Cours n°4

Magnetic Activated Cell Sorting (cell separation (Milteny Biotec))
Cette technique permet de purifier spécifiquement, sans contamination, un objet cellulaire
(organite) grâce à la présence d’un antigène membranaire exprimé à la surface de celui-là.
Saccules golgiens ont été purifiés sans contamination par le RER avec cette technique.

Electrophorèses
Principe : des objets chargés peuvent migrer dans le sens opposé à leur charge si elles se
trouvent dans un champ électrique. La vélocité dépend des conditions opérationnelles et
permet donc une purification.
Application : protéines, acides nucléiques, petites particules subcellulaires.
Sur le gel précédent sont visualisés les marqueurs de PM
Pour identifier notre protéine après électrophorèse on est obligé d’utiliser un Ac.
Pour avoir une bonne interaction Ac-Ag on doit transférer grâce à un champ électrique les
protéines du gel sur papier (mb spéciale). On appelle cette technique le Western Blot.

Iso focalisation (Isoelectrique focussing electrophoresis) :
Gradient pH est établi à même le gel (ou autre milieu) dans un champ électrique.
Protéines séparées suivant leur charge naturelle, précipitent à un pH équivalent à leur pI (point
iso électrique).
Electrophorèse bidimensionnelle
Extraction Trypsinisation spectrométrie de masse
Identification de la protéine Interrogation banque
de données protéiques

Chromatographies
Deux phases : une mobile avec les objets à séparer (protéines, acides nucléiques) et une phase
stationnaire.
Chromatographie de partage :
- Sur papier
- Sur couche mince
Chromatographie sur colonne :
- gel filtration ou d’exclusion (séparation en fonction de la masse)
- échangeuse d’ions (fonction de la charge)
- d’affinité (fonction de l’affinité pour un substrat)
- phase inverse (High Pressure Liquid Chromatography en fonction de la polarité des
molécules à séparer)
Technique de séparation des constituants d’un mélange par entraînement à l’aide d’une phase
mobile (solvant) le long d’une phase stationnaire (gel de silice).
La vitesse de migration d’une substance est la résultante de :
- la force d’entraînement par le solvant (solubilité
- la force de rétention par le gel (adsorption)

La bille de gel peut être considérée comme une structure poreuse. La taille des pores est un
paramètre connu, il donne la limite d’exclusion des molécules.