisation
de sondes de tailles supérieures conduit à la formation de boucles (autohybridation) qui
empêche l'hybridation avec les cibles (7) .
II.
La Phase de fabrication et de fixation des sondes
Le fonctionnement des puces à ADN est basé sur le phénomène d'hybridation, à savoir,
l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences de nucléotides. Cette
hybridation forme un duplex (double brin).Le brin dont on connait la séquence, intégrale ou
partielle, constitue la sonde et celui que l'on souhaite caractériser est la cible. L'utilisation de
l'hybridation, n'est pas nouvelle. En effet la PCR, les différents blots (Northern, Southern et
Dot) notamment, utilisent ce principe. L'originalité des puces est la constitution de
l'hybridation sur phase solide, permettent de travailler simultanément avec un nombre de
sondes considérables, dont les positions sont parfaitement connues.
Les puces actuelles diffèrent par les techniques de fabrication et de fixation des sondes qui
peuvent être classé selon deux écoles:
• La fixation de oligonucléotides déjà synthétisés
• La synthèse in situ
• II.1. La fixation d'oligonucléotides déjà synthétisés
-Par adressage mécanique
En 1989, les chercheurs de l'institut de Biologie Moléculaire de Moscou ont évoqué l'idée de
fixer des oligonucléotides sur des plots de gel de polyacrylamide activés. Les oligonucléotides
nécessaires sont prélevés et placés sur les plots par l'intermédiaire d'une micropipette
robotisée.
-Par adressage électrochimique
Développée en France par Cis Bio International en partenariat avec le CEA de Grenoble, cette
méthode d'adressage consiste à activer spécifiquement une microéléctrode de 50 micro-mètre
en or et cela afin d'adresser une séquence définie d'oligonucléotides. On réalise sur chaque
électrode une éléctro-polymérisation entre un pyrolle normal et un pyrolle sur lequel a été fixé
un oligonucléotide de façon covalente.
• II.2. La synthèse in situ
- Par adressage Photochimique
Ce principe développé par les Hollandais d'Affymetrix utilise la synthèse in situ. Des
groupements photolabiles protègent les groupements réactifs qui interviennent dans la liaison
avec le nucléotide. A l'aide de masques on découvre spécifiquement certains plots et on y fixe
un nucléotide donné qui possède lui aussi un groupement photolabile chargé de protéger la
liaison avec le nucléotide suivant. Les oligonucléotides sont synthétisés de façon
combinatoire avec l'utilisation successive de différents masques photolitographiques de
formes définies.
Cette technique est connue sous le nom de VLSIPS (Very Large Scale Imobilised Polymer
Synthesis)et est aujourd'hui la plus avancée. Cette technique permet de synthétiser rapidement
un grand nombre de nucléotides différents. Par exemple, pour une sonde longue de huit
nucléotides, il existe 4^8 séquences différentes, soit 65 536 combinaisons. Dans le cadre de la
synthèse en Bandes orthogonales, l'application successives de 32 masques permet de toutes
les synthétiser. D'autres techniques permettent d'abaisser le nombre de masques nécessaires
Fig: Synthèse binaire.
Une autre innovation intéressante conçue par Nanogène utilise le pilotage électronique de
l'hybridation. Sur cette puce chaque microéléctrode crée un champ électrique qui dans un
premier temps favorise l'hybridation et accélère la réaction par une concentration
éléctrophorétique des cibles autour de la sonde et dans un second temps via une inversion de
courant, répulse les sondes non ou mal hybridées limitant ainsi le risque de mesappariements.
Pour les autres puces, les méthodes de stringence classiques (Salinité, température, Ph) sont
utilisées.
III.
La lecture de l'hybridation
La phase de lecture de la puce suit la phase d'hybridation. Il s'agit ici de repérer ce qui a été
effectivement hybridé, c'est à dire de repérer à quelle adresse les sondes sont complémentaires
des cibles de l'échantillon test. Lors de la phase de lecture, un laser excite les molécules
fluorescentes liées aux cibles hybridées et un microscope confocal lié à un ordinateur capte et
analyse la lumière émise par l'excitation de ces molécules. Cela aboutit à une empreinte
d'hybridation.
On peut se réjouir en remarquant les progrès effectués au niveau de la détection de
l'hybridation. En effet, l'ancienne méthode de détection, dite classique risque d'être remplacée
par un procédé qui rendant au terme de puce son aspect électronique, permet, grâce à des
phénomènes physiques dont la quantification est possible, l'analyse de courants locaux
résultants de l'hybridation, lesquels sont détectés par des semi-conducteurs qui constituent le
support de fixation des sondes.
3. Applications
La biologie moléculaire possède une grande variété de techniques pour
l’analyse des acides nucléiques et des protéines. La plupart de ces techniques et de
ces procédures sont la base des diagnostiques et des tests chimiques. Ces
techniques incluent l’analyse de l’hybridation des acides nucléiques, l’analyse par
des enzymes de restriction, l’analyse des séquences génétiques, ainsi que la
séparation et la purification des acides nucléiques et des protéines.
La plupart de ces techniques comportent de nombreuses opérations (pipetage,
centrifugation, électrophorèse…) à effectuer sur un grand nombre d’échantillons.
Elles sont souvent complexes et prennent beaucoup de temps. Les conséquences
en sont des pertes de sensibilité, de spécificité ainsi qu’une faible reproductibilité.
Ces problèmes ont notamment limité les applications en diagnostic. De nouvelles
techniques ont donc été développées. Ces méthodes utilisent la fixation de
séquences spécifiques sur une surface solide de petite taille, les puces. Ces
systèmes d’hybridation sont des versions miniaturisées des formats utilisés dans les
techniques de dot-blot inverse et d’hybridation sandwich (cf schéma 3).
Les matrices obtenues peuvent être utilisées pour le séquençage par
hybridation, mais les utilisations les plus probantes restent la détection de microorganismes, les analyses de mutations et du taux d’expression des gènes.
3.1. Le séquençage par hybridation
L’utilisation des puces pour le séquençage des génomes et sans doute l’une
des applications les plus innovante en matière d’étude du génome. L’idée de
séquençage par hybridation (SHOM pour Sequencing by Hybridization using an
Oligonucleotide Matrix ou SbH pour Sequencing by Hybridization) a été émise
simultanément en 1989 par 2 équipes Anglaises, une équipe Yougoslave et une
équipe Russe.
Le principe du séquençage par hybridation est illustré ci contre (cf schéma 19).
Il
repose sur l’utilisation de sondes chevauchantes s’hybridant à la matrice. La
détection des sondes hybridées permet ainsi de séquencer par " petits blocs " et de
reconstituer le brin d’ADN par un traitement informatique des résultats.
Des sondes de 8 mers sont utilisées, car on considère en pratique qu’un
octamère est unique dans un génome. Pour un séquençage intégral il faudra donc
utiliser les 65 536 octamères existants. Ces sondes peuvent être synthétisées in situ,
ou bien présynthétisées puis fixées sur le support (voir les sondes et leur adressage).
La synthèse directe sur support reste intéressante du fait du nombre de réactions
réduites ( 4 x 8 soit 32 réactions). Toutefois, cette technique est limitante sur le plan
économique car si de telles synthèses sont aujourd’hui courantes, leurs coûts
s’avèrent souvent élevés. De plus, reste le problème majeur lié à la synthèse in situ,
à savoir l’impossibilité de purifier ou de contrôler la qualité des oligomères
synthétisés contrairement à une synthèse classique.
Le support préférentiellement utilisé pour la fixation de sondes reste le gel de
polyacrylamide, avec comme marquage la fluorescence ou la radioactivité. Les
éléments de gel contenant les sondes ont des dimensions de 30µm x 30µm, et par
conséquent une puce contenant 65 536 sondes aurait une dimension de d’environ 3
cm x 3 cm.
La détection des duplex formés est adaptée aux marqueurs utilisés. La
fluorescence, qui est le marquage le plus utilisé pour sa résolution, est détecté par un
système microscope-caméra CCD–ordinateur, permettant de lire en quelques
minutes la surface de la puce avec une résolution importante et de saisir ainsi
l’empreinte d’hybridation. Le traitement informatique des données est ensuite réalisé
par des logiciels.
3.1.1. Obstacles au séquençage par hybridation
Le principal obstacle rencontré pour la technique de séquençage par
hybridation est l’existence de mésappariements ; en effet, deux brins d’ADN peuvent
former un duplex, même si ils différent d’une ou plusieurs bases. La stabilité du
duplex formé ne sera toutefois pas altérée au même niveau suivant la nature du
mésappariement, les longueurs des brins du duplex et la localisation du ou des
mésappariement(s). Les mésappariements les plus difficiles à détecter sont les G-T
et G-A en position terminale.
Plusieurs paramètres ont été pris en compte pour rendre la technique plus
discriminante entre les duplex parfaits et imparfaits. Tout d’abord, la longueur des
sondes influe sur la stabilité du duplex : plus une sonde sera courte, moins elle
acceptera de former un duplex comportant un mésappariement. En retour, les
simulations menées sur ordinateur ont montré que la taille maximale de brin
séquençable est de 500, 2 000 et 8 000 pb pour des sondes ayant une taille
respectivement de 6, 7 et 8 mers. L’utilisation de sondes plus courtes permet
également d’abaisser le bruit de fond.
L’autre paramètre étudié est la température de fusion. Cette température est
définie, pour une molécule double brin donnée, comme la température à laquelle
50% des brins d’ADN seront sous forme simple brin les 50% restant étant sous forme
double brin. La température de fusion d’un duplex parfait est donnée par la formule :
T = 4 ( G+C) + 2 (A + T)
Plus la température sera élevée, plus elle permettra la déstabilisation des
duplex imparfaits. Les expériences ont montré qu’un lavage à faible température
durant plusieurs heures ou pendant quelques minutes (voire quelques secondes) à
5°C en dessous de la température de fusion apparente des duplex stables,
permettait la dissociation des duplex imparfaits.
La température jouant un rôle clé, sa régulation sera finement contrôlée, le plus
souvent par des thermorégulateurs à effet Peltier. Cependant, la technique de
séquençage par hybridation doit s’affranchir de tels problèmes, l’hybridation ne
pouvant être menée à plusieurs températures différentes suivant la nature de chaque
oligomère. De ce fait différentes expériences ont été réalisées dans le but
d’uniformiser les températures d’hybridation en tenant compte des compositions des
sondes.
L’ajout de différentes molécules stabilisatrices a également été étudié, comme
par exemple le chlorure de tetramethylammonium qui permet la stabilisation des
appariements A-T et l’égalisation dans une certaine limite des appariements A-T et
G-C pour des sondes fixées sur du verre. De même, la betaïne modère la relation
liant la température de fusion à la composition en base des sondes.
Une autre étude a abouti à l’utilisation d’un champ électrique dans le but de
déstabiliser les duplex imparfaits. Pour cela, une tension va être appliquée entre le
support et le milieu, permettant au support d’être chargé positivement. Cette étude,
menée en collaboration avec la firme Nanogen, permet de dénaturer des duplex
contenant jusqu’à un mésappariement.
Un autre problème rencontré concerne la formation de structures secondaires
internes dans les ADN cibles simples brins, qui vont adopter des structures
réversibles, en épingle à cheveux ou en boucles entraînant un ralentissement de la
diffusion de l’ADN au sein du gel. Afin de réduire les risques de repliements, l’ADN
cible est fragmenté aléatoirement en éléments de 10 à 30 bases.
Enfin, d’après une étude menée sur les cinétiques d’hybridation entre ADN, ARN
et PNA (cf schéma 20) il a été démontré qu’un duplex ADN/PNA était, en
composition égale en bases, beaucoup plus stable et plus discriminant vis à vis des
mésappariements.
3.1.2. Efficacité du séquençage par hybridation
L’utilisation du SbH est limitée par l’existence de loci riches en éléments répétés
de taille supérieure ou égale à n-1, n étant la taille des sondes utilisées. De ce fait le
SbH ne peut être directement utilisé pour le séquençage de fragments contenant des
séquences G-T répétées, des extensions poly A et des microsatellites. Le
séquençage direct de ce type de motif n’est réalisable, que pour des répétitions de
taille inférieure à celle des sondes, ou bien en introduisant un système de
quantification de l’hybridation permettant de déterminer le nombre de fragments
contenant ces motifs. Or, comme l’on démontré les travaux de séquençage
classique, le génome humain (de même que tous les génomes d’organismes
supérieurs) comporte de nombreuses séquences répétées, présentes aussi bien
dans les séquences codantes que non codantes.
Ici encore la fragmentation de l’ADN cible semble être la seule alternative. Elle
permet une simplification de la tâche de reconstruction de la séquence, inversement
proportionnelle à l’augmentation de la longueur de l’ADN cible et la diminution de la
longueur des sondes (cf schéma 19).
Le séquençage d’éléments répétés peut également être facilité par la mesure
de la longueur totale du brin à séquencer ainsi que la détermination de la distance
entre les séquences uniques encadrant les séquences répétées. Ce type de
données peut aisément être obtenu par analyse sur gel des profils de restriction ou
de produits PCR. Toute ces informations complémentaires permettent d’élargir le
champ d’application du SbH.
3.1.3. Applications du séquençage par hybridation
Le SbH doit être un outil de séquençage rapide, peu coûteux, fiable et
entièrement automatisable.
Pour ce faire, les optimisations portant sur l’amélioration de la préparation de la
matrice, des procédures et des conditions d’hybridations, des systèmes de détection,
des méthodes annexes de discrimination des mésappariements ainsi que le
développement d’instruments et de logiciels appropriés ont été menés séparément et
de manière approfondie. Les faisabilités des différentes étapes et améliorations ont
été démontrées.
De plus, la simplicité de la technique permet une automatisation par des
systèmes existants et les puissances fournies par les ordinateurs courants sont
suffisantes pour permettre un essor de cette technique dans plusieurs champs
d’applications.
Dans l’état actuel de développement, le SbH reste réservé aux applications de
comparaison de séquences ne différant que par quelques bases (analyse de
mutations). Ce type d’analyse diffère des études de polymorphismes qui n’étudient
que des positions précises sur un gène. Ces applications prendrons plus
d’importance lorsque les projets de séquençage des génomes arriverons à terme
(2005 pour le projet génome humain) et qu’un grand nombre de gènes auront été
identifiés.
3.1.4. Conclusion
Le SbH sera-t-il un outil de " mégaséquençage " ?
Apparemment tous les composants cruciaux de l’approche sont définis et testés
dans plusieurs laboratoires et les résultats obtenus sont raisonnablement optimistes.
Cependant, la technique est loin d’être totalement développée bien que les
estimations sur la faisabilité de la technique soient disponibles depuis environ 4 ans.
Lorsque la technique sera automatisée, elle devrait permettre de séquencer plusieurs
mégabases (109 bases) en 24 heures, contre environ 4000 actuellement.
Le coût de production, à l’échelle industrielle, de ces puces ne devrait pas être
excessif (quelques dollars). Cependant ceci ne sera réalisable que si de véritables
usines de synthèses d’oligonucléotides possédant une qualité suffisante sont mises
en place.