Télécharger - Annales partiels ENSTBB

Chromatographie d’affinité
I-
La phase stationnaire
Sur la matrice sont greffés des ligands qui lient la molécule d’intérêt de façon réversible. Soit ils sont en
contact direct avec la matrice, soit ils en sont séparés par un bras espaceur (c’est le cas des petits ligands). Pour
décrocher la molécule d’intérêt il faut soit changer de tampon, soit utiliser des agents chaotropiques, soit mettre des
compétiteurs pour les molécules ou pour le ligand.
II-
Chromatographie d’affinité à ligand pseudo-spécifique
A- Non biologique
1- IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography)
Cette technique utilise des agents chélateurs, comme l’acide imminodiacétique (figure ci-dessus), qui
immobilisent des atomes de métal. Ces derniers vont pouvoir se lier par liaison de coordination à des histidines. La
nature du métal et le positionnement des histidines les unes par rapport aux autres déterminent l’intensité de
l’interaction. En fonction de l’agent chélateur le métal aura 2 à 4 liaisons libres. Il faut choisir le bon agent chélateur,
le bon métal et le bon tampon d’équilibration.
Pour purifier une protéine recombinante, il est possible de lui introduire une étiquette histidine par génie
génétique. L’élution se fait grâce à l’imidazole (noyau du radical de l’histidine). Ce dernier peut être mis en faible
quantité dans le tampon pour rendre la purification plus spécifique.
2- Par les colorants
Les colorants vont être fixés sur la matrice d’agarose. Chaque colorant va retenir des protéines spécifiques.
Par exemple, le Bleu Cibacron® va retenir toutes les protéines qui utilisent du NAD, Les colorants rouges celles qui
utilisent du CoA, et les jaunes celle qui on pour coenzymes du FAD. L’élution peut se faire par ajout de ces
coenzymes.
B- Biologique : glutathion
Le glutathion est formé de trois acides aminés (ce n’est pas un tripeptide !). Il se lie de façon covalente au
support grâce à la cystéine. Une protéine, la glutathion S transférase (GST) à une affinité prononcée pour ce
composé. Elle est accrochée à la protéine d’intérêt par génie génétique. Seules les hybrides GST-protéines vont être
retenus sur la colonne.
III-
Chromatographie d’affinité à ligand spécifique
A- Spécificité de groupe
1- Enzyme/Cofacteur
Les sérines protéases vont interagir avec la benzamidine fixée sur un bras espaceur. Cette propriété peut
être utile lorsqu’on fait agir des protéases sur des protéines hybrides (pour décrocher une GST par exemple) et qu’on
veut les enlever. On peut également retenir les sérines protéases en greffant sur les billes de sépharose des
arginines.
2- Les lectines et les glycoprotéines
Les lectines se lient aux glycoprotéines, glycolipides ou les sucres au niveau des fragments
polysaccharidiques. L’élution se fait par gradient de force ionique ou par compétition des sucres. Une des principales
lectines est la lectine Con A. Cette interaction fonctionne en faible présence de détergents.
3- La calmoduline et la calmoduline binding protein (CBP)
Les protéines recombinantes liées à la CPB vont se lier à la calmoduline greffée sur des billes lorsqu’il y a du
calcuim. Les protéines sont libérées lorsqu’on met des agents chélateurs dans le tampon.
4- Purification des anticorps
a- Par streptavidine/biotine
La streptavidine est une protéine tétramérique capable de fixer de façon non covalente la biotine (vitamine
H). Une biotine va être accrochée aux anticorps. Ces derniers vont être introduits dans une colonne de billes greffées
de streptavidine qui vont retenir les anticorps.
b- Purification par les protéines A, G ou L.
Se sont toutes des protéines produites par des bactéries. Les protéines A et G ont une affinité pour le
fragment Fc des anticorps alors que la protéine L a de l’affinité pour les chaines légères Kappa des fragments Fab.
Cette affinité permet de séparer les Ac des autres protéines. Cette interaction se fait à pH basique.
Il est possible de purifier des protéines de fusion avec une étiquette ‘’Fab’’.
5- Purification covalente (Permet de purifier les protéines ayant des fonctions thiols –SH.)
B- Spécificité stricte : liaison anticorps/antigène
Si les Ac sont greffés par leur partie protéiques, ceux-ci vont être orientés dans toutes les directions (et donc
certains sites seront inaccessibles). On va donc les greffer avec les sucres présents sur le fragment Fc. Pour cela on va
oxyder les sucres pour former des fonctions aldéhydes. Sur les billes vont être mis à l’extrémité de bras espaceurs
des groupements hydrazides qui vont réagir avec les aldéhydes pour former une liaison covalente ce qui permet
d’orienter les Ac et d’exposer leur site de liaison à l’Ag vers la phase mobile.
Il est également possible de greffer des protéines A sur les billes. Les Ac vont le lier de façon non permanante
avec cette protéines et à l’aide d’une molécule bifonctionnelle (DMP) les deux protéines vont se lier covalemment.
Une fois fixés à la phase stationnaire, les anticorps vont interagir spécifiquement avec l’antigène
correspondant, ce qui permet la purification de se composé.
On peut purifier les protéines de fusion en leur ajoutant une étiquette ‘’protéine A ‘’.