Biochimie du 9 octobre 2003

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Biochimie du 9 octobre 2003.
E – charge électrique – électrophorèse chromatographies.
La charge électrique des protéines est utilisé pour faire migrer ces protéines dans un champs
électrique donc technique d’électrophorèse en fonction du PH du milieu.
Différentes modalités :
1-Electrophorèse sur support papier.
Elle est simple pour la séparation des protéines dans les milieux biologiques. Elle s’applique
sur un support papier et on peut séparer de cette manière la plupart des protéines sous forme
de fractions protéiques (un grand nombre de protéine séparé qui migrent). Par exemple dans le
sérum il y a des protéines qu’on peut séparer par électrophorèse sur papier. Après migration
des protéines, on colore les protéines pour les rendre visible. Dans le sérum il y a des
centaines de protéines donc on les rassemble en 5/6 fractions qui sont un ensemble de protéine
qui au PH du tampon ont les mêmes caractéristiques de dissociation. Dans un densitomètre
(spectrophotomètre) on obtient l’intensité de coloration de chacune des fractions qui est
proportionnelles à la quantité des protéines et sur un graph. on obtient cette intensité sous
forme d’une variation de densité optique, ce graph. est dit un électrophorègramme, un profil
d’électrophorèse.
La protéine qui migre le plus en milieu alcalin est la plus concentré dans le sérum : l’albumine
(50%) et derrière on a identifié les fractions en les nommant des globulines en leurs donnant
une lettre grecque et un chiffre. Les gamma globulines sont les anticorps de l’individu. Cette
technique est applicable à tous les liquides de l’organisme.
2- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Elle permet de séparer les protéines, les faire migrer dans des conditions telles qu’on peut les
distinguer en fonction de leurs masses moléculaires. Pour que les protéines migrent, il faut
qu’elles soient chargés, pour ne pas les différencier en fonction de leur charge (comme en
électrophorèse classique) on les entoure toutes d’un détergent : le sodium de décyl sulfate
(SDS) qui détruis les liaisons non covalentes et déroulent les protéines à condition de pas
avoir de ponts dissulfure à l’intérieur. Le SDS est ce produit qui possède une chaîne carboné
assez longue et à une extrémité un groupement chargé négativement. Lorsqu’on rajoute ce
produit à une protéine, il se fixe sur la chaîne polypeptidique en présentant vers l’extérieur
son groupement chargé -. Donc ça fait que toutes les protéines ont la même charge négative
globale. Pour séparer ces protéines, on va les faire migrer sur un support de gel de
polyacrylamyde qui est un polymère synthétique de l’acrylamyde. En fonction des
proportions des différents produits qu’on rajoute à l’acrylamyde pour former ce gel, on peut
avoir un gel de consistante plus ou moins ferme ou liquide en fonction de la quantité
d’acrylamide par rapport au reste. Donc sur un support de ce type dans un moule on coule un
gel à une certaine épaisseur et d’un bout à l’autre du gel on met des proportions différentes
d’acrylamide pour avoir un gradient de concentration c’est à dire à une extrémité concentré en
acrylamide = dure et à l’autre bout plus mou. Les mailles qui constituent ce gel peuvent plus
ou moins laisser passer les protéines. Donc quand on dépose des protéines du coté où le gel
est mou, les protéines entrent dans le gel et vont être entrainer par courant électrique. Il y aura
donc une séparation des protéines en fonction de la masse moléculaire : les petites protéines
qui se faufilent vont le plus loin possible mais les grosses protéines sont freiner par les canaux
du gel qui deviennent de plus en plus petits donc elles sont arrêter plus haut. Ensuite on
introduit un colorant de protéine pour les visualiser.
Cette technique est plus simple que l’ultracentrifugation et ça rapport la masse moléculaire à
une longueur de migration. On peut l’appliquer à l’étude de la composition d’une protéine en

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ses différentes sous unités. Quand on veut étudier une protéine et savoir si elle est composé
d’une seul ou de plusieurs sous unité, si ces sous unités sont associés par des liaisons non
covalentes ou de ponts dissulfure on peut réalisé cette expérimentation dans différentes
conditions.
- Si on rajoute du SDS à une protéine globulaire composé d’une seule chaîne
polypeptidique, ça déroule la chaîne et en électrophorèse il y a qu’une seule bande.
- Si on a une protéine à 2 chaînes associées par des liaisons non covalentes avec
simplement un traitement par le SDS on va obtenir deux sous unités, deux fractions à
masse moléculaire à des niveaux différents. Si après traitement par le SDS on obtient
qu’une seule bande dont la masse moléculaire est égale à la masse des deux autres, ça
peut vouloir dire que la protéine n’a pas été dissocié complètement parce qu’on a mis
que du SDS donc il faut mettre en plus du bêta mercaptoéthanol ; si à ce moment on
obtient deux fractions ça veut dire que ces deux sous unités étaient associés par un
pont dissulfure.
 Actualité : Pour identifier des protéines de mélange complexe, on a imaginé un autre type
d’électrophorèse qui est l’étude du protéome/ de la protéomique qui est l’étude d’un ensemble
de protéine en une seule technique, visualiser toutes les protéines d’un mélange en une seule
fois. C’est une électrophorèse bidimensionnelle qui permet de faire une analyse d’un mélange
de protéine. La première dimension est sur gel de polyacrylamyde puis on fait pivoter à 90° le
support et on fait migrer ces protéines dans une deuxième dimension (par exemple en fonction
du point isoélectrique). Cette technologie a bénéficié de l’apport de l’informatique pour
analyser précisément les spots.
f- propriétés antigénique d’une protéine.
Anticorps est créé contre protéine étrangère (antigène) à l’organisme. Il y a une fixation stéréo
spécifique antigène anticorps (pince). Le devenir est l’élimination de ce complexe par les
cellules phagocytaires. Complexe antigène anticorps a des propriétés de précipitations pour
être analyser par la spectrophotométrie et ça donne lieu à des techniques de l’immunochimie
qualitative (le poids) ou quantitative. Technologies donnent lieu à de nombreuses techniques
qui concerne l’immunoprécipitation (technique ancienne) mais on ne s’en occupe pas.
-dosage immunochimique avec marqueur : Sur le complexe antigène anticorps on rajoute
sur un des deux éléments une substance qui sert de marque au complexe. La première
technique développé est la technique radioimmunologique (technique RIA est une technique
par compétition) parce qu’elle utilise un isotope radioactif qui va être fixé sur le complexe.
Pour réaliser cette technologie, on a par exemple l’insuline à doser donc il faut un anticorps
anti insuline et donc il faut avoir marquer l’antigène = insuline marquée avec un isotope
radioactif c’est à dire substituer un atome présent dans la structuration de la protéine par un
autre. Technique par compétition qui consiste en l’introduction de l’anticorps, l’antigène
qu’on veut doser, et une petite quantité d’insuline radio marqué, on mélange tout ça et on
attends qu’il y ait un équilibre pour complexes antigène anticorps formé (avec antigène =
insuline à doser ou antigène = insuline marqué). On déplace l’équilibre entre ces deux types
de complexes en fonction de la proportion relative qu’on apporte dans les échantillons
inconnus : plus il y a d’antigène dans les échantillons inconnus plus il va prendre interaction
avec l’anticorps donc moins il restera d’anticorps libre pour fixer l’antigène marquée. Si au
contraire il y avait peu d’antigène dans la préparation inconnu, tous l’antigène qui était
marqué va pouvoir s’associer à l’anticorps. Au bout d’un temps d’équilibration on isole par
une technique de précipitation des complexes marqués qui seront mesurés dans un compteur
de radioactivité. Il y a une relation inversement proportionnel entre la quantité de
radioactivité mesuré et la quantité d’antigène à détecter. C’est à dire que le signal de

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radioactivité sera d’autant plus important qu’il y aura peu de molécules à détecter dans
l’échantillon inconnu
Inconvénients : produits radioactifs utilisés donc ne se conserve pas, pas stable, et ces produits
sont cher, les personnels qui les manipulent doivent prendre précaution pour ne pas être
contaminer, le compteur de radioactivité coûte très cher. Donc ces dosages sont restés
longtemps inaccessible à beaucoup de laboratoires.
- dosage immuno enzymatique (EIA) : immuno car on utilise toujours l’interaction antigène
anticorps mais enzymatique parce qu’on a fixé sur un des 2 une enzyme qui peut en
transformant un substrat générer une coloration du substrat.
Ici on montre la technique ELISA : utilisant une enzyme fixé à un anticorps sur un support
solide. Elle est aussi dit une technique sandwich en phase hétérogène c’est à dire qu’on
emprisonne l’antigène entre deux molécules d’anticorps. Pour ça on fixe l’anticorps d’une
protéine à pister sur le support dans lequel on fait la réaction (généralement un tube). Si on
rajoute l’antigène, on fixe l’antigène et que l’antigène. L’astuce c’est de rajouter le deuxième
anticorps contre le même antigène sauf que là on fixe une enzyme à sa surface. A la fin de la
réaction, pour se débarrasser des autres produits, on jette le liquide donc on garde sur le
support que les complexes antigènes anticorps qui nous intéresse. A la fin on rajoute un
produit qui va coloré le complexe par l’enzyme (qui est ici la peroxydase qui est en grande
quantité dans les végétaux et elle dégrade le peroxyde d’hydrogène H2O2 qui est transformé
en H2O + O2), ce produit est le substrat de l’enzyme. Dans la préparation on associe à ce
substrat de la peroxydase un chromogène (produit chimique qui change de couleur en fonction
de son degré d’oxydo réduction). Si on rajoute dans la réaction de l’eau oxygéné et un substrat
chromogène on va avoir une coloration dont l’intensité est proportionnelle à la quantité
d’enzyme présent sur les complexes qui est elles mêmes proportionnelles à la concentration
d’antigène. Si on mesure l’intensité de coloration par rapport à des variations de
concentrations de protéines à analyser (ici c’est l’IgE qui est support de la réaction
allergique). Pour ce type de réaction on a une relation directement proportionnel entre la
densité optique mesurée et la quantité de molécule à détecter. Le substrat pour générer le
coloration est l’orthophénylènediamine (OPD).
Technique d’immunoblotting = immunotransfert
On peut coupler les techniques d’ électrophorèse et d’immunoanalyse.
Après une électrophorèse en gel de polyacrylamyde, on transfère ces protéines sur une
membrane de type papier (blot transfert). On utilise cette membrane, ce blot pour révéler
ensuite les protéines. On peut pas travailler sur le gel directement parce que les anticorps
n’entrent que difficilement dans le gel. On travaille donc sur cette emprunte de protéine
presque sèche sur le papier. On rajoute l’anticorps contre la protéine à individualiser. On a ici
une technique qui permet d’utiliser toujours le même anticorps pour pouvoir faire une
immunorévélation. Quelque soit la protéine qu’on va pouvoir identifier, on peut toujours
utiliser le même anticorps marqué à l’enzyme. Pour faire ça on réalise une technologie en
pratiquant un double système de fixation d’anticorps. Le premier anticorps est classique
contre la protéine à tester, par exemple l’ac anti albumine humaine fabriqué chez le lapin puis
on utilise un anticorps anti immunoglobuline. Si on veut faire une immunorévélation directe à
cet état, il faudrait que pour chaque anticorps on ait fait un marquage avec une enzyme. Si on
a de nombreuses protéines on fait beaucoup de marquages différents donc l’idée est d’utiliser
la propriété que chaque Ac fabriqué possède une certaine spécificité de l’espèce animale qui
l’a produit. A coté de la partie qui agit avec l’antigène il y a une autre partie dans les Ac qui
est spécifique de l’espèce. En prenant des anticorps anti albumine humaine fait chez le lapin
et les injectant à une chèvre, celle ci va faire des Ac anti lapin et pas anti albumine. Cet
anticorps de chèvre anti lapin va reconnaître la spécificité lapin sur la molécule

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d’Immunoglobuline donc on va pouvoir fixer ce deuxième Ac sur le premier quelques soit sa
spécificité antigénique de reconnaissance d’albumine des immunoglobulines. Et c’est donc
cette deuxième structure qu’on fixe à une enzyme donc toujours le même anticorps qu’on
pourra utiliser quelque soit la spécificité de la protéine immunisé. Ce système de double
anticorps permet d’économiser et donc d’avoir qu’un seul anticorps marqué pour tout révéler.
Pour les protéines ça s’appel la technique de Western Blot.
EXEMPLES DE STUCTURES PROTEIQUES.
a- Peptides et protéines hormonaux.
Il existe des peptides au niveau cérébral et de glandes endocrines à fonction très importantes.
-Au niveau de l’hypothalamus : il sécrètent les plus petits peptides facteurs qui jouent sur
d’autres glandes, ce sont des releasing hormones. Ceux ci jouent sur l’antéhypophyse qui
régule l’activité de la thyroïde. Un de ces peptides est composé de 3 AA : TRH (thyrotropin
releasing hormone) qui agit sur la TSH (antéhypophyse) qui régule la biosynthèse des
hormones thyroïdiennes. Ce tripeptide a été extrait de l’hypothalamus à partir du mouton pour
avoir des mgs de ce produit et pouvoir l’analyser. Sur ces 3 AA il y en a 2 modifiés : Une
proline modifié qui est l’oxoproline en N terminal et une prolinamide en C terminal. Roger
Guillemin a découvert la structure de ce peptide.
-Au niveau du tractus digestifs : peptides gastro-intestinaux qui agissent sur plusieurs organes
et peu importe leurs noms. Ce sont des polypeptides de quelques dizaines d’AA.
-Les protéines hormonales : L’insuline qui régule le métabolisme du glucose, les hormones
fabriquer sur les ovaires : FSH, LH. L’hormone régulant la croissance des tissus : la GH
(grosse hormone) ou somatotropine. Toutes ces hormones proviennent souvent de précurseurs
qui se coupent en morceaux pour générer la diversité des hormones jouant un rôle
physiologie. L’exemple du peptide long synthétisé au niveau hypophysaire, peptide qui n’a
pas de rôle fonctionnel mais est clivé en plusieurs morceaux à rôle fonctionnel particulier. En
particulier ici il se différencie pour faire l’ACTH (régule le métabolisme de la corticostérone
au niveau de la corticosurrénale) et d’autres qui ont rôle au niveau cérébral.
b- Protéines fibrillaires ou fibreuses (sont allongés).
Sont en quantité importantes, ce sont en masse les plus importante dans l’organisme car
constitue le ¼ des protéines de l’organisme (espèce de protéine) qui sont le collagène à 18
variétés différentes. Le collagène est présent au niveau du tissu conjonctif, poil, dent, etc… et
ces produits sont constitués de variétés de collagène différents. Ces protéines sont composés
de structure unique répétitive formant des fibres et ces structures sont soit en hélice alpha soit
en feuillet bêta plissé. Toutes les protéines fibreuses retrouvées dans l’organisme humain sont
composés de molécules avec des structures d’hélice alpha. Ce collagène est toujours organisé
de la même manière : il est formé de cordage. En ME on va voir la protéine qui forme ces
espèces de tuyaux, chacune des structures est la fibrille de collagène avec un enroulement de
structure élémentaire. La quantité de sous unité pour une fibrille est différente selon les
variétés de collagène visible dans les différents tissus. Si on déroule le cordage on a le
cordage initial qui est toujours identique et composé lui aussi de sous unité, chacune de ces
fibres étant composé de 5 sous unités, chacune de ces sous unités est la protofibrille de
collagène. Fibrille : c’est la structure final, l’ensemble ; protofibrille : chaque sous unité ; si
on regarde dans chaque sous unité de protofibrille elles sont organisés de la même manière
sous forme de la molécule de collagène proprement dit qui est formé de 3 hélices alpha
enchevêtré. On a ici la molécule de tropocollagène qui est l’initiale formé de 3 chaînes
polypeptidiques enroulés sur elles même Chacune de ces chaînes polypeptidiques est enroulés

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sur elle même pour former une structure secondaire d’hélice alpha. Cette molécule de
tropocollagène à 3 hélices polypeptidiques gauches (gauches parce qu’à l’inverse des
protéines globulaires il y a une symétrie dévié vers la gauche des chaînes). L’assemblage de
ces 3 chaînes conduits à une super hélice qui est une hélice droite, c’est à dire une symétrie
parfaite classique.
Chacune de ces chaînes polypeptidiques est riche en glycine qui représente le 1/3 des AA.
Certaines AA peuvent être hydroxylés comme la proline et lysine qui ont un OH sur leurs
chaîne latérales ; les OH servent de point d’ancrage de liaison entre toutes les molécules les
une aux autres et c’est ce qui joint par des non covalentes les différentes fibrilles entre eux et
c’est ce qui fait ce paquet de cordage associé les uns aux autres. Cette hydroxylation des AA
réalisé lors de la synthèse de la protéine est sous la dépendance de la vitamine C (acide
ascorbique). Historiquement il existait le scorbut quand les individus n’avaient pas de fruits
avec vitamine C donc pas possible de faire collagène donc hémorragie se compliquant par
décès.
Pour maintenir les différentes fibres entre elles, il y a une réticulation par les lysines qui
permet d’associer encore plus fermement les protéines entre elles.
C/Protéines globulaires.
1-Exemple de l’hémoglobine :
Les protéines globulaires réalisent des fonctions multiples, générer des interactions avec
composants multiples. L’hémoglobine est composé de 4 sous unités : 4 chaînes
polypeptidiques organisés de la même manière. Ce sont des sous unités de globines (2 alpha
et 2 bêta) et elles sont presque identiques. Cette protéine intègre une structure composé d’un
noyau tétrapyrolique c’est à dire 4 noyaux pyrrols associés par liaisons particulières + au
milieu un atome de fer fixé aux 4 extrémités des cycles pyrroliques et par une 5ème liaison à la
chaîne peptidique = globine par l’intermédiaire d’une liaison avec une histidine. C’est une
liaison de coordinence métallique donc il y a une 6ème liaison au niveau de laquelle se fixe
l’oxygène. La partie constitué du noyau tétrapyrolique est l’hème (partie héminique) de
l’hémoglobine.
-conformation rapporté à la fonction de l’hémoglobine : Le globule rouge à des centaines
de millions de molécules d’hémoglobine qui va livré son oxygène au tissu et en fonction des
conditions du milieu il va soit capter de l’O sur le poumon soit donner son oxygène au niveau
des tissus. Ces notions de fixation/délivrance de l’O2 a trait à des modifications de
structuration de la protéine (quaternaire ou tertiaire). On a ici le plan du noyau tétrapyrolique
avec le fer qui est au centre du noyau ; cet atome de fer dans sa position où il fixe l’oxygène
est centré sur le noyau tétrapyrolique, dans le même plan que le noyau tétrapyrolique. Etant
dans le même plan il dépasse du noyau tétrapyrolique donc s’il y a de l’O2 dans
l’environnement par contact entre les deux la molécule va fixé de l’O2. Si l’hémoglobine va
porter son O2 au niveau des tissus, elle est dans un milieu pauvre en O2 : le PH va être acide
donc la conformation de la protéine va changé. En particulier la chaîne polypeptidique ici noir
va se rassembler sur elle même ce qui va tirer vers le haut l’histidine de la chaîne et tirer vers
le haut le fer qui va avoir une géométrie qui ne va plus être au centre du noyau tétrapyrolique
et en se tirant vers le haut il libère de l’O2.
2- Exemple de l’immunoglobuline M:
Qui ont une masse moléculaire très important ce sont les Ig M. On voit chaque fois des sous
unités qui possède une pince et ici ce sont des supers anticorps qui vont fixer 5 antigènes en
même temps. Ici il faut voir que cette structuration très compacte correspond à des Ac très
affins pour l’antigène, sont organisés de telle manière à ce qu’il y a interactions extrêmement
fermes entre tout ces monomères par des liaisons covalentes de points dissulfures (ces liaisons
en foncés nombreuses).