Cours n°4
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Magnetic Activated Cell Sorting (cell separation (Milteny Biotec)) Cette technique permet de purifier spécifiquement, sans contamination, un objet cellulaire (organite) grâce à la présence d’un antigène membranaire exprimé à la surface de celui-là. Saccules golgiens ont été purifiés sans contamination par le RER avec cette technique. Electrophorèses Principe : des objets chargés peuvent migrer dans le sens opposé à leur charge si elles se trouvent dans un champ électrique. La vélocité dépend des conditions opérationnelles et permet donc une purification. Application : protéines, acides nucléiques, petites particules subcellulaires. Sur le gel précédent sont visualisés les marqueurs de PM Pour identifier notre protéine après électrophorèse on est obligé d’utiliser un Ac. Pour avoir une bonne interaction Ac-Ag on doit transférer grâce à un champ électrique les protéines du gel sur papier (mb spéciale). On appelle cette technique le Western Blot. Iso focalisation (Isoelectrique focussing electrophoresis) : Gradient pH est établi à même le gel (ou autre milieu) dans un champ électrique. Protéines séparées suivant leur charge naturelle, précipitent à un pH équivalent à leur pI (point iso électrique). Electrophorèse bidimensionnelle Extraction Trypsinisation Identification de la protéine spectrométrie de masse Interrogation banque de données protéiques Chromatographies Deux phases : une mobile avec les objets à séparer (protéines, acides nucléiques) et une phase stationnaire. Chromatographie de partage : - Sur papier - Sur couche mince Chromatographie sur colonne : - gel filtration ou d’exclusion (séparation en fonction de la masse) - échangeuse d’ions (fonction de la charge) - d’affinité (fonction de l’affinité pour un substrat) - phase inverse (High Pressure Liquid Chromatography en fonction de la polarité des molécules à séparer) Technique de séparation des constituants d’un mélange par entraînement à l’aide d’une phase mobile (solvant) le long d’une phase stationnaire (gel de silice). La vitesse de migration d’une substance est la résultante de : - la force d’entraînement par le solvant (solubilité - la force de rétention par le gel (adsorption) La bille de gel peut être considérée comme une structure poreuse. La taille des pores est un paramètre connu, il donne la limite d’exclusion des molécules. Vitesse d’élution et taille des molécules : - Les molécules de taille supérieure aux pores sont éluées les premières. - Les molécules pénétrant dans les mailles du gel sont éluées de façon proportionnelle à leur taille. Exemple de chromatographie d’affinité : Méthode d’étude de la cellule Méthode génie génétique : principe Code = UNIVERSEL, c'est-à-dire que c’est le même pour tous les êtres vivants sauf quelques rares exceptions : - Certains protistes : un seul codon stop (UGA) ; les autres codent pour un acide aminé. - Les mitochondries ont leur propres ADN et leurs propres ribosomes qui sont plus petits (ressemblent à ceux des procaryotes). Il peut y avoir jusqu’à 6 codons différents (5 chez humains). Cette caractéristique permet le transfert de gènes d’une espèce à l’autre = génie génétique. - Introduction de gènes dans la bactérie - Introduction de gènes dans un organisme pluricellulaire Exemple : production d’insuline humaine par une bactérie : On prélève le gène de l’insuline humaine et on l’introduit dans le plasmide d’une bactérie. Exemples : bactéries qui synthétisent : - Insuline (diabétiques) - Facteur de coagulation (hémophiles) - Hormone de croissance (traiter le nanisme, jouvence) - Enzyme pouvant métaboliser certains polluants (pétrole par exemple) - Protéines synthétiques qui n’existent pas dans la nature - Etc … On peut aussi modifier les êtres pluricellulaires : Végétaux : Le gène est introduit dans une cellule du parenchyme ou méristématique. Cette cellule est multipliée en éprouvette pour former un nouvel individu (cloning). Animaux : Le gène est introduit dans un ovule fécondé ou une cellule embryonnaire. L’ovule est implanté dans l’utérus d’une femelle porteuse. Plantes résistantes aux insectes, aux herbicides, au gel. Fruits et légumes qui se conservent plus longtemps. Nouvelles saveurs. Plantes plus riches en certains éléments nutritifs (vitamines par exemple). Etc. Animaux à croissance plus rapide, plus faible en gras, plus productifs (en lait, en viande, en œuf). Production de protéines à usage pharmaceutique (insuline, GH, HBc par exemple) Etc. Ces saumons ont le même age. Celui du bas est un OGM : DANGERS ????? Pour la santé ? Pour l’environnement ? Thérapie génique : corriger les gènes défectueux en introduisant dans les cellules le gène normal. Problème : comment introduire le gène dans chacune des cellules à corriger ??? En utilisant des cellules souches (non différenciées) et en les réimplantant dans l’organisme. Exemple de cellule souche et différenciation cellulaire Une cellule souche peut donner naissance à plusieurs cellules différentes. Exemple : La cellule hémocytoblastique de la moelle osseuse qui peut donner naissance à toutes les cellules sanguines. On extrait une cellule ordinaire de la brebis A. On extrait un ovule de la brebis B. Le noyau de l’ovule est détruit et remplacé par le noyau de la cellule de la brebis A. L’ovule avec son nouveau noyau est implanté dans une brebis C. Qui donne alors naissance à un jumeau identique (clone) de A. Dolly 1997-2003 : Il a fallu dans le cas de Dolly 276 essais avant de réussir. Les 3 domaines et les 6 règnes Un schéma possible de la phylogénie des organismes vivant sur Terre pour certains nous ne savons pas si cela c’est bien passé ainsi, mais cette phylogénie est compatible avec les données disponibles : De la cellule procaryote à la cellule eucaryote. Un des scénarios possibles est présenté ici. Les étapes numérotées 4a, 4b, 4c se sont déroulées simultanément : Légende : 1) La perte de la paroi cellulaire fut probablement la première étape 2) Les repliements internes accroissent la surface disponible pour l’absorption des nutriments de l’environnement. 3) Des membranes internes auxquelles se sont fixées des ribosomes se forment, certains entourent l’ADN. 4) a) En se liant à la membrane d’une vésicule formée par repliement, l’ADN entraîne la création d’un précurseur du noyau. b) Le cytosquelette (actine et microtubules) se forme. c) Les vésicules digestives primitives évoluent pour former des lysosomes en utilisant des enzymes provenant originellement du réticulum endoplasmique. 5) Formation d’un flagelle permettant une propulsion. 6) Les peroxysomes ont pu se former par l’endocytose de procaryotes possédant des capacités de détoxication. 7) Formées par l’endocytose de procaryotes ; les mitochondries ont permis la génération de l’ATP 8) L’endocytose de cyanobactéries a conduit au développement des chloroplastes, qui ont fourni à la cellule les capacités nécessaires à la synthèse de matériaux par utilisation de la lumière solaire. « Même si personne ne croit plus vraiment qu’une simple structure en arbre soit le meilleur modèle pour représenter l’origine de la vie, l’ancrage de Mimivirus à une position très ancestrale (3 milliards d’années) est compatible avec plusieurs hypothèses élégantes (mais jusqu’ici sans fondement expérimental) qui établissent un lien direct entre les virus à ADN et l’émergence du noyau cellulaire des eucaryotes. » Jean-Michel Claverie STRUCTURE ET FONCTION DES MEMBRANES Dans cette section : 1) Introduction : fonctions des membranes 2) Perspectives historiques (déductions logiques de la structure) 3) Le modèle en mosaïque fluide 4) La membrane plasmique - frontière cellulaire - transport de matériaux - diffusion - diffusion facilitée - transport actif - endocytose et exocytose - signalisation et transduction I] Introduction : les 5 fonctions des membranes 1) Frontière : perméabilité sélective entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule 2) Compartimentation de la cellule (organites membranaires : mitochondries, chloroplastes, organelles avec les membranes et fonctions spécifiques). La surface de membrane à l’intérieur de la cellule est souvent plus grande que la surface autour de la cellule. 3) Contrôle des entrées et des sorties de la cellule (échanges cellulaires par transporteurs, endocytose et exocytose) 4) Réception et transduction de signaux extérieurs via des récepteurs dans la membrane et cascade transductrice transformant le signal extérieur en message intérieur compréhensible entraînant une action cellulaire. 5) Communication cellule à cellule (via des connexions cytosoliques directes types gapjunctions animaux, plasmodesmes plantes) et adhésion intercellulaire. Pour résumer avec un dessin : II] Perspectives historiques (déductions logiques de la structure) 1890 Charles Overton étudie les cellules de la racine des cheveux : - Il note que différentes substances pénètrent les cellules à différents degrés ne dépendants pas de la taille des substances étudiées. - Il trouve en fait que le degré d’incorporation est proportionnel à la solubilité des substances dans les lipides (huiles). - Il en conclut que la frontière cellulaire est composée de lipides (il suggère qu’il y a du cholestérol et du phosphatidyl choline. 1902 Irving Langmuir étudie les lipides : - Il dissout les lipides dans du benzène et note qu’ils peuvent former une monocouche au dessus d’un film d’eau. - Il en conclut que les lipides sont amphipathiques (=amphiphiles) 1920 Garter et Grendel étudient la structure moléculaire de la barrière cellulaire - Ils mesurent le surface des GR (microscopie), 100 m²/cellule - extraient les lipides d’un nombre exact de GR et utilisent la technique d’étalement de Langmuir sur un film d’eau et trouvent que la monocouche de lipide correspond exactement à 2 fois la surface des GRs. - Ils concluent que la barrière est constituée d’une bicouche lipidique. 1930 Dawson et Danielli étudient la tension superficielle à interface huile/eau : - Ils mesurent la tension superficielle (Tsup) des bio-membranes et trouvent 0,2 dynes/cm alors que celle de l’eau est de 70 dynes/cm. En mélengeant des lipides à de l’eau ls n’arrivent qu’à 36 dynes/cm. - Ils prennent le modèle de G&G en défaut en assimilant la barrière à un film bi-couche huileux ou bien il existe quelque chose qui fait chuter considérablement la Tsup ! - Ils découvrent que ce sont les PROTEINES qui font chuter la Tsup - Ils proposent un modèle trilamellaire confirmé en 1959 par Robertson qui voit finalement des membranes par MET. STRUCTURE DE LA MEMBRANE AU MET Epaisseur : 7 à 8 nm Deux feuillets visibles au microscope électronique en « rail de chemin de fer ». Il faudra superposer 10000 épaisseurs de membrane pour obtenir l’épaisseur d’une feuille de papier. III] Le modèle mosaïque fluide (Jon Singer et Garth Nicolson) Toujours en vigueur, ce modèle date de 1972 (+80 ans de recherche depuis les travaux d’Overton pour établir un modèle acceptable) Un certains nombre d’observations va conduire S&N à réfuter le modèle trilamellaire de D&D : - Ex. : Protéines/Lipides = 0,23 = 20%/80% dans les gaines de myéline des axones Singer et Nicolson envisagent une nouvelle liaison : la liaison Hydrophobe. Les protéines globulaires sont ancrées dans la membrane par leur portions hydrophobes (on va les dénommer protéines intrasèques)
