Sousthern - Bio Logique

Sousthern
On va travailler sur des Adn génomique, ce procédé comporte différentes étapes :
Uniquement pour le sousthern
1) Extraction de l’ADN génomique
2) Digestion de l’ADN par une enzyme de restriction (exemple BamH1 ou Ecor1).
3) On fait migrer les fragments d’ADN sur un gel NON DENATURANT (migration de l’ADN double
brin appariés)
4) Dénaturation de l’ADN
NB : dans l’absolue à ce moment de la manipulation on ne voit pas les bande sur le gèle car par révélé par du
BET mais il existe pourtant de nombreuses bande correspondant aux fragments d’ADN.
5) Transfert du gel sur une membrane de nylon (passif ou par electrotranfert)
6) Pontage covalent des fragments à la membrane ( appelé CROSS-LINK° se fait dans un four à UV de
très haute énergie , cela va créer des liaisons covalentes entre la membrane et l’ADN.
Commun au northern et sousthern
7) Prehybridation (saturation des membranes)
8) Hybridation :
On met les sondes préparées (voir fiche préparation des sondes) avec l’ADN pendant 3 à 4 h environ.Cette
étape doit s’effectuer à une température particulière, en effet il faut que la température d’hybridation soit
inférieur au Tm mais suffisamment élevé pour que l’hybridation soit spécifique.
On parle de forte STRIGENCE qui correspond à une température élevée et à une force ionique faible.
9) lavage :
il faut laver dans une solution saline à forte concentration pour garder à la fin uniquement les hybridations
spécifiques.
10) Révélation :
 Sonde chaude (radioactive) : incorporation de dNTP radioactif et révélation par autoradiographie
 Sonde froide : Hybridation de la membrane avec des anticorps antibiotine ou antidig, ces anticorps sont
couplés à une activité enzymatique (phosphatase alcaline ou peroxydase)
On met en la préparation en présence d’un substrat radioactif de tel sorte a révélé la présence du
fragment marqué.