La Microscopie - Master Pathologie Humaine
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La Microscopie Que veut on voir ? Et comment ? 2013‐09‐10 Tout est question d’échelle 2013‐09‐10 Base de la microscopie 2013‐09‐10 La résolution Résolution latérale : dxy = 0.46l/NA (0.61 l/NA) Résolution axiale : dz = 1.4nl/NA2 (2 l/NA2) / / 2013‐09‐10 • A balayage A balayage Microscopie électronique 2013‐09‐10 Microscopie électronique • A transmission 2013‐09‐10 La microscopie électronique Le MET Le MET 2013‐09‐10 L’Optique Comment différencier en microscopie les structures Les méthodes Diascopiques Echantillon Transparent Vivant, non fixé Naturellement coloré Fixation Coloration spécifique (Gram, gimenez,etc) Observation directe Fond clair Augmentation du contraste: Contraste de phase p Contraste interférentiel (DIC) Contraste de Offman Fond noir Etc 2013‐09‐10 La Coloration Gram +, Gimenez +……… Comment différencier en microscopie les structures Méthodes épiscopiques Méthodes épiscopiques Echantillon Vivant, non fixé autofluorescent L’IMMUNOHISTOCHIME N fl Non fluorescent t Vivant, non fixé fi ti fixation Marquage fluo q g (anticorps, Dapi, etc) Protéine de fusion (CFP, GFP,YFP,RFP Fluorophores p vitaux 2013‐09‐10 Observation directe Fluorescence Grande évolution de la microscopie: la fluorescence (10 ‐9 ~10‐6 s) L GFP é é dé i La GFP a été décrite pour la première fois en 1962 l iè f i 1962 Osamu Shimomura, Martin Chalfie et Roger Tsien La méduse (Aequorea victoria), GFP (green flurescent protein) GFP (green flurescent 2013‐09‐10 Microscopie en fluorescence -L L’absorption absorption de lumière permet la transition d’une d une molécule (fluorochrome) de l’état fondamental à l’état excité (instable), de niveau d’énergie supérieur. - La molécule reste dans cet état excité pendant un courte durée (qqs ns). - la restitution d ’énergie pour le retour à l’état fondamental,, peut p se faire sous forme d ’émission de lumière (fluorescence). - A cause de la dissipation interne d’énergie, la lumière émise a une longueur d’onde supérieure (= plus faible énergie) que la lumière d’excitation d excitation (Stokes shift). Excitation E n e r g i e Dissipation Di i ti interne Stokes shift Fluorescence - La quantité de lumière émise est très faible par rapport à la quantité de lumière excitatrice. Longueur d’onde d onde 2013‐09‐10 zebrafish 2013‐09‐10 Anatomie d’un Microscope 2013‐09‐10 Principe du Confocal 2013‐09‐10 Non Confocal Vs. Confocal 2013‐09‐10 La microscopie confocale bi (multi) photonique 2‐Photons 1‐Photon • Excitation Confocale • Pinhole plus nécessaire • Volume Focal Excité (0 (0.1 1 µm)³ µm) •Resolution comparable à Excitation 1-Photon Focal R i Region 2 photons 1 photon Intérêt : • Investigation g dans cellules vivantes • meilleure pénétration Neuron, mouse brain Lucifer Yellow 2013‐09‐10 L’imagerie du Vivant 2013‐09‐10 Fluorescence à excitation multi‐photonique laser 2013‐09‐10
