Les sondes froides - Site perso mcavalla

Adeline Granzotto
Emilie Mendiburu
Définition
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Sonde froide: c'est un enchaînement
de nucléotides définis qui vont
s'hybrider avec la séquence a révélé
.Cet enchaînement est lié a la biotine
attachée au bout d'une chaîne
carbonée de longueur variable. La
biotine est alors révélée par un
système d'amplification de type
immunochimique.
Radical R: Biotine +
chaine carbonnée
Les sondes froides et l' hybridation moléculaire
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Les sondes froides sont utiliser pour l' hybridation moléculaire
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Hybridation moléculaire : technique permettant de mettre en évidence au
sein d'une cellule ou d'un tissu, une séquence d'acide nucléique, par
exemple de localiser un locus sur un chromosome.
Elle est basée sur le principe de complémentarité des bases nucléiques, plus
particulièrement entre l'ADN et le brin d'ARN de séquence
complémentaire.
Le brin de séquence complémentaire est aussi appelé sonde et généralement
"marquer" pour le localiser. Il existe donc des "sondes radioactives" et des
"sondes froides".
Hybridation moléculaire
L'HIS ( Hybridation In Situ) est un outil
incomparable pour étudier l'expression
des gènes. Elle apporte ainsi des
informations précises sur la localisation
des acides nucléiques étudiés.
Le mode de révélation des sondes varie
en fonction de la nature du marquage,
microscopie à fluorescence en cas de
FISH, avidine ou streptavidine pour la
biotine, anticorps marqués par un
enzyme et/ou par l'or colloïdal pour la
digoxigénine, anticorps ou
chromogènes pour les enzymes.
Technique FISH
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Hybridation sur chromosomes (FISH)
Cette technique est aujourd'hui l'outil principal actuel de la cytogénétique
moléculaire. Les applications en sont multiples tant en recherche (cartographie,
organisation de la chromatine,...) qu'en diagnostic (caractérisation ou détection d'un
remaniement chromosomique de petite taille).
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La technique FISH est utilisée pour la détection prénatal de la trisomie 21.
Technique de Random
La technique de random priming que nous utilisons, consiste ainsi
à polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de
monobrin (brins composés de six nucléotides aléatoires),
suivant le principe indiqué sur le schéma ci-dessous:
Protocole de marquage
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Le marquage de sonde par phosphorylation à l’ATP-γ32P consiste à marquer un
oligonucléotide à son extrémité 5’ puis à l’apparier à un oligonucléotide
complémentaire.
- 50 ng d’un oligonucléotide ont été mélangés avec:
- 1 μl du tampon kinase 10X,
- 5 μl d’ATP-γ32P (250 μCi/μl),
- 1 μl de T4-PNK
puis le volume a été ajusté avec de l’eau jusqu’à 10 µl.
La solution est incubée à 37°C pendant une heure.
Ensuite, 150 ng du deuxième oligonucléotide, complémentaire à celui marqué, ont
été ajoutés avec 1 μl de NaCl (1.5M) et de l’eau pour un volume final de 15 μl.
La sonde a été chauffée à 95°C pendant 5 min et refroidie graduellement durant 2
heures.
Révélation
La révélation se fait par fixation sur la biotine de l'avidine puis
fixation d'un anticorps anti-avidine fluorescent.
Cet anticorps fluorescent est alors excité, il récupère la lumière
émise par les sites fluorescent et l'emet.
Conclusion
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Ces sondes froides présentent un problème de
sensibilité et leur utilisation ne fait pas toujours
l'unanimité.
Elles n'ont pas les inconvénients d' utilisation et de
retraitement des sondes radioactives.
Bibliographie
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www.anapath.necker.fr
www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html
www.pasteur.fr/recherche/unites/biophyadn/fFfish.html