CYTOMÉTRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2
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CYTOMÉTRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2 TECHNIQUES COMPLÉMENTAIRES POUR L’EXPLORATION DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE FORMATION pour le LBFA Cécile COTTET 2007 3 sessions : I- Pré requis communs aux 2 techniques - La fluorescence - Les sources lumineuses - Filtres et PMT - Fluorochromes II- Cytométrie en flux - Principe & Applications III- Microscopie confocale Bases de microscopie et principe du confocal PLAN 1.Composants du microscope: -trajet de la lumière -oculaires, -condenseurs, -objectifs, 2. Généralités -résolution et PSF, -ouverture numérique, -indice de réfraction, - profondeur de champ, 3. Principe de la microscopie confocale COMPOSANTS DU MICROSCOPE LAMPE HALLOGÈNE CONDENSEUR PLATINE OCULAIRES LAMPE FLUO OBJECTIFS ENTREE LASER MISE AU POINT TRAJET DE LA LUMIÈRE Lampe blanche observateur échantillon filtres Lampe fluo LES OCULAIRES Combinaisons de lentilles, Grossissement x10 (x6,3 si tube binoculaire grossit déjà x1,5) Rôle : ajuster la distance de la pupille à l’objet, permet le réglage « personnalisé» du focus LE CONDENSEUR source condenseur objectif Plan objet Rôles : - Réaliser une ouverture numérique voisine de celle de l’objectif -Eclairer uniformément le champ d’observation DIFFÉRENTS MODES DE CONTRASTES Transmission Phase contrast Differential interference contrast (DIC/Nomarski) Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif MICROSCOPE À TRANSMISSION Eyepieces Objectives Sample Condenser Lamp Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif L’ÉCLAIRAGE DE KÖHLER Critical illumination Objective Köhler illumination Object plan Aperture diaphragm Condenser Lamp Field diaphragm Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif L’ÉCLAIRAGE DE KÖHLER Rendre le polygone net : hauteur du condenseur (diaphragmes d’ouverture et de champ) Centrer (clés de centrage) Non réglé Rôle : Réglé Réduire la perte de contraste par illumination excessive A. Jobart-Malfait A. Jobart-Malfait CONTRASTE DE PHASE Décrit par Fritz Zernike en 1934, prix Nobel en 1953 Technique qui permet d’obtenir des images contrastées à partir d’échantillons transparents : Transformer des différences de phase en différences d’intensités Utilisé pour observer des cellules vivantes, micro-organismes, coupes de tissus , organites cellulaires A. Jobart-Malfait CONTRASTE DE PHASE A. Jobart-Malfait A. Jobart-Malfait A. Jobart-Malfait A. Jobart-Malfait A. Jobart-Malfait DIC (Nomarski) Contraste de Phase… … vs DIC (Nomarski) LES CARACTÉRISTIQUES DES OBJECTIFS - Sec ou Immersion (eau ou huile) - Grossissement - Ouverture numérique - Distance de travail PLAN-APO-60X 1.40 N.A. ∞/0.17 Grossissement Champ plat Apochromatique Epaisseur Ouverture Longueur numérique de tube de la lamelle Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif Le grossissement n’est pas suffisant ! Résolution ! Même grossissement ! Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif Diffraction à travers une lentille Diffraction: Airy disc point source idéal Objectif light point Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif NOTION DE RÉSOLUTION PSF= Point Spread Function = fonction d’étalement du point L’ Image d’un point est une tâche (Tâche d’Airy) résultant de l’interférence entre les ondes diffractées Le diamètre de cette tâche dépend: - du système d’observation - de la longueur d’onde - de l’indice de réfraction LIMITE DE RÉSOLUTION D’UN SYSTÈME OPTIQUE énergie (CRITÈRE DE RAYLEIGH) deux molécules ou billes brillantes plan lentille point source D’après Usson & Sibarita, CNRS, Grenoble RESOLUTION = Distance minimale requise entre deux objets pour qu’ils apparaissent distincts. Dépend de l’ouverture numérique de l’objectif rxy = Critère de Rayleigh 0,61λ NA rz = λn NA 2 Confocal : Rxy = 0,4 λ /N.A. Meilleure résolution en lumière violette qu’en rouge Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif NUMERICAL APERTURE N.A. = n sin(µ) n : refraction index µ : half-angle of the illumination cone = cône de lumière entre le foyer et la lentille Détermine la résolution spatiale et axiale ainsi que la luminosité de l’image NUMERICAL APERTURE 0.12 Low resolution N.A. 0.87 High resolution Plus N.A est grande, meilleure est la résolution Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif PROFONDEUR DE CHAMP - Correspond à la distance D qui sépare, en suivant l’axe optique, les parties extrêmes de l’objet, nettes sans variation mécanique de la mise au point = distance de 2 points de l’axe tels que leurs images soient toutes deux acceptables -Dépend de l’ouverture numérique + NA grande, + D petite = meilleur sectionnement optique meilleure résolution D = Raxial + 0,34 n / M x N.A. (M : grossissement) INDICE DE RÉFRACTION n = c/v C= vitesse de la lumière dans le vide V= vitesse de la lumière dans le matériau INDICE DE RÉFRACTION Loi de Snell: l’angle de Transmitted (refracted)Beam réflection (Ør) est égal à Incident Beam θi θt l’angle d’incidence (Øi) quelle que soit la nature du matériau de surface θr Reflected Beam n1 sin Øi = n2 sin Øt L’angle du rayon transmis (Øt) dépend, lui, de la nature du matériau INDICE DE RÉFRACTION INDICE DE RÉFRACTION cytoplasme polystyrène 1.37 1.6030 À SAVOIR… - N.A. est donnée pour une lentille dans son milieu ; -n varie en fonction de la température , définis pour 21°C (importance de la clim) et avec la longueur d’onde (problèmes de chromatisme) - Objectifs conçus avec distance de travail précise, épaisseur de lamelle donnée (0,17mm) indices de réfraction précis; ± milieu d’immersion avec n proche ⇒Si ces conditions ne sont pas respectées, la pile de sections Optiques apparaîtra soit étirée, soit tassée selon l’axe Z. MICROSCOPIE ÉPI-FLUORESCENCE… …vs MICROSCOPIE CONFOCALE www.olympusfluoview.com/ FONCTIONNEMENT D’UN MICROSCOPE À ÉPIFLUORESCENCE www.ifr87.cnrs-gif.fr Microscope Confocal à Balayage Laser Photomultiplicateur « Pinhole » Miroir dichroïque Objectif Laser Plan focal z adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 INTÉRÊT DU PINHOLE M. Fallet cours de microscopie confocale 2005 AVANTAGES DE LA MICROSCOPIE CONFOCALE • Réduit le “flou” dû à la lumière hors focus • Augmente la résolution • Améliore le rapport signal/bruit • Permet l’observation d’échantillons épais • Permet un balayage en Z, et un sectionnement optique Création d’une image 2D avec l’aide des galvanomètres Laser X : mouvement continu Y : mouvement par ligne Galvanomètres Numérisation x y X Emission de fluorescence adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 L’image 2D se forme ligne par ligne (pixel = picture element) ~2 µs 512 pixel fluorescence ~2 ns ligne ~1 ms image ~1 s Image numérique Echantillon y 512 pixel x adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 Comment se fait une série d’images en z Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 Création d’une image 3D à l’aide d’un galvanomètre au niveau de l’objectif ou de la platine Objectif X y X x Z Platine Le résultat de ces mouvements adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 Acquisition d’une série de sections optiques dans l’axe vertical Z z y x Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 Projection des données tridimensionnelles d’une cellule z « Logiciel » y x Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/Susanne Bolte IFR87 www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm Filtre Long Pass Miroir dichroïque 510 LP Dichroic Filter/Mirror à 45 deg Lumière transmise Lumière réfléchie % Transmission Lumière source 0 block UV pas s IR Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif LEICA TCS SP2 AOBS Sp prism Sp detector PMT 4 PMT 3 PMT 2 PMT 1 AOBS www.leica-microsystems.com PMT TRANS AOTF LASERS ET AOTF : Acoustico Optical Tuneable Filter www.olympusfluoview.com/ The cross-talk problem Lasers 488 and UV Laser 488 then UV Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif AOBS : Acoustico Optical Beam Splitter www.leica-microsystems.com PRISM SPECTROPHOTOMETER DETECTOR Fluorescence provenant du spécimen pinhole PMT Prisme « spectral » lentille Fente motorisée Sélectionnant bande spectrale Détectée par PMT www.leica-microsystems.com 30 70 Spectral acquisition of a lambda series 415 nm Intensity Z 695 nm 415 emission wavelength 695 Spectral acquisition of a lambda series Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif RÉALISATION D’ACQUISITIONS Procédures d’allumage -voir classeur vert PRÉCAUTIONS D’EMPLOI Lasers : 1 fois allumés: durée min d’utilisation : 1h à l’extinction : durée min de refroidissement : 2 heures Lampe fluo: 1 fois allumée: durée mini d’utilisation : 30 min à l’extinction: durée mini de refroidissement:30 min à 1h Inscrire sans le classeur ou sur la feuille près de la lampe l’ heure d’allumage et d’extinction RÉALISATION D’ACQUISITIONS Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Objectifs disponibles x40Oil NA 1,25 WD 100µm Rxy 156,2 nm Rz 334,4 nm Coverglass 0,17mm x63Water NA 1,20 WD 220µm Rxy 162,7 nm Rz 290,3nm x63Oil NA 1,40 WD 100µm Rxy 139,4 nm Rz 235,8 nm Coverglass 0,17mm X10 sec NA 0,30 WD 11000µm Rxy 650,7 nm Rz 4767,6 nm RÉALISATION D’ACQUISITIONS Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Filtres disponibles sur le microscope 1 : pour l’UV: DAPI, Hoechst… 3: I3: Exc BP 475/20 em BP 510/23 FITC, GFP 4: Scan ! 2 : N2.1: Exc BP 515-560 em LP 590 Rhodamine, Texas red… RÉALISATION D’ACQUISITIONS Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Lasers disponibles UV Argon AOTF(multi-raies) He/Ne AOTF Ne/Ne AOTF Excitation (nm) 351-364 458-476-488-514 543 633 RÉALISATION D’ACQUISITIONS Procédure standard de saisie d’images 1- observation au microscope -choisir un objectif, - choisir et centrer un champ, - faire la mise au point, alignement Köhler, DIC -vérifier présence de marquage fluo et spécificité RÉALISATION D’ACQUISITIONS 2- Observation en mode confocal -choix des différents paramètres (mode, format,laser, bandes spectrales et PMT) -réglage de l’intensité du(des) lasers : % AOTF et PMT(s) : gain/offset Série Z -déterminer épaisseur de l’échantillon : positions z begin et end - choix du moyennage (Li.A ou Aver ) - choix du nombre de coupes et intervalles (ex 40 coupes de 0,2µm entre 0 et+8µm dans la cellule) RÉALISATION D’ACQUISITIONS Série Z suite -choix du mode xyz : coupes optiques dans 1 couleur ou xyλz: coupes optiques dans plusieurs canaux (séquentiel) ou xyzt : 3D en fonction du temps Série λ -déterminer λ begin et λ end - pas de moyennage nécessaire, pas de séquentiel possible - choix du spectre et intervalles (ex 40 images entre 520nm et 620 nm avec bandes de 10nm) Série t -déterminer temps total et intervalle de temps entre chaque image - choix moyennage - séquentiel possible RÉALISATION D’ACQUISITIONS Conditions optimales pour obtenir une bonne image en fluorescence - Grande N.A. - Champ d’illumination le plus petit possible - Système optique limitant la contribution des objets situés hors plan de mise au point Contraintes de préparation - absence de mouvement des cellules -absence de compression lors de la mise au point - absence de bruit de fond -Préservation de la structure 3D -Addition d’anti-fadding SAUVEGARDE DES DONNÉES A faire à la fin de chaque manip La + fiable = CD ou DVD !!! LBFA : transfert réseau vers station d’analyse immédiatement à la fin de la manip ! Autres : CD Le stockage données fortement déconseillé sur le confocal: Encombrement mémoire, risque de perte ! Ménage régulier du disque D… TRAITEMENT DES DONNÉES Station d’analyse d’image Poste informatique dédié : logiciel LCS Lite, Image J, Volocity Amélioration image : bruit de fond, contraste luminosité.. Quantification : spectres, courbes intensité de fluo au cours du temps Reconstruction 3D, projections, mesure de distances,… Combinaison d’images ou séries Séparations d’images ou séries
