Maturation des ARN pré messagers – Epissage

Minault Quentin
Cazals Cyril
Binome 5
Cours du 16/09/11 14h-16h
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Maturation des ARN pré messagers – Epissage
« Mes exemples sont là pour illustrer le cours » la prof.
I)
Maturation des ARN pré – messagers : 2 « retouches »
aux extrémités et un bouleversement à l’intérieur
1) De l’ADN à l’ARN
L’ADN contient environ 20 000 – 25 000 gènes.
La RNA polymérase permet le passage du gène à l’ARN, c’est la transcription.
Cet ARN est alors sous forme de pré messager qui va par la suite subir
plusieurs étapes avant de pouvoir devenir mature : formation d’une structure
cap (coiffe en 5’) ainsi qu’une coupure de l’ARN naissant en 3’ (clivage/ poly
adénylation).
De plus, après ou pendant la transcription, on assiste à une étape nommée
l’épissage : L’ARN une fois mature pourra être exporté en dehors du noyau
vers le cytoplasme afin d’y être traduit et dégradé.
Ces mécanismes sont importants car de nombreuses maladies humaines et
cancers sont dues à des altérations au niveau des différentes étapes citées ci –
dessus (Alzheimer, syndrôme du X fragile, cancers…).
2) Maturation de l’ARN pré messager
Chez les eucaryotes, l’ARNm possède une coiffe en 5’ ( le cap), des séquences
codantes (exons), des séquences non codantes (introns), une queue polyA en
3’, une séquence traduite ORF et des séquences non traduites (5’ et 3’ UTR : ce
sont les régions régulatrices).
a) Le 5’ capping
En 5’ de l’ARN transcrit, il reste une extrémité triphosphate. La synthèse du cap
se fait en 4 étapes :
- l’ARN 5’ triphosphatase enlève 1 phosphate
- la guanylyl transférase permet l’ajout d’un GTP et le rejet de PPi
- méthylation de cap sur la première guanine par la 7-guanine methyl transférase
- ajout de groupements méthyls sur les riboses grâce à la 2-O’ methyl transférase
La coiffe (cap) est rapidement ajoutée après l’initiation car toutes les enzymes
nécessaires se fixent directement sur la RNA polymérase. Ce mécanisme est
indépendant de la séquence AND il ne concerne que l’ARNprémessager
La coiffe sert à stabiliser l’ADN contre les nucléases et c’est également un site de
liaison pour différents facteurs.
La liaison entre la coiffe et le RNA est une liaison triphosphate 5’ => 5’ alors que
la liaison entre les nucléosides de l’ARN est une liaison phosphodiester 3’ => 5’.
b) La polyadénylation
Une séquence est reconnue par le complexe protéique. Celui ci clive
l’ARNm  dégradation de la partie 3’ et ajout d’une queue polyA par une
polyA polymérase.
Rôles :
-
II)
Augmenter la stabilité du messager via eIF4G : l’ARNm prend une
conformation circulaire dans le cytoplasme, cela bloque l’activité des
nucléases.
Favoriser la traduction.
L’épissage constitutif : Principes et Aspects
réactionnels
1) Principe
Epissage = splicing = enlever les introns + relier les exons
Les séquences consensus : 2 types (site fort si aucune variation de séquence et
site faible si variation de séquence).
Introns pas forcément épissé dans ordre.
Les séquences cis :
Au niveau de l’exon n : site donneur en 5’ (GU)
Au niveau de l’exon n+1 : site accepteur en 3’ (AG)
Chez l’homme il existe entre site branchement et site accepteur un pont
polypyrimidique
Sequences tres conservees chez levure d’ou travail sur levure.
Reconnues par le spliceosome ( conservé de la levure a homme).
Il existe d’autres séquences cis : inhibitrices (silencers) et activatrices
(enhancers).
2) Deux réactions de transestérification (voir diapo)
-
-
Le groupement 2’OH du site accepteur(qui est fortement réactif) lance
une attaque nucléophilique sur la guanine du site donneur du premier
exon. L’adénine et la guanine sont alors reliées et forment une stucture
en lariat (lassot).
Le groupement 3’ OH du site donneur lance une attaque nucléophilique
au niveau du site accepteur, il a relarguage de l’intron et ligation des
deux exons.
3) Composant du spliceosome (complexe d’épissage)
Le spliceosome correspond au complexe d’épissage.
C’est un complexe multi mega Dalton (60S) .
Il est composé de 5 ARN sn (small nuclerar) : U1, U2, U4, U5 et U6 qui sont
associés à des protéines sn (7) et à des protéines non snRNP (plus de 170 chez
l’homme).
5 U sont donc impliqués et auront des fonctions différentes :
- U1 reconnaît le site donneur
- U2 reconnaît le point de branchement
- U4 et U6 interagissent ensemble avec le site donneur et donc aussi avec U1
- U5 avec les sites en 5’ et 3’
Les protéines du spliceosome (snRNP) ont aussi différentes fonctions (liaison à
l’ARN, activité, interaction). Le spliceosome s’assemble de manière plus ou moins
séquentielle, c’est une structure dynamique présentant de nombreux
réarrangements, ce qui permet la stabilité et flexibilité de l’épissage.
a) Interactions ARN/ARNm
U1 s’hybride avec site donneur,formation d’une séquence double brin par
appariement.
U2 s’hybride avec le site de branchement mais le A ne s’apparie pas.
U4 et U6 s’apparient ensemble.
b) Réarrangement ARN/ARN
U2 au niveau du site de branchement.
U6 interagit avec le site 5’.
Conséquences juxtaposition du site donneur du premier exon et du
point de branchement, ce réarrangement ARN/ARN va rapprocher dans
l’espace les sites 5’ et 3’ (grâce à U5) et donc rapprocher les deux exons,
ce qui permet la deuxième réaction de transestérification.
c) Réarrangement protéine/protéine
Au cours de l’épissage, des protéines s’ajoutent, d’autres s’enlèvent.
4) Assemblage du spliceosome
- Complexe E : quand U1 est arrivé sur le site 5’ (site donneur) et est stabilisé,
l’ARN s’engage dans le cycle d’épissage
- Complexe A (pré spliceosome) : U2 vient se fixer sur le site de branchement
(le complexe commence à être stable)
- Complexe B (spliceosome pré catalytique) : U4 – U5 –U6 arrivent sous forme
de trimère. U6 par son activité hélicase commence à chasser U1 et U4. Il se
forme alors le complexe B actif où il n’y a pas encore de corps catalytique
- Complexe B (spliceosome actif catalytiquement) : Par de nombreux
réarrangements.
- Complexe C (spliceosome activé) : U4 est enlevé pour rendre U6 accessible.
U6 reconnaît l’ARN prémessager, fait des réactions avec U2 pour faire la
première étape de transestérification  structure en lariat.
Le complexe C subit la 2ème réaction de transestérification  ligation des
deux exons + relarguage de l’intron  recyclage de protéines et des ARN du
spliceosome qui s’étaient dissociées.
III) Bases de la reconaissance des sites d’épissage in
vivo, par la machinerie d’épissage
Il existe plusieurs types de gènes :
-
SUR2(cytochrome 450) : gène typique chez mammifères (40kb)
Dystrophine humaine : plus grand gène, responsable de la dystrophie de
Duchenne et Drecker (2,4 Mb)
Nébulline : 183 exons , 249 kb: le plus complexe
La caractéristique invariante est que les exons interne ont une taille régulière
(entre 50 - 150 pb) et les introns une taille variable ( de 100 à 300 pb).
Comment la cellule va t – elle reconnaître des séquences variables sur des
longueurs aussi grandes ?
Ce qui permet de reconnaître les exons des introns sont les séquences consensus
en 5’ et 3’.
Chez S. cerevisiae, les séquences sont bien conservées ainsi que le site de
branchement.
Chez H. sapiens, à part le GU (qui est une séquence invariable), tout le reste peut
être non conservé. Le site de branchement est également très peu conservé.
Mécanismes facilitant la reconnaissance des sites d’épissage :
1) Couplage de la transcription et de l’épissage
- Vitesse de polymérisation :
- 1500 à 2000 nts par min
- 2 à 3 min pour synthétiser un pré-mRNA de 5 kb
- 50 - 75 min pour un pré-mRNA de 100 kb
- Cinétique de l’épissage in vivo :
- 2 min pour 1 intron de 0.5 à 1 kb
»»» Un gène de moins de 5 kb peut être transcrit totalement, puis épissé.
»»» Un gène de plus de 5-6 kb est transcrit et épissé de manière
concomitante.
Seuls les gènes transcrits par la Pol II ont une structure en
exons/introns (gènes « morcelés ») et sont soumis à l’épissage.
 Des gènes morcelés (normalement transcrits par Pol II), mais
fusionnés à un promoteur Pol III ou T7 sont transcrits in vivo mais sont
peu ou pas épissés.
 Particularité de la Pol II par rapport aux autres Pol : présence d’un Cterminal domain (CTD) : formé de 50 répétitions d’un heptapeptide (des
sérines en 2’ et en 5’). C’est une plateforme d’interactions avec d’autres
protéines.
Il faut savoir que la phosphorylation de la sérine 5’ initie le
transcription tandis que celle de la sérine 2’ initie l’élongation.
In vivo, une Pol II tronquée de son domaine CTD peut transcrire les
gènes, mais les pré-mRNA résultant sont maturés et épissés
inefficacement.
 La Pol II active un épissage in vitro.
Ces données mettent en évidence le rôle du CTD dans l’épissage. Il
intervient comme plate-forme d’interactions avec de multiples facteurs de
maturation et d’épissage.
2) Reconnaissance des sites d’épissages « à travers » l’exon, la
définition de l’exon précède la définition de l’intron
Les sites de reconnaissances sont reconnus d’abord à travers l’exon puis a
travers l’intron :
- Reconnaissance des sites 5’ et 3’ : c’est la définition de l’exon
- Epissage : c’est la définition de l’intron
3) Les régions introniques sont globalement réfractaires à la
reconnaissance d’exons
IV) Epissage alternatif : caractéristiques générales
- Plus de 90% des gènes humains sont affectés, responsable de nombreuses
maladies.
- Rôle important au niveau du développement, différenciation cellulaire et
gamétogénèse.
- Spécificité tissulaire : testicule + cerveau (épissage alternatif +++)
- Régulation de l’expression génique via couplage au NMD : nonsense mediated
mRNA decay.
 Dans certains cas, un codon stop prématuré peut – être inclus dans un ARNm :
- Normalement : la traduction a lieu, la protéine est tronquée
- Avec ce système NMD : il y a dégradation de l’ARNm : pas de traduction.
Ce couplage avec le NMD est très souvent utilisé pour réguler le taux de
protéines.
Différents modes d’épissage alternatif (voir diapo 34)
- sites donneurs alternatif : site distal, proximal
- sites accepteurs alternatifs : distal, proximal
- exon cassette
- intron retenu : décalage de cadre de lecture
- exons mutuellement exclusifs
- promoteurs alternatifs
- site de poly A alternatifs
Toutes ces combinaisons augmentent la diversité protéique à partir d’un ARNm.
Ex : protéine Dscam, molécule qui sert au niveau du branchement lors de
l’épissage alternatif chez la drosophile : isoformes ++++ (38016 protéines
synthétisés a partir de ce même ARNm).
Troponine T (dans le muscle) : 64 isoformes possibles : 2 exons exclusifs, 5 exons
alternatifs. Protéines avec fonctions pouvant être différentes.
Comment se fait l’épissage alternatif ?
Enchancers et silencers :
- Enchancer : ESE (exonic splicing enhancers) : au niveau des exons,
reconnu par protéines SR facilite l’inclusion des exons qui ont cette
séquence
- Silencers (ou repressors) : ISS ou ESS, reconnu par la protéine hnRNP
Les facteurs trans
- Dans toutes les cellules : on a :
o SR active l’inclusion des exons alternatifs
o hnRNP favorise l’exclusion des exons alternatifs
- En fonction du type de cellule, on aura soit plus de SR, soit plus de hnRNP
Mode d’action général des facteurs trans :
- Les exons constitutifs ont des séquences d’épissage fortes (car consensus)
- Les exons alternatifs ont des séquences d’épissage faibles (variable) et ont
donc besoin de séquences activatrices (enhancer : protéine SR par ex)
 Action antagoniste des protéines SR et hnRNP
Le choix d’un site d’épissage dans la cellule va dépendre de la quantité de
facteur trans disponible dans la cellule donnée.
Ex : détermination du sexe chez Drosophilia melanogaster (voir diapo 41)
Chez femelle : XX, X/A = 1
Chez male : XY, X/A = 0,5
- Chez femelle : transcription précoce de Sxl (important pour détermination du
sexe) Sxl agit pour synthétiser TRA, il y a épissage d’un isoforme qui permet
formation de Dsx(f).
- Chez mâle : moins de facteur trans dont transcription tardive de Sxl :
Quand Sxl est produit, il influe sur l’épissage :
- Chez la femelle : Sxl favorise l’exclusion de l’exon 3
- Chez l’homme : Par épissage alternatif il y a inclusion de l’exon 3, celui ci
contient un codon stop prématuré, il y a dégradation de l’ARNm et dont
pas de traduction de la protéine Sxl.
Les deux protéines sont différentes, et seront responsable de la différenciation
sexuelle (épissage alternatif au niveau de cellule, gamètes, etc.)
V) Quand la machine se dérègle : cancer-thérapies.
Environ 50% des mutations chez l’homme : mutations d’épissage.
Des études récentes ont montrés que généralement dans le cas de cancer, c’est le
mécanisme d’épissage alternatif qui est déréglé.
Questions :
1) Est-ce que les modifications des profils d’épissage initient la
tumorigenèse/permettent la progression cancéreuse?
2) Est que les changements augmentent le potentiel oncogénique des protéines
exprimées à partir des nouveaux variants?
3) Est-ce que les profils peuvent être utilisés pour identifier des sous-types de
cancers, le prognostic ou aider à de meilleurs traitements?
Différents exemples
KLF6 ( kruppel like transcription factor)
Gène suppresseur de tumeur, il inhibe la croissance cellulaire via P21
Du fait d’un polymorphisme au niveau de l’intron, il existe différentes
isoformes : ex SV1 et SV2. SV1 a une fonction dominante négative qui créé un
site de liaison pour une protéine SR (c’est un facteur trans).
BRCA1 – cancer du sein/ovaires : possède de nombreuses mutation et
polymorphismes.
Mutation non sens : E1694X : code pour un codon stop, elle affecte l’épissage
alternatif, il y a élimination de l’exon 18, perte du domaine C terminal de BRCA1
qui n’est alors plus fonctionnel  développement du cancer.
En temps normal, au niveau de l’exon 18 : on a une protéine ASF/SF2 qui se lie à
une séquence activatrice (enhancer).
Mais quand mutation non sens : création d’une séquence inhibitrice reconnue
par hnRNP.
P53 – suppresseur de tumeur, gène le plus souvent muté dans les cancers
humains (>20 000 mutations dont 951 silencieuses) . La plupart des mutations
semblent affecter des ESE, sites d’épissages, etc.
Les variants de ces p53 : fonctions différentes, favorisent la propagation
tumorale.
C’est la quantité de facteur trans qui détermine un profil d’épissage particulier.
ASF/SF2 est une protéine SR qui modifie l’épissage de plusieurs ARNm, inhibe
l’apoptose, agit comme un oncogène.
Ron – récepteur de 2 chaines, quand ligand fixe il se dimérise, il est phosphorylé
ce qui active une cascade de signaux afin de réguler la croissance cellulaire, la
mobilité, etc. Si AS, délétion d’un domaine de 49 AA, Delta Ron activé
continuellement : Croissance cellulaire ++, mobilité ++
Quand formation de tumeur : front invasif : les cellules épithéliales se modifient,
elles se décrochent et envahissent le tissu  EMT (epithelial mesenchym
transition).
Lors de la métastase : cellules bien accrochées et bien différenciées  MET
(mesenchym epithelial transition)
L’exon 11 de 49 AA régulé par SF2/ASF (son épissage), formation de delta Ron :
formation du front invasif
Si peu ou pas de ASF/SF2 : cellule différenciées : métastase
Facteurs régulant l’épissage :
- Dans le cas du front invasif : cellule a faible densité : ASF/SF2 +++, SAM68-P +++,
Erk ½ +++
- Métastase : cellule forte densité : peu de ASF/SF2, etc
CD44 – lipoprotéine transmembranaire, souvent muté
Contient des exons constitutifs+alternatifs (10), dans les tumeurs : plus d’inclusions
d’exons alternatifs que dans les tissus sains
Quand on regarde différentes tumeurs, il y a association de l’un/plusieurs de ces
exons à un cancer  spécificité
Ex : exon V5 : permet de déterminer la gravité du cancer
Pyruvate kinase
Les tumeurs utilisent beaucoup de glucose, elles détournent la phosphorylation
oxydatif au profit de la glycolyse aérobie. Le pyruvate se transforme en lactate,
cette réaction cause peu de production d’ATP mais beaucoup de glucose.
- Développement de tumeur/développement embryonnaire : exclusion de
l’exon 9, inclusion de l’exon 10  isoforme PKM2
- En temps normal, c’est l’inverse  isoforme PKM1
Thérapies :
Il existe différents types de thérapies qui nous ont permis d’identifier différents
isoformes d’épissages du cancer.
Question : Cibles potentielles pour de nouvelles stratégies thérapeutiques ?
Radio – immunothérapie : Anti-corps couplé avec marqueur radio - actif, on
irradie la tumeur en ciblant les cellules tumorales (spécifiquement). Inconvénient :
tumeur solide, difficulté de l’anti - corps à pénétré dans le tissu/cellule.
Cibler la machinerie d’épissage : Par SRPK1 on active les protéines SR et on
augmente leur action. Problème SRPK1 : spécificité, on peut altérer l’épissage
d’autres ARNm  faire le rapport bénéfice/risque mais le bénéfice surpasse le
risque.
Correction de l’épissage aberrant : On injecte des ribozymes qui vont dégrader
les ARN aberrants. Inconvénient : pas assez de spécificité.
Thérapie pour RON :
- Soit radio – immunothérapie (par un anti – corps anti RON)
- Soit par oligo antisens (= séquence complémentaire à des enhancers ou
silencers qui vont respectivement recruter ou bloquer des facteurs trans,
ce qui favorise ou défavorise la production de RON par rapport dRON).