Sommaire - Université Paul Sabatier

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par
l’Université Toulouse III – Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Ingénieries Microbienne et Enzymatique
Présentée et soutenue par Amandine DE ALMEIDA COURNET
Le 30 avril 2010
Titre : Etude de la catalyse microbienne de la réduction électrochimique du dioxygène
JURY
Rapporteurs :
Mme
M.
Elisabeth LOJOU (CNRS, Marseille)
José MOURA (Université de Lisbonne)
Examinateurs :
Mme
M.
M.
M.
Marie-Noëlle BELLON-FONTAINE (AgroParisTech, Paris)
Frédéric JORAND (Université de Nancy)
Mathieu BERGE (Université de Toulouse)
Alain BERGEL (CNRS, Toulouse)
Directrice de thèse :
Co-directrice de thèse :
Mme
Mme
Christine ROQUES (Université de Toulouse)
Marie-Line DELIA (INP de Toulouse)
Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
Unité de recherche : LU49, Adhésion bactérienne et formation de biofilms
Laboratoire de Génie Chimique CNRS UMR 5503
Directrices de Thèse : Christine Roques et Marie-Line Délia
1
Remerciements
Avant de rentrer dans le vif du sujet, je souhaite adresser mes remerciements à toutes les
personnes qui m’ont m’accompagnée dans ce travail de thèse et qui m’ont permis d’aboutir à
ce résultat.
Tout d’abord mes directrices de thèse, Christine Roques et Marie-Line Délia. Merci de
m’avoir donné l’opportunité de travailler sur un sujet aussi intéressant et novateur que les
bactéries électroactives en particulier dans le domaine de la santé. Merci également pour
m’avoir toujours encouragée à présenter mes travaux dans de nombreux congrès aux quatre
coins du monde. Merci pour toutes les formations : qualité, hygiène et sécurité, microscopie
électronique et autres. Enfin, je n’oublierai pas votre grande efficacité lors de la rédaction et
de la correction du présent manuscrit.
Je remercie Elisabeth Lojou et José Moura qui ont accepté d’évaluer mon travail de thèse et
d’en être les rapporteurs. Merci également aux autres membres du jury, Marie-Noëlle BellonFontaine et Frédéric Jorand, qui ont accepté de participer à l’examen de mon travail. Merci à
vous quatre pour l’intérêt que vous avez porté à cette étude et l’intéressante discussion que
nous avons eu ensemble au cours de la soutenance.
Je tiens également à remercier Alain Bergel qui a participé à l’encadrement de ces travaux.
Merci de m’avoir presque tout appris de la bioélectrochimie. Merci pour les réunions, tes
commentaires, ton encouragement, toujours très efficaces, que se soit au cours du travail de
paillasse ou de la rédaction des publications.
Un gigantesque merci à Mathieu Bergé qui a encadré et suivi ce travail au jour le jour. Merci
pour ton immense disponibilité et tout l’intérêt que tu t’es découvert pour ces bactéries qui
font de l’électricité ! Je ne te remercierai jamais assez pour tout le soutien que tu m’as apporté
pour orienter et planifier le travail, toujours dans la bonne humeur. Merci de t’être réjoui avec
moi des manips qui marchaient et de t’être scandalisé avec moi de celles qui ne marchaient
pas ! Merci aussi pour les très bons moments passés en salle de repos et pour toutes nos
2
discussions allant de l’histoire d’Alexandre le Grand au dernier match de foot ou de rugby en
passant par les poussettes et autres accessoires bébé !
Merci à Joanna, ma petite sœur, et Cécile, qui ont participé à ces travaux en tant que
stagiaires.
Je tiens également à exprimer ma sincère reconnaissance à Marie-line de Solan pour le temps
qu’elle a consacré à me former à la microscopie électronique à balayage.
Un grand merci à Laurence Tellier, pour tout son soutien administratif et qualité. Merci aussi
à Mme Chamayou pour son aide comptable.
Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe Biosym du Laboratoire de Génie Chimique et au
sein du Laboratoire de Microbiologie Industrielle. Je tiens à remercier tous mes collègues
avec qui j’ai partagé mon quotidien.
Tout d’abord les membres de l’équipe Biosym lors des premiers mois de ma thèse : Sandrine,
Claire, Maha, Nancy, Régine, Liz, Hicham, Benjamin, Luc…
Puis tous les employés de la FONDEREPHAR : Cathy, Paméla, Ingrid, Sabine, Haouaria,
Jocelyne, Cédric, Carole, Sylvie, Sandra, Delphine, Leila et Elisabeth.
Enfin, je remercie mes collègues du LabMI pour leur soutien à toute épreuve et leur amitié :
Julien et ses lacs méromictiques, Aurélie et nos nombreuses discussions parfois scientifiques,
Sophie et nos sorties à la danse, Alain pour les rigolades en salle de repos, Audrey, Christel,
Léïla et Pouneh. Merci pour toutes les joies et les déceptions partagées.
Je remercie mes parents, ma famille, mes amis qui m’ont toujours soutenue pendant ces
longues années d’étude. Merci de vous être même intéressés à mon travail !
Pour terminer, merci Rémi ! Pour m’avoir soutenue et encouragée dans mes choix. Pour avoir
lu et relu ce manuscrit. Pour ton amour inconditionnel et ta confiance en moi malgré les
moments difficiles.
Portée par vous tous j’ai pu achever ce travail de thèse. Merci !
3
Sommaire
Sommaire
Introduction générale________________________________________________________ 7
Enjeux et objectifs______________________________________________________________ 8
Présentation du manuscrit _______________________________________________________ 9
Chapitre I :
I.1
Synthèse bibliographique ________________________________________ 11
Pseudomonas aeruginosa et biofilm ________________________________________ 12
I.1.1
Pseudomonas aeruginosa : généralités et enjeux de santé publique ______________________ 12
I.1.2
Le biofilm __________________________________________________________________ 13
I.1.2.1
Définition______________________________________________________________ 13
I.1.2.2
Formation du biofilm_____________________________________________________ 15
I.1.3
I.2
I.1.2.2.1
Facteurs de mobilité et d’adhérence _______________________________________ 17
I.1.2.2.2
Le quorum sensing : facteur de différenciation_______________________________ 18
Autres bactéries et biofilms_____________________________________________________ 21
Les bactéries électroactives _______________________________________________ 22
I.2.1
Définition, découverte et intérêt _________________________________________________ 22
I.2.2
La pile à combustible microbienne _______________________________________________ 23
I.2.3
Les environnements, les bactéries ________________________________________________ 25
I.2.4
Les mécanismes _____________________________________________________________ 29
I.2.4.1
Mécanismes indirects_____________________________________________________ 29
I.2.4.2
Mécanismes directs ______________________________________________________ 30
I.2.4.2.1
Production de médiateurs _______________________________________________ 31
I.2.4.2.2
Pili conducteurs_______________________________________________________ 34
I.2.4.2.3
Contact direct avec des protéines membranaires _____________________________ 35
I.2.4.2.4
Combinaison des trois mécanismes _______________________________________ 37
I.2.5
Les bactéries à Gram positif ____________________________________________________ 38
I.2.6
Biocathodes : la catalyse de la réduction du dioxygène _______________________________ 39
I.3
I.2.6.1.1
Enjeu des biocathodes__________________________________________________ 39
I.2.6.1.2
Biocathodes utilisant le manganèse ou le fer ________________________________ 40
I.2.6.1.3
Biocathodes utilisant directement le biofilm_________________________________ 41
Détection de micro-organismes opportunistes et pathogènes ___________________ 42
I.3.1
Généralités__________________________________________________________________ 42
I.3.2
Méthodes classiques __________________________________________________________ 44
I.3.3
Biocapteurs _________________________________________________________________ 46
4
Sommaire
I.3.3.1
Définition______________________________________________________________ 46
I.3.3.2
Stratégies d’immobilisation ________________________________________________ 46
I.3.3.3
Transduction du signal____________________________________________________ 48
I.3.4
Capteur d’adhésion de bactéries _________________________________________________ 48
Chapitre II :
Matériels et méthodes_________________________________________ 50
II.1
Souches bactériennes ____________________________________________________ 51
II.2
Entretien et protocoles appliqués aux bactéries ______________________________ 54
II.2.1
Conservation, entretien et préparation_____________________________________________ 54
II.2.2
Electrolytes _________________________________________________________________ 54
II.2.3
Dénombrement et caractérisation des bactéries______________________________________ 54
II.2.4
Prétraitements des bactéries ____________________________________________________ 55
II.2.4.1
Fixation et inactivation des bactéries_________________________________________ 55
II.2.4.2
Filtration ______________________________________________________________ 56
II.2.4.3
Lyse __________________________________________________________________ 56
II.2.4.4
Stress oxydant __________________________________________________________ 56
II.3
Matériels et techniques électrochimiques ___________________________________ 56
II.3.1
Electrodes __________________________________________________________________ 56
II.3.2
Potentiostats ________________________________________________________________ 58
II.3.3
Voltammétrie cyclique ________________________________________________________ 58
II.3.4
Chronoampérométrie__________________________________________________________ 59
II.4
Test d’électroactivité des bactéries en voltammétrie cyclique ___________________ 59
II.5
Etudes en chronoampérométrie ___________________________________________ 61
II.5.1
En bécher___________________________________________________________________ 61
II.5.2
En réacteur _________________________________________________________________ 61
II.6
Voltammétrie cyclique sur des molécules immobilisées ________________________ 62
II.7
Microscopie électronique à balayage _______________________________________ 63
Chapitre III :
Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa ____________ 64
III.1
Introduction ___________________________________________________________ 65
III.2
Catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène par P. aeruginosa mesurée par
voltammétrie cyclique__________________________________________________________ 66
III.2.1
Article “Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by Pseudomonas aeruginosa” ____ 66
III.2.2
Résultats complémentaires ___________________________________________________ 84
III.3
Chronoampérométrie ___________________________________________________ 90
5
Sommaire
III.3.1
En réacteur _______________________________________________________________ 90
III.3.2
En bécher ________________________________________________________________ 91
III.4
III.3.2.1
Chronoampérométrie continue _____________________________________________ 92
III.3.2.2
Chronoampérométrie séquentielle ___________________________________________ 93
Conclusion ____________________________________________________________ 94
Chapitre IV :
Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries _________ 96
IV.1
Introduction ___________________________________________________________ 97
IV.2
Bactéries pathogènes ou opportunistes _____________________________________ 97
IV.2.1
Article “Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by a wide range of bacteria including
Gram-positive” _____________________________________________________________________ 98
IV.2.2
Résultats complémentaires __________________________________________________ 109
IV.3
Bactéries environnementales_____________________________________________ 110
IV.4
Conclusion ___________________________________________________________ 116
Chapitre V :
Mécanismes enzymatiques ____________________________________ 118
V.1
Introduction __________________________________________________________ 119
V.2
Activité métabolique ___________________________________________________ 120
V.3
Activité de molécules et d’enzymes directement fixées sur l’électrode ___________ 122
V.4
Conclusion ___________________________________________________________ 125
Conclusion générale et perspectives __________________________________________ 126
Conclusions _________________________________________________________________ 127
Perspectives et applications potentielles __________________________________________ 129
Références bibliographiques ________________________________________________ 132
Annexes_________________________________________________________________ 144
Annexe I : Liste des abréviations________________________________________________ 145
Annexe II : Table des figures ___________________________________________________ 146
Annexe III : Table des tableaux_________________________________________________ 150
Annexe IV : Titre et résumé en anglais___________________________________________ 151
6
Introduction générale
Introduction générale
7
Introduction générale
Enjeux et objectifs
Depuis plusieurs années le biofilm est reconnu comme la forme de développement
majoritaire des bactéries dans la nature. En effet, ce mode de développement confère aux
bactéries de nombreuses protections vis-à-vis des différents stress environnementaux. Il se
trouve que ce mode de croissance est souvent associé à des problèmes de santé publique tels
que la formation de biofilms contenant des bactéries opportunistes dans les réseaux d’eau, sur
les dispositifs médicaux (cathéters, endoscopes…) ou encore les muqueuses du corps humain.
Une fois le biofilm formé il est très difficile de l’éliminer du fait de sa grande résistance aux
agents antibactériens. Un des exemples les plus connus de micro-organismes générant ce type
de biofilms est Pseudomonas aeruginosa.
Cependant, certains biofilms bactériens peuvent avoir des implications plus bénéfiques
en liaison avec des propriétés particulières des cellules adhérées. Nous développerons ici le
cas des biofilms électroactifs. Ces biofilms, découverts assez récemment, sont capables
d’échanger des électrons directement avec des matériaux conducteurs et donc de générer un
courant électrique. Cette propriété intéresse beaucoup les chercheurs dans l’optique de la mise
au point de piles à combustible microbiennes dans lesquelles la production d’électricité par
les micro-organismes électroactifs est souvent couplée au traitement de déchets organiques.
Dans un tel contexte, la compréhension et la maîtrise des mécanismes de transferts d’électrons
entre les biofilms électroactifs et les électrodes a une importance majeure. A l’heure actuelle,
les mécanismes de transfert d’électrons de la bactérie vers l’électrode (réaction anodique) sont
bien décrits alors que les transferts de l’électrode vers la bactérie (réaction cathodique) sont
peu connus. Concernant les applications, cette propriété n’a encore jamais été proposée
comme outil de détection précoce de biofilm.
Les enjeux de notre travail sont doubles. Le premier enjeu est assez fondamental
puisqu’il s’agit de la description d’un nouveau phénomène de transfert d’électrons entre une
électrode et une bactérie lors d’une réaction cathodique : la catalyse de la réduction du
dioxygène. Le deuxième enjeu est quant à lui plus appliqué et consiste à déterminer si cette
nouvelle propriété ne pourrait pas permettre la mise au point d’une méthode de détection de la
phase d’adhésion, première étape du processus de formation de biofilm.
8
Introduction générale
De tels enjeux ont permis de fixer des objectifs à cette étude. Tout d’abord nous avons
décidé de travailler sur une bactérie modèle pour l’adhésion et la formation du biofilm que
nous maîtrisons bien : Pseudomonas aeruginosa. Il était important dans un premier temps de
déterminer si cette bactérie était électroactive ou non. Le deuxième objectif était d’analyser ce
phénomène pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors du transfert électronique
entre la bactérie et une électrode. Enfin, nous avons souhaité élargir l’étude à d’autres
bactéries que P. aeruginosa d’une part pour déterminer la spécificité de cette méthode de
détection et d’autre part pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes mis en
jeu.
Présentation du manuscrit
Ce travail s’organise en 5 chapitres. Le chapitre I est une synthèse bibliographique qui
présente en premier lieu la bactérie Pseudomonas aeruginosa qui a été utilisée comme modèle
dans cette étude, ainsi que la problématique biofilm liée à cette bactérie. Ensuite est présentée
une propriété découverte assez récemment chez certaines bactéries sous forme de biofilms,
leur électroactivité. Une revue bibliographique est faite sur les différentes bactéries possédant
cette propriété ainsi que sur les mécanismes actuellement décrits pour ces transferts
d’électrons. Enfin, dans la dernière partie de cette synthèse sont présentées les différentes
méthodes de détection de micro-organismes pathogènes et de biofilms qui existent à l’heure
actuelle.
Le chapitre II inventorie les différentes souches et traitements étudiés ainsi que les
matériels et méthodes électrochimiques utilisés lors de cette étude.
Dans les chapitres suivants nous exposons les résultats obtenus en les discutant. Le
chapitre III est consacré aux tests effectués sur P. aeruginosa visant à mettre en évidence et à
analyser la catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène par cette bactérie. Le
chapitre IV évalue cette catalyse chez un grand nombre d’autres bactéries. Dans la première
partie de ce chapitre nous analysons cette catalyse chez des souches référencées d’intérêt
9
Introduction générale
médical. La deuxième partie porte sur l’étude d’isolats environnementaux issus de biofilms
électroactifs de rivière. Nous avons terminé ce travail avec le chapitre V qui présente les
résultats obtenus sur des molécules directement immobilisées sur une électrode.
Enfin une conclusion générale permet de résumer les résultats obtenus et de discuter
des perspectives et applications potentielles d’un tel travail.
10
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Chapitre I : Synthèse bibliographique
11
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.1
I.1.1
Pseudomonas aeruginosa et biofilm
Pseudomonas aeruginosa : généralités et enjeux de santé publique
P. aeruginosa, bacille à Gram négatif, aérobie strict et ubiquiste, est un microorganisme privilégié pour l’étude de la dynamique des biofilms. Naturellement, P. aeruginosa
se retrouve dans de nombreux environnements, comme les sols, l’eau ou encore les végétaux.
Ce pathogène opportuniste peut infecter une multitude d’hôtes : nématodes, insectes,
humains, plantes (Rahme et al., 2000). Chez l’homme, P. aeruginosa est la cause majeure
d’infections, notamment nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Ce microorganisme est à l’origine de pneumonies, d’infections des plaies et brûlures ainsi que du
tractus urinaire, et de septicémies.
P. aeruginosa est également la bactérie pathogène prédominante causant des
infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. En effet, d’après les
données du « U.S. Cystic Fibrosis Patient Registry », 58,7% des patients sont colonisés par la
bactérie et cette proportion atteint même 80% chez les patients d’âge adulte. Les infections
par ce pathogène, secondaires à la colonisation, se traduisent par des bronchiectasies
(bronchioles chroniquement dilatées et inflammées) et des hémoptyses progressives (présence
de sang dans le sputum) causant un déclin des facultés respiratoires et un taux de mortalité de
plus de 90 % chez ces patients. En effet, son mode de développement en biofilm dans les
alvéoles pulmonaires des patients le protège des traitements antibiotiques (Brooun et al.,
2000), ainsi que des défenses de l’hôte (Yu et Head, 2002).
La virulence de cette bactérie et les problèmes de santé publique qu’elle occasionne
sont fortement liés à son mode de développement sous forme de biofilm. En effet, une fois le
biofilm formé, les bactéries sont protégées contre les systèmes de défense immunitaires et les
traitements, qu’ils soient physiques ou chimiques : désinfectants, détergents et antibiotiques.
La formation de biofilm, quasi-systématique pour cette bactérie dans un système comportant
une phase aqueuse, est décrite dans le paragraphe suivant.
12
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.1.2
Le biofilm
I.1.2.1
Définition
La définition d’un biofilm a beaucoup évolué depuis sa découverte attribuée à Van
Leeuwenhoek au 17ème siècle. En effet, il aurait observé, pour la première fois, en utilisant son
microscope certes primitif, des micro-organismes adhérés à la surface des dents. Plus
récemment, les travaux de Claude E. Zobell, un des pionniers de la recherche sur les biofilms,
ont grandement contribué à l’élaboration du concept d’attachement bactérien (Zobell et Allen,
1933; Zobell et Allen, 1935). Les chercheurs sont toujours en désaccord sur certains points
mais une définition communément admise est celle de Donlan et Costerton (Donlan et
Costerton, 2002) : « un biofilm est une communauté microbienne sessile caractérisée par des
cellules attachées de manière irréversible à un substrat, une interface ou tout simplement entre
elles, enrobées d’une matrice extracellulaire de substances polymériques (en général
d’exopolysaccharides) qu’elles ont elles-mêmes produites et qui présentent un phénotype
particulier en terme de taux de croissance et de transcription de gènes. »
Les surfaces pouvant servir de support peuvent être de différentes natures : roches,
canalisations plastiques ou métalliques, muqueuses de l’organisme (cas de P. aeruginosa dans
les alvéoles pulmonaires de patients atteints de la mucoviscidose)… Les biofilms se forment
ainsi à l’interface surface/liquide, mais peuvent également être observés à l’interface
air/liquide. Les flocs ou agrégats sont également considérés comme des biofilms.
La structure du biofilm est renforcée par la matrice extra-cellulaire d’exopolymères,
constituée essentiellement d’exopolysaccharides (EPS) : l’alginate
chez P. aeruginosa
(Figure I.1). Cette matrice englobe d’autres molécules de nature organique et inorganique,
jouant également un rôle dans la résistance aux stress environnementaux, par exemple l’ADN
extracellulaire, les protéines et les ramnolipides (Allesen-Holm et al., 2006; Pamp et TolkerNielsen, 2007). Cette matrice représente 85% du volume total et permet au biofilm de
conserver une grande plasticité. Au sein du biofilm, les bactéries sont regroupées en microcolonies séparées par des canaux aqueux. Ce réseau de canaux assure le transport du
dioxygène et des nutriments ainsi que l’évacuation des déchets. Ainsi, les constituants
solubles capables de diffuser à travers la matrice peuvent être utilisés par les bactéries. Un
gradient de nutriments et de dioxygène est observable depuis le sommet du biofilm jusqu’à sa
13
Chapitre I : Synthèse bibliographique
base où règne un micro-environnement anaérobie (de Beer et al., 1994). Cette observation
conforte l’idée selon laquelle l’état métabolique d’une bactérie à l’intérieur d’un biofilm
dépend de sa localisation au sein de la structure (Filloux et Vallet, 2003).
Figure I.1 Formule développée des alginates.
Le mode de développement en biofilm est pour le micro-organisme un moyen de lutter
pour sa survie dans un environnement hostile. En effet, cette organisation présente de
nombreux avantages.
Tout d’abord, et bien évidemment, celui de la protection vis-à-vis de l’environnement.
En effet, comme il a été expliqué plus haut, la population bactérienne est enrobée d’une
matrice composée principalement d’EPS qui fait partie intégrante de l’organisation
structurelle du biofilm. Il a été montré que la matrice d’EPS pouvait physiquement empêcher
l’entrée de certains agents antimicrobiens à l’intérieur du biofilm, en agissant comme un
échangeur d’ions par exemple, et ainsi réduisant la diffusion de composés depuis le milieu
extérieur vers l’intérieur du biofilm (Gilbert et al., 1997; Teitzel et Parsek, 2003). Il a
également été montré que le mode de développement sous forme de biofilm protégeait de
différents stress environnementaux comme les radiations ultra violettes (Espeland et Wetzel,
2001), la présence de métaux lourds (Teitzel et Parsek, 2003), les variations de pH (McNeill
et Hamilton, 2003), les chocs osmotiques et la dessiccation (Le Magrex-Debar et al., 2000), la
phagocytose (Leid et al., 2002) et contre plusieurs antibiotiques et agents antimicrobiens
(Mah et O'Toole, 2001; Stewart et Costerton, 2001; Elasri et Miller, 1999; Ophir et Gutnick,
1994).
Une autre caractéristique peut être celle de la coopération métabolique (Davey et
O'Toole, 2000). En effet, il est très fréquent de trouver différentes espèces au sein d’un même
14
Chapitre I : Synthèse bibliographique
biofilm. Leur proximité facilite les échanges de substrats et l’évacuation ou la distribution de
produits métaboliques. Les biofilms fournissent un environnement idéal pour l’établissement
de relations syntrophiques (symbiose particulière où deux types de bactéries métaboliquement
différents dépendent l’un de l’autre pour utiliser certains substrats).
I.1.2.2
Formation du biofilm
Un modèle de formation du biofilm communément admis chez P. aeruginosa est
présenté dans la figure I.2. Il comporte quatre étapes : l’adhésion dite réversible, l’adhésion
irréversible, la maturation et le détachement.
Pour aboutir à l’étape d’adhésion réversible, la bactérie doit dans un premier temps
approcher le support. Des mécanismes dans lesquels la cellule n’est pas active interviennent :
mouvement brownien, sédimentation et transfert de masse par convection (Yang et al., 1999),
mais aussi des mécanismes où la cellule est active comme le chimiotactisme et la mise en
place d’appendices générateurs de mouvement tels que les flagelles (O'Toole et Kolter, 1998).
Cette approche conduit à un attachement transitoire pendant lequel la bactérie va chercher à «
évaluer » la surface sur laquelle elle se trouve. A ce stade (entre 20 et 50 nm du support),
l’adhésion dite réversible, est due aux forces de Van der Waals, aux forces acide-base de
Lewis et aux forces électrostatiques. Les bactéries peuvent alors être remises en suspension
sous l’effet des mouvements browniens, des forces de cisaillement du flux de liquide ou
encore de la mobilité intrinsèque des cellules (Campanac, 2002).
Dans un deuxième temps, une association stable avec la surface s’établit grâce à des
structures adhésives telles que des adhésines filamenteuses (fimbriae, pili) ou non (EPS,
capsule,…) et à la mise en place de nombreuses liaisons de faible énergie comme les liaisons
hydrogène, hydrophobes et les liaisons ioniques (Palmer et al., 2007).
L’attachement irréversible établi, des micro-colonies vont pouvoir se former. Les
bactéries adhérées vont se multiplier et synthétiser une matrice extracellulaire d’EPS dans
laquelle elles se retrouveront incluses.
15
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Le biofilm va ensuite entrer en phase de maturation. C’est lors de cette étape qu’il va
prendre la forme de « champignon », caractéristique chez P. aeruginosa, et que le réseau de
canaux aqueux va se mettre en place.
Enfin vient l’étape de détachement au cours de laquelle des cellules vont être libérées
sous forme planctonique pour la colonisation de nouvelles surfaces.
Figure I.2. Représentation schématique des différentes étapes de formation d’un biofilm de P.
aeruginosa et visualisation par microscopie à transmission : 1 adhésion réversible, 2 adhésion
irréversible/formation de micro-colonies, 3 et 4 maturation, 5 détachement (Stoodley et al., 2002).
La formation et la vie d’un biofilm font intervenir de nombreux éléments de
régulation. Ces facteurs commencent à être bien caractérisés chez P. aeruginosa et d’autres
bactéries d’intérêt médical. Nous présenterons d’une part les facteurs de mobilité et
d’adhérence, en particulier les pili, qui interviennent durant les premières phases d’adhésion
et d’autre part les facteurs de différenciation tels que le quorum sensing et l’alginate qui
interviennent plutôt lors de la phase de maturation.
16
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.1.2.2.1 Facteurs de mobilité et d’adhérence
O’Toole et Kolter ont pu mettre en évidence certains facteurs de mobilité et
d’adhérence (1998). Ils ont montré qu’un mutant défectueux dans la formation du flagelle
(appendice polaire chez P. aeruginosa constitué essentiellement par la sous-unité FlicC et
permettant à la bactérie de se déplacer en milieu liquide ou semi-solide) n’adhère que très
faiblement au support. Plus récemment il a été montré que des mutants possédant un flagelle
inactif étaient également incapables d’adhérer à une surface (Vallet et al., 2001). Le flagelle
est donc particulièrement important dans l’approche du support.
Les pili de type IV sont des structures fibrillaires présentes au pôle de la bactérie et
permettant des mouvements à l’interface de surfaces solides liés à leur rétraction. O’Toole et
Kolter (1998) ont montré que des mutants défectueux dans la biogenèse des pili de type IV
peuvent former une monocouche cellulaire sur un support mais sont incapables de former les
micro-colonies. De plus, la protéine Crc (catabolite repression protein) de P. aeruginosa, qui
réprime le métabolisme des glucides en présence d’intermédiaires du cycle de Krebs est
nécessaire à la formation du biofilm. La mutation Crc- aboutit, entre autres, à un défaut de
formation des pili de type IV qui peut expliquer l’incapacité à développer un biofilm de ces
mutants (O'Toole et al., 2000). Vallet et al. (2001), ont mis en évidence l’existence de pili de
type fimbriae et leur nécessité dans la phase d’attachement en travaillant sur un mutant
défectueux dans la voie Chaperone Usher Pathway (Cup) qui en permet l’assemblage.
Il a été montré grâce à l’utilisation de puces à ADN que l’expression des gènes codant
pour PilA, la sous-unité structurale des pili de type IV, FlicC et CupA1 diminue en contexte
biofilm (Whiteley et al., 2001). Cela démontre que ces appendices de surface ne sont pas
nécessaires au maintien du biofilm, une fois le développement débuté.
Les lipopolysaccharides (LPS) forment le feuillet externe de l’enveloppe bactérienne
des bactéries à Gram négatif et semblent jouer un rôle particulier dans la formation du
biofilm. P. aeruginosa possède deux types de LPS : LPS de type A et LPS de type B. La
composition en LPS et la variation du niveau de A et de B sont importantes pour
l’attachement sur différents types de surfaces selon qu’elles sont hydrophobes ou hydrophiles
(Makin et Beveridge, 1996). D’après les auteurs, la présence de LPS de type A favoriserait
17
Chapitre I : Synthèse bibliographique
l’adhésion à des surfaces hydrophobes et les LPS de type B l’adhésion à des surfaces
hydrophiles.
I.1.2.2.2 Le quorum sensing : facteur de différenciation
Le quorum sensing (QS) est un mode de communication entre bactéries d’une même
espèce. Ce mécanisme semble fortement impliqué dans la régulation de l’adaptation
écologique et la pathogénicité de P. aeruginosa. Dans ce système dit à deux composants, la
bactérie produit des petites molécules diffusibles qui peuvent être détectées par les bactéries
environnantes. Dans le cas de P. aeruginosa, et la plupart des bactéries à Gram négatif, ces
molécules de signal sont des N-acyl-homosérine lactones (HSL-s). Cela constitue un système
de communication chimique bactérien intercellulaire, dépendant de la densité de population
bactérienne et permettant aux bactéries de coordonner l’expression de certains gènes
spécifiques et donc de contrôler leur réponse globale en fonction de la densité de population.
Chez P. aeruginosa, deux principaux systèmes de QS ont été décrits : le système las et le
système rhl, contrôlant à eux deux la transcription de plusieurs gènes impliqués dans la
formation du biofilm et plus largement dans la virulence.
Le système las, le premier à avoir été décrit (Gambello et Iglewski, 1991), comprend
le gène lasR codant pour la protéine régulatrice LasR et le gène lasI codant pour une enzyme,
auto-inducteur synthase, LasI, nécessaire à la synthèse d’un type d’HSL : N-(3oxododecanoyl)-L-homosérine lactone (3-oxo-C12-HSL). La 3-oxo-C12-HSL possède la
propriété de traverser facilement les membranes bactériennes et constitue ainsi un véritable
moyen de communication entre les bactéries. Lorsque la concentration en 3-oxo-C12-HSL
atteint un seuil critique, témoin d’une concentration bactérienne élevée, elle provoque
l’activation d’un régulateur transcriptionel de type « R » qui va alors déclencher l’expression
de plusieurs gènes cibles (Figure I.3). Beaucoup de ces gènes cibles sont impliqués dans la
virulence de P. aeruginosa. lasI fait également partie de ces cibles permettant une
amplification du signal par auto-induction.
Le deuxième système rhl fonctionne selon le même schéma (Figure I.3) et comprend
le gène rhlR, codant pour la protéine régulatrice RhlR et le gène rhlI, codant pour une enzyme
auto-inducteur synthase, RhlI nécessaire à la synthèse d’un second type d’HSL : N-butyryl-L-
18
Chapitre I : Synthèse bibliographique
homosérine lactone, C4-HSL (Ochsner et al., 1994; Latifi et al., 1995). Le complexe RhlRC4-HSl contrôle l’expression de plusieurs gènes dont rhlI (auto-induction).
Un troisième régulateur existe chez P. aeruginosa, le système QscR (Chugani et al.,
2001). Bien que cette protéine ne soit pas associée à une auto-inducteur synthase, il a été
montré qu’elle pouvait répondre à des signaux HSL, et qu’elle était un régulateur clé d’un
sous-ensemble de gènes contrôlés par le QS (Lequette et al., 2006).
Figure I.3. Mécanisme moléculaire du quorum sensing chez P. aeruginosa (Ruimy et Andremont,
2004).
La figure I.3 présente certains facteurs de virulence contrôlés par le QS chez P.
aeruginosa. Ceux qui nous intéressent ici plus particulièrement sont ceux impliqués dans la
formation du biofilm. Le rôle du QS dans la formation de biofilm à P. aeruginosa n’est pas
encore parfaitement compris (Kirisits et Parsek, 2006). Il est clair que plusieurs facteurs
régulés par le QS interviennent dans la construction du biofilm tels que les EPS,
essentiellemnt l’alginate, et les rhamnolipides nécessaires à la structuration du biofilm mais
également au détachement cellulaire (Davey et al., 2003), la pyoverdine qui est un
19
Chapitre I : Synthèse bibliographique
sidérophore (Banin et al., 2005), l’expression des lectines LecA et LecB (Tielker et al., 2005;
Diggle et al., 2006) ou encore la libération d’ADN qu’on retrouve dans la matrice
extracellulaire (Allesen-Holm et al., 2006). On pourrait donc penser que des mutants de QS
formeraient des biofilms avec de lourds défauts. Plusieurs études corroborent cette hypothèse
(Hentzer et al., 2002; Hentzer et al., 2003; Christensen et al., 2007). Cependant certains
travaux montrent que des mutants de QS produisent des biofilms identiques à ceux des
souches sauvages (Heydorn et al., 2002; Purevdorj et al., 2002). Dans leur revue de 2006,
Kirisits et Parsek considèrent que pour ces études-là, les conditions de culture pour
l’obtention du biofilm n’induisaient pas l’activation du QS. Ils insistent sur le fait que QS et
formation du biofilm sont des processus clairement liés mais que ce lien est très dynamique et
dépend grandement des conditions environnementales. Il a récemment été montré que des
analogues des HSL, en particulier de la C4-HSL, synthétisés chimiquement, pouvaient entrer
en compétition avec les HSL naturelles et perturber le système de QS chez P. aeruginosa
(Khalilzadeh, 2009). De telles molécules entrainent un défaut de formation du biofilm
pendant l’étape de colonisation et de formation des micro-colonies (Khalilzadeh, 2009). Cette
étude confirme l’implication du QS, notamment du système rhl, dans la formation du biofilm
et plus particulièrement au niveau des étapes de formation des micro-colonies.
L’alginate, qui est un EPS produit par P. aeruginosa, est également un facteur de
virulence contrôlé par le QS. Il est connu depuis de nombreuses années que les isolats
pulmonaires de P. aeruginosa sont fortement muqueux. La mucosité est due à la production
d’alginate. Contrairement aux flagelles et aux pili, l’expression de algC est augmentée d’un
facteur quatre en biofilm (Garrett et al., 1999). Il est également intéressant de constater que le
facteur sigma alternatif σ22, ou AlgT, contrôle positivement la production d’alginate alors
qu’il contrôle négativement la synthèse du flagelle (Garrett et al., 1999). Alors qu’une souche
non muqueuse peut former un biofilm d’une épaisseur de 6 µm, une souche muqueuse peut
donner un biofilm ayant une épaisseur moyenne de 40 µm.
La figure I.4 récapitule les différents facteurs génétiques, et secondairement
phénotypiques, intervenant dans la formation du biofilm chez P. aeruginosa.
20
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Cup
Figure I.4. Facteurs génétiques et phénotypiques intervenant lors de la formation du biofilm à P.
aeruginosa (Davey et O'Toole, 2000).
I.1.3
Autres bactéries et biofilms
P. aeruginosa n’est pas la seule bactérie capable de former des biofilms. La plupart des
pathogènes opportunistes et des bactéries en général, sont capables de se développer sous
cette forme et de résister à un grand nombre d’agressions extérieures. Il est maintenant
communément admis que le biofilm est la forme de développement la plus répandue dans
l’environnement pour l’ensemble des micro-organismes. La forme planctonique ne serait
qu’une étape transitoire avant la colonisation de nouvelles surfaces. Voici quelques exemples
de bactéries pathogènes connues et étudiées pour leur formation de biofilm : Staphylococcus
spp. (Gotz, 2002), Escherichia coli (Reisner et al., 2003), Mycobacterium spp. (Hall-Stoodley
et al., 2006), Vibrio cholerae (Watnick et Kolter, 1999), Bacillus spp. (Hamon et al., 2004)…
Les biofilms sont très souvent connus pour leurs aspects néfastes. En premier lieu
viennent les nombreux problèmes de santé publique liés au développement de biofilms de
bactéries opportunistes et/ou pathogènes sur les muqueuses chez l’homme et sur des surfaces
inertes directement en contact avec le sujet (dispositifs médicaux) ou non comme les réseaux
d’eau (Hall-Stoodley et al., 2004). Dans l’industrie agroalimentaire, en plus des problèmes
sanitaires, les problèmes d’encrassement se posent, par exemple celui des réacteurs et des
réseaux d’eau (Carpentier et Cerf, 1993; Lequette et al., 2010). Des biofilms ont également
été mis en cause dans les phénomènes de biocorrosion (Beech et Sunner, 2004) notamment en
milieu marin (plate-formes pétrolières, coques de bateaux, installations portuaires…).
Malgré tout cela, il existe des biofilms que l’on pourrait qualifier de bénéfiques.
Certains biofilms très utiles en détoxification, par exemple dans le cas des boues activées
(Guellil et al., 2001), ou encore ces nombreux biofilms qui permettent de réguler les
21
Chapitre I : Synthèse bibliographique
écosystèmes humains comme les écosystèmes intestinaux et oraux (Isolauri et al., 2004;
Filoche et al., 2010). Un autre exemple est celui des biofilms électroactifs grâce auxquels il
est possible de récupérer de l’énergie électrique à partir de l’énergie à bas coût contenue dans
des matières organiques telles que des sédiments marins ou des mélasses. La partie suivante
de cette synthèse bibliographique décrit l’état des connaissances sur ces biofilms particuliers.
I.2
I.2.1
Les bactéries électroactives
Définition, découverte et intérêt
En 1911, Michael C. Potter obtient pour la première fois une force électromotrice dans
une pile, entre des électrodes plongées dans une culture de bactéries ou de levures et des
électrodes plongées dans un milieu stérile (Potter, 1911). D’après lui, l’énergie électrique
provient de la dégradation de la matière organique par les micro-organismes. Vingt ans plus
tard, Barnett Cohen confirme ces résultats avec la mise au point d’une pile bactérienne
délivrant 35 V pour 0,2 mA (Cohen, 1931). Après ces deux publications, il a fallu attendre les
années 1960 pour que l’idée de génération microbienne d’électricité soit reprise, dans le cadre
d’un programme lancé par la NASA, en tant qu’opportunité de recycler les déchets en énergie
électrique durant les vols spatiaux (Canfield et al., 1963). Cependant, d’autres technologies
comme le photovoltaïque ont évolué beaucoup plus rapidement, ce qui explique la baisse
d’intérêt pour l’énergie électrique microbienne. Une très forte reprise de la recherche sur les
piles à combustible microbiennes a marqué le début des années 2000. Les bactéries
électroactives sont maintenant définies comme des bactéries capables d’échanger des
électrons avec une électrode et ainsi de participer à la génération de courant.
Ce phénomène découvert au début du XXème siècle intéresse à nouveau les
chercheurs pour sa capacité à transformer l’énergie chimique contenue dans un substrat en
énergie électrique. Dans le contexte actuel où les gouvernements, les industriels et les
scientifiques sont à la recherche de nouvelles sources d’énergie, les piles à combustible
microbiennes ont tout à fait leur place. En effet, ces systèmes (voir paragraphe suivant pour
plus de détails) permettent d’extraire du courant à partir d’une grande variété de déchets
organiques grâce à l’activité des biofilms bactériens électroactifs qui se forment à la surface
des électrodes. L’augmentation fulgurante du nombre d’articles consacrés aux piles à
22
Chapitre I : Synthèse bibliographique
combustible microbiennes ces dernières années montre bien l’intérêt croissant des chercheurs
pour ce type de biofilms (Figure I.5). Certes, les puissances récupérées sont encore beaucoup
trop faibles pour la plupart des applications envisagées ; l’enjeu est donc d’augmenter ces
puissances. Pour cela l’analyse des mécanismes mis en jeu au niveau de la cellule a son
importance.
Figure I.5. Nombre de publications concernant les piles à combustible microbiennes en fonction de
l’année de publication (données issues de l’ISI Web of Science).
De manière générale, quel que soit le mécanisme considéré, le principe
d’électroactivité est toujours le même. La bactérie, en absence de son accepteur final
d’électrons naturel utilise pour le remplacer une électrode, participant ainsi à la génération
d’un courant électrique. Par exemple, Geobacter sulfurreducens, qui est une des bactéries les
plus étudiées dans ce domaine, utilise en culture de laboratoire l’acétate comme donneur
d’électrons et le fumarate comme accepteur final d’électrons. Si l’on ne fournit que l’acétate à
la bactérie, elle est capable d’utiliser l’électrode comme accepteur final d’électrons en
remplacement du fumarate (Bond et Lovley, 2003).
I.2.2
La pile à combustible microbienne
Une pile à combustible classique est composée de deux électrodes, une anode et une
cathode, séparées par un électrolyte qui assure entre autres le passage du courant par transfert
23
Chapitre I : Synthèse bibliographique
ionique des charges. Dans un tel système, la génération d’électricité se fait grâce à l’oxydation
sur l’anode d'un combustible réducteur (par exemple le dihydrogène) couplée à la réduction
sur la cathode d'un oxydant, tel que le dioxygène. La réaction d'oxydation du dihydrogène est
accélérée par un catalyseur qui est généralement du platine.
Le principe d’une Pile à Combustible Microbienne (PCM) est tout à fait comparable à
celui d’une pile à combustible classique, à ceci près que la réaction anodique est catalysée par
des micro-organismes électroactifs. Dans le compartiment anodique, le biofilm ayant colonisé
l’anode oxyde un donneur d’électrons. Les électrons issus de cette oxydation sont transférés à
l’anode directement ou indirectement par les bactéries. Ils circulent ensuite dans le circuit
électrique externe jusqu’à la cathode où, couplés à l’arrivée de protons ils donnent lieu à une
réduction, très souvent celle du dioxygène en eau (Figure I.6).
Figure I.6. Principe d’une pile à combustible microbienne (http://pcm-lgc.blogspot.com/).
L’intérêt particulier d’une PCM par rapport à une pile à combustible classique (à
dihydrogène par exemple) réside dans le fait que les micro-organismes qui colonisent l’anode
permettent d’utiliser comme combustible toute sorte de matières organiques : acétate, glucose,
mélasses, mais aussi les déchets organiques contenus dans les eaux de stations d’épuration,
les déchets agricoles (laiteries, lisiers, etc.), les déchets domestiques et tout type de substrats
fermentescibles. Cette technologie permet donc de produire de l’électricité directement par la
dégradation de matière organique. Les PCM ouvrent la voie à l’exploitation de combustibles à
très bas coûts, voire gratuits lorsqu’il s’agit par exemple de la charge organique contenue dans
24
Chapitre I : Synthèse bibliographique
les effluents aqueux domestiques ou industriels. La pile assure alors une double fonction :
produire de l’électricité et intensifier les procédés de traitement d’effluents en accélérant la
dégradation de la matière carbonée.
La figure I.7 donne une idée des densités de puissances atteintes par les PCM. On
remarque très bien une nette évolution de cette puissance du début des années 2000 à nos
jours.
Figure I.7. Densités de puissance de PCM, normalisées par rapport à la surface d’électrode (Logan,
2009). Les données représentées par des cercles proviennent d’études publiées entre 1999 et 2006 par
différents groupes de recherche utilisant du dioxygène à la cathode (Logan et Regan, 2006). Les
triangles représentent des études plus récentes avec des densités de puissance plus élevées, pour
lesquelles la puissance a été normalisée par rapport à la surface de la cathode puisque la puissance est
limitée par la cathode.
I.2.3
Les environnements, les bactéries
La plupart des micro-organismes électroactifs sont issus d’environnements naturels
tels que l’eau de mer, le compost ou les sédiments, ou d’environnements renfermant une flore
microbienne complexe tels que des boues ou des effluents. La figure I.8 illustre la diversité
des environnements utilisés comme sources de micro-organismes électroactifs.
25
Chapitre I : Synthèse bibliographique
effluents
agricoles (1)
effluents
industriels (2)
effluents
domestiques (11)
sédiments (15)
boues activées
(16)
boues anaérobies
(12)
Figure I.8. Environnements utilisés comme sources de micro-organismes électroactifs pour
ensemencer le compartiment anodique des piles à combustible microbiennes. Entre parenthèses est
précisé le nombre de publications mentionnant la source de micro-organismes électroactifs citée. Cette
étude est basée sur un total de 57 publications (Parot, 2007).
Très souvent cette électroactivité est mise en évidence en absence de dioxygène
puisque dans la plupart des PCM les réactions à l’anode se font en totale anaérobiose. Dans le
tableau I.1 est présenté un grand nombre de bactéries électroactives ainsi que leur provenance
et leurs particularités. Les mécanismes de transfert y sont mentionnés lorsqu’ils ont été
étudiés. Ces mécanismes et le cas particulier des bactéries à Gram positif seront décrits plus
en détail dans les pages qui suivent.
Tableau I.1. Liste non exhaustive des micro-organismes dont l’électroactivité a été démontrée et
caractérisation de cette électroactivité.
26
Souche de référence
DSM 10664
Isolat PCM eaux usées
Souche de référence
BBK006
Isolat PCM eaux usées
Souche de référence
DSM 14005
Souche de référence
WV6
Souche de référence
MR 1
Desulfitobacterium
hefniense
Clostridium butyricum
sp. EG3
Bacillus subtilis
Corynebacterium sp.
MFC03
Thermincola
ferriacetica
Clostridium isatidis
Shewanella oneidensis
Souche de référence
K12 HB101
Isolat PCM boue
Brevibacillus sp. PTH1
Escherichia coli
Provenance
Micro-organisme
Pili conducteur
Courant PCM (anode)
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries (quinones)
Contact direct (cytochrome)
Courant PCM (anode)
Courant PCM (anode) + VC
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries (riboflavines)
Le transfert semble direct
Le transfert semble direct
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries
Le transfert semble direct
Utilise des acides humiques comme
médiateurs exogènes
Utilise des médiateurs exogènes produits
par P. aeruginosa (phénazines)
Mécanisme
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode) 7,3 mW/m² pH
9 + VC
Courant PCM (anode) 1,05 mW/cm²
+ VC
Pics en oxydation et en réduction en
VC
Courant PCM (anode) +
Voltammétrie Cyclique (VC)
Courant PCM (anode) 400 mW/m²
Mise en évidence du phénomène
(Qiao et al.,
2008; Zhang et
al., 2008b)
(Gorby et al.,
2006)
(Bretschger et
al., 2007)
(Marsili et al.,
2008; von
Canstein et al.,
2008)
(Compton et al.,
2000)
(Marshall et
May, 2009)
(Liu et al., 2009)
(Nimje et al.,
2009)
(Park et al.,
2001)
(Milliken et
May, 2007)
(Aelterman et
al., 2006; Pham
et al., 2008)
Référence
Chapitre I : Synthèse bibliographique
27
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode) + VC
Isolat PCM boue
Référence ATCC
BAA-621
Référence DSMZ 2032
Isolat sédiment eau
douce
Isolat PCM
Isolat PCM eaux usées
Isolat d’une rivière
acide
Isolat PCM eaux usées
Isolat sédiments forêt
Levure (provenance
non déterminée)
Pseudomonas
aeruginosa
Rhodoferax
ferrireducens
Desulfobulbus
propionicus
Geothrix fermentans
Ochrobactrum anthropi
YZ-1
Acidiphilium sp.
3.2Sup5
Aeromonas hydrophila
Klebsiella pneumoniae
L17
Hansenula anomala
Rhodopseudomonas
palustres
Isolat sédiment marin
Desulfomonas
acetoxidans
Courant PCM (anode) + VC
Catalyse anodique VC
Courant PCM (anode)
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode)
Courant PCM (anode)
Courant PCM (anode)
Courant PCM (anode) + VC
Courant PCM (anode) 0,014 W/m²
Courant PCM (anode)
Souche de référence
ATCC 51573
Geobacter
sulfurreducens
Mise en évidence du phénomène
Provenance
Micro-organisme
Transfert direct par enzymes
membranaires : ferricyanure réductase et
lactate déshydrogénase
Le transfert semble direct
Le transfert semble direct
Le transfert semble direct
Non déterminé
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries
Le transfert semble direct
Le transfert semble direct
Le transfert semble direct
Le transfert est dû à des composés redox
excrétés par les bactéries (phénazines,
pyocyanine)
Non déterminé
Contact direct (cytochrome)
Pili conducteur
Mécanisme
(Prasad et al.,
2007)
(Zhang et al.,
2008a)
(Pham et al.,
2003)
(Malki et al.,
2008)
(Zuo et al.,
2008)
(Xing et al.,
2008)
(Bond et Lovley,
2005)
(Holmes et al.,
2004a)
(Chaudhuri et
Lovley, 2003)
(Rabaey et al.,
2005)
(Bond et al.,
2002)
(Reguera et al.,
2005; Reguera et
al., 2006)
(Holmes et al.,
2006)
Référence
Chapitre I : Synthèse bibliographique
28
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.2.4
Les mécanismes
Les mécanismes de transfert d’électrons de la bactérie vers l’électrode (réaction
anodique) sont de mieux en mieux appréhendés, surtout pour les bactéries à Gram négatif.
Dans ce paragraphe, seuls les mécanismes découverts chez les bactéries à Gram négatif sont
présentés. Le cas particulier des bactéries à Gram positif sera discuté dans le paragraphe I.2.5.
Les mécanismes indirects sont connus depuis plusieurs dizaines d’années. La
découverte des mécanismes directs étant plus récente, ce sujet fait encore débat. Les
paragraphes qui suivent ont pour objectif de présenter ces divers mécanismes et les avancées
scientifiques dans ces domaines.
I.2.4.1
Mécanismes indirects
Depuis plus d’une quinzaine d’années, la production de courant par des microorganismes via des médiateurs exogènes est bien connue. Dans de tels systèmes, le transfert
d’électrons entre la bactérie et l’électrode est facilité par l’ajout de médiateurs solubles
(Figure I.9). La bactérie est capable de réduire un médiateur qui pourra ensuite être ré-oxydé
au contact de l’électrode, phénomène assurant le transfert d’électrons entre la bactérie et
l’électrode, et donc une génération de courant. De nombreux composés ont été testés avec
plusieurs micro-organismes. En voici quelques exemples : le ferricyanure de potassium
(Emde et al., 1989), l’acide 2,6-disulfonique d’anthraquinone, le sepulchrate de cobalt (Emde
et Schink, 1990), la thionine (Kim et al., 2000), le rouge neutre (Park et Zeikus, 2000) et
l’azure A (Choi et al., 2001). L’utilisation de médiateurs reste problématique car beaucoup
d’entre eux sont toxiques et ne peuvent pas être utilisés pour récupérer de l’énergie à partir de
matière organique dans des environnements ouverts.
29
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Donneur
d’électrons
Donneur
d’électrons
oxydé
Electrode
Médiateur
exogène
oxydé
Médiateur
exogène
réduit
Electron
Bactérie
Figure I.9. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons indirect entre une
bactérie et une électrode via des médiateurs exogènes.
I.2.4.2
Mécanismes directs
Ce n’est que depuis le début des années 2000 que le transfert direct d’électrons entre
une électrode et un micro-organisme a été mis en évidence.
En 2001, une équipe américaine a démontré la possibilité de puiser de l’énergie à
l’interface eau/sédiments marins sans ajout de médiateurs exogènes (Reimers et al., 2001). En
effet, si des électrodes de graphite ou de platine sont placées dans les sédiments marins
(anaérobiose, compartiment anodique) et connectées à des électrodes similaires dans l’eau
surnageante (aérobiose, compartiment cathodique), une puissance électrique peut être fournie
(0,01 W/m² d’électrode). Ils avaient ainsi créé un tout nouveau type de PCM. En analysant la
communauté bactérienne attachée à l’anode (dans les sédiments), la même équipe a pu
montrer que ces anodes étaient particulièrement riches en Geobacteraceae (Bond et al.,
2002). Les chercheurs ont ensuite travaillé sur des espèces de Geobacteraceae in vitro. Ils ont
ainsi pu montrer que G. sulfurreducens était capable d’oxyder des donneurs d’électrons
(acétate, dihydrogène) en utilisant l’électrode comme unique accepteur d’électrons et ce sans
aucun ajout de médiateurs exogènes (Bond et Lovley, 2003).
30
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Depuis cette découverte, de nombreuses équipes essayent de trouver de nouveaux
micro-organismes électroactifs et de comprendre les mécanismes cellulaires qui permettent à
ces bactéries d’utiliser, sans ajout de médiateur exogène, une électrode comme accepteur
d’électrons. Plusieurs mécanismes ont pu être mis en évidence : l’utilisation de médiateurs
endogènes, l’utilisation de pili conducteurs ou encore le transfert d’électrons par contact direct
avec des protéines membranaires. Ces différents phénomènes sont décrits par la suite.
I.2.4.2.1 Production de médiateurs
Certaines bactéries sont capables d’utiliser leurs propres médiateurs pour assurer le
transfert d’électrons vers l’électrode. La cellule produit une molécule qu’elle réduit et qui peut
ensuite être oxydée au contact de l’électrode. Cette molécule peut de nouveau être réduite par
la bactérie, assurant ainsi le transport d’électrons entre la cellule et l’électrode (Figure I.10).
Quelques exemples des recherches les plus abouties sur ce sujet sont présentés ici.
Donneur
d’électrons
Donneur
d’électrons
oxydé
Electrode
Médiateur
endogène
oxydé
Médiateur
endogène
réduit
Electron
Bactérie
Figure I.10. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons entre une bactérie et
une électrode via des médiateurs endogènes.
31
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Dans le cas de Shewanella oneidensis, des chercheurs ont montré l’implication de
molécules électroactives d’origine bactérienne, présentes dans le biofilm, dans le transfert
d’électrons entre cette bactérie et une électrode (Marsili et al., 2008; von Canstein et al.,
2008). Il s’agit de riboflavine (Figure I.11) et de riboflavine-5’-phosphate. Enlever ces
molécules du biofilm entraine une réduction du taux de transfert d’électrons de plus de 70%.
Ils ont également démontré qu’il restait une couche de flavines adsorbées à l’électrode même
après avoir enlevé les molécules surnageantes. De plus, parmi les cellules participant à la
génération de courant dans une pile à combustible microbienne à S. oneidensis, un grand
nombre est sous forme planctonique, ce qui confirme l’implication de médiateurs solubles
(Lanthier et al., 2008).
Figure I.11. Formule semi-développée de la molécule de riboflavine.
Le transfert d’électrons entre E. coli et une électrode semble également être dû à la
production de transporteurs d’électrons par la bactérie. En effet, le contact entre les bactéries
et l’électrode n’est pas nécessaire. Une équipe a pu montrer que couvrir l’électrode d’une
membrane avec des pores plus petits que la taille de la bactérie ne changeait pratiquement rien
à l’efficacité de la pile à combustible (Zhang et al., 2008b). Une analyse du filtrat par GC-MS
les a conduits à suspecter trois molécules (Figure I.12). Une deuxième équipe travaillant sur
E. coli soupçonne l’implication de dérivés d’hydroquinone (Qiao et al., 2008). Ils proposent
un mécanisme entièrement couplé au métabolisme de la cellule (Figure I.13).
Figure I.12. Formules semi-développées de trois transporteurs d’électrons suspectés dans une pile à
combustible microbienne à E. coli (Zhang et al., 2008b).
32
Chapitre I : Synthèse bibliographique
A
B
C
Figure I.13. Mécanisme hypothétique de transfert d’électrons entre E. coli et une électrode (Qiao et
al., 2008) (A) et formules semi-développées de la quinone (B) et de l’hydroquinone (C).
Enfin, les mécanismes de transfert d’électrons de P. aeruginosa vers une électrode ont
été largement étudiés. Cette bactérie, dont une souche a été extraite du compartiment
anodique d’une pile à combustible microbienne, est capable d’assurer la production de
courant en utilisant comme médiateurs la pyocyanine (Figure I.14) et des phénazines (Rabaey
et al., 2004). Ces molécules sont des pigments naturellement produits par la bactérie et
impliqués dans la virulence. Des mutants défectueux pour la synthèse de pyocyanine et de
phénazine-1-carboxamide n’atteignent que 5% de la puissance électrique produite par la
souche sauvage. L’ajout de pyocyanine permet de restaurer 50% de cette puissance (Rabaey
et al., 2005).
Figure I.14. Formule semi-développée de la molécule de pyocyanine.
33
Chapitre I : Synthèse bibliographique
D’autres bactéries sont capables d’échanger des électrons avec une électrode via des
médiateurs endogènes (Tableau I.1), mais les molécules responsables du transfert sont mises
en évidence mais rarement caractérisées.
I.2.4.2.2 Pili conducteurs
Un autre mécanisme découvert beaucoup plus récemment est l’utilisation de pili
conducteurs. Certaines bactéries ont leur surface recouverte d’appendices appelés pili
impliqués dans plusieurs processus : mobilité, formation du biofilm, chimiotactisme,
conjugaison… Il a été montré pour certaines bactéries électroactives que ces pili pouvaient
conduire le courant électrique et étaient nécessaires au transfert d’électrons entre les cellules
et les électrodes (Figure I.15). De tels appendices présentent des avantages évidents pour la
bactérie (Gorby et al., 2006). Tout d’abord, celui de faciliter le transfert d’électrons puisqu’il
n’y a plus forcément besoin de contact direct avec la surface de la bactérie ; on peut même
imaginer que ces « nano-fils électriques » permettent d’atteindre des zones inaccessibles à la
cellule elle-même. Enfin, leur implication permet d’augmenter considérablement la surface
active.
Donneur
d’électrons
Donneur
d’électrons
oxydé
Electrode
Pilus conducteur
Electron
Bactérie
Figure I.15. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons direct entre une
bactérie et une électrode via des pili conducteurs.
34
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Deux bactéries très connues dans le monde de l’électroactivité microbienne, que nous
avons déjà mentionnées, disposent de tels « nano-fils ». La première est G. sulfurreducens.
Les espèces de Geobacter sont connues pour être capables de réduire des oxydes de Fe(III)
(Lovley et al., 2004). Ces espèces disposent de pili unilatéraux (Childers et al., 2002) et il a
été proposé que ces pili aidaient à établir un contact entre les oxydes de Fe(III) et la bactérie.
En 2005, l’équipe de Derek Lovley de l’université du Massachusetts a montré qu’un mutant
de G. sulfurreducens défectueux dans la formation de ces pili (pilA-) était tout à fait capable
de fixer les oxydes de Fe(III) mais pas de les réduire (Reguera et al., 2005). Ils ont également
montré que ces pili étaient très conducteurs. Tout ceci indique que les pili de G.
sulfurreducens, outre leur rôle dans la formation du biofilm (Reguera et al., 2007), peuvent
servir de « nano-fils » assurant le transfert d’électrons entre la surface de la bactérie et les
oxydes de Fe(III) (Reguera et al., 2005).
La deuxième bactérie chez laquelle ce mécanisme a été mis en évidence est S.
oneidensis. Cette bactérie possède des appendices semblables à des pili capables de conduire
l’électricité (Gorby et al., 2006). En allant plus loin dans l’étude du mécanisme, les
chercheurs ont pu montrer que les cytochromes MtrC et OmcA, déjà connus pour être
impliqués dans le transfert d’électrons entre la bactérie et une électrode, étaient indispensables
à la production des nano-fils conducteurs. Ces appendices électriquement conducteurs ont été
mis en évidence chez d’autres micro-organismes sans lien direct avec la réduction de métaux,
comme par exemple, chez la cyanobactérie Synechocystis (Gorby et al., 2006). Chez
Pelotomaculum thermopropionicum ils semblent même servir de connections électriques
entre la bactérie et Methanothermobacter thermoautotropicus (Gorby et al., 2006). De telles
découvertes tendent à montrer que les nano-fils ne sont pas spécifiques des bactéries métalloréductrices et qu’ils peuvent participer à des transferts d’électrons de diverses natures tels que
le transfert entre espèces bactériennes.
I.2.4.2.3 Contact direct avec des protéines membranaires
Enfin, le troisième mécanisme implique des protéines membranaires et nécessite un
contact direct entre la surface de la bactérie et l’électrode. Ces protéines sont capables
35
Chapitre I : Synthèse bibliographique
d’assurer de manière directe le transfert d’électrons entre la bactérie et l’électrode (Figure
I.16).
Donneur
d’électrons
Donneur
d’électrons
oxydé
Electrode
Protéine
membranaire
Electron
Bactérie
Figure I.16. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons direct entre une
bactérie et une électrode via des protéines membranaires.
Les protéines les plus souvent mises en cause dans ce transfert par contact sont les
cytochromes. Ces protéines contiennent des groupements prosthétiques (non protéiques)
constitués d’un noyau porphyrine contenant du fer. Les cytochromes s’oxydent et se réduisent
en perdant ou en gagnant un seul électron provenant de l’atome de fer situé dans l’hème. Ces
protéines sont situées dans la membrane cytoplasmique des bactéries et font partie de la
chaîne de respiration. Il existe différentes classes de cytochromes.
Chez G. sulfurreducens, il a été montré que plusieurs cytochromes de type c situés sur
la surface extérieure de la cellule tels que OmcB, OmcS et OmcE, étaient impliqués dans le
transfert d’électrons direct vers une électrode ou des oxydes de fer (Holmes et al., 2006;
Leang et al., 2003). La figure I.17 présente le modèle proposé par Lovley (2008) concernant
ce transfert d’électrons depuis le NADH (issu de l’oxydation de la matière organique) jusqu’à
l’électrode.
36
Chapitre I : Synthèse bibliographique
S. oneidensis présente également également ce type de mécanisme. Il a été montré que
certains cytochromes jouaient un rôle clé dans les procédés de génération de courant et de
réduction d’oxydes métalliques chez cette bactérie (Bretschger et al., 2007).
Figure I.17. Modèle du transfert d’électrons chez Geobacter sulfurreducens depuis le NADH issu de
l’oxydation de matières organiques vers une électrode (Lovley, 2008).
I.2.4.2.4 Combinaison des trois mécanismes
Les trois mécanismes décrits dans les paragraphes précédents sont très certainement
utilisés de façon simultanée au sein d’un biofilm électroactif. Plusieurs faits vont dans le sens
de cette hypothèse. Tout d’abord, pour certaines bactéries, plusieurs mécanismes ont été mis
en évidence. C’est le cas par exemple de G. sulfurreducens (pili conducteurs et cytochromes)
et de Shewanella sp. (pili conducteurs, médiateurs endogènes et cytochromes). Par ailleurs,
les biofilms électroactifs sont souvent des structures assez épaisses composées de plusieurs
genres de bactéries et même parfois de levures, de champignons et d’algues (Parot, 2007).
Dans cette communauté complexe, les différents mécanismes coexistent nécessairement. Les
bactéries en contact direct avec la surface utilisent sans doute des protéines membranaires
telles que les cytochromes, les bactéries un peu plus éloignées utiliseraient les pili
conducteurs et celles en périphérie du biofilm pourraient utiliser des médiateurs solubles
37
Chapitre I : Synthèse bibliographique
(Lovley, 2008). Il a même été montré que certaines bactéries étaient capables d’utiliser des
médiateurs produits par d’autres pour assurer un transfert d’électrons jusqu’à l’électrode
(Pham et al., 2008).
I.2.5
Les bactéries à Gram positif
La grande majorité des bactéries décrites comme électroactives jusqu’à présent sont
des bactéries à Gram négatif. En effet, les bactéries à Gram positif possèdent une paroi
beaucoup plus épaisse formée essentiellement de peptidoglycane et surtout n’ont pas de
membrane externe très riche en protéines. Selon certains chercheurs, cette paroi pourrait
fortement réduire le transfert d’électrons direct entre la bactérie et une électrode. De plus, les
théories actuelles concernant la réduction directe de l’anode supposent une localisation des
systèmes de transport d’électrons sur la membrane externe des bactéries à Gram négatif
(Lovley, 2008). Ainsi, l’absence de telles protéines membranaires chez les bactéries à Gram
positif explique que, jusqu’à présent, les chercheurs pensaient plutôt à un rôle secondaire de
ces bactéries au sein des communautés microbiennes électroactives (Rabaey et al., 2007).
Ceci justifie le peu de travaux effectués sur ce type de bactéries concernant leur potentiel
électroactif. Cependant quelques études montrent la possibilité pour des bactéries à Gram
positif d’échanger, directement ou non, des électrons avec une électrode et de générer du
courant.
Venant appuyer l’idée de Rabaey et al. (2007), deux études montrent la nécessité
d’incuber des micro-organismes à Gram positif avec des médiateurs solubles exogènes pour
obtenir un courant. Desulfitobacterium hafniense est capable de générer du courant dans une
pile à combustible microbienne lorsque sont ajoutés des acides humiques (Milliken et May,
2007). De même, une souche de Brevibacillus peut transférer des électrons à une électrode en
utilisant comme médiateur des phénazines, qui sont des pigments produits par P. aeruginosa,
une bactérie à Gram négatif (Pham et al., 2008).
Cependant plusieurs études montrent une activité directe de bactéries à Gram positif.
Certaines produisent leurs propres médiateurs. Bacillus subtilis a été utilisé dans le
compartiment anodique d’une pile à combustible microbienne pour récupérer 1,05 mW/cm²
d’électrode (Nimje et al., 2009). Le transfert d’électrons a été caractérisé par voltammétrie
38
Chapitre I : Synthèse bibliographique
cyclique et, en comparant les activités du surnageant et des bactéries remises en suspension,
les auteurs ont montré l’implication de médiateurs excrétés par les bactéries. De même, une
souche de Corynebacterium testée sous des conditions alcalines permet d’atteindre des
densités de puissance de 7,3 mW/m² en utilisant des médiateurs endogènes (Liu et al., 2009).
Clostridum butyricum (Park et al., 2001), Clostridium isatidis (Compton et al., 2000) et
Thermincola ferriacetica (Marshall et May, 2009) sont capables d’utiliser directement par
contact une électrode comme accepteur d’électrons.
En conclusion, même si pour l’instant leur nombre est inférieur à celui des bactéries à
Gram négatif, les bactéries à Gram positif sont également capables de catalyser des réactions
d’oxydoréduction au contact d’électrodes. D’ailleurs, l’intérêt des chercheurs pour cette
catégorie de micro-organismes commence sensiblement à augmenter.
I.2.6
Biocathodes : la catalyse de la réduction du dioxygène
I.2.6.1.1 Enjeu des biocathodes
Toutes les études présentées dans les paragraphes précédents portent sur des microorganismes capables de catalyser des réactions anodiques, c’est-à-dire de transférer des
électrons à une électrode. Beaucoup moins nombreux sont les auteurs qui s’intéressent à la
catalyse cathodique. Pourtant, la réaction ayant lieu à la cathode dans une PCM (le plus
souvent la réduction du dioxygène), peut s’avérer limitante. À l’heure actuelle, on utilise
souvent du platine comme catalyseur. La possibilité de mettre au point des biocathodes est
très intéressante en termes de coûts. Avec ce procédé, la réduction ayant lieu à la cathode est
catalysée par des micro-organismes. La PCM devient alors totalement biologique
(compartiments anodique et cathodique). Outre l’avantage du coût plus faible de construction
et d’entretien, les biocathodes peuvent permettre d’améliorer la durabilité de la pile. En effet
les problèmes dus à la sensibilité du platine à toute sorte de pollutions inhibantes ou encore à
la consommation d’éventuels médiateurs d’électrons peuvent être éliminés. Enfin, le
métabolisme microbien au sein des biocathodes peut être utilisé pour produire des molécules
d’intérêt (Lovley, 1991) ou pour éliminer des composés indésirables, comme par exemple
dans la dénitrification.
39
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Quelques études sont consacrées à la mise au point de ces biocathodes et à l’analyse
du transfert d’électrons de l’électrode vers la bactérie. Les biocathodes peuvent être classées
en deux groupes : les biocathodes aérobies et les biocathodes anaérobies. Nous ne parlerons
ici que des premières, puisque c’est bien la réduction du dioxygène qui nous intéresse dans
cette étude. Le dioxygène est l’accepteur final d’électrons le plus utilisé pour la réaction
cathodique dans les PCM, à cause de son potentiel redox élevé (E°O2/H2O = 1,23 V – 0,059 pH
/ESH), de son abondance dans l’air, et de son coût réduit. Différentes stratégies d’utilisation
des bactéries dans les biocathodes ont été imaginées.
I.2.6.1.2 Biocathodes utilisant le manganèse ou le fer
Certaines études utilisent des micro-organismes pour participer à l’oxydation de
composés métalliques transitoires pour transférer les électrons au dioxygène, tels que Mn(II)
ou Fe(II). C’est grâce à ce mécanisme que la première biocathode a vu le jour dans une PCM
complète (Rhoads et al., 2005). Dans cette pile, entièrement biologique, Klebsiella
pneumoniae est utilisée comme catalyseur dans le compartiment anodique et Leptothrix
discophora dans le compartiment cathodique. Les auteurs ont montré qu’en ajoutant le cycle
d’oxydation/réduction du manganèse dans la cathode aérobie, la puissance pouvait être
multipliée par plus de 40. Dans la première étape du cycle, qui est abiotique, MnO2 est réduit
en un hydroxyde MnOOH, en acceptant un électron de la cathode. Cette réaction est suivie
par une réduction supplémentaire de MnOOH en Mn2+ grâce à l’apport d’un deuxième
électron par la cathode. La deuxième étape fait intervenir les MOB (manganese oxidizing
bacteria) comme par exemple Leptothrix discophora, qui oxydent Mn2+ en MnO2 en donnant
deux électrons au dioxygène. Ce mécanisme est résumé dans la figure I.18. La pile
entièrement microbienne ainsi mise au point a permis d’alimenter en électricité un capteur
sans fil implanté dans l’environnement (Shantaram et al., 2005).
40
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Figure I.18. Représentation schématique du dépôt et de la ré-oxydation du manganèse utilisés comme
réaction cathodique (Rhoads et al., 2005).
Les systèmes utilisant le Fe(II) sont relativement similaires, avec un avantage
supplémentaire puisque le fer est 5 à 10 fois plus abondant que le manganèse sur Terre
(Nealson et Saffarini, 1994). Le Fe2+ est oxydé par les bactéries en Fe3+, qui est ensuite réduit
à la cathode. Ce système a été utilisé pour la détoxification des eaux usées en transformant
cette fois-ci de l’énergie électrique en énergie chimique (Lopez-Lopez et al., 1999).
I.2.6.1.3 Biocathodes utilisant directement le biofilm
Un autre système fait intervenir des biofilms électroactifs développés à la surface de la
cathode. Ce principe a été testé particulièrement pour les PCM en milieux marins. Dans ces
milieux ouverts il est pratiquement impossible d’empêcher la formation de biofilm sur la
cathode, puisque celle-ci est exposée dans l’environnement aqueux à une grande diversité de
communautés microbiennes (Holmes et al., 2004b). Au cours d’un projet sur une pile
abiotique en milieu marin, des chercheurs se sont rendus compte que le biofilm développé sur
la cathode augmentait les taux de réduction du dioxygène (Hasvold et al., 1997). Plus
récemment, une PCM en eau de mer formée d’une anode abiotique et d’une cathode
recouverte d’un biofilm a été mise au point (Bergel et al., 2005). Les auteurs ont montré que
la densité de puissance maximale fournie par la pile chutait de 270 mW/m² à 2,8 mW/m²
lorsque le biofilm était enlevé de la cathode. Les auteurs pensent que les micro-organismes au
sein du biofilm sont capables de catalyser la réduction du dioxygène.
41
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Un dispositif similaire avec une anode abiotique et une biocathode aérobie a été mis en
œuvre par K. Rabaey (Rabaey et al., 2008). La biocathode a été ensemencée avec un mélange
d’isolats environnementaux issus d’eaux de rivières. Les chercheurs sont ainsi parvenus à une
densité de puissance de 303 mW/m² de cathode. La communauté microbienne a été analysée
et plusieurs bactéries se sont révélées dominantes : Sphingobacterium, Bacteroides,
Acinetobacter et Acidovorax sp.
Récemment, la formation d’un biofilm anaérobie sur une anode plongée dans du
terreau de jardin a permis d’identifier, contre toute attente, certaines bactéries capables de
catalyser la réduction du dioxygène, comme par exemple Enterobacter spp. (Parot et al.,
2009). Cette activité a été démontrée en voltammétrie cyclique.
La première application de l’électroactivité des bactéries reste la production
d’électricité dans les piles à combustible microbiennes. Cependant, des chercheurs ont
imaginé utiliser des techniques électrochimiques dans les applications en détection de microorganismes. Bien que de nombreux biocapteurs soient basés sur des méthodes
électrochimiques, à l’heure actuelle aucun d’entre eux n’utilise les propriétés électroactives
des bactéries. Les paragraphes qui suivent décrivent les différentes techniques utilisées dans
la détection de micro-organismes pathogènes et présentent les avantages des méthodes
électrochimiques ; y sont également présentés les quelques travaux effectués en électrochimie
concernant la détection de biofilms.
I.3
I.3.1
Détection de micro-organismes opportunistes et pathogènes
Généralités
La détection de micro-organismes pathogènes est un problème majeur depuis plusieurs
dizaines d’années en raison des conséquences graves dans le domaine de la santé publique.
Un groupe de chercheurs a récemment réalisé une étude basée sur plus de 2500 articles
publiés entre 1985 et 2005 dans le domaine de la détection de bactéries pathogènes (Lazcka et
al., 2007). Les résultats de leur étude bibliographique sont présentés dans les figures I.19 et
I.20. Les trois domaines d’application que sont l’industrie alimentaire, le diagnostic clinique
42
Chapitre I : Synthèse bibliographique
et les contrôles qualité de l’eau et de l’environnement représentent à eux seuls plus des deux
tiers des articles consacrés à la détection de pathogènes.
Figure I.19. Distributions par application et par micro-organisme du nombre de travaux concernant la
détection de pathogènes (Lazcka et al., 2007).
La figure I.20 compare les différentes méthodes utilisées, toujours en fonction du
nombre de publications. On peut remarquer que les méthodes classiques telles que la PCR ou
les méthodes par culture et dénombrement sont de loin les plus utilisées. La sélectivité et la
fiabilité des ces méthodes expliquent sans aucun doute leur succès constant. Même si les
méthodes par culture prennent beaucoup plus de temps que la PCR, ces deux techniques
fournissent des résultats exploitables.
Les biocapteurs sont très prometteurs puisqu’ils semblent proposer des résultats tout
aussi fiables mais dans des délais plus courts, ce qui explique le grand intérêt qu’ils suscitent.
Quoi qu’il en soit, il reste encore beaucoup de travail à accomplir avant que les biocapteurs ne
deviennent une réelle alternative. Cependant, l’analyse de la figure I.20 b suggère que la
technologie des biocapteurs est celle qui évolue le plus rapidement ces dernières années. Le
marché potentiel est également très prometteur (Alocilja et Radke, 2003).
43
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Figure I.20. (a) Nombre approximatif d’articles utilisant différentes techniques pour détecter et/ou
identifier des bactéries pathogènes. (b) Evolution du nombre de travaux publiés sur la détection de
bactéries pathogènes de 1985 à 2005 (Lazcka et al., 2007).
I.3.2
Méthodes classiques
La PCR, le dénombrement et l’identification après culture et les tests immunologiques
représentent les outils les plus classiques utilisés pour la détection de pathogènes. Malgré
quelques inconvénients tels que la durée de l’analyse ou encore la complexité de mise en
œuvre, ces méthodes restent intéressantes et il est encore possible de les faire progresser. De
44
Chapitre I : Synthèse bibliographique
plus, ces trois techniques sont souvent utilisées en parallèle pour fournir des résultats par
confrontation.
Le dénombrement après culture est sans aucun doute la technique la plus ancienne et
demeure la méthode standard de détection. Cependant, il faut attendre un à deux jours pour
obtenir des résultats pour la détection de P. aeruginosa par exemple, et cela peut aller jusqu’à
plusieurs jours et même plusieurs semaines pour des bactéries avec des exigences culturales
plus importantes ou des cinétiques de croissance très lentes, comme les espèces de Legionella.
Ce long temps d’analyse représente un inconvénient majeur lorsqu’il s’agit de détecter une
contamination le plus rapidement possible.
La PCR, développée dans le milieu des années 80 (Mullis et al., 1986), est une
méthode basée sur l’isolation, l’amplification et la quantification d’une petite séquence
d’ADN à l’intérieur du matériel génétique de la bactérie à détecter. Cette méthode prend
beaucoup moins de temps (de quelques heures à une journée) et permet par exemple de
rechercher spécifiquement une espèce (PCR classique), d’estimer cette espèce sur le plan
quantitatif (PCR quantitative), ou alors de rechercher plusieurs bactéries à la fois (multiplex
PCR). Une des limitations est que la PCR ne fait pas la distinction entre les bactéries viables
et les bactéries non-viables. La reverse transcriptase PCR (RT-PCR) a été développée pour ne
détecter que les cellules viables et augmenter le seuil de détection (Yaron et Matthews, 2002).
Les méthodes immunologiques de détection de bactéries sont des outils analytiques
très puissants pour un grand nombre de cibles. Le test ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) est la technique la plus aboutie dans ce domaine, et son principe
représente une grande source d’inspiration pour de nombreux biocapteurs. Ce procédé permet
de doser les antigènes (corps considérés comme étrangers par l'organisme) ou les anticorps
grâce à l'utilisation d'un marqueur (molécule dont la détection permet d'identifier ces
éléments) couplé à l’anticorps ou antigène correspondant. Dans la méthode ELISA, ces
marqueurs sont des enzymes. Cette méthode permet de détecter les immunoglobulines
(anticorps) qui sont dirigées contre un virus ou une bactérie. Autrement dit, le test ELISA
permet de savoir si une personne est effectivement affectée par un micro-organisme.
45
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.3.3
Biocapteurs
I.3.3.1
Définition
Une définition communément admise pour les biocapteurs est celle du journal
Biosensors & Bioelectronics (http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home
/405913/description). Les biocapteurs sont des appareils d’analyse comprenant une substance
biologique (tissus, micro-organismes, organelles, récepteurs cellulaires, enzymes, anticorps,
acides nucléiques…), un composé dérivé d’une substance biologique (anticorps recombinants,
aptamères…) ou une substance biomimétique (récepteurs synthétiques, catalyseurs
biomimétiques, ligands, polymères…) qui sont intimement liés ou intégrés dans un
transducteur physico-chimique ou un microsystème de transduction, qui peut être optique,
électrochimique, thermométrique, piézo-électrique, magnétique ou micromécanique. Les
biocapteurs fournissent en général un signal numérique électronique qui est proportionnel à la
concentration de la substance analysée ou au groupe de substances analysées.
I.3.3.2
Stratégies d’immobilisation
Plusieurs stratégies existent pour immobiliser la molécule de reconnaissance sur un
support. Il y a trois classes principales de molécules utilisées dans les biocapteurs : les
enzymes, les anticorps et les acides nucléiques. Cependant, dans la détection de microorganismes, les enzymes sont plus utilisées comme marqueurs (comme dans les tests ELISA)
qu’en tant que molécules de reconnaissance. L’utilisation d’anticorps est beaucoup plus
répandue que celle des sondes à ADN. C’est pourquoi nous ne présenterons ici que les
stratégies utilisant les anticorps. Dans tous les cas, les anticorps sont immobilisés sur un
substrat qui peut être la surface du détecteur lui-même, ses environs ou encore un
transporteur. Pour l’or, qui est le matériau le plus utilisé dans le domaine des biocapteurs,
trois principales méthodes d’immobilisation existent : l’adsorption directe (Tombelli et
Mascini, 2000), le système avidine-biotine (Ouerghi et al., 2002) et le système par
monocouches auto-assemblées (Su et Li, 2004). Le principe de ces trois techniques est
présenté dans la figure I.21.
46
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Figure I.21. Représentation schématique des principales stratégies d’immobilisation et des étapes clé.
Adsorption directe : a1, nettoyage de la surface ; a2, immersion dans la solution d’anticorps ; a3,
lavage ; a4, addition de l’échantillon ; a5, détection. Système avidine-biotine : b1, nettoyage de la
surface ; b2, fixation de l’avidine ; b3, addition d’anticorps biotinylés ; b4, lavage ; b5, addition de
l’échantillon ; b6, détection. Monocouches auto-assemblées : c1, nettoyage de la surface ; c2,
formation de la monocouche auto-assemblée ; c3, activation ; c4, immobilisation des anticorps ; c5,
lavage ; c6, addition de l’échantillon ; c7, détection.
La première méthode est sans aucun doute la plus simple et la plus rapide mais
également la moins fiable du fait qu’elle repose sur l’attachement aléatoire des anticorps sur
le substrat. L’adsorption est non-spécifique et les performances du capteur sont rarement
satisfaisantes (Tombelli et Mascini, 2000). La deuxième méthode est simple et très efficace.
Un des avantages majeurs est le fait que l’attachement, bien que résistant, est non-covalent, ce
qui permet une réutilisation du substrat après lavages. En revanche, les réactifs sont assez
coûteux. La troisième méthode, plus complexe, consiste à immerger la plaque d’or dans une
solution (éthanol) contenant un surfactant (disulfures, thiols…). Après la formation de cette
monocouche, l’anticorps est lié à l’autre extrémité du groupement thiol en utilisant différentes
méthodes chimiques de modification et d’activation pour optimiser l’orientation de l’anticorps
sur le substrat. Cette technique est utilisée dans un grand nombre d’applications (Mansfield et
Forsythe, 2001; Oh et al., 2003; Vaughan et al., 2001).
47
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.3.3.3
Transduction du signal
Nous venons de décrire les mécanismes de reconnaissance basés sur l’utilisation
d’anticorps. Le biocapteur, pour être efficace, nécessite ensuite une technique de transduction
rapide. Les plus connues sont les techniques optiques et les techniques électrochimiques. Les
capteurs optiques sont très populaires du fait de leurs très bonnes sélectivité et sensibilité.
Plusieurs méthodes de détection optique existent : la détection par fluorescence où un
composé fluorescent est couplé à l’anticorps (Li et al., 2004), la détection par Surface
Plasmon Resonance (Cooper, 2003) basée sur la mesure du changement d’indice de réfraction
induit par des altérations structurales d’un film de métal suite aux interactions
anticorps/antigène, ou encore la technique piézoélectrique (O'Sullivan et Guilbault, 1999) qui
repose sur l’observation du changement de fréquence de résonance d’une microbalance à la
suite du changement de masse du support.
Les techniques électrochimiques sont principalement basées sur l’observation de
modifications de courant ou de potentiel dues aux interactions à la surface du support. Les
méthodes ampérométriques, qui sont les plus communes, consistent à fixer le potentiel du
capteur à une valeur pour laquelle le micro-organisme à analyser produit directement ou
indirectement (ajout de médiateur) un courant. Une équipe est arrivée à détecter entre 100 et
600 cellules d’E. coli en 30 min en utilisant une méthode ampérométrique (Abdel-Hamid et
al., 1999). D’autres techniques comme la potentiométrie (Schoning et Poghossian, 2002), la
conductimétrie (Lu et al., 2008; Muhammad-Tahir et Alocilja, 2003) et les méthodes par
mesure d’impédance (Ong et al., 2001) sont également des stratégies intéressantes, mais plus
complexes à mettre en œuvre.
I.3.4
Capteur d’adhésion de bactéries
Devant l’importance des populations microbiennes adhérées ou sous forme biofilm
dans la maîtrise du risque microbiologique, que ce soit au niveau industriel ou hospitalier,
certains chercheurs se sont attachés à mettre en place des capteurs d’adhésion de bactéries.
L’objectif n’est plus de détecter spécifiquement un micro-organisme libre dans une solution
(par exemple du sang, de l’eau…), comme c’était le cas dans les paragraphes précédents, mais
plutôt de détecter une contamination sous forme de biofilm directement dans la zone à
48
Chapitre I : Synthèse bibliographique
contrôler. Une équipe de chercheurs portugais a mis au point une méthode utilisant la
voltammétrie cyclique permettant de détecter une formation de biofilm à P. fluorescens
(Vieira et al., 2003). Ils ont montré que la réponse obtenue en voltammétrie cyclique était
proportionnelle à l’épaisseur du biofilm formé à la surface de l’électrode. En effet, en
présence du biofilm, une diminution du courant est observée à cause de l’encrassement de
l’électrode et donc de la diminution du courant de réduction du dioxygène dû soit à la
diminution de la surface disponible, soit à la limitation du transfert de matière (Vieira et al.,
2003).
La société Neosens développe la sonde Neosens FS-1000 WT qui permet de suivre en
ligne et en continu les phénomènes d’encrassement rencontrés dans tout procédé de traitement
de fluide par calorimétrie. Ce capteur de quelques millimètres a été mis au point au
Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés à Toulouse. Il utilise la
technique du fil chaud et mesure les flux de chaleur. Il se positionne à l’intérieur des
équipements pour fournir une mesure industrielle en continu, en ligne et in situ.
Périodiquement chauffé de façon imperceptible, il renseigne sur l’état d’encrassement de
l’équipement via la mesure de sa température de surface. De manière très simplifiée, plus le
dépôt est important, moins la chaleur générée par le capteur peut diffuser dans le liquide.
L’ensemble de ces résultats est protégé par un brevet français qui a été étendu au niveau
international (Fillaudeau et al., 2006). Un accord de licence exclusif a été signé avec
l’entreprise Neosens pour le développement et l’exploitation commerciale du dispositif.
En conclusion, les biocapteurs, notamment les capteurs électrochimiques, offrent une
alternative très intéressante aux méthodes classiques de détection, en particulier grâce au gain
de temps qu’ils représentent. Certains capteurs sont même directement implantables, par
exemple dans des réseaux d’eau, et permettent la détection de contamination sous forme de
biofilm et plus seulement sous forme planctonique. Cependant, ces derniers sont peu sélectifs
puisqu’ils détectent tout encrassement de l’électrode, qu’il soit biologique ou minéral. Le
travail présenté dans cette thèse pourrait se révéler une alternative ou tout du moins un début
de réponse à ce problème.
49
Chapitre II : Matériels et méthodes
Chapitre II : Matériels et méthodes
50
Chapitre II : Matériels et méthodes
II.1
Souches bactériennes
Les différentes souches testées dans cette étude sont rassemblées dans les tableaux
II.1, II.2 et II.3. Les souches référencées proviennent de l’Institut Pasteur à Paris. Les isolats
cliniques nous ont été fournis par le Laboratoire de Bactériologie et d’Hygiène de l’Institut
Fédératif de Biologie du CHU de Purpan de Toulouse. Les isolats de P. aeruginosa ont été
prélevés chez des patients atteints de mucoviscidose. Ces différentes souches ont été choisies
pour leur phénotype particulier : pigmentation, aspect mucoïde ou non.
Tableau II.1. Souches bactériennes d’intérêt médical utilisées dans cette étude : origine et
particularité.
Bactéries
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Brevundimonas diminuta
Burkholderia cepacia
Branhamella catarrhalis
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Shigella flexneri
Acinetobacter sp.
Kingella kingae
Kingella denitrificans
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Staphylococcus carnosus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Enterococcus faecalis
Enterococcus hirae
Lactobacillus farciminis
Streptococcus mutans
Référence/Origine
PA01
Isolat clinique
CIP 103020
CIP 80.24
CIP 73.21
Isolat clinique
K 12
CIP 82.48
Isolat clinique
CIP 80.16
CIP 103473
Particularité
Génome séquencé
Pathogène opportuniste
Pathogène opportuniste
Pathogène opportuniste
Infection oto-rhino-laryngologique
Pathogène opportuniste
Infection urinaire
Infection intestinale
Pathogène opportuniste
Isolement nasal
Isolement du pharynx
CIP 52.62
CIP 53.45
SJ 149 CIPF
CIP 4.83
CIP 68.21
Isolat clinique
CIP 58.55
CIP 103136
CIP 103220
Contaminant
Pathogène opportuniste
Non pathogène
Isolement lésion cutanée
Pathogène opportuniste
Pathogène opportuniste
Pathogène opportuniste
Espèce anaérobie facultative
Isolement lésion carieuse
51
Chapitre II : Matériels et méthodes
Tableau II.2. Souches de P. aeruginosa utilisées dans cette étude : origines et particularités
phénotypiques.
Nom
PA01
7844 M
7844 S
7645 M
A01
A02
A03
A04
A05
A06
PA14
PA14 Kat APA14 Kat BPA14 Kat EPA14 Kat ABETB
TB PA5349-KO-mutant
Origine
Institut Pasteur (France)
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
isolat clinique
Phénotype
pigmentation verte
mucoïde
révertant non-mucoïde
mucoïde
aucune pigmentation
pigmentation brune
aucune pigmentation
aucune pigmentation
pigmentation bleue
pigmentation brune
Université de Sogang (Corée)
Université de Sogang (Corée)
Université de Sogang (Corée)
Université de Sogang (Corée)
Université de Sogang (Corée)
Catalase +
Catalase -/+
Catalase +
Catalase +
Catalase -
Medizinische Hochschule
Hannover (Allemagne)
Medizinische Hochschule
Hannover (Allemagne)
PAK-NP pilA-/ladZ25
PAK-NP pilA-/IC41
CNRS, Marseille
CNRS, Marseille
PAK-NP pilA-/ladN6
CNRS, Marseille
souche sauvage
pas de rubrédoxine réductase
non piliés et présentant un
retard de colonisation (support
Tygon®) par rapport à la
souche sauvage
Des mutants de P. aeruginosa ont également été testés. Chez P. aeruginosa, il y a trois
gènes monofonctionnels de catalase : katA, katB and katE. Les simples mutants PA14 KatA-,
PA14 KatB-, PA14 KatE-, le triple mutant PA14 KatABE- et la souche sauvage PA14 ont été
fournis par l’Université de Sogang en Corée du Sud (Lee et al., 2005). Des mutants non piliés
de la souche PAK de P. aeruginosa proviennent du Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes
Macromoléculaires du CNRS de Marseille : PAK-NP pilA-/ladZ25, PAK-NP pilA-/IC41,
PAK-NP pilA-/ladN66 (Campanac, 2002). Une souche mutée incapable de produire la
rubrédoxine réductase ainsi que la souche sauvage correspondante proviennent de la
Medizinische Hochschule Hannover en Allemagne (Hagelueken et al., 2007).
Les isolats environnementaux testés sont issus de biofilms épilithiques électroactifs
récupérés sur des électrodes en acier immergées dans la Garonne (Haute-Garonne, France) et
52
Chapitre II : Matériels et méthodes
la Vézère (Dordogne, France) lors d’une étude précédente par Emilie Lyautey du Laboratoire
d’Ecologie Fonctionnelle à Toulouse (UMR 5245 CNRS–UPS–INPT). Les différentes
souches ont été identifiées par séquençage de l’ADN 16S par le même laboratoire. Ces isolats
sont regroupés dans le tableau II.3.
Tableau II.3. Indentification des isolats environnementaux provenant de biofilms épilithiques
électroactifs par séquençage de l’ADN 16S (Emilie Lyautey du Laboratoire d’Ecologie
Fonctionnelle à Toulouse).
Numéro d’accession
GQ398331
GQ398332
GQ398333
GQ398334
GQ398335
GQ398336
GQ398337
GQ398338
GQ398339
GQ398340
GQ398341
GQ398342
GQ398343
GQ398344
GQ398345
GQ398347
GQ398350
GQ398351
GQ398353
GQ398355
GQ398356
GQ398357
GQ398359
GQ398360
GQ398364
GQ398367
GQ398368
GQ398369
GQ398370
GQ398373
GQ398374
GQ398375
Bactérie la plus proche (% de similitude)
Citrobacter gillenii (99.8)
Klebsiella oxytoca (99.0)
Aeromonas sobria (100)
Morganella morganii (99.6)
Aeromonas sharmana (97.4)
Acinetobacter johnsonii (96.2)
Microbacterium oxydans (100)
Sphingomonas molluscorum (98.6)
Moraxella osloensis (99.9)
Arthrobacter aurescens (99.8)
Exiguobacterium acetylicum (99.9)
Myroides odoratus (99.5)
Pseudomonas fluorescens (99.8)
Massilia timonae (99.5)
Rhodococcus equi (100)
Rhizobium radiobacter (99.6)
Variovorax paradoxus (99.6)
Chryseobacterium ureilyticum (99.5)
Flavobacterium johnsoniae (99.0)
Exiguobacterium sibiricum (99.9)
Exiguobacterium undae (99.7)
Novosphingobium aromaticivorans (97.7)
Bacillus cereus (99.9)
Bacillus flexus (100)
Raoultella terrigena (100)
Curtobacterium flaccumfaciens (99.8)
Labedella kawkjii (99.8)
Frigoribacterium faeni (99.5)
Leucobacter luti (98.7)
Pseudomonas putida (100)
Janthinobacterium lividum (99.9)
Zoogloea ramigera (98.7)
53
Chapitre II : Matériels et méthodes
II.2 Entretien et protocoles appliqués aux bactéries
II.2.1 Conservation, entretien et préparation
Toutes les souches ont été conservées à -80°C dans du bouillon Eugon (Biomérieux,
France) additionné de glycérol à 10% (v/v). La majorité des bactéries a été régénérée sur
gélose TS (Biomérieux, France) sous condition aérobie (incubation à 37°C). Seul S. mutans et
les deux souches de Kingella ont été régénérés sur gélose au sang (Milieu Colombia au sang
de mouton stérile, Biomérieux, France). L. farciminis a, quant à lui, été entretenu sur gélose
MRS (AES, France). Avant chaque manipulation les souches ont été mises en culture dans
20mL de milieu liquide TS (Biomérieux, France) sous agitation douce à 37°C pour les
bactéries d’origine humaine et 20°C pour les isolats environnementaux. S. mutans et L.
farciminis ont été mis en culture liquide sans agitation. Après 16 h d’incubation, les
suspensions bactériennes ont été centrifugées (10min, température ambiante, 3000 × g),
lavées deux fois dans l’électrolyte avant d’être re-suspendues dans ce même électrolyte.
II.2.2 Electrolytes
Différents électrolytes ont été utilisés : du tampon phosphate (K2HPO4/KH2PO4, 0.1
mol/L, pH 7), du bouillon TS (Biomérieux, France) et du bouillon biofilm modifié (Tableau
II.4). Ce dernier est un milieu minimum qui a été mis au point au laboratoire pour la culture
spécifique de P. aeruginosa sous forme de biofilm (Khalilzadeh, 2009).
Tableau II.4. Composition du bouillon biofilm modifié.
Composants
MgSO4, 7H2O
FeSO4
Na2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
Glucose
pH (non ajusté)
Concentration
0,2 g/L
0,0005 g/L
1,25 g/L
0,5 g/L
0,1 g/L
0,05 g/L
7,2
II.2.3 Dénombrement et caractérisation des bactéries
54
Chapitre II : Matériels et méthodes
L’évaluation du nombre de bactéries a été faite par mesure de densité optique (DO) à
640 nm et par dénombrement sur boîte de TS gélosé (Biomérieux, France). Dans ce dernier
cas, des dilutions sériées de raison 10 sont réalisées dans l’eau distillée stérile dont 0,1 mL
sont soit inclus dans le milieu gélosé soit étalés sur la gélose.
La caractérisation phénotypique des souches a été effectuée par coloration de Gram.
Les tests catalase et cytochrome c oxydase ont été réalisés avec les tests ID color Catalase et
Oxidase Reagent sur disque (Biomérieux, France). Les résultats de ces tests seront notés par
la suite : catalase + ou catalase - et oxydase + ou oxydase -.
Les productions de pyocyanine et de pyoverdine ont été évaluées sur les milieux
gélosés KingA et KingB (AES, France), après 24h d’incubation à 37°C. La pyocyanine bleuit
le milieu KingA. Une coloration rouge traduit la production de pyorubine. La pyoverdine
rend, quant à elle, le milieu KingB vert-jaune.
II.2.4 Prétraitements des bactéries
Différents tests électrochimiques ont été effectués sur des bactéries pré-traitées afin de
mieux caractériser les implications des cellules et de leur métabolisme dans les phénomènes
observés.
II.2.4.1 Fixation et inactivation des bactéries
Des tests ont été pratiqués sur des cellules mortes de P. aeruginosa PA01. Après une
culture sur la nuit dans du bouillon TS (Biomérieux, Fance), les cellules ont été lavées comme
décrit dans le paragraphe II.2.1 et re-suspendues dans du méthanol 99,5 % (Aldrich, France)
durant 30 min. Les cellules ainsi tuées ont été lavées à nouveau avec du tampon phosphate et
testées en voltammétrie cyclique de la même façon que les cellules vivantes. Dans une autre
expérience, les cellules ont été tuées directement à la surface de l’électrode de travail après un
certain temps de contact entre les bactéries et les électrodes. Dans ce cas, après le temps de
contact, l’électrode de travail a été immergée dans du méthanol pendant 30 min. Un test en
55
Chapitre II : Matériels et méthodes
voltammétrie cyclique a été fait sur cette électrode avec des cellules mortes adhérées à sa
surface.
II.2.4.2 Filtration
Après une heure d’agitation de la suspension bactérienne (bactéries lavées et resuspendues dans 20 mL de tampon phosphate) en concentration contrôlée, 20 mL ont été
filtrés à travers un filtre stérile de porosité 0,45 µm puis à travers un filtre stérile de porosité
0,20 µm (Millipore, Bellirica, USA). Le filtrat a ensuite été testé en voltammétrie cyclique
comme décrit au paragraphe II.4. Ce filtrat a également été testé après traitement pendant 15
min à 90°C pour l’inactivation des enzymes.
II.2.4.3 Lyse
Après deux lavages successifs dans du tampon phosphate, les bactéries ont été resuspendues dans 500µL de lysozyme (Sigma Aldrich, France). Après 10min d’attente à
température ambiante, le même volume de SDS 1% a été rajouté (Sigma Aldrich, France)
lysant ainsi les bactéries. L’activité du lysat a pu ainsi être évaluée en voltammétrie cyclique.
II.2.4.4 Stress oxydant
Après culture pendant la nuit dans du TS liquide, du peroxyde d’hydrogène H2O2
(Sigma Aldrich, France) a été ajoutée dans le milieu de culture avec les bactéries à une
concentration finale de 500 µmol/L (Horsburgh et al., 2001). La suspension bactérienne a
alors été incubée pendant une heure dans ces nouvelles conditions. Les bactéries ont ensuite
été récupérées et lavées comme décrit au paragraphe II.2.1.
II.3 Matériels et techniques électrochimiques
II.3.1 Electrodes
56
Chapitre II : Matériels et méthodes
Le montage utilisé est un montage électrochimique classique à trois électrodes : une
électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode. L’ensemble des
électrodes utilisées dans cette étude est présenté dans la figure II.1.
Deux types d’électrodes de travail ont été utilisés. Les premières sont des barreaux de
carbone vitreux (Carbone vitreux V25, 3 × 150 mm, Carbone Lorraine, Gennevilliers, France)
de 0,07 cm² de section, enrobés dans un cylindre de résine inerte (Epofix, Struers) d’environ 1
cm de diamètre pour garantir que seule la section de 0,07 cm² soit active. Avant leur
utilisation, les électrodes ont été polies mécaniquement (polisseuse ESCIL, ESC 200 GTL)
avec du papier abrasif (LAM-PLAN, France) de grains successifs décroissants (P400, P800,
P1200, P2400, P4000), jusqu’à obtenir une surface polie parfaitement uniforme. La qualité du
polissage a été vérifiée avant chaque expérience en voltammétrie cyclique. Une désinfection à
l’alcool a été effectuée avant chaque expérimentation. Ces électrodes ont surtout été utilisées
lors des expériences de voltammétrie cyclique.
Le deuxième lot d’électrodes de travail utilisé est en acier inoxydable 254 SMO. Les
électrodes sont des plaques de dimension 30 mm × 25 mm × 1mm. Les connexions
électriques ont été réalisées par l’intermédiaire d’une tige de titane (diamètre 2 mm, Alfa
Aesar) filetée et vissée sur l’électrode. Avant leur utilisation, les électrodes ont d’abord été
dégraissées dans une solution 50 : 50 (v/v) d’acétone/éthanol pendant 20 min puis rincées à
l’eau distillée. Elles ont ensuite été traitées pendant une heure sous agitation magnétique dans
un bain contenant 20 % (v/v) d’acide nitrique à 65% et 2% (v/v) d’acide fluorhydrique à 40%.
Pour finir, elles ont été abondamment rincées à l’eau.
Les électrodes de référence utilisées sont des électrodes au calomel saturées (ECS,
Hg/Hg2Cl2/Cl-, Copenhagen, Radiometer). Le potentiel de ces électrodes a été régulièrement
vérifié. Elles ont été conservées dans une solution de KCl saturée. Une désinfection à l’alcool
a été effectuée avant chaque utilisation.
Les contre-électrodes sont en platine. Pour les faibles volumes, en bécher, de simples
fils de platine ont été utilisés. Pour les volumes plus conséquents, en réacteur de 500mL, les
contre-électrodes sont des grilles de platine. Avant toute utilisation, la stérilisation a été
effectuée à la flamme d’un bec Bunsen.
57
Chapitre II : Matériels et méthodes
A
B
C
D
E
Figure II.1. Electrodes utilisées dans cette étude : électrode de carbone vitreux (A), électrode en acier
inoxydable (B), contre-électrodes en platine (C et D) et électrode de référence au calomel saturée (E).
Les électrodes ainsi préparées et désinfectées sont placées sous PSM (Poste de
Sécurité Microbiologique) de classe II pour la réalisation des essais.
II.3.2 Potentiostats
Trois potentiostats différents ont été utilisés pendant l’étude : un potentiostat
monovoie Princeton Applied Research piloté par le logiciel Power Suite, un potentiostat
quatre voies et un multipotentiostat 16 voies (VMP, Bio-logic S.A., France) pilotés par le
logiciel EC-Lab.
II.3.3 Voltammétrie cyclique
La voltammétrie cyclique (VC) consiste à faire varier linéairement le potentiel de
l’électrode de travail au cours du temps en effectuant des allers-retours entre deux valeurs
limites. Pendant ce balayage, le potentiostat mesure le courant résultant des réactions
électrochimiques qui se produisent à la surface de l’électrode de travail. On obtient alors un
voltammogramme cyclique, qui représente la réponse en courant en fonction du potentiel
appliqué (Figure II.2). Par convention, les courants d’oxydation sont notés positivement et les
courants de réduction négativement. Ainsi, l’oxydation d’un composé à la surface de
l’électrode de travail donne un pic sur la partie supérieure du voltammogramme (courant
positif). Par opposition, la réduction d’un composé se manifeste sous la forme d’un pic sur la
58
Chapitre II : Matériels et méthodes
partie inférieure du cycle (courant négatif). Cette méthode permet d’observer des phénomènes
électrochimiques transitoires.
6
Oxydation
4
2
I (µA)
0
-2
-4
Réduction
-6
-8
-10
-12
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/SCE)
Figure II.2. Exemple d’un voltammogramme cyclique illustrant la réduction du dioxygène. Les
flèches marquent le sens du balayage de potentiel effectué à 0,1 V/s.
II.3.4 Chronoampérométrie
La chronoampérométrie (CA) consiste à imposer un potentiel constant à l’électrode de
travail. Le potentiostat mesure au cours du temps le courant résultant des réactions
électrochimiques qui se produisent à la surface de l’électrode de travail. La
chronoampérométrie permet surtout de mettre en évidence des phénomènes lents et durables.
II.4 Test d’électroactivité des bactéries en voltammétrie cyclique
Les tests ont été effectués dans un bécher de 40 mL en utilisant comme électrolyte le
tampon phosphate et comme électrodes de travail les électrodes de carbone vitreux (Figure
II.3). Un premier voltammogramme a été réalisé avec 20 mL de tampon seul. Ce test
permettait de contrôler la qualité de l’état de surface de l’électrode de travail après polissage.
En effet, un polissage imparfait augmente la surface active de l’électrode et fournit donc des
intensités de courant plus importantes contrôlables par voltammétrie cyclique. La
reproductibilité du polissage mécanique a ainsi pu être attestée. Un deuxième test a été
effectué après l’ajout des bactéries préalablement re-suspendues dans du tampon phosphate en
concentration finale contrôlée (108 bactéries/mL sauf indication contraire). Pendant les temps
59
Chapitre II : Matériels et méthodes
d’attente (contact entre les bactéries et l’électrode), la suspension bactérienne a été agitée avec
un agitateur magnétique pour maintenir une concentration constante en dioxygène dissous.
Après ce temps d’attente, un dernier voltammogramme a été effectué pour déterminer l’effet
du temps de contact bactéries/électrodes.
Les mesures en conditions anaérobies ont été effectuées après barbotage de diazote N2
(Aga, France) dans la solution pendant 20 min. Le barbotage de N2 ou l’agitation ont toujours
été arrêtés avant d’effectuer les mesures de voltammétrie cyclique.
Les cycles de voltammétrie ont été réalisés avec différentes vitesses de balayage allant
de 10 à 1000 mV.s-1. La vitesse de 100 mV.s-1 a été choisie comme le meilleur compromis
entre la qualité et l’intensité de la réponse obtenue. Les bornes du cycle ont été choisies de
façon à pouvoir observer la réduction du dioxygène sans être gêné par la réduction et/ou
l’oxydation de l’électrolyte. Ainsi les voltammogrammes ont été réalisés en commençant à
0,1 V/ECS (potentiel de repos de l’électrode de travail), en effectuant trois cycles de 0,7
V/ECS à -1 V/ECS et en terminant au potentiel de départ.
Electrode de travail
Electrode de référence
Contre-électrode
Suspension bactérienne
Figure II.3. Montage à trois électrodes en bécher.
60
Chapitre II : Matériels et méthodes
II.5 Etudes en chronoampérométrie
II.5.1 En bécher
Le même montage que celui décrit au paragraphe précédent a été utilisé (Figure II.3).
Deux types de chronoampérométrie ont été effectués sur les suspensions bactériennes.
Tout d’abord une chronoampérométrie classique, c'est-à-dire une mesure du courant
au cours du temps à potentiel fixé, a été réalisée. Le potentiel choisi était -0,35 V/ECS, valeur
pour laquelle le courant en présence des bactéries après 1 h d’attente est très élevé par rapport
au témoin. La chronoamapérométrie a donc été commencée sur du tampon seul (témoin), puis
poursuivie pendant plusieurs heures après l’ajout des bactéries. Pendant toute la durée de la
mesure, la suspension a été agitée pour maintenir une concentration en dioxygène dissous
constante.
La deuxième méthode était une chronoampérométrie que l’on appellera séquentielle.
Les mesures ont été réalisées durant quelques minutes, cette fois de manière séquentielle,
avant l’ajout de bactéries (témoin), immédiatement après l’ajout des bactéries, et après 1h, 3h,
4h et 5h de contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation. Durant les mesures, le
potentiel a été fixé à -0,35 V/ECS et la suspension bactérienne n’a pas été agitée.
II.5.2 En réacteur
Les électrodes en acier inoxydable (30mm ×25mm ×1mm, 254 SMO) ont été utilisées
comme électrodes de travail. L’électrode de référence est toujours une ECS. La contre
électrode est une grille de platine.
Des réacteurs (spécialement fabriqués par le verrier du Laboratoire de Génie Chimique
pour permettre le montage à trois électrodes) de volume utile 500 mL, préalablement
stérilisés, ont été remplis avec du bouillon biofilm. L’objectif étant d’obtenir un
développement bactérien sur les électrodes, il a fallu fournir aux cellules une source de
carbone, le glucose, dans le bouillon biofilm. Les réacteurs ont ensuite été ensemencés à 107
cellules/mL avec une culture de 16 h en milieu liquide TS (37°C sous agitation) après lavage
61
Chapitre II : Matériels et méthodes
des cellules dans du bouillon biofilm. Les réacteurs ont été placés dans un bain thermostaté à
37°C pendant plusieurs jours sous un PSM. Ces réacteurs ont été alimentés en continu,
pendant toute la durée de l’expérience, avec du bouillon biofilm au débit de 2 mL/min à l’aide
de pompes péristatiques (Campanac, 2002). L’apport de dioxygène et l’agitation ont été faits
par barbotage d’air par un fritté. La figure II.4 fournit une vue globale du montage.
Le courant a été suivi de manière continue en chronoampérométrie tout au long de
l’expérience, le potentiel étant fixé à -0,35 V/ECS. En complément, une série de
voltammétries cycliques a été réalisée chaque jour. Le cycle a été adapté au nouveau milieu
toujours dans l’objectif de minimiser les effets dus à l’oxydation ou à la réduction de
composés présents. Ainsi, le cycle commençait à -0,4 V/ECS, puis suivaient trois boucles de 0
V à -0,8 V/ECS. Enfin, le cycle se terminait à -0,4 V/ECS. Trois vitesses de balayage
différentes ont été testées : 200, 100 et 10mV/s.
Figure II.4. Photographie du montage pour les mesures de chronoampérométrie en réacteur sous
PSM.
II.6 Voltammétrie cyclique sur des molécules immobilisées
La procédure qui suit a été utilisée pour tester en voltammétrie cyclique les molécules
suivantes toutes fournies par Sigma Aldrich : catalase (référence C1345), hémine (référence
51280), porphyrine de fer (2,3,7,8,12,13,17,18-Octaethyl-21H,23H-porphine iron(III)
chloride, référence 257532) et porphyrine de magnésium (2,3,7,8,12,13,17,18-Octaethyl21H,23H-porphine magnesium, référence 257559).
62
Chapitre II : Matériels et méthodes
Un premier voltammogramme a été effectué sur le tampon phosphate seul avec
l’électrode de travail en carbone vitreux non modifiée pour vérifier l’état de surface.
L’électrode de travail a ensuite été immergée dans du DMSO pur (Sigma Aldrich) pendant 15
min puis rincée avec l’électrolyte (tampon phosphate) et l’eau distillée. 2 mg/mL de molécule
ont été dissous dans le DMSO. L’électrode a été immergée dans cette solution pendant 15 min
et ensuite rincée avec l’électrolyte. L’électrode ainsi modifiée a été directement testée en
voltammétrie cyclique comme décrit au paragraphe II.4.
II.7 Microscopie électronique à balayage
Les observations microscopiques ont été effectuées avec l’aide de Marie-Line de
Solan au service analytique du Laboratoire de Génie Chimique avec un microscope
électronique à balayage LEO 435 VP (Carl Zeiss SMT).
Pour pouvoir observer la surface des électrodes de travail et évaluer le recouvrement
par les bactéries, nous avons dû les découper pour disposer de petites surfaces utilisables dans
le microscope. Avant observation, les échantillons ont été fixés dans une solution de
glutaraldéhyde à 2,5% (Sigma Aldrich, France) à 4°C pendant 1 h et déshydratés par
trempage dans des bains successifs d’éthanol de concentrations croissantes (30°, 50°, 80°,
99°) pendant 10 min à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été séchés sous
hotte à flux laminaire et recouverts d’une fine couche d’or pour garantir leur intégrité et leur
conductivité électrique par vaporisation par procédé plasma (sputter coater Scancoat Six SE,
Edwards).
63
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Chapitre III :
Catalyse de la réduction
du dioxygène par P. aeruginosa
64
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
III.1 Introduction
L’objectif à long terme de ce travail était de mettre au point une méthode de détection
rapide de P. aeruginosa directement utilisable dans les réseaux d’eau. Pour cela il était
important de parvenir à détecter la bactérie en présence de dioxygène. Les méthodes
électrochimiques, comme décrit précédemment (§ I.3.3.3), sont des méthodes très
intéressantes du point de vue de leur rapidité. Cette première phase de l’étude consiste donc à
déterminer si P. aeruginosa est détectable par voie électrochimique, et de quelle manière se
fait cette détection. Nous souhaitions également déterminer si des différences existaient
suivant la virulence des bactéries, lors de la production importante d’EPS par exemple.
Comme présenté dans le chapitre I (§ I.2.4.2.1), des souches de P. aeruginosa ont déjà
été identifiées dans les compartiments anodiques de certaines piles à combustible
microbiennes. Des études sur les mécanismes ont montré que les phénazines, pigments
naturellement produits par P. aeruginosa et diffusibles dans le milieu, assuraient le transfert
d’électrons de la bactérie à l’électrode. Mais ces études ont toutes été effectuées en absence de
dioxygène.
Dans ce chapitre nous étudions l’électroactivité de P. aeruginosa en présence de
dioxygène et nous analysons le transfert d’électrons entre l’électrode et la bactérie. Plusieurs
méthodes électrochimiques ont été utilisées. Tout d’abord la voltammétrie cyclique
communément admise comme méthode rapide de détection de l’électroactivité, puis la
chronoampérométrie pour analyser les processus de transfert d’électrons en régime
stationnaire.
Les essais ont essentiellement été réalisés sur la souche PA01. Les souches présentant
des phénotypes particuliers ou mutées ont été évaluées pour mieux cerner le processus mis en
cause. Ces essais ont alors été réalisés dans les conditions standards définies précédemment.
Des tests complémentaires ont été réalisés en modifiant ces conditions pour la souche PA01.
65
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
III.2 Catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène par P. aeruginosa mesurée
par voltammétrie cyclique
III.2.1 Article “Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by Pseudomonas aeruginosa”
Les premières expériences ont eu pour objectif de déterminer si P. aeruginosa pouvait
s’avérer électroactive dans ses conditions normales de métabolisme, c’est-à-dire en présence
de dioxygène. Ces travaux ont donné lieu à la publication « Electrochemical reduction of
oxygen catalized by Pseudomonas aeruginosa » dans le journal Electrochimica Acta. Un
résumé en français de cette étude est présenté avant l’article lui-même. Plusieurs expériences
permettant de compléter la compréhension des mécanismes impliqués sont ajoutées à la suite
de la publication.
Le pic de réduction du dioxygène dissous obtenu en VC qui commence à -0,37 ± 0,01
V/ECS dans du tampon phosphate seul est déplacé en présence de P. aeruginosa après 1h de
contact entre les bactéries et les électrodes. Dans ces nouvelles conditions, la réduction
commence à -0,18 ± 0,01 V/ECS et atteint son maximum à -0,44 ± 0,03 V/ECS avec une
intensité de -11,4 ± 0,4 µA, qui est quatre fois supérieure à l’intensité obtenue dans le tampon
phosphate seul à potentiel égal. P. aeruginosa est donc capable de catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène.
Après avoir montré que P. aeruginosa était capable d’utiliser une électrode en carbone
vitreux comme donneur d’électrons, nous avons essayé de progresser dans la compréhension
du mécanisme. Différents temps de contact (15 s, 15 min, 30 min et 1 h) entre les bactéries et
les électrodes ont été testés, montrant une augmentation de l’amplitude de la catalyse avec le
temps de contact. Dès 15 min, la catalyse est observable mais l’activité devient maximale
après une heure de contact. Nous avons d’abord pensé que ce temps d’attente correspondait au
temps nécessaire aux bactéries pour adhérer à l’électrode de travail. Les observations au
microscope électronique montrent qu’après quelques secondes, un recouvrement de
l’électrode identique à celui observé après une heure est atteint. Ce temps de contact d’une
heure est nécessaire pour que la catalyse ait lieu mais l’intensité de cette dernière n’est pas
corrélée au nombre de bactéries à la surface de l’électrode. Cependant c’est bien ce qui est
adsorbé ou adhéré à la surface de l’électrode qui est responsable de la catalyse puisque le
phénomène persiste après avoir transvasé les électrodes dans du tampon neuf. De plus, le
66
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
filtrat n’a qu’une très faible activité, ce qui montre que les phénazines ou d’autres molécules
médiatrices solubles ne sont pas responsables du phénomène. L’adhésion des bactéries est
bien nécessaire mais pas suffisante.
Puisque la présence des bactéries n’est pas suffisante pour obtenir la catalyse, deux
hypothèses peuvent être émises. La première est que les bactéries sont simplement adsorbées
sur la surface de l’électrode aux temps de contact courts (15 s) et que le transfert d’électrons
nécessite une adhésion active de la part des bactéries (après 1 h). La deuxième est que les
bactéries au contact de l’électrode ont besoin de temps pour produire certains composés
électroactifs.
La première hypothèse est assez difficile à vérifier. Il est en effet difficile de savoir si
l’attachement irréversible des bactéries a été atteint. Cependant plusieurs pistes nous mènent
vers la seconde hypothèse. Tout d’abord, aucune différence n’a été observée en microscopie
entre les bactéries en contact avec l’électrode durant quelques secondes, et celles en contact
durant une heure. Ensuite, l’alginate et les pili qui sont tous deux impliqués dans la phase
d’adhésion irréversible ne semblent pas avoir d’effet sur la catalyse (voir § III.2.2 pour plus
de précisions).
La deuxième hypothèse semble donc plus probable. De plus, plusieurs études ont
démontré l’activité électrochimique de certaines enzymes membranaires contenant un noyau
hémique comme par exemple la catalase. Nous avons donc lancé différents essais afin
d’explorer cette hypothèse. Des mutants de P. aeruginosa PA14 défectueux dans la
production de catalase ont été testés et présentent la même électroactivité que la souche
sauvage. La catalase n’est donc pas indispensable dans ce transfert d’électrons. Mais d’autres
enzymes hémiques sont présentes au niveau de la membrane ou dans l’environnement très
proche de la bactérie et peuvent être suspectées : oxydase, cytochrome, rubrédoxine,
ferrédoxine…
67
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by Pseudomonas aeruginosa
Amandine Courneta,b, Mathieu Bergéa, Christine Roquesa, Alain Bergelb and Marie-Line
Déliab*
a
Université de Toulouse; UPS; LU49, Adhésion bactérienne et formation de biofilms; 35
chemin des Maraîchers, 31 062 Toulouse cedex 09 France
b
Laboratoire de Génie Chimique CNRS UMR5503 ; 4 allée Emile Monso, BP 84234, 31432
Toulouse cedex 04 France
Publication acceptée sous réserve de révisions mineures dans le journal « Electrochimica
Acta »
Abstract
Pseudomonas aeruginosa has already been shown to catalyze oxidation processes in the
anode compartment of a microbial fuel cell. The present study focuses on the reverse capacity
of the bacterium i.e. reduction catalysis. Here we show that P. aeruginosa is able to catalyze
the electrochemical reduction of oxygen. The use of cyclic voltammetry showed that, for a
given range of potential values, the current generated in presence of bacteria could reach up to
four times the current obtained without bacteria. The adhesion of bacteria to the working
electrode was necessary for the catalysis to be observed but was not sufficient. The electron
transfer between the working electrode and the bacteria did not involve mediator metabolites
like phenazines. The transfer was by direct contact. Membrane-bound proteins, like catalase,
may be involved. Various strains of P. aeruginosa, including clinical isolates, were tested and
all of them, even catalase defective mutants, presented the same catalytic property. P.
aeruginosa offers a new model for the analysis of reduction catalysis and the protocol
designed here may provide a basis for developing an interesting tool in the field of bacterial
adhesion.
Keywords:
Oxygen
reduction,
Pseudomonas
aeruginosa,
cyclic
voltammetry,
electrochemically active bacteria.
68
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
1. Introduction
Electroactive bacteria are able to transfer electrons to an electrode and thus produce current
[1]. They have recently generated considerable interest concerning bioelectricity production in
Microbial Fuel Cells (MFCs), in which they offer the possibility of converting chemical
energy from a wide range of organic wastes into electrical energy [2]. Various bacteria have
already been shown to be electroactive [3] and a lot of work is being done to try to decipher
the cellular mechanisms by which such an electron transfer is possible. Many studies are
devoted to oxidation processes that occur in the anode compartment of MFCs in an attempt to
understand how bacteria transfer electrons to electrodes. Three different processes of transfer
have been described. Some bacteria produce electrochemically active mediator metabolites
that serve as electron shuttles between cells and electrodes [4]. Other bacteria have been
shown to transfer electrons directly to electrodes without the implication of metabolites but
through membrane-bound redox compounds such as C-cytochromes [5]. Finally, in some
thick biofilms, involvement of conductive nanowires produced by the cells has been
demonstrated with Shewanella and Geobacter species [6, 7]. These various studies have been
mostly performed for anodic processes.
Microbially-catalyzed reductions also exist [8-10] but have not been so largely studied. The
catalysis of oxygen reduction by microbial biofilms was first identified in the field of
microbial corrosion [11]. Biofilms formed in seawater have been shown to be efficient in
catalyzing the reduction of oxygen on stainless steels and other materials but, for now, the
mechanisms remain a subject of debate. Several hypotheses have been proposed, including
direct catalysis by adsorbed enzymes like catalase [12, 13] or indirect catalysis via the
production of hydrogen peroxide [14] or the production of manganese oxides/hydroxides by
manganese oxidizing bacteria [15]. In recent years, attempts have been made to exploit the
electrocatalytic properties of aerobic seawater biofilms to design biofilm-cathodes in MFCs
[10, 16, 17]. Marine electro-active biofilms are composed of natural microbial consortia, in
which microbial diversity is very large. It is suspected that mechanisms similar to those
identified in corrosion studies may be involved but these mechanisms alone cannot explain
the high current density values that are observed with natural seawater biofilms operating at
controlled potential. .
69
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Several studies have been performed on the electroactivity of Pseudomonas species but all of
them have focused on the ability of these microorganisms to give electrons to electrodes using
their own electron shuttles. In 1996, pyocyanin, a blue pigment produced by several strains of
P. aeruginosa, was studied by adsorptive stripping voltammetry [18]. This work revealed that
pyocyanin had a redox activity of around -0.20 V vs Ag/AgCl. Some work on Pseudomonas
chlororaphis assessed the necessity of phenazine-1-carboxamide (PCN) production for this
strain to keep its ability to reduce Fe(III) [19]. More recently, P. aeruginosa was isolated from
the anodic compartment of an MFC [20]. This bacterium was shown to produce soluble
components called phenazines that served as electron shuttles between the bacteria and the
electrode [4]. P. aeruginosa has already been used to improve electricity generation in the
anodes of MFCs [21] but, to our knowledge, this bacterium has never been shown to catalyze
a cathodic reaction.
Here, we study the ability of P. aeruginosa to use an electrode as an electron donor. P.
aeruginosa is an aerobic bacterium, so its usual electron acceptor is oxygen. For this reason,
we focused on the ability of P. aeruginosa to catalyze the electrochemical reduction of
oxygen. This catalysis cannot be used in cathodic compartments of MFCs since the potential
of the oxygen reduction catalyzed by bacteria is still too low for such an application.
However, a specific experimental protocol was designed to study the reaction using cyclic
voltammetry (CV). This method has already been shown to be efficient for rapid detection of
the electroactivity of bacterial cells [20, 22]. The objectives of the present study were (i) to
see whether P. aeruginosa was able to catalyze the electrochemical reduction of oxygen (ii) to
progress in understanding the mechanisms of the electron transfer, and (iii) to discuss the
potential applications of such a property.
2. Experimental
2.1. Bacterial strains, culture conditions and chemicals
Experiments were performed on the reference strain PA01 of P. aeruginosa. Clinical isolates
from patients with cystic fibrosis obtained from the Hospital Bacteriology and Hygiene
Laboratory in Toulouse (France) were also tested (Table 1). Four P. aeruginosa PA14
catalase mutants were provided by Sogang University, Korea: PA14 KatA-, PA14 KatB-,
PA14 KatE- and PA14 KatABE- [23]. Catalase activity was assessed with the ID color
70
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Catalase test (Biomérieux, France). All the strains were stored at -80°C in Eugon medium
(10% glycerol). They were plated on Trypcase Soy Agar (Biomérieux, France) under aerobic
conditions. Before each experiment, the strains were grown overnight in 20mL Trypcase Soy
Broth (Biomerieux, France) at 37°C under gentle stirring (200 rpm). The bacterial
suspensions were then centrifuged (10 min, room temperature, 3600 × g), washed twice in
phosphate buffer (K2HPO4/KH2PO4, 0.1 M, pH 7), and re-suspended in the same buffer. All
experiments were performed in the same buffer at room temperature.
TABLE 1. Phenotypic characterization of various electroactive strains of P. aeruginosa.
Name
PA01
7844 M
7844 S
7645 M
A01
A02
A03
A04
A05
A06
PA14
PA14 Kat APA14 Kat BPA14 Kat EPA14 Kat ABE-
Origin
Pasteur institute (France)
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
clinical isolates
Sogang University (Korea)
Sogang University (Korea)
Sogang University (Korea)
Sogang University (Korea)
Sogang University (Korea)
Phenotype
green pigmentation
mucoid
non-mucoid revertant
mucoid
no pigmentation
brown pigmentation
no pigmentation
no pigmentation
blue pigmentation
brown pigmentation
Catalase +
Catalase -/+
Catalase +
Catalase +
Catalase -
2.2. Cyclic voltammetry method
Cyclic voltammetry consists in performing a potential scan on a solution while recording the
current obtained. Currents due to oxidation processes are conventionally noted as positive and
those due to reduction as negative. Experiments were monitored by a Princeton Applied
Research potentiostat and the Power Suite software. Working electrodes were 0.07 cm² glassy
carbon rods inserted in an inert resin cylinder of approximately 1 cm diameter. Prior to use,
the rods were polished with abrasive silicon carbide paper and cleaned in distilled water. The
counter-electrode was a platinum wire and a saturated calomel electrode (Radiometer
Analytical) was used as a reference (SCE).
2.3. Protocol conditions
71
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Experiments were conducted in a 40 mL cell. A first voltammogram was run with 20 mL
buffer to check the quality of the working electrode surface. A second was performed
immediately after the addition of bacterial cells (resuspended culture in buffer) at the final
concentration of 108 bacteria/mL. Then the suspension was stirred for 15 min, 30 min or 1 h to
maintain a homogeneous oxygen concentration and the CV scan was performed again.
Measurements under anaerobic conditions were carried out after removing oxygen from the
solution by 20 min of nitrogen bubbling. There was no stirring or gas bubbling during current
recording.
Similar CV experiments were done on the filtrate of P. aeruginosa PA01. After one hour of
stirring, 20 mL of bacterial suspension was filtered through a 0.45 µm sterile filter then
through a 0.20 µm one. The resulting filtrate was tested by CV as described above.
Each experiment was independently performed at least three times.
2.4. Scanning electron microscopy (SEM)
Scanning electron microscopy was used on small pieces of working electrodes to analyze the
coverage of the surface by microorganisms. Prior to observations, the samples were fixed in
2.5% glutaraldehyde at 4°C for 1 h and dehydrated in a graded series of aqueous ethanol
solutions (30, 50, 80 and 99%). Finally, samples were sputtered with gold and examined in a
LEO 435 VP microscope (Carl Zeiss SMT).
3. Results
3.1. Preliminary measurements
Before the measurements, voltammograms of P. aeruginosa PA01 in buffer were analyzed
with different scan rates: 1000, 750, 500, 200, 100, 50, 20 and 10 mV s-1. The shape of the
curves was the same whatever the scan rate, the only differences being the background
signals, the time the measurement lasted, and the intensity of the response. The scan rate of
100 mV s-1 was chosen as the best compromise between quality, intensity and rapidity of the
response obtained. Voltammograms starting at 0.1 V/SCE, continuing with three cycles from
0.7 V/SCE to -1 V/SCE and ending at the initial potential were reproducible and allowed easy
observation of oxygen reduction. In the figures, only the first cycle is shown, to make the
curves clearer.
72
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
3.2. Control voltammograms on phosphate buffer
The voltammograms performed on phosphate buffer under aerobic conditions presented a
reduction wave (Fig 1A, line a). This wave was confirmed to correspond to the
electrochemical reduction of the dissolved oxygen (O2 + 2 H+ + 2e- → H2O2 (1) and H2O2 +
2H+ + 2e- → 2H2O (2)) since it disappeared after oxygen was removed by nitrogen bubbling
(Fig 1A, line c). It has previously been shown that the balance between the two reactions
depends on the nature of the carbon electrode and of its pre-treatment. The balance between
reactions (1) and (2) controls the general shape of the current-potential curve obtained by
voltammetry. Numerical modelling has also indicated that, at high scan rate (as used here in
voltammetry experiments), hydrogen peroxide is almost completely reduced by reaction (2)
before it is able to move far from the electrode surface by diffusion [12]. So, in a first
approach, an overall equation can be used to explain the phenomenon (O2 + 4H+ + 4e- →
2H2O). The voltammogram in phosphate buffer under anaerobic conditions showed neither a
current peak nor a current wave (Fig 1A, line c). The flat curve corresponded to the capacitive
(non-Faradic) current induced by the charging and discharging of the electrochemical double
layer, but no electron exchange (oxidation-reduction phenomenon) took place between the
electrode and dissolved compounds. Under aerobic conditions, oxygen reduction started at
-0.37 ± 0.01 V/SCE, and a steady state current was established from -0.81 ± 0.02 V/SCE due
to mass transfer limitation of oxygen to the electrode surface (diffusion-limited current). The
average values and standard deviations were the result of 7 independent experiments.
Moreover, oxygen bubbling led to an augmentation of the curve amplitude (data not shown).
After one hour of stirring, the voltammogram remained the same (Fig. 1A, line b). Stirring
ensured that the solution was regularly re-oxygenated and led to reproducible
voltammograms.
73
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Fig. 1. Cyclic voltammograms of (A) phosphate buffer alone and (B) P. aeruginosa PA01 in
phosphate buffer (line a), after one hour of gentle stirring (line b) and after 20 minutes of nitrogen
bubbling (line c).
3.3. Electrochemical reduction of oxygen by P. aeruginosa PA01
The voltammogram recorded immediately after the addition of the suspension of P.
aeruginosa PA01 (Fig. 1B, line a) was identical to the first voltammogram performed in
phosphate buffer alone (Fig. 1A, line a). In contrast, after one hour of stirring, a displacement
of the oxygen reduction wave was observed (Fig. 1B, line b). The presence of bacteria clearly
modified the shape of the current-potential curve. In these new conditions, the wave started at
-0.18 ± 0.01 V/SCE, reached its maximum at -0.44 ± 0.03 V/SCE (average values and
standard deviations from 7 independent experiments) and finally returned to the same
diffusion-limited current. For a given value of the potential, the current generated in presence
of P. aeruginosa PA01 after one hour of stirring was higher than immediately after bacteria
addition. It was observed to rise to as much as four times the current obtained without
bacteria: -11.4 ± 0.4 µA (-162 ± 5 µA/cm²) compared to -2.4 ± 0.5 µA (-34 ± 7 µA/cm²) for
the same potential value (7 independent experiments). After one hour of stirring in presence
of bacteria and 20 min of nitrogen bubbling, very weak catalysis was observed (Fig. 1B, line
c), probably due to traces of oxygen remaining in the solution.
Different durations of stirring were tested. As shown in figure 2E (only the part of the
voltammogram that is of interest is shown in order to make the phenomenon more clearly
visible) the amplitude of the oxygen reduction wave increased with the contact duration.
Weak catalysis was observed after 15 min (Fig. 2E, line b) but was maximal after 1h of
contact (Fig. 2E, line d). Beyond one hour (3 h, 6 h, 24 h), the wave amplitude did not
74
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
increase further and it appeared that a steady state had been reached. Scanning microscopy
was used to assess the working electrode surface coverage by bacteria. Observations were
made after 15 s, 15 min, 30 min and 1 h of contact between electrodes and bacteria in
phosphate buffer under gentle stirring (Fig. 2A, B, C and D). There were not more adhered
bacteria after one hour of contact between electrodes and the bacterial suspension than after
15 seconds (Fig. 2A and D). These pictures show that the coverage did not significantly
increase with the contact duration (Fig. 2A, B, C and D). The catalytic effect observed on the
voltammogram was consequently not directly correlated to the bacterial surface coverage.
Fig. 2. Scanning electron micrographs of the working electrode surface after 15 s (A), 15 min (B), 30
min (C) and 1 h (D) of contact with bacteria, magnification 5000, and corresponding cyclic
voltammograms of P. aeruginosa PA01 in phosphate buffer (E) after 15s (line a), 15 min (line b), 30
min (line c), and 1 h (line d) of contact. Beyond 1 hour (3h, 6h and 24h), the wave amplitude does not
increase further.
75
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
3.4. Characterization of the electrochemical activity
Three other tests were performed on P. aeruginosa PA01 to understand the phenomenon
further. The bacterial suspension was stirred for one hour without any contact with the
electrodes. After this delay, when the electrodes were plunged into the suspension, the
voltammogram recorded was identical to the control curves recorded in buffer alone; no
catalytic effect could be observed (data not shown). Thus, a certain time of contact between
microorganisms and electrodes was absolutely necessary. In a second set of experiments, the
bacteria were filtered out of the suspension, and the electrodes were plunged for one hour in
the filtrate under stirring. Voltammograms revealed only a very weak catalytic effect
compared with that of the bacterial suspension (Fig. 3). This demonstrated that a mediator
alone was not responsible for the catalysis and that the presence of bacteria was necessary.
The final test evaluated the activity of the matter adhering to the working electrode. After one
hour of contact with bacteria under stirring, the electrodes were removed from the suspension,
rinsed in distilled water and tested again in 20mL fresh phosphate buffer (Fig. 4). The curve
in the fresh buffer presented the same catalysis of oxygen reduction. Bacteria, proteins or
other molecules they produced, and which became attached to the working electrode surface,
were consequently fully responsible for the catalytic effect.
Fig. 3. Cyclic voltammograms in phosphate buffer (line a), with P. aeruginosa PA01 filtrate (line b)
and P. aeruginosa PA01 filtrate after one hour of stirring (line c). After one hour of stirring, the
bacterial suspension was filtered through a 0.45 µm sterile filter then through a 0.20 µm one. CV scans
were performed on this filtrate (line b and c).
76
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Fig. 4. Cyclic voltammograms of P. aeruginosa PA01 in phosphate buffer (line a), after one hour of
stirring (line b) and after the electrodes were removed and plunged into a fresh phosphate buffer (line
c).
3.5. Electrochemical reduction of oxygen by other strains of P. aeruginosa
All the strains of P. aeruginosa tested in this study by the cyclic voltammetry method (Table
1) presented the same behavior as PA01. The difference between the maximal intensity of the
oxygen reduction peak in presence of PA01 and other strains of P. aeruginosa was lower than
5% (3 independent experiments on each strain). The clinical strains were chosen because of
their different phenotypes so as to assess a possible implication of alginate and pigments in
the catalytic effect. The strain 7844M is mucoid; it produces a lot of alginate. The 7844S is a
non-mucoid revertant obtained after plating 7844M several times. Both presented the same
restriction card and differed only by the production of alginate. These two strains showed
similar positive activity, suggesting that alginate production was not involved in the
electrochemical effect. Four strains of P. aeruginosa were tested because of their differences
in pigmentation: green (pyoverdin), blue (pyocyanin), brown (pyomelanin, pyorubin) and
three with no pigmentation at all. All of them presented the same electrochemical activity.
Finally, no significant electrochemical differences were observed between the PA14 catalasedefective mutants and the wild type strain. The catalase activity of the mutants was tested and
revealed that PA14 KatB- and PA14 KatE- presented a catalase activity similar to the wild
type one, PA14 KatA- presented a weak catalase activity, and the triple mutant PA14
KatABE- no catalase activity at all (Table 1).
4. Discussion
77
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
In the presence of bacteria, the reduction of oxygen started for lower potentials and higher
currents were obtained (Fig. 1). For the first time, P. aeruginosa has been shown to catalyze
the electrochemical reduction of oxygen. Previous studies on P. aeruginosa have been
devoted to anodic processes only, where the bacterial cell transfers electrons to the electrodes.
In the present work, the reverse phenomenon has been demonstrated (Fig. 1B).
A certain time of contact between the bacterial suspension and electrodes is necessary for the
full catalytic effect to be observed (Fig. 1B). A weak effect was detected in the first few
minutes and was complete only after one hour (Fig. 2E). Microscopic images showed that a
few seconds were enough to get a bacterial coverage of the electrode surface similar to that
observed after one hour (Fig. 2A and 2D). Nevertheless, it was necessary to wait for 1 h to
obtain the full catalytic effect even though there were not more bacteria on the electrode
surface after this delay. On the other hand, experiments performed in fresh buffer after
adhesion indicated that bacteria, proteins or other produced molecules adhering to the
electrode surface were responsible for the phenomenon (Fig. 4). Adhesion is necessary but
not sufficient; a prolonged contact time is also required.
The attachment of bacteria to a solid surface implies two steps: reversible and irreversible
attachment [24]. In the first step, the bacteria are transported close enough to the surface,
involving van der Waals forces, electrostatic forces and hydrophobic interactions. The second
stage of adhesion is the locking phase and employs molecularly mediated binding between the
surface and specific adhesins, like exopolysaccharides (biofilm matrix), pili, fimbriae, etc. On
the SEM images, no difference was observed between bacteria adsorbed on the electrode
surface after 15 seconds or after one hour of contact. The 1-hour contact time did not lead to a
visual modification of the adsorption pattern, which would have indicated biofilm
development. Moreover, the tests on mucoid and non-mucoid strains indicated that alginate,
which is the main component of the biofilm matrix formed by P. aeruginosa [25], had no
effect on the catalysis (Table 1). Preliminary work on a P. aeruginosa pilA mutant (deficient
in biogenesis of type IV pili) did not show any difference with respect to the wild type strain
in cyclic voltammetry (data not shown). Like alginate, these pili are crucial for irreversible
attachment and maturation of biofilm [24, 26]. In addition, beyond 1h of contact (3h, 6h or
24h), no increase in the catalysis was observed. All these data suggest that the pure process of
adhesion and biofilm formation is not entirely responsible for the transfer of electrons.
Something more than adhesion is needed.
78
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
A real contact between bacterial cells and the electrode surface was required since, after one
hour of stirring of the bacterial suspension without any contact with the electrode, no catalytic
effect was observed on the voltammogram. So the catalysis does not depend on compounds
that bacteria produce and release into the medium, like phenazines. The negative result on the
filtrate test confirmed this hypothesis (Fig 3). Previous studies that have demonstrated the
involvement of phenazines in anodic processes related to P. aeruginosa showed a strong
activity of the filtrate [4]. Then, whatever the pigmentation of the strain, due to the production
of phenazines [27], detection became possible, even for strains with no pigmentation at all
(Table 1). Phenazines are definitively not involved in the transfer of electrons described here.
Hence, unlike in anodic catalysis, P. aeruginosa does not use released electron shuttles.
Another explanation could be that bacteria do produce electroactive molecules but that they
are bound into the membrane or are diffusible only for a short distance from the bacteria. This
may explain why contact with the electrodes is required during the delay time if the catalytic
effect is to be observed. The weak effect obtained with the filtrate would be explained by a
small release of this compound from the cell membrane to the solution. For instance, type IV
pili produced at the surface of Geobacter sulfurreducens were responsible for the transfer of
electrons [7]. As presented above, P. aeruginosa mutants deficient in type IV pili biogenesis
were able to catalyze the electrochemical reduction of oxygen. These pili were consequently
not involved in the electronic transfer observed here. Several other biological compounds
adsorbed alone on an electrode surface are known to catalyze the electrochemical reduction of
oxygen without any involvement of bacterial cells. The most studied are iron-based proteins:
haeme proteins [28], cytochrome [29], cytochrome c oxidase [30], catalase [12, 31]. Here, we
focused on catalase, which had already been demonstrated to induce the catalysis of
electrochemical reduction of oxygen on glassy carbon electrodes [13]. Catalase is an enzyme
located on the outer membrane of the majority of Gram-negative and on several Grampositive bacteria [32]. It catalyzes hydrogen peroxide dismutation. Catalase adsorbed on
glassy carbon electrodes has been tested with cyclic voltammetry under conditions similar to
those in the work presented here. The voltammograms obtained had the same general shape as
those plotted here with P. aeruginosa. The oxygen reduction wave was displaced and started
around -0.20V/SCE in presence of catalase. We consequently suspected that this protein was
responsible for the phenomenon observed here. In P. aeruginosa, there are three differentially
evolved monofunctional catalase genes, katA, katB, and katE [33]. PA14 KatABE- strain does
not present any catalase activity [23], but this strain is able to catalyze the electrochemical
79
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
reduction of oxygen like the wild type strain, PA14 (Table 1). Therefore catalase is not
entirely responsible for the electrochemical catalysis of oxygen reduction.
The concept of microbial electro-catalysis of oxygen reduction on metallic surfaces was first
identified in the field of microbial corrosion with biofilms formed in fresh seawater. The work
presented here, which was carried out with pure cultures of different P. aeruginosa strains,
opens a new route for investigation. Actually, the different assumptions that have been
evoked to explain the electro-catalysis of oxygen reduction by natural biofilms: production of
hydrogen peroxide, involvement of manganese oxides/hydroxides, direct catalysis by
adsorbed catalase, can no longer explain the electro-catalytic effect observed here with pure
strains. Data obtained in the present work suggest that electro-catalysis is sustained by the
production of a compound that remains linked to the cells or in the cell vicinity, with only
weak release. Catalase cannot be responsible but other small iron-binding proteins, such as
ferredoxin, cytochrome, rubredoxin etc., could play this role. The common denominator
among all these proteins is their active site called porphyrin, and such haeme proteins are
known to catalyze oxygen reduction on metallic cathodes [34]. Involvement of porphyrin
molecules in the catalytic effect observed here would explain the similarity of the effect for all
the P. aeruginosa strains tested. Moreover, recent work devoted to the identification of the
microbial composition of the seawater biofilms that catalyze oxygen reduction has evidenced
the large microbial diversity of these biofilms (Vandecandelaere, personal communication, to
be published). The involvement of such ubiquitous molecules as porphyrins would also
explain the fact that a large number of various species are able to catalyze the electrochemical
reduction of oxygen. The present study will be completed by focusing on possible production
of haeme compounds during the contact period.
In a more technical approach, although the catalysis of oxygen reduction demonstrated here is
not interesting for MFC applications (potential too low), the protocol allows the detection of
the early stages of P. aeruginosa biofilm formation, i.e. the first step of adhesion. All the
tested strains of P. aeruginosa, including clinical isolates, were able to catalyze the
electrochemical reduction of oxygen. This property seems to be universal among P.
aeruginosa strains. The catalytic effect allowed a detection of the bacterial adhesion to the
electrode after a few minutes only (1 hour for the full catalytic effect). The signal obtained
was easily identifiable and highly reproducible. Therefore this property may provide an
opportunity for early detection of bacterial adhesion. Indeed, the majority of the
80
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
electrochemical methods already proposed to detect biofilm colonization have focused on
biofilm growth and can only detect a deposit on the electrode surface, without indication of its
biotic or abiotic character [35, 36]. In contrast, the technique presented here detects the
presence of bacteria on the surface. The method does not only measure surface fouling; it
requires a real interaction between the bacteria and the electrode. Further work is now in
progress to assess whether the cyclic voltammetry protocol highlights a property present in
most aerobic bacteria or a specificity of P. aeruginosa. Preliminary results have shown that
other opportunistic bacteria, like Escherichia coli, Enterobacter cloacae and Shigella sp., are
detectable using the CV method in the same way as P. aeruginosa.
5. Conclusion
It has been demonstrated here that P. aeruginosa is able to catalyze the electrochemical
reduction of oxygen. This phenomenon implies a prolonged contact between bacteria and the
working electrode. The transfer of electrons is not due to electron shuttles released into the
medium by bacteria and phenazines are not involved. Type IV pili are not involved in the
process either. Finally, the activity of membrane-bound redox compounds seems the most
probable explanation because of the similarity of results reported in the literature with
adsorbed proteins. Tests performed on catalase mutants showed that this enzyme was not
necessary for the catalysis described. P. aeruginosa now offers a new, easy-to-handle model
to advance in deciphering the mechanism of microbial electro-catalysis of oxygen reduction.
Moreover, the procedure designed here may become a suitable technique for detecting the
first steps of bacterial adhesion.
Acknowledgments
We are grateful to Sandrine Parot (Laboratoire de Génie Chimique, Toulouse) for her expert
advice and assistance in the cyclic voltammetry method and to Marie-Line de Solan
(Laboratoire de Génie Chimique, Toulouse) for her precious help with SEM. Thanks to YouHee Cho (Sogang University, Korea) for having kindly provided the catalase mutant strains.
We also thank the federative structure FERMAT for its support.
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81
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
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83
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
III.2.2 Résultats complémentaires
Certains résultats concernant la compréhension des mécanismes impliqués ont été
directement présentés dans l’article sans être illustrés. Les pages suivantes les décrivent de
façon plus complète. La figure III.1 démontre l’électroactivité indifférenciée de trois souches
mutées de P. aeruginosa. Ces trois mutants ne possèdent pas de pili et présentent des retards
de colonisation dans la formation du biofilm par rapport à la souche sauvage (Campanac,
2002). Pourtant, les trois souches possèdent la même propriété que la souche sauvage PA01,
de catalyser la réduction électrochimique du dioxygène, dans les mêmes proportions et sans
retard (maximum de détection au bout d’une heure). Ces voltammogrammes montrent donc
que d’une part, les pili de type IV ne sont pas directement impliqués dans le phénomène
observé comme cela a été démontré chez G. sulfurreducens (Reguera et al., 2005), et que
d’autre part, un défaut dans le processus de formation du biofilm (phases postérieures à
l’adhésion) n’a aucune conséquence sur la catalyse.
4
4
A
2
0
0
-2
-2
I (µA)
I (µA)
2
-4
-6
b
-8
-4
-6
-10
-12
-12
-1
-0,8
-0,6
b
-8
a
-10
-14
-1,2
B
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
a
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
E (V/ECS)
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
E (V/ECS)
4
2
C
0
I (µA)
-2
-4
b
-6
a
-8
-10
-12
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure III.1. Etudes en voltammétrie cyclique des mutants non pilié de P. aeruginosa PAK-NP pilA/ladZ25 (A), PAK-NP pilA-/IC41 (B), PAK-NP pilA-/ladN66 (C). Tampon phosphate après ajout des
bactéries (ligne a) et après une heure de contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation
(ligne b).
84
0,8
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Plusieurs manipulations ont été effectuées pour progresser dans la compréhension du
phénomène et des mécanismes impliqués.
Nous avons tout d’abord étudié l’intensité du pic de réduction du dioxygène dissous
(Ipic) catalysé par P. aeruginosa après 1h de contact avec les électrodes en faisant varier la
vitesse de balayage du cycle de voltammétrie. Pour chaque vitesse de balayage, Ipic moyen et
l’écart-type ont été calculés à partir de trois expériences indépendantes. Tracer Ipic en fonction
de la racine carrée de la vitesse de balayage renseigne sur la nature de la réduction. Ici, une
droite est obtenue avec pour coefficient de régression 0,9957 (Figure III.2). Cela signifie que
cette réduction est limitée par la diffusion du réactif, ce qui est tout à fait en accord avec les
observations précédentes. Le pic observé est dû à la catalyse de la réduction du dioxygène
dissous. Il est donc logiquement limité par la diffusion du dioxygène au sein de la suspension
bactérienne jusqu’à l’électrode et/ou les bactéries.
0
-5
-10
Ipic (µA)
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
0
5
10
15
20
0.5
Vitesse de balayage
25
(mV/s)
30
35
0.5
Figure III.2. Intensité du pic de réduction du dioxygène catalysée par P. aeruginosa PA01 en fonction
de la racine carrée de la vitesse de balayage. Valeurs moyennes et écarts-types calculés sur trois
expériences indépendantes. Régression linéaire : R² = 0,9957.
Nous avons ensuite souhaité évaluer l’effet de la concentration en bactéries dans la
suspension bactérienne pendant le temps de contact avec les électrodes. L’objectif était de
déterminer si l’intensité de l’activité électrochimique était corrélée au nombre de bactéries en
suspension. La figure III.3 présente les voltammogrammes cycliques de P. aeruginosa PA01
pour différentes concentrations cellulaires. La concentration en cellules a été évaluée par
mesure de la densité optique (DO) à 640 nm. La corrélation DO / nombre d’unités formant
colonie (UFC) a également été déterminée : nombre d’UFC = 5.108 unités de DO (relation
85
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
établie pour des DO comprises entre 0,05 et 0,8). Afin de mieux analyser ces courbes, pour
chaque concentration, l’évolution de l’intensité du courant a été tracée en fonction du temps et
l’aire comprise entre la courbe témoin (tampon phosphate seul) et la courbe après 1h de
contact entre les bactéries et les électrodes a été calculée. La quantité d’électricité ainsi
déterminée est présentée dans la figure III.4 en fonction de la concentration en bactéries. On
remarque une certaine corrélation : plus il y a de bactéries en suspension plus la quantité de
courant récupérée est importante.
2
témoin
I (µA)
0
-2
DO 0,067
-4
DO 0,1
-6
DO 0,2
-8
DO 0,3
-10
DO 0,5
-12
-14
-1,1
DO 0,8
-1
-0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1
0
0,1
0,2
0,3
E (V/SCE)
Figure III.3. Voltammogrammes cycliques après 1h de contact entre les électrodes et une suspension
de P. aeruginosa à des concentrations différentes évaluées par la densité optique (DO) à 640 nm.
Quantité d'électricité (C)
3,0E-05
2,5E-05
2,0E-05
1,5E-05
1,0E-05
5,0E-06
0,0E+00
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
DO
Figure III.4. Représentation graphique de la quantité d’électricité (aire sous la courbe de la catalyse
de la réduction du dioxygène) en fonction de la concentration en bactéries évaluée par la densité
optique (DO) à 640 nm. Régression linéaire : R² = 0,9327.
86
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Il a également été vérifié que les bactéries étaient toujours vivantes après 1h de contact
avec les électrodes dans le tampon phosphate. En effet, l’activité aurait pu être due à une lyse
cellulaire qui relarguerait des molécules électroactives dans le milieu. Cette hypothèse a été
évaluée par dénombrement sur boîte de TS. Aucune mort cellulaire significative de PA01
n’est observée après 1h, 3h et 6h passées dans le tampon. Pour compléter cette mesure,
l’activité d’un lysat de P. aeruginosa a été testée (lyse avec du lysozyme et du SDS). La
figure III.5 montre qu’après 1h d’attente on observe une activité d’amplitude inférieure à celle
observée sur des cellules vivantes de PA01. Cette observation n’a pas permis de conclure
quant à la réelle activité du lysat puisqu’il restait des cellules vivantes dans la suspension
(contrôle sur milieu TS gélosé). Cependant, après filtration de cette solution aucune activité
n’a été observée.
4
2
0
I (µA)
-2
-4
-6
c
b
-8
-10
a
-12
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure III.5. Voltammogramme cyclique sur du tampon phosphate seul (ligne a), après ajout du lysat
de P. aeruginosa PA01 (ligne b), et après une heure de contact entre le lysat et les électrodes sous
agitation (ligne c).
L’expérience faite sur le filtrat de P. aeruginosa PA01 dans l’article précédent (§
III.2.1) montre que ce dernier a une faible activité. Dans l’article nous suggérons que ce
phénomène pourrait être dû à l’activité de certaines enzymes et qu’un faible relarguage dans
le milieu expliquerait l’activité résiduelle du filtrat. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons
testé en voltammétrie cyclique ce même filtrat après traitement à 90°C pendant 15min.
Aucune activité électrochimique n’a été obtenue (Figure III.6). Ceci corrobore l’hypothèse
d’une activité enzymatique.
87
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
4
2
0
I (µA)
-2
-4
a
-6
b
-8
-10
c
-12
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure III.6. Voltammogramme cyclique sur du tampon phosphate seul (ligne a), sur du filtrat de P.
aeruginosa PA01 inactivé (ligne b), et après une heure de contact entre ce filtrat et les électrodes sous
agitation (ligne c).
Toujours en VC, des tests ont été faits sur des cellules de P. aeruginosa PA01
prélevées durant différentes phases de la culture : phase exponentielle et phase stationnaire.
L’objectif était de déterminer si cela avait un impact sur l’électroactivité de la souche. Aucune
différence n’a été observée, indiquant que pour cette bactérie, l’état physiologique dans lequel
se trouvent les cellules au moment de la mise en suspension n’a apparemment pas d’effet sur
la catalyse de la réduction du dioxygène.
Des mesures de VC ont été faites en utilisant d’autres électrolytes que le tampon
phosphate. Dans du milieu liquide TS, aucune catalyse n’apparaît sur les voltammogrammes,
même après une heure de contact entre les bactéries et l’électrode. De plus, les deuxième et
troisième courbes ne correspondent pas à la première, les courants de réduction du dioxygène
sont plus faibles (Figure III.7). Le milieu TS est un milieu riche dans lequel les bactéries
continuent leur croissance. Donc, après l’ajout des bactéries, la composition du milieu change
et les courbes ne sont plus reproductibles. Une autre explication possible peut être que le
milieu s’adsorbe progressivement sur l’électrode et gêne le transfert d’électrons. De plus, le
milieu TS est un milieu qui ne favorise pas l’adhésion et le développemt de biofilm mais
plutôt la croissance sous forme planctonique (Khalilzadeh, 2009). Cela pourrait expliquer
l’absence de catalyse dans ce milieu. Le bouillon biofilm est un milieu minimum qui favorise
le développement sous forme de biofilm. Lorsque ce milieu est utilisé comme électrolyte en
VC, la catalyse est faiblement détectable ; mais les résultats se sont avérés peu reproductibles,
peut-être à cause de la composition du milieu (voir § II.2.2).
88
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
4
2
0
I (µA)
-2
-4
b
c
-6
-8
a
-10
-12
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
E (V/ECS)
Figure III.7. Voltammogrammes cycliques sur du milieu liquide TS seul (ligne a), après ajout de P.
aeruginosa PA01 (ligne b), et après une heure de contact entre les bactéries et les électrodes (ligne c).
Comme expliqué dans l’article, nous suspectons l’activité d’enzymes membranaires.
Dans cette optique, l’effet de la rubrédoxine réductase a été testé. Ce système a été largement
décrit chez P. aeruginosa et est indispensable pour l’oxydation des n-alcanes (Hagelueken et
al., 2007). Dans ce complexe, la rubrédoxine sert de transporteur d’électrons entre la
rubrédoxine réductase et l’alcane hydroxylase. Les rubrédoxines jouent aussi un rôle
important dans la réponse au stress oxydatif chez les micro-organismes anaérobies ou
microaérophiles puisqu’elles sont capables de réduire le dioxygène et la plupart des espèces
réactives de l’oxygène (Fareleira et al., 2003). Les rubrédoxines sont de petites protéines
diffusibles (≈6kDa) comprenant un site actif redox composé de quatre cystéines avec un
atome de fer central. Ce système, et notamment la rubrédoxine, a été étudié pour son transfert
d’électrons avec une électrode (dos Santos et al., 2003). Le complexe rubrédoxinerubrédoxine réductase pourrait assurer le transfert d’électrons entre la membrane de la
bactérie et la surface de l’électrode. La souche de P. aeruginosa dont le gène codant pour la
rubrédoxine réductase a été délété présente la même capacité à catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène que la souche sauvage (Figure III.8). Cette enzyme ne semble
donc pas directement impliquée dans le phénomène décrit dans cette étude. Cependant, pour
compléter ces résultats, il serait intéressant de tester un mutant pour la rubrédoxine, qui est la
petite molécule qui assure le transfert d’électrons dans ce système.
89
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
4
4
2
A
0
0
-2
-2
-4
I (µA)
I (µA)
2
b
-6
-4
-8
-10
-10
-14
a
-16
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
c
-12
c
-14
b
-6
-8
-12
B
0
E (V/ECS)
0,2
0,4
0,6
0,8
-16
-1,2
a
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure III.8. Etudes en voltammétrie cyclique de la souche sauvage TBwt (A) et de la souche mutée
qui ne produit pas de rubrédoxine TB PA5349 KO mutant (B). Tampon phosphate (ligne a) après ajout
des bactéries (ligne b) et après une heure de contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation
(ligne c).
III.3 Chronoampérométrie
III.3.1 En réacteur
L’objectif des mesures en chronoampérométrie était de déterminer si le phénomène
transitoire mis en évidence en voltammétrie cyclique était toujours présent en régime
stationnaire. De plus, dans l’optique d’une application en biocathode, il était important de
vérifier si ce transfert d’électrons était durable. Pour cela, une première expérience a été
effectuée sur 10 jours en réacteur alimenté en bouillon biofilm en continu sur des électrodes
en acier inoxydable généralement utilisées dans les PCM. Le bouillon biofilm a été choisi,
malgré la faible reproductibilité de la catalyse observée dans cet électrolyte, car il permet
préférentiellement la croissance des bactéries sous forme adhérée. Le potentiel a été fixé à
-0,35 V/ECS, potentiel pour lequel la différence de courant est la plus importante entre le
voltammogramme témoin et celui effectué après 1h d’attente sous agitation en présence des
bactéries. Aucune évolution du courant n’a été observée dans cette expérience même après 10
jours de mesures. De plus, des voltammétries cycliques ont été faites chaque jour sur les
électrodes dans les réacteurs sans observer aucune augmentation de courant.
Une des raisons pour lesquelles aucune détection n’a été possible est peut-être liée au
nouveau matériau utilisé pour les électrodes de travail. En effet, les bactéries pourraient ne
pas adhérer à l’électrode en acier. Afin de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse, à la fin de
90
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
l’expérience, un dénombrement sur boîte de TS après grattage de l’électrode a été effectué
pour déterminer la quantité de cellules adhérées à l’électrode. Un biofilm s’est bien formé à la
surface des électrodes en acier inoxydable (8,7 ± 0,4 107 ufc/cm2 d’électrode). Lors de ces
dénombrements, deux phénotypes de la même souche PA01 ont été mis en évidence : des
bactéries très pigmentées ont été isolées sur les électrodes (pyoverdine/pyocyanine) alors que
des bactéries produisant peu de pigment ont été isolées sous forme planctonique dans le
milieu (pigmentation évaluée sur milieux KingA et KingB). Ces phénazines ont déjà été mises
en cause dans la production de courant chez P. aeruginosa pour des réactions anodiques
(Rabaey et al., 2005). L’électroactivité de ces deux isolats a été comparée en VC. Aucune
différence significative n’a pu être observée (Figure III.9).
4
4
2
A
0
0
-2
-2
I (µA)
I (µA)
2
-4
-6
b
-4
-6
b
-8
-8
c
-10
-12
-14
-1,2
B
-12
a
-0,7
c
-10
-0,2
0,3
0,8
-14
-1,2
a
-0,7
E (V/ECS)
-0,2
0,3
0,8
E (V/ECS)
Figure III.9. Voltammogrammes cycliques de l’isolat pigmenté (A) et de l’isolat non pigmenté (B) à
100 mV/s. Tampon phosphate (ligne a) après ajout des bactéries (ligne b) et après une heure de contact
entre les bactéries et les électrodes sous agitation (ligne c).
Le changement de milieu peut également expliquer l’absence d’augmentation de
courant. En effet, la catalyse était faiblement reproductible dans ce milieu en voltammétrie
cyclique. Ce problème peut être lié à la présence de glucose, qui est un donneur d’électrons,
même en très faible quantité (0,05 g/L) dans le milieu. Pour répondre à ces différentes
interrogations (nouveau milieu, matériau de l’électrode, changement de conditions…), des
expériences en chronoampérométrie ont été réalisées en bécher sur des électrodes en carbone
vitreux dans du tampon phosphate, mais sur des temps plus courts.
III.3.2 En bécher
91
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
Les mesures de CA en réacteur en alimentation continue en bouillon biofilm sur des
électrodes de travail en acier n’ayant pas donné de résultats, nous avons souhaité nous
rapprocher le plus possible des conditions pour lesquelles la détection était possible en VC.
Dans ce but, le modèle en bécher, avec des électrodes en carbone vitreux comme électrodes
de travail et le tampon phosphate comme électrolyte, a été utilisé.
III.3.2.1 Chronoampérométrie continue
Une première mesure a été effectuée en continu pendant 1h30 pour déterminer si le
courant de réduction détecté en VC étant également détectable en CA. Le potentiel a été fixé à
- 0,35 V/ECS, potentiel pour lequel la différence de courant est la plus importante entre le
voltammogramme témoin et celui effectué après 1 h d’attente sous agitation en présence des
bactéries. Aucun courant de réduction n’apparaît sur le graphique même après 1h30 de
contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation (Figure III.10).
0,0
-0,2
Début de l’agitation
I (µA)
-0,4
-0,6
-0,8
-1,0
-1,2
Ajout des cellules
-1,4
0
20
40
60
80
100
Temps (min)
Figure III.10. CA continue sur une suspension de P. aeruginosa PA01 dans du tampon à potentiel
imposé (-0,35 V/ECS).
Cela tendrait à montrer que la chronoampérométrie ne permet pas de mettre en
évidence les mêmes phénomènes que la voltammétrie cyclique. La souche PA01, pour
laquelle on détecte une activité en réduction en VC, ne produit aucun courant cathodique au
potentiel de -0,35 V/ECS. D’autres potentiels ont été testés (-0,30 ; -0,40 et -0,45 V/ECS)
sans aucun résultat. Cette fois, le changement de conditions expérimentales ne peut pas être
mis en cause puisque les mêmes conditions ont été utilisées pour la VC et la CA. Une
92
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
conclusion importante de ces mesures est que déterminer l’électroactivité d’une bactérie en
voltammétrie cyclique ne garantit absolument pas de bonnes performances en régime
stationnaire et donc pour une éventuelle application dans les piles à combustible
microbiennes. Pourtant cette méthode est largement utilisée pour analyser rapidement les
transferts d’électrons entre les bactéries et les électrodes (Rabaey et al., 2004).
III.3.2.2 Chronoampérométrie séquentielle
Pour approfondir encore la compréhension du phénomène, nous avons effectué des
CA, toujours sur le montage en bécher, mais cette fois de manière séquentielle. Une mesure
en CA au potentiel de -0, 35 V/ECS a été réalisée durant quelques minutes sur un bécher
témoin (tampon seul) et sur un bécher contenant une suspension de PA01 dans du tampon à
différents temps de contact entre la solution et les électrodes. Les résultats sont présentés en
I (µA)
figures III.11 et III.12.
t0
1h
2h
4h
Temps (min)
Figure III.11. CA discontinue témoin sur du tampon seul à potentiel imposé (-0,35 V/ECS). Les
temps annoncés correspondent aux temps d’attente sous agitation du tampon en présence des
électrodes.
93
I (µA)
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
t0
1h
2h
4h
5h
Temps (min)
Figure III.12. CA discontinue sur une suspension de P. aeruginosa PA01 dans du tampon à potentiel
imposé (-0,35 V/ECS). Les temps annoncés correspondent aux temps d’attente sous agitation de la
suspension bactérienne en présence des électrodes.
On peut remarquer sur le premier graphique (tampon seul, Figure III.11) de très faibles
valeurs de courant détectées à -0,35 V/ECS. La plus grande est détectée après 2h d’agitation
et n’atteint que -1 µA. Lors de la même expérience mais en présence de PA01, des pics de
courant de réduction élevé sont détectés au tout début de chaque mesure. La plus forte valeur
de courant, I = -4,8 µA, est relevée lors de la mesure après 4 h de contact entre les bactéries et
les électrodes. Cependant ce courant revient en quelques minutes à sa valeur de base. Ces
observations vont dans le sens d’une activité transitoire de certains composés de la membrane
cellulaire. Le phénomène ne semble pas persister en régime permanent et donc ne semble pas
lié au métabolisme de la cellule.
III.4 Conclusion
Cette première partie de l’étude a permis de montrer que P. aeruginosa PA01 est
capable de catalyser la réduction électrochimique du dioxygène. C’est la première fois que
l’activité de cette bactérie est démontrée en réduction. Ce phénomène est facilement
observable en voltammétrie cyclique grâce à un déplacement de la vague correspondant à la
réduction du dioxygène. La réduction a lieu pour des potentiels plus élevés, et des courants
électriques plus forts sont obtenus en présence des bactéries. Cette catalyse est observable
après seulement quelques minutes de contact entre les bactéries et l’électrode de travail et
94
Chapitre III : Catalyse de la réduction du dioxygène par P. aeruginosa
devient maximale après 1 h. La bactérie est elle-même responsable du phénomène par contact
avec l’électrode de travail et n’utilise pas de médiateurs diffusibles autonomes tels que les
phénazines. L’analyse du phénomène en voltammétrie cyclique nous pousse à suspecter
l’activité de composés membranaires. En effet, le transfert d’électrons est probablement dû à
des enzymes à la surface de la bactérie ou à de petites molécules diffusibles, mais dans
l’environnement très proche de la cellule. L’étude de bactéries mutées de P. aeruginosa
montre que les pili de type IV, la catalase et la rubrédoxine réductase ne sont pas impliqués.
Nous suspectons toujours une activité enzymatique. Cette voie sera explorée dans le chapitre
V. Des souches provenant d’isolats cliniques ont également été testées. Toutes présentent la
même capacité catalytique que PA01, quelles que soient leur pigmentation et leur production
d’alginate. Les phénazines et l’alginate sont tous deux des facteurs de virulence de la bactérie,
or aucune différence n’est notée en fonction de leur production.
Le phénomène a également été étudié en chronoampérométrie. Il n’est détectable que
de manière transitoire en tout début de mesure. Sur plusieurs jours, malgré le développement
de biofilm à la surface des électrodes de travail, aucun courant de réduction n’est produit. La
voltammétrie cyclique et la chronoampérométrie ne permettent pas de mettre en évidence les
mêmes transferts d’électrons. La voltammétrie cyclique permet de détecter des phénomènes
transitoires qui ne sont pas directement utilisables en régime stationnaire. Les phénomènes
ainsi détectés ne sont pas nécessairement intéressants pour des applications en PCM. Pourtant
la voltammétrie cyclique est souvent utilisée comme moyen de détection d’électroactivité ou
encore dans l’analyse des transferts d’élecrons observés en PCM en régime permanent (Nimje
et al., 2009; Rabaey et al., 2004).
D’un point de vue plus appliqué, le protocole de voltammétrie cyclique présenté ici
permet la détection de P. aeruginosa PA01 dès les premiers stades d’adhésion à l’électrode.
En effet, après seulement quelques minutes d’immersion dans la suspension bactérienne, la
catalyse de la réduction du dioxygène due à la bactérie est observable. Cette méthode pourrait
s’avérer intéressante pour la mise au point d’une méthode de détection rapide d’adhésion.
Cependant, il reste encore à vérifier si cette propriété mise en évidence chez P. aeruginosa est
spécifique de cette bactérie ou bien si elle se retrouve chez d’autres micro-organismes. Ceci
fait l’objet du chapitre qui suit. En fonction des résultats, différentes applications pourront
être envisagées.
95
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Chapitre IV :
Catalyse de la réduction
du dioxygène par d’autres bactéries
96
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
IV.1 Introduction
Après avoir caractérisé la catalyse de la réduction du dioxygène pour une bactérie en
particulier, P. aeruginosa, nous avons tenu à déterminer si cette propriété était commune à
d’autres bactéries. Dans ce chapitre sont présentées deux études distinctes.
Dans un premier temps, nous avons étudié la capacité de bactéries pathogènes,
opportunistes
et/ou
contaminantes
de
l’environnement
à
catalyser
la
réduction
électrochimique du dioxygène. L’objectif était de tester un grand nombre de bactérie à Gram
négatif et à Gram positif afin de déterminer si cette propriété découverte chez P. aeruginosa
était répandue au sein du règne des bactéries. En effet, les bactéries à Gram positif étant
beaucoup moins étudiées que les bactéries à Gram négatif, il était important de déterminer si
elles aussi étaient capables de catalyser la réduction électrochimique du dioxygène. L’étude
de bactéries qui sont des contaminants potentiels et/ou des pathogènes opportunistes était
particulièrement intéressante dans l’optique de la mise au point d’une méthode de détection
de bactéries associées à un risque en terme de santé publique.
La deuxième partie du chapitre est consacrée à l’étude de cette catalyse chez des
bactéries environnementales. Cette étude s’intégrait dans un programme plus large visant à
étudier les biofilms épilithiques de rivière. Nous avons collaboré avec le Laboratoire
d’Ecologie
Fonctionnelle
à
Toulouse
(UMR
5245
CNRS–UPS–INPT)
et
plus
particulièrement avec Emilie Lyautey et Frédéric Garabétian. L’objectif principal était de
déterminer si ces biofilms pouvaient être électroactifs et ensuite d’étudier cette électroactivité
par voltammétrie cyclique. Nous avons ainsi analysé la catalyse de la réduction
électrochimique du dioxygène chez 32 isolats environnementaux.
IV.2 Bactéries pathogènes ou opportunistes
97
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
IV.2.1 Article “Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by a wide range of bacteria
including Gram-positive”
Les travaux effectués sur les bactéries d’intérêt médical ont abouti à l’article
« Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by a wide range of bacteria including Grampositive » accepté dans le journal Electrochemistry Communications. Un résumé des résultats
obtenus est présenté en français avant l’article lui-même.
Dans cet article, la même méthode de VC que celle décrite précédemment (§ III.2.1) a
été appliquée dans les conditions standards à Micrococcus luteus, une bactérie à Gram positif,
souvent isolée de la peau des mammifères, qui peut s’avérer un pathogène opportuniste chez
certains patients immunodéprimés. Les voltammogrammes effectués sur le tampon seul et sur
le tampon en présence de la bactérie montre que celle-ci est capable de catalyser la réduction
du dioxygène comme P. aeruginosa (§ III.2.1). Le filtrat de M. luteus a également été testé et
n’a aucune activité, même après 1 h de contact avec les électrodes. Cela prouve l’absence de
médiateur autonome en solution produit par la bactérie.
Dix neuf autres bactéries d’intérêt ont été testées de la même manière. Toutes les
souches à Gram négatif testées sont capables de catalyser la réduction du dioxygène. Quant
aux bactéries à Gram positif, seulement un tiers des souches testées est électroactif. Des
analyses statistiques (tests de Student) montrent qu’il n’y a pas de différence significative
entre les souches capables de catalyser la réduction du dioxygène. Le même type de
mécanisme doit donc être impliqué dans la catalyse pour toutes les bactéries.
Certaines bactéries ne présentant pas d’activité catalase (K. kingae et K. denitrificans)
sont capables de catalyser la réduction du dioxygène. Cela confirme les résultats obtenus avec
les mutants de P. aeruginosa défectueux dans la production de catalase. La catalase n’est pas
nécessaire pour que le phénomène ait lieu. La même conclusion peut être faite concernant la
cytochrome c oxydase. Certaines souches ne présentant pas d’activité cytochrome C oxydase
(E. coli et S. carnosus par exemple) possèdent les mêmes propriétés électroactives.
De nombreuses bactéries sont donc capables de catalyser la réduction électrochimique
du dioxygène. Parmi les bactéries testées toutes les bactéries aérobies sont positives. Les
bactéries à Gram négatif anaérobies facultatives sont capables d’une telle catalyse mais
98
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
présentent un retard plus ou moins important (allongement du temps de contact de plusieurs
heures pour la détection de la catalyse). Les bactéries incapables d’une telle catalyse sont des
bactéries à Gram positif anaérobies facultatives ou aérotolérantes telles que les streptocoques
et entérocoques.
Ce travail a donc mis en évidence une propriété assez répandue chez les bactéries, y
compris chez les Gram positif. Il a également permis de montrer que les capacités
électrochimiques ne sont pas restreintes aux seules bactéries issues des PCM, mais que de
nombreuses espèces bactériennes peuvent être considérées comme potentiellement
électroactives.
99
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Electrochemical reduction of oxygen catalyzed by a wide range of bacteria
including Gram-positive
Amandine Courneta,b, Marie-Line Déliab, Alain Bergelb, Christine Roquesa and Mathieu
Bergéa
a
Université de Toulouse, UPS ; LU49, Adhésion bactérienne et formation de biofilms ; 35
chemin des Maraîchers, 31 062 Toulouse cedex 09 France
b
Laboratoire de Génie Chimique CNRS UMR5503, 4 allée Emile Monso, BP 84234, 31432
Toulouse cedex 04 France
Publication acceptée dans le journal « Electrochemistry Communications »
Abstract
Most bacteria known to be electrochemically active have been harvested in the anodic
compartments of Microbial Fuel Cells (MFCs) and are able to use electrodes as electron
acceptors. The reverse phenomenon, i.e. using solid electrodes as electron donors, is not so
widely studied. To our knowledge, most of the electrochemically active bacteria are Gramnegative. The present study implements a transitory electrochemical technique (cyclic
voltammetry) to study the microbial catalysis of the electrochemical reduction of oxygen. It is
demonstrated that a wide range of aerobic and facultative anaerobic bacteria are able to
catalyze oxygen reduction. Among these electro-active bacteria, several were Gram-positive.
The transfer of electrons was direct since no activity was obtained with the filtrate. These
findings, showing a widespread property among bacteria including Gram-positive ones, open
new and interesting routes in the field of electroactive bacteria research.
Keywords: Oxygen reduction, electrochemically active bacteria, Gram-positive bacteria,
cyclic voltammetry.
100
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
1. Introduction
Electroactive bacteria are able to exchange electrons with conducting materials [1]. Therefore,
these bacteria can produce current in microbial fuel cells by converting chemical energy from
organic substrates into electrical energy.
Today, various bacteria have already been shown to be electroactive, to exchange electrons
directly (without the addition of any exogenous mediators) with electrodes [2]. Geobacter
sulfurreducens is certainly the most thoroughly studied of these microorganisms [3-5].
Shewanella putrefaciens also presents this characteristic [6], as do many others like
Pseudomonas aeruginosa [7], Escherichia coli [8], etc. All these microorganisms were
harvested in environmental backgrounds like compost, sea water, and sea sediments. The
mechanisms of their electron transfers have been widely studied. Several bacteria use their
own mediators [8-10], others are able to transfer electrons to the electrodes by direct contact
via membrane-bound redox compounds [11] or via conducting nanowires produced by the
cell [12, 13].
Most of the research on electroactive bacteria has been done on Gram-negative bacteria [2].
The idea that Gram-positive bacteria can also exchange electrons with electrodes is still
debated. Gram-positive bacteria possess a cell wall that could potentially reduce electron
exchange by direct contact. However, a few recent studies have shown the electroactivity of
Gram-positive bacteria. The vast majority of them describe indirect transfer of electrons
between the electrode and the cells. It has been shown, for instance, that Brevibacillus sp., is
able to use metabolites produced by a Gram-negative bacteria, Pseudomonas sp., to achieve
extracellular electron transfer [14], Desulfitobacterium hafniense is able to use humic acids as
electron shuttles [15], and Bacillus subtilis and Corynebacterium sp. use their own mediators
to reduce the electrode [16, 17]. To our knowledge, only two genus of Gram-positive bacteria
have already been shown to exchange electrons directly with electrodes: Thermincola [18],
and Clostridium [19, 20].
These various studies have been performed for anodic processes except the one done on
Clostridium isatidis that showed a reversible electroactivity of the strain on graphite
electrodes [20]. Not so many bacteria are known to be able to perform the opposite process
i.e. to microbially catalyze cathodic reductions. However, microbial catalysis of oxygen
reduction remains an important challenge in the fields of biocorrosion [21] and MFC cathodes
[22]. Enterobacter sp. E1, isolated from an electroactive biofilm formed in compost, was
101
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
found to be able to catalyze the electrochemical reduction of oxygen when adsorbed on a
carbon electrode [23]. This study used cyclic voltammetry to detect the catalytic effect, which
implied a prolonged contact between bacteria and the working electrode. To our knowledge,
only Gram-negative bacteria have been shown to be able to catalyze the electrochemical
reduction of oxygen.
The purpose of the present work was to test a wide range of aerobes and facultative
anaerobes, including Gram-positive bacteria, for their possible ability to catalyze oxygen
reduction on a carbon electrode. Cyclic voltammetry was used as a fast method to test many
different strains in order to determine whether such electroactivity may be widespread among
aerobic bacteria or correspond to a particular distribution.
2. Experimental
2.1. Bacterial strains, culture conditions and chemicals
All the reference strains were provided by Institut Pasteur (Paris, France). Clinical isolates
were obtained from the Hospital Bacteriology and Hygiene Laboratory in Toulouse (France).
The strains are described in Table 1. They were maintained on Trypcase Soy agar
(Biomérieux, France) under aerobic conditions except for S. mutans and Kingella sp., which
were maintained on Columbia blood agar (Biomérieux, France), and L. farciminis, on M.R.S.
agar (AES, France). Before each experiment, the strains were grown overnight in 20mL
Trypcase Soy broth (Biomerieux, France) at 37°C under gentle stirring except for S. mutans
and L. farciminis, which were not stirred. Bacterial suspensions were then centrifuged (10
min, room temperature, 3000 × g), washed twice in phosphate buffer (K2HPO4/KH2PO4, 0.1
M, pH 7), and re-suspended in the same buffer. All experiments were performed in the same
buffer at room temperature (22 ± 2°C).
Catalase and oxidase characterization were performed using the ID color Catalase test
(Biomérieux, France) and Oxidase Reagent test (Biomérieux, France).
2.2. Cyclic voltammetry (CV)
102
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
CVs were performed with 0.07 cm² glassy carbon rods (Glassy Carbon V25, 3 × 150 mm,
Carbone Lorraine, Gennevilliers, France) used as working electrodes and with a platinum
wire used as a counter electrode. Potentials were monitored with respect to a saturated
calomel reference electrode (SCE) and CVs were performed at a scan rate of 100 mV/s with a
Princeton Applied potentiostat. Voltammograms started at 0.1 V/SCE to 0.7 V/SCE and
continued with three cycles from 0.7 V/SCE to -1 V/SCE. In the figure, only the first cycle is
shown, to make the curves clearer.
Experiments were conducted in a 40 mL cell. A first CV was run in 20 mL buffer to control
the quality of the clean working electrode surface. The cell suspension was added to obtain a
cell density of around 108 bacteria/mL measured by the optical density at 640 nm. A second
voltammogram was performed immediately after the addition of the microorganisms into the
cell. Then the suspension was stirred for 1h or more, depending on the strains (Table 1), to
maintain a homogeneous oxygen concentration and CV was performed again. The filtrate of
M. luteus was also tested. After one hour of stirring, 20 mL of bacterial suspension was
filtered through a 0.45 µm sterile filter then through a 0.20 µm one. The CV test was done on
the resulting filtrate immediately and after one hour of stirring. Measurements under
anaerobic conditions were carried out after removing oxygen from the solution by 20 min of
nitrogen bubbling. There was no stirring or gas bubbling during current recording. Each CV
experiment was performed three times, with clean working electrodes each time.
3. Results and discussion
The control voltammograms performed on phosphate buffer alone (Fig. 1A) showed a
reproducible wave starting at -0.37 ± 0.01 V/SCE (seven independent experiments). Initial
CVs were strictly identical to the CVs recorded after one hour of stirring (Fig. 1A, lines a and
b). This wave corresponded to the electrochemical reduction of dissolved oxygen since it
disappeared after oxygen was removed by nitrogen bubbling (Fig. 1A, line c).
After one hour of stirring in presence of Micrococcus luteus, the wave corresponding to the
electrochemical reduction of oxygen started at higher potential and higher currents were
obtained (Fig. 1B, line b). The oxygen reduction started at the potential Estart = -0.19 ± 0.01
V/SCE and reached its maximum of current at Epeak = -0.46 ± 0.03 V/SCE with Ipeak = -13.48
± 0.21 µA (average values of three independent experiments). These three parameters, E start,
103
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Ipeak and Epeak, characterized the oxygen reduction reaction. Occurrence of a catalytic effect
was identified by a shift of Estart towards positive potential and/or an increase in Ipeak with
respect to the control experiment (Fig. 1A). Ipeak was four times the intensity obtained with the
control at the same potential. After one hour of stirring in presence of bacteria and 20 min of
nitrogen bubbling, the CV was identical to the one obtained in phosphate buffer alone after
nitrogen bubbling (Fig. 1B, line c). After one hour of stirring, the bacteria were filtered out of
the suspension, and clean electrodes were plunged into the filtrate. The voltammogram did
not reveal any catalysis of oxygen reduction for the filtrate, even after one hour of stirring
(Fig. 1B, line d). Consequently, no soluble mediator was involved in the electron transfer
pathway. This is the first time to our knowledge that a Gram-positive bacterium has been
shown to be electroactive in cathodic reactions in presence of oxygen with neither addition of
exogenous mediators nor involvement of an endogenous mediator.
Figure 1. Cyclic voltammograms of (A) phosphate buffer alone and (B) M. luteus in phosphate buffer
and M. luteus filtrate. Initial CV (line a), after one hour of gentle stirring (line b) and after oxygen
removal by nitrogen bubbling (line c). Line d represents the voltammogram for M. luteus filtrate after
one hour of stirring. Solid lines on axes represent the characteristic values of the catalyzed peak: *
Estart, ** Epeak and *** Ipeak.
Nineteen other bacteria were tested using the same protocol (Table 1). Each strain was tested
three times independently. All the Gram-negative strains tested were able to catalyze the
electrochemical reduction of oxygen and one third of the tested Gram-positive bacteria were
electroactive. The electrocatalytic capacity does not seem to be related to the genus since one
of the three tested species of Staphylococcus was able to catalyze the reduction of oxygen,
while two were not (Table 1). Statistical analyses were carried out on the data that
characterized the catalyzed peak: Ipeak, Epeak and Estart using the Student’s test. Fluctuations
were observed but no significant difference appeared among any of the positive strains. This
104
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
indicates that the catalysis observed with all the bacteria was probably due to the same kind of
mechanism. This phenomenon seems widespread among bacteria.
Table 1
Electroactivity of Gram-positive and Gram-negative bacteria tested by cyclic voltammetry.
CVs were performed in phosphate buffer (0.1 M, pH 7) on 0.07 cm² glassy carbon rods
(Glassy Carbon V25, 3 × 150 mm, Carbone Lorraine, Gennevilliers, France) at 100 mV/s. The
oxygen reduction started at the potential Estart and reached its maximum of current (Ipeak) at
Epeak. These three parameters, Estart, Ipeak and Epeak, characterized the catalysed oxygen
reduction. The detection time corresponded to the contact duration between electrodes and
bacteria. Average values and standard deviations were calculated from three independent
experiments for each strain.
Catalyzed oxygen reduction peak
Bacteria
Reference
Phenotype
Cat = catalase
Ox = oxidase
Detection
time
Estart V/SCE
Ipeak µA
Epeak V/SCE
Pseudomonas aeruginosa
PA01
Gram-Cat+0x+
1h
-0.19 ± 0.03
-11.71 ± 0.19
-0.45 ± 0.05
Pseudomonas fluorescens
clinical isolate
Gram-Cat+Ox+
1h
-0.18 ± 0.01
-10.01 ± 0.08
-0.45 ± 0.01
Brevundimonas diminuta
CIP 103020
Gram-Cat+Ox+
1h
-0.13 ± 0.02
-14.21 ± 3.97
-0.33 ± 0.01
Burkholderia cepacia
CIP 80.24
Gram-Cat+Ox+
1h
-0.14 ± 0.03
-17.14 ± 2.75
-0.36 ± 0.05
Branhamella catarrhalis
CIP 73.21
Gram-Cat+Ox+
1h
-0.18 ± 0.01
-13.43 ± 0.13
-0.44 ± 0.00
clinical isolate
Gram-Cat+Ox-
6h
-0.19 ± 0.01
-10.33 ± 1.02
-0.48 ± 0.01
K 12
Gram-Cat+Ox-
3h
-0.21 ± 0.02
-10.25 ± 1.37
-0.49 ± 0.01
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Shigella flexneri
CIP 82.48
Gram-Cat+Ox-
3h
-0.21 ± 0.01
-11.54 ± 0.71
-0.51 ± 0.00
Acinetobacter sp.
clinical isolate
Gram-Cat+Ox-
1h
-0.16 ± 0.01
-10.14 ± 0.68
-0.41 ± 0.05
Kingella kingae
Kingella denitrificans
Micrococcus luteus
Bacillus subtilis
CIP 80.16
Gram-Cat-Ox-
3h
-0.22 ± 0.01
-9.59 ± 0.99
-0.49 ± 0.01
CIP 103473
Gram-Cat-Ox-
1h
-0.21 ± 0.01
-12.05 ± 0.21
-0.49 ± 0.01
CIP 53.45
Gram+Cat+Ox+
1h
-0.19 ± 0.01
-13.48 ± 0.21
-0.46 ± 0.03
CIP 52.62
Gram+Cat+Ox+
1h
-0.18 ± 0.01
-11.57 ± 0.81
-0.49 ± 0.02
CIP 103274
Gram+Cat+Ox-
1h
-0.22 ± 0.01
-9.54 ± 0.49
-0.52 ± 0.00
Staphylococcus aureus
CIP 4.83
Gram+Cat+Ox-
no catalysisa
Staphylococcus epidermidis
CIP 68.21
Gram+Cat+Ox-
no catalysisa
clinical isolate
Gram+Cat-Ox-
no catalysisa
CIP 58.55
Gram+Cat-Ox-
no catalysisa
Lactobacillus farciminis
CIP 103136
Gram+Cat-Ox-
no catalysisa
Streptococcus mutans
CIP 103220
Gram+Cat-Ox-
no catalysisa
Staphylococcus carnosus
Enterococcus faecalis
Enterococcus hirae
a
no catalysis was observed even after a 24-hour immersion of the electrode in the cell
suspension.
105
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Using the filtrate from M. luteus (Fig. 1B) demonstrated that the catalytic mechanism did not
involve diffusible mediators. Thus, membrane-bound compounds may be suspected of being
involved. The electrochemistry of several enzymes has already been studied and, among
them, catalase adsorbed on glassy carbon electrodes gave an oxygen reduction peak very
close to the one observed in the present study [24]. However, Kingella species that did not
present any catalase also induced a catalytic effect, showing that the phenomenon cannot be
attributed to the presence of catalase or, at least, not only to the presence of catalase. No
correlation was observed with oxidase activity either. Catalase and oxidase do not seem
necessary for this catalysis.
Each aerobic strain tested was able to catalyze the electrochemical reduction of oxygen.
Among
the
facultative
anaerobes
tested,
Gram-negative
bacteria,
especially
Enterobacteriaceae, were electroactive. A delay in the catalysis of oxygen reduction was
noted for E. coli, E. cloacae and S. flexneri, for which a contact time greater than 1 hour was
required before a significant catalytic effect was observed (Table 1). The majority of the
active strains were ubiquitous and possessed a large capacity of adaptation. The bacteria that
did not reveal activity were Gram-positive facultative anaerobic or aerotolerant strains, some
of them having higher cultural requirements (S. mutans and L. farciminis). The difficulty in
detecting these bacteria might simply be due to the fact that the assay conditions impaired
their physiological activity. However, CFU counting showed that there was no bacterial death
after 1 hour in this buffer (data not shown).
4. Conclusion
For the first time, M. luteus, a Gram-positive bacterium, has been shown to be able to catalyze
the electrochemical reduction of oxygen on a carbon electrode. The electron transfer was not
supported by exogenous or endogenous mediators. A wide range of aerobic and facultative
anaerobic bacteria, including several Gram-positive bacteria presented the same
electrochemical property. Catalase and oxidase, which have already been shown to affect
oxygen reduction in similar ways, were not responsible for the phenomenon observed here.
However, we still suspect membrane-bound redox compounds. The present work shows that
the electrochemical property of bacteria is not restricted to species harvested in MFCs. All
bacteria, including Gram-positive ones, should now be considered as potentially electroactive.
106
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Acknowledgments
We are grateful to the FERMaT federative structure for its support.
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108
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
IV.2.2 Résultats complémentaires
Dans l’article précédent il est montré que des bactéries à Gram positif sont capables
d’utiliser directement l’électrode de carbone vitreux comme donneur d’électrons pour
catalyser la réduction du dioxygène. Une étude a montré que des bactéries à Gram positif
étaient capables d’utiliser des molécules produites par P. aeruginosa comme médiateurs pour
participer à la génération de courant dans une MFC (Pham et al., 2008). Nous avons voulu
tester cette hypothèse sur une bactérie à Gram positif incapable de catalyser seule la réduction
du dioxygène. Pour cela, des VC ont été réalisées avec la souche de S. aureus en présence de
filtrat de P. aeruginosa PA01. Aucune différence n’a été observée entre le filtrat de P.
aeruginosa PA01 et après ajout de S. aureus (Figure IV.1). Même après 1h de contact entre
les bactéries et l’électrode le votammogramme ne présente pas de catalyse de la réduction du
dioxygène comparable à celle obtenue avec PA01. Cette observation vient corroborer le fait
que la catalyse ne serait pas soutenue par des molécules exocellulaires. De plus, même si
PA01 produisait des molécules médiatrices, celles-ci ne sont pas utilisables par S. aureus.
4
2
0
I (µA)
-2
-4
b
-6
c
-8
a
-10
-12
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure IV.1. VC sur du filtrat de P. aeruginosa seul (ligne a), sur du filtrat de P. aeruginosa PA01
après ajout de S. aureus (ligne b) et après 1h d’attente sous agitation (ligne c).
Comme cela a été mentionné dans le chapitre III, nous pensons que ce phénomène est
lié à l’activité d’enzymes membranaires. Il est donc légitime de suspecter des enzymes
capables de réduire le dioxygène. Ces enzymes étant très répandues chez de nombreuses
bactéries aérobies ou anaérobies facultatives, il est difficile d’expliquer les différents
comportements des bactéries quant à la catalyse électrochimique de cette réduction. Nous
109
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
avons réalisé un stress oxydant par ajout d’H2O2 (voir § II.2.4.4) visant à augmenter l’activité
de ces enzymes capables de réduire les espèces réactives de l’oxygène et le dioxygène luimême sur deux souches anaérobies facultatives :
-
d’une part, sur une souche ne présentant aucune électroactivité, S. aureus (Figure
IV.2 A)
-
et d’autre part, sur une souche moyennement électroactive, E. coli (Figure IV.2 B).
La catalyse électrochimique de la réduction du dioxygène a ensuite été analysée pour ces deux
souches. On aurait pu s’attendre à une augmentation de la catalyse chez E. coli et/ou une
apparition de la catalyse chez S. aureus. Pourtant, aucun effet du stress oxydant n’a été
montré en voltammétrie cyclique pour ces deux souches (Figure IV.2 C et D).
4
4
A
2
0
0
-2
-2
I (µA)
I (µA)
2
-4
-6
b
-8
a
B
a
-4
b
-6
c
-8
-10
-10
c
-12
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
d
-12
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
-14
-1,2
0,8
-1
-0,8
-0,6
4
2
0
0
-2
-2
-4
b
-6
a
-8
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0
0,2
0,4
0,6
0,8
D
-4
a
b
-6
c
-8
-10
-10
-12
-14
-1.2
-0,2
4
C
I (µA)
I (µA)
2
-0,4
E (V/ECS)
E (V/ECS)
-1
-0.8
-0.6
d
-12
c
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
-14
-1,2
-1
-0,8
-0,6
E (V/ECS)
-0,4
-0,2
E (V/ECS)
Figure IV.2. Voltammogrammes cycliques sur des cellules de S. aureus (A) et E. coli (B) et sur des
cellules de S. aureus et E. coli préalablement soumise à un stress oxydant à l’H2O2 (respectivement C
et D). Tampon phosphate (lignes a) après ajout des bactéries (lignes b) et après 1h (lignes c) et 3h
(lignes d) de contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation.
IV.3 Bactéries environnementales
110
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Dans le cadre d’une étude de biofilms épilithiques de rivières, au cours de deux
expérimentations consécutives en 2006 puis 2007, des assemblages naturels de biofilms
phototrophes testés en rivière par le Laboratoire d’Ecologie Fonctionnelle à Toulouse (UMR
5245 CNRS–UPS–INPT) se sont avérés être électroactifs. Les objectifs généraux de cette
étude étaient i) d’évaluer l’électroactivité d’assemblages épilithiques in situ, ii) de caractériser
la structure des communautés algales (diatomées) et bactériennes d’assemblages de biofilms
épilithiques ayant colonisé des substrats différents (acier inoxydable vs cuivre) et de mettre en
relation ces structures et les signaux enregistrés en continu, et iii) de caractériser le potentiel
électrochimique de souches bactériennes isolées d’assemblages naturels.
In situ, des variations de potentiel de +100 à +150 mV ont été observées au cours de la
colonisation de coupons d’acier inoxydable immergés en rivière. Emilie Lyautey (postdoctorante dans le Laboratoire d’Ecologie Fonctionnelle à Toulouse) a isolé 32 taxons
cultivables de ces biofilms électroactifs en utilisant une approche par culture sous condition
aérobie. Ces isolats ont été caractérisés au plan moléculaire par séquençage de l’ADNr 16S.
L’analyse phylogénétique des séquences alignées a permis de déterminer quelles étaient les
espèces bactériennes les plus proches, et le pourcentage de similarité entre ces souches et
leurs plus proches voisines (Tableau II.3), ceci afin de tester leur capacité à générer un signal
détectable en laboratoire par voltammétrie cyclique.
Mon travail s’est situé à ce stade de l’étude. Nous avons analysé, en collaboration avec
Emilie Lyautey, la capacité des 32 isolats environnementaux à catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène en voltammétrie cyclique. Seuls ces résultats seront discutés
dans cette partie. Ils devraient permettre de compléter la caractérisation de ces biofilms.
L’intérêt pour notre travail est d’agrandir la liste des bactéries testées pour essayer de
déterminer la source d’une telle propriété. Ce travail devrait donner lieu à une publication qui
est en cours d’écriture. Certaines des figures qui suivent en sont extraites.
Sur l’ensemble des isolats testés trois comportements différents ont été observés. Soit
une catalyse forte avec un pic bien marqué ressemblant à celui observé avec P. aeruginosa,
soit une catalyse faible avec un pic peu marqué, soit une absence de catalyse (Figure IV.3).
L’ensemble des résultats est présenté dans deux tableaux : le premier concerne les bactéries à
Gram négatif (Tableau IV.1) et le deuxième les isolats à Gram positif (Tableau IV.2). Sur les
32 isolats testés, 7 (22%) sont incapables de catalyser la réduction électrochimique du
111
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
dioxygène dans nos conditions (les tests ont été répétés deux fois pour ces bactéries), pour 4
isolats (12%) la détection est possible mais très faible et 21 souches (66%) donnent un pic de
catalyse bien marqué.
4
Intensity (µA)
0
-4
-8
-12
-16
a
-20
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6 -1.0
b
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
c
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
Potential (V vs SCE)
Figure IV.3. Voltammogrammes cycliques obtenus pour a) un isolat incapable de catalyser la
réduction électrochimique du dioxygène (GQ398344 : Massilia timonae), b) un isolat capable d’une
faible catalyse (GQ398350 : Variovorax paradoxus) et c) un isolat capable d’une forte catalyse
(GQ398335 : Aeromonas sharmana). Les courbes grises correspondent aux voltammogrammes
obtenus avant l’ajout des cellules et les courbes noires aux voltammogrammes obtenus après 3 h (a) et
1 h (b et c) de contact entre les électrodes et la suspension bactérienne (Lyautey et al., en préparation).
Une première conclusion est que cette propriété est très répandue au sein des bactéries
aérobies. Si l’on considère les proportions en tenant compte du Gram, cela donne :
-
pour les 20 bactéries à Gram négatif testées : 3 (15%) avec absence de catalyse, 2
(10%) avec une faible catalyse et 15 (75%) avec une catalyse bien marquée,
-
pour les 12 bactéries à Gram positif testées : 4 (33%) avec absence de catalyse, 2
(16%) avec une faible catalyse et 6 (50%) avec une catalyse bien marquée.
La proportion de bactéries capables de catalyser la réduction électrochimique du
dioxygène est à nouveau plus élevée chez les bactéries à Gram négatif que chez les bactéries à
Gram positif. Pour les bactéries présentant une faible catalyse les proportions sont à peu près
équivalentes. En ce qui concerne les bactéries ne présentant aucune catalyse la proportion est
plus de deux fois plus élevée chez les bactéries à Gram positif que chez les bactéries à Gram
négatif. Ces observations tendraient à confirmer l’idée selon laquelle le groupe des bactéries à
Gram positif renfermerait moins de potentialités en termes d’électroactivité.
112
proviennent des tests en voltammétrie cyclique effectués après 1h ou 3h de contact entre la suspension bactérienne et les électrodes.
Tableau IV.1. Electroactivité, taxonomie et caractérisation phénotypique des isolats à Gram négatif de biofilms épilithiques électroactifs. Estart, Ipic et Epic
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
113
proviennent des tests en voltammétrie cyclique effectués après 1h ou 3h de contact entre la suspension bactérienne et les électrodes.
Tableau IV.2. Electroactivité, taxonomie et caractérisation phénotypique des isolats à Gram positif de biofilms épilithiques électroactifs. Eshift, Ipic et Epic
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
114
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Attardons-nous maintenant sur les différences observées en fonctions des classes,
ordres, familles, genres et espèces. Tout d’abord, en fonction des classes, on remarque que
chez les γ-Proteobacteria tous les isolats testés sont capables de catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène (Figure IV.4). C’est d’ailleurs dans cette famille que l’on
retrouve les Pseudomonaceae (P. fluorescens et P. putida) et Aeromonas sharmana pour
lesquelles on observe les plus forts courants de catalyse. En revanche, chez les Actinobacteria,
la moitié des bactéries testées est incapable de catalyser cette réduction.
12
10
Catalyse bien marquée
Nombre d'isolats
8
Catalyse faible
Aucune catalyse
6
4
2
0
Flavobacteria
α-Proteobacteria
β-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
Actinobacteria
Bacilli
Figure IV.4. Nombre d’isolats testés produisant une catalyse de la réduction électrochimique du
dioxygène bien marquée, une catalyse faible ou aucune catalyse, en fonction des classes de bactéries.
Gram négatif : Flavobacteria, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria et γ-Proteobacteria et Gram positif :
Actinobacteria et Bacilli.
Au sein d’une même famille et même parfois au sein d’un même genre, différents
comportement sont observés. Par exemple dans la famille des Flavobacteriaceae, Myroides
odoratus ne présente aucune catalyse contrairement à Flavobacterium johnsonia et
Chryseobacterium
ureilyticum.
La
même
observation
concerne
la
famille
des
Microbacteriaceae au sein de laquelle 3 bactéries sont incapables de catalyser la réduction du
dioxygène, une est capable d’une faible catalyse et Frigoribacterium faeni donne une des plus
fortes catalyses avec un Ipic de -14,5 µA. De même, l’appartenance à un genre ne garantit pas
115
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
un comportement catalytique identique. En effet, Bacillus flexus et Bacillus cereus testés dans
cette étude assurent respectivement une faible catalyse et aucune catalyse (Tableau IV.2),
alors que Bacillus subtilis, testé lors de l’étude sur les bactéries d’intérêt médical, présente
une forte catalyse (§ IV.2).
Enfin, aucune corrélation n’apparaît entre catalyse de la réduction électrochimique du
dioxygène et présence de cytochrome c oxydase chez les bactéries testées. Ceci confirme les
résultats précédents (§ IV.2) concernant des bactéries d’intérêt médical.
IV.4 Conclusion
La catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène a été étudiée avec de
nombreuses bactéries d’intérêt médical et issues de biofilms épilithiques de rivière. Le
premier point important réside dans le fait que plusieurs souches à Gram positif, comme M.
luteus et B. subtilis sont capables de réaliser cette catalyse. Ce travail montre que les bactéries
à Gram négatif ne doivent pas être les seules pistes de recherche dans le domaine de la
génération de courant par voie bactérienne.
Ensuite, des souches de références et des isolats cliniques, provenant ni de piles à
combustibles microbiennes ni de quelconques biofilms électroactifs, peuvent s’avérer
capables d’un transfert d’électrons avec une électrode. Cela signifie que de nombreuses
souches, quelle que soit leur origine, peuvent être considérées comme des micro-organismes
potentiellement électroactifs.
De plus, cette propriété semble très répandue, puisqu’au total, 75% des souches
présentées dans ce chapitre sont capables de catalyser la réduction électrochimique du
dioxygène. Certaines classes comportent un plus grand nombre de bactéries électroactives que
d’autres, comme les γ-Proteobacteria par exemple. Mais au sein d’un même genre il peut y
avoir des comportements différents. C’est le cas pour les genres Bacillus et Staphylococcus.
Ces remarques, en complément des observations faites sur différentes souches de P.
aeruginosa dans le chapitre III, tendent à prouver que cette propriété est plus vraisemblement
liée à l’espèce. Cependant, cela devrait être confirmé sur différentes souches d’autres espèces
que P. aeruginosa.
116
Chapitre IV : Catalyse de la réduction du dioxygène par d’autres bactéries
Enfin, des enzymes classiquement impliquées dans le transfert d’électrons, comme la
catalase et la cytochrome c oxydase ne semblent pas être responsables de cette catalyse
puisque des bactéries ne possédant ni catalase ni cytochrome c oxydase en sont capables, ce
qui confirme les résultats présentés dans le chapitre III. Cependant, nous suspectons toujours
l’activité de protéines membranaires qui font l’objet du chapitre suivant.
117
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
118
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
V.1 Introduction
Il a été montré dans le chapitre précédent que la catalyse de la réduction
électrochimique du dioxygène était une propriété très répandue chez les bactéries aérobies,
qu’elles soient à Gram positif ou négatif. Plusieurs tests (voir chapitre III) laissent envisager
le rôle d’une activité enzymatique à la surface des bactéries. Ce chapitre a pour objectif de
faire le lien entre l’activité observée chez les bactéries et celle observée pour des enzymes ou
des molécules seules.
De nombreuses enzymes ont été analysées par voie électrochimique, notamment en
voltammétrie cyclique. Les cytochromes par exemple, ont été largement étudiés et ce bien
avant que leur implication ne soit démontrée lors de transferts directs d’électrons entre les
bactéries et les électrodes dans des PCM (Friedrich et al., 2008; Lojou et al., 2005). La
rubrédoxine, dont nous avons déjà parlé dans le chapitre III, a également été analysée (dos
Santos et al., 2003). La catalase est une autre enzyme membranaire étudiée, mais cette fois
pour sa capacité à catalyser la réduction électrochimique du dioxygène. Cette enzyme est
composée de quatre sous-unités identiques comprenant chacune une Fe(III)-protoporphyrine
IX. Ces quatre sites actifs sont composés de noyaux pyrroles au centre desquels se trouve un
atome de fer qui peut être oxydé et réduit. Cette enzyme catalyse la dismutation du péroxyde
d’hydrogène en dioxygène et en eau en évitant la formation de radicaux libres (2H2O2 → O2 +
2H2O). La catalase se retrouve chez la plupart des micro-organismes aérobies puisqu’elle
protège les cellules des effets toxiques du péroxyde d’hydrogène produit lors du phénomène
de respiration aérobie. Le transfert direct d’électrons entre la catalase et une électrode a été
étudié récemment. Les chercheurs ont montré que la catalase était capable d’utiliser une
électrode de carbone vitreux comme donneur d’électrons pour catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène. En effet, lorsque l’enzyme est immobilisée sur l’électrode, la
réduction du dioxygène apparaît pour des potentiels plus élevés, et des intensités de courant
plus fortes sont obtenues (Lai et Bergel, 2000). Les auteurs émettent ensuite des hypothèses
quant à l’effet de l’orientation de la molécule lors de son immobilisation sur l’électrode. En
effet, l’hème (site actif) est accessible par un seul canal long de 30 Å qui est bordé de résidus
hydrophobes (Fita et Rossmann, 1985). La fixation de l’enzyme par le DMSO permettrait de
l’orienter de façon à ce que le transfert d’électrons soit possible depuis l’électrode vers le site
actif (Lai et Bergel, 2002). Cette enzyme a été mise en cause dans certains transferts
119
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
d’électrons lors de réactions cathodiques entre des cellules de Pseudomonas sp. et des
électrodes. En effet, les chercheurs ont montré que l’augmentation de courants cathodiques
observée en présence de la bactérie était corrélée à son activité catalase (Busalmen et al.,
2002). Ils supposent donc que la catalase joue un rôle important dans la biocorrosion.
La première partie de ce chapitre est consacrée à l’étude du phénomène pour des
bactéries de P. aeruginosa PA01 fixées (mortes mais intactes). Ces expériences visent à
démontrer la nécessité ou non d’une activité métabolique des cellules pour que la catalyse ait
lieu. La deuxième partie étudie l’activité électrochimique de molécules directement fixées sur
l’électrode. Les molécules testées sont la catalase et l’hémine ainsi que deux molécules de
porphyrine. Elles ont été choisies à cause de leur site actif commun porphyrinique. Les
porphyrines sont composées de quatre sous-unités pyrrole combinées avec des métaux.
Lorsque ce métal est un atome de fer on parle souvent d’hème. Les enzymes contenant des
porphyrines sont très abondantes dans le monde du vivant. En effet, elles sont impliquées
dans de nombreuses chaînes de transport d’électrons et en particulier dans le métabolisme de
l’oxygène. Pour en citer quelques unes : catalases, oxydases, peroxydases, cytochromes,
hémoglobine (Tsiftsoglou et al., 2006)… Toutes ces enzymes sont des candidats potentiels
pour l’activité catalytique que nous avons détectée chez de nombreuses bactéries aérobies.
V.2 Activité métabolique
Dans le chapitre III, plusieurs résultats nous ont poussés à conclure à une processus
enzymatique pour expliquer la catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène chez P.
aeruginosa et un grand nombre d’autres bactéries. C’est notamment le cas de l’expérience
réalisée sur le filtrat de PA01 qui montre une très faible activité de ce filtrat, probablement
due à un faible relargage de la molécule active dans le milieu, qui est totalement perdue
lorsque ce filtrat est chauffé à 90°C pendant 15 min. Dans cette partie nous avons tenu à
déterminer si cette activité enzymatique était liée au métabolisme de la cellule.
Des tests ont été effectués pour analyser la nécessité d’une activité métabolique de la
cellule pendant le transfert d’électrons. Les voltammogrammes réalisés sur des cellules
mortes (traitées au méthanol pendant 30 min), même après une heure de contact entre ces
cellules et les électrodes, ne font apparaître aucune catalyse de la réduction du dioxygène
120
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
(Figure V.1 A). En revanche, nous observons la catalyse lorsque les bactéries sont tuées à la
surface de l’électrode après une heure de contact (Figure V.1 B). Un test similaire a été
effectué sur des bactéries tuées à la surface de l’électrode mais après seulement quelques
secondes de contact entre les bactéries et l’électrode. Aucune catalyse ne s’observe sur cette
électrode.
Figure V.1. Effets de différents traitements au méthanol sur la catalyse de la réduction du dioxygène
par P. aeruginosa PA01. A : VC sur le tampon seul (ligne a) après ajout de cellules de PA01
préalablement traitées au méthanol (ligne b) et après une heure sous agitation (ligne c). B : VC sur du
tampon seul (ligne a), après ajout de cellules de PA01 (ligne b) et après une heure d’agitation
l’électrode de travail est enlevée, traitée au méthanol et plongée dans du tampon phosphate propre
(ligne c).
Ces expériences montrent que les cellules doivent être vivantes pendant l’heure de
contact. Après ce délai, probablement nécessaire pour la production ou la relocalisation de
protéines ou d’autres composés microbiens à la surface des bactéries, les cellules peuvent être
tuées sans que leur perte d’activité métabolique n’influence la catalyse. Cette observation
conforte l’hypothèse de l’implication de molécules membranaires mais sans lien direct avec
l’activité métabolique de la cellule. Plusieurs composés biologiques adsorbés seuls sur une
électrode permettent de catalyser la réduction électrochimique du dioxygène sans aucune
implication de la cellule bactérienne, par exemple la catalase (Lai et Bergel, 2002).
121
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
V.3 Activité de molécules et d’enzymes directement fixées sur l’électrode
Dans cette partie, nous analysons la réponse en voltammétrie cyclique de différentes
molécules disposant de sites actifs porphyriniques dans le but de déterminer si ce type de
molécules pourrait être responsable du transfert d’électrons observé entre l’électrode et la
bactérie lors de la catalyse de la réduction du dioxygène. Les objectifs de cette partie restent
assez modestes puisque nous avons fait varier peu de paramètres pour l’étude des molécules
(seulement trois vitesses de balayage testées : 50, 100 et 500 mV/s). Cependant, les
voltammogrammes sont reproductibles (trois manipulations indépendantes pour chaque
enzyme) et permettent d’apporter un complément important aux analyses menées sur les
bactéries.
Nous avons sélectionné tout d’abord la catalase pour reproduire des résultats déjà
décrits dans la litérrature (Lai et Bergel, 2000), puis l’hémine (Figure V.2 A), qui est un
élément constitutif des hémoprotéines (hémoglobine, myoglobine, cytochromes, catalase,
peroxydase…), et pour finir deux porphyrines, une de magnésium et l’autre de fer (Figure V.2
B et C).
A
B
C
Figure V.2. Formules de l’hémine (A), de la porphyrine de magnésium (B) et de la prophyrine de fer
(C).
Le protocole de fixation des molécules sur l’électrode fait intervenir du DMSO. Nous
avons donc effectué un témoin sur une électrode modifiée après traitement au DMSO sans
enzyme. Aucune activité parasite pouvant interférer avec l’observation de la catalyse de la
réduction du dioxygène n’est observée sur le voltammogramme témoin (Figure V.3).
122
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
6
4
2
0
I (µA)
-2
-4
-6
-8
b
-10
-12
a
-14
-16
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
E (V/ECS)
Figure V.3. VC témoin après avoir immergé l’électrode dans du DMSO pur pendant 30 min. Ligne a
tampon seul, ligne b après modification de l’électrode au DMSO.
Les résultats obtenus pour les quatre molécules sont regroupés dans la figure V.4. Trois
vitesses de balayage ont été testées : 50, 100 et 500 mV/s. Seuls les voltammogrammes
effectués à 100 mV/s sont présentés, les autres vitesses n’apportant pas d’information
supplémentaire. On remarque que les quatre molécules sont capables de catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène. La catalyse est très forte et équivalente pour les deux
molécules de porphyrines avec Ipic = -23,8 µA (Epic = -0,26 V/ECS) pour la porphyrine de fer
et Ipic = -23 µA (Epic = -0,37 V/ECS) pour la porphyrine de magnésium. L’hémine donne
également une catalyse très forte avec un Ipic de -24 µA (Epic = -0,24 V/ECS), mais le pic
semble plus complexe. Certainement deux réactions d’oxydoréduction différentes se
superposent. La catalyse est bien visible avec la catalase mais beaucoup plus faible avec un
Ipic de -14,6 µA (Epic = -0,45 V/ECS).
Les catalyses mises en évidence pour ces molécules sont tout à fait comparables à
celles observées en présence des bactéries. En effet, les pics les plus forts en présence des
bactéries, par exemple Aeromonas sharmana, atteignent des courants de -20 µA pour des
potentiels de -0,36 V/ECS, proches de ceux observés pour la porphyrine de magnésium.
123
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
20
20
A
15
10
10
5
5
0
I (µA)
I (µA)
15
-5
a
-10
-15
B
0
-5
-10
a
-15
-20
-20
-25
-30
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
b
-25
-0,2
-30
-1,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
b
-1
-0,8
-0,6
E (V/ECS)
C
15
10
5
5
0
I (µA)
I (µA)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,2
0,4
0,6
0,8
20
10
-5
-10
a
0
-10
-15
-20
-20
b
-25
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
E (V/ECS)
D
-5
-15
-30
-1,2
-0,2
E (V/ECS)
20
15
-0,4
a
b
-25
0,2
0,4
0,6
0,8
-30
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
E (V/ECS)
Figure V.4. VC avec la catalase (A), l’hémine (B), la porphyrine de fer (C) et la porphyrine de
magnésium (D). Ligne a : témoin sur du tampon seul, ligne b : après fixation de la molécule sur
l’électrode par le DMSO.
La catalyse de la réduction du dioxygène constatée pour ces molécules est clairement
due à l’atome métallique situé en leur centre. La catalase est une enzyme complexe formée de
plusieurs sous-unités avec un site actif accessible par un seul canal (Fita et Rossmann, 1985).
Cela peut expliquer la faible catalyse observée par rapport à des molécules comportant le
même site actif, mais beaucoup plus petites, et donc plus accessibles, telles que les
porphyrines ou l’hémine. La réaction de réduction du dioxygène est complexe :
O2 + e- → O2•O2•- + 2H+ + e- → H2O2
H2O2 + e- + 2H+ → OH• + H2O
OH• + H+ + e- → H2O
Elle peut être simplifiée en : O2 + 2H+ + 2e- → H2O2 et H2O2 + 2H+ + 2e- → 2H2O. En
fonction de l’étape lors de laquelle interviennent les différentes molécules, la forme des pics
peut s’avérer très différente. Cela pourrait expliquer les différences observées entre l’hémine
et les deux porphyrines. De plus, l’hémine est une molécule plus complexe, contenant des
groupements carboxyles qui pourraient être impliqués dans le double pic observé. De plus
124
Chapitre V : Mécanismes enzymatiques
amples analyses seraient évidemment nécessaires pour conclure complètement sur l’activité
de ces molécules.
V.4 Conclusion
Cette partie permet de compléter le travail entrepris sur la recherche des mécanismes
impliqués dans la catalyse microbienne de la réduction électrochimique du dioxygène. En
effet, nous avons montré que l’activité métabolique des cellules n’était pas nécessaire une fois
l’heure de contact passée entre les bactéries et les électrodes. Cela signifie que le transfert
d’électrons entre l’électrode et le dioxygène n’est pas activement catalysé par les cellules. Il
se fait sans aucun lien avec le métabolisme cellulaire. La thèse selon laquelle des protéines
membranaires seraient impliquées est toujours valable, mais la bactérie n’est pas elle-même
responsable de ce transfert.
Les tests effectués sur des molécules et des enzymes seules immobilisées sur l’électrode
donnent des résultats tout à fait comparables à ceux obtenus pour les bactéries. Bien que
préliminaire, cette étude confirme que l’activité métabolique n’est pas nécessaire pour que le
transfert ait lieu. Les molécules testées comprennent toutes le même site actif à base de
porphyrine, à savoir un atome métallique au milieu de quatre groupements pyrrole. Ce sont
donc vraisemblablement des enzymes porphyriniques qui sont responsables du transfert
d’électrons entre les bactéries et l’électrode dans le cas de la catalyse de la réduction
électrochimique du dioxygène. La catalase n’est pas indispensable au phénomène mais de
nombreuses autres molécules membranaires contiennent ces sites actifs. Il est d’ailleurs tout à
fait possible que plusieurs enzymes participent à la catalyse chez les bactéries. De plus, ces
enzymes sont très répandues chez les bactéries aérobies, ce qui peut expliquer la grande
proportion de bactéries testées capables de catalyser la réduction du dioxygène.
Cette étude mériterait d’être approfondie, d’une part en diminuant les vitesses de
balayage pour essayer de découpler les pics obsérvés avec l’hémine et de mieux les analyser.
D’autre part, en testant ces molécules en absence de dioxygène, ce qui permettrait de vérifier
la présence d’un pic en oxydation.
125
Conclusion générale et perspectives
Conclusion générale et perspectives
126
Conclusion générale et perspectives
Conclusions
L’originalité des travaux présentés dans cette étude est basée sur un phénomène peu
étudié de transfert d’électrons de l’électrode vers la bactérie. C’est en effet la première fois
qu’un tel transfert est démontré chez P. aeruginosa et un grand nombre d’autres bactéries. La
démarche entreprise est également peu commune puisqu’elle consistait à tester un grand
nombre de souches, y compris des bactéries à Gram positif sans lien apparent avec des
biofilms électroactifs. Ces travaux peuvent avoir des implications importantes sur notre vision
de l’électroactivité des bactéries.
L’objectif premier de cette étude était d’étudier un mécanisme de transfert d’électrons
depuis l’électrode vers la bactérie. Un phénomène un peu particulier a été découvert tout
d’abord chez P. aeruginosa. Cette bactérie se révèle capable de catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène, c'est-à-dire qu’en sa présence, la réduction électrochimique du
dioxygène a lieu pour des potentiels plus élevés, et des courants plus importants sont
récupérés. Ce transfert d’électrons n’a lieu qu’après un certains temps de contact entre la
suspension bactérienne et l’électrode, qui se traduit par une détection de bactéries à la surface
de l’électrode. Cependant, l’adhésion ou tout du moins l’adsorption des bactéries à la surface
de l’électrode ne semble pas suffisante pour que le transfert se fasse. Pourtant, nous n’avons
mis en évidence l’implication d’aucun médiateur d’électrons extra-cellulaire soluble ; le
transfert se fait par contact direct entre la bactérie et l’électrode. Les pili ne semblent pas
impliqués puisque des mutants non piliés ont la même propriété que la souche sauvage.
En revanche, plusieurs résultats nous conduisent à penser que des protéines
membranaires sont responsables du phénomène. Nous avons testé quatre molécules
porphyriniques directement sur l’électrode et toutes présentent la même capacité que les
bactéries de catalyser la réduction du dioxygène. Ces travaux montrent l’ubiquité du
phénomène chez ces enzymes et suggèrent que des molécules possédant des sites actifs à base
de porphyrine sont responsables du phénomène chez les bactéries. La catalase fait partie de
ces enzymes mais n’est pas nécessaire pour le transfert d’électrons observé dans cette étude.
En effet, des mutants défectueux pour la production de catalase sont toujours capables de
réduire le dioxygène. D’autres protéines membranaires pourraient jouer ce rôle, comme les
cytochromes. Il est possible que plusieurs enzymes soient impliquées à la fois. Nous avons
127
Conclusion générale et perspectives
également montré que le transfert d’électrons entre l’électrode et la bactérie ne nécessitait
aucunement une activité métabolique de la cellule. Une fois un certain temps de contact
écoulé entre les bactéries et l’électrode, les cellules peuvent être tuées sans que la catalyse ne
soit perdue. Cela signifie que le transfert d’électrons se fait probablement entre des protéines
membranaires de la cellule et l’électrode mais sans lien direct avec le métabolisme cellulaire.
Ce mécanisme est illustré dans la figure 1. Enfin, plusieurs souches de P. aeruginosa ont été
testées. Toutes présentent la même propriété quelque soit leur phénotype, notamment
mucoïde ou non mucoïde.
O2
H2O
Electrode
Protéine
membranaire
porphyrinique
oxydée
Protéine
membranaire
porphyrinique
réduite
Electron
Bactérie
Figure 1. Proposition du mécanisme de transfert d’électrons entre l’électrode et la bactérie dans le cas
de la catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène.
Des analyses ont également été faites en chronoampérométrie, toujours sur P.
aeruginosa. Aucune augmentation du courant n’a été montrée par cette méthode. Cela signifie
que les phénomènes de transfert d’électrons mis en évidence en voltammétrie cyclique ne sont
pas forcément durables et peuvent ne pas mener à une production de courant en
chronoampérométrie et donc en pile à combustible. Cela remet en cause l’usage de la
voltammétrie cyclique comme moyen de détection de l’électroactivité. Pourtant cette méthode
est très souvent utilisée pour analyser le transfert d’électrons entre une bactérie isolée d’un
biofilm électroactif dans une PCM et l’électrode. Certes, des systèmes d’oxydoréduction
présents dans la bactérie ou son milieu environnant peuvent être mis en évidence par cette
128
Conclusion générale et perspectives
technique, mais cela ne veut pas dire qu’ils sont responsables de l’augmentation du courant en
PCM.
Un grand nombre d’autres bactéries a été testé pour déterminer si ce phénomène était
spécifique de P. aeruginosa ou non. Des souches de référence, des isolats cliniques et des
souches environnementales ont été testées. Il s’avère que sur les 52 bactéries testées, 75 %
sont capables de catalyser la réduction électrochimique du dioxygène. Ce phénomène semble
très répandu et n’est absolument pas spécifique d’une seule espèce. Même des bactéries à
Gram positif sont capables d’un tel transfert, ce qui est peu décrit dans la littérature. L’étude
de la répartition de cette capacité en fonction des classes, familles ou genres ne nous a pas
permis de mettre en évidence une tendance particulière. D’ailleurs, au sein d’un même genre,
des comportements différents sont parfois observés. En revanche, au sein d’une même espèce,
la propriété semble être conservée. Cette partie du travail démontre que cette capacité est très
répandue chez les bactéries aérobies. Une conséquence importante pour la recherche dans le
domaine des bactéries électroactives est que, finalement, n’importe quelle souche, qu’elle soit
isolée d’un biofilm électroactif ou non, peut être considérée comme une bactérie
potentiellement électroactive. Nous suggérons que la recherche dans ce domaine ne doit pas
se cantonner aux seules bactéries issues de piles à combustible microbiennes.
Perspectives et applications potentielles
La première des perspectives est d’essayer de progresser dans la compréhension des
mécanismes cellulaires impliqués dans ce phénomène. Nous avons montré que des enzymes
porphyriniques étaient sans doute responsables du transfert d’électrons. Certaines enzymes ne
sont pas indispensables dans cette catalyse comme la catalase, la cytochrome c oxydase et la
rubrédoxine réductase, mais nous n’avons pas déterminé précisément l’enzyme ou les
enzymes réellement impliquées. La mise en œuvre de cette recherche peut se heurter à
différents écueils, notamment le fait qu’un certains nombre de protéines potentiellement
impliquées sont indispensables à la survie bactérienne (gènes difficilement délétables) et que
plusieurs enzymes peuvent être impliquées à la fois. Cependant, certains gènes ont déjà été
mutés chez des espèces de Pseudomonas dans la voie métabolique des porphyrines, hemA et
hemH par exemple (Baysse et al., 2001). Ces mutants peuvent être intéressants d’une part
pour confirmer l’implication des porphyrines et d’autre part pour cibler dans cette voie
129
Conclusion générale et perspectives
métabolique les étapes indispensables à la catalyse de la réduction électrochimique du
dioxygène, notamment si différentes enzymes sont impliquées.
Les autres perspectives sont plus orientées vers les applications possibles de cette
découverte. La première application à laquelle on peut penser est bien évidemment la
production d’électricité dans les PCM. En effet, nous avons mis en évidence la catalyse d’une
réaction cathodique. Cela peut sembler intéressant dans la mise au point de biocathodes,
d’autant plus que la réaction à catalyser à la cathode d’une PCM est souvent la réduction du
dioxygène. Cependant, le phénomène décrit n’est pas durable (aucun courant en
chronoampérométrie), sans doute parce qu’il n’est pas couplé au métabolisme de la cellule.
De plus la catalyse observée ici a lieu pour des potentiels trop faibles pour être vraiment
intéressante dans les applications de type biocathodes.
Par ailleurs, la méthode mise au point pourrait être utilisée comme méthode de
détection de l’électroactivité de bactéries. Mais une fois encore, les mesures de voltammétrie
cyclique ne renseignent pas sur la capacité à produire du courant de manière durable en
chronoampérométrie ou en PCM.
Le dernier point est la simple détection de bactéries, et même plus spécifiquement
d’adhésion de bactéries. En effet, la méthode présentée dans ce travail offre la possibilité de
détecter la présence de cellules adhérées à l’électrode. Cette détection est facilement
observable (déplacement du pic de réduction du dioxygène) et rapide, le test ne durant que
quelques secondes ou minutes. De plus, il est possible de détecter les toutes premières phases
d’adhésion, et donc de formation du biofilm, puisque la catalyse est visible dès les premières
minutes de contact entre les bactéries et l’électrode. Cela peut être très intéressant dans le
domaine de la détection de bactéries opportunistes, dans les réseaux d’eau et de productions
d’eau traitée (à faible contamination) par exemple, où il est primordial de parvenir à détecter
la contamination le plus tôt possible lors de la formation du biofilm. En effet, une fois le
biofilm mature, l’élimination devient très difficile. L’avantage de cette technique est qu’elle
peut être rapide : elle ne nécessite aucune phase préliminaire d’isolement ou de culture des
micro-organismes comme cela est le cas dans la plupart des méthodes de détection.
Cependant, il reste encore beaucoup de travail pour arriver à un dispositif directement
implantable dans les réseaux d’eau, notamment la miniaturisation du dispositif et la
vérification de sa fonctionnalité in situ. De plus, ce capteur n’est pas spécifique et nous
130
Conclusion générale et perspectives
n’avons encore aucun moyen de préciser le type de micro-organisme présent sur l’électrode.
Autre limite, toutes les bactéries ne sont pas détectables par cette technique. Par exemple, il
nous est encore impossible de détecter S. aureus. Malgré ces quelques bémols, cette méthode
reste compétitive si on la compare aux autres méthodes électrochimiques existantes pour la
détection d’adhésion. Les capteurs qui existent à l’heure actuelle sont essentiellement des
capteurs d’encrassement. Ils ne font aucune différence entre les micro-organismes et la
matière inerte. La méthode décrite dans cette étude permet la détection spécifique de bactéries
adsorbées.
Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau phénomène de transfert
d’électrons entre l’électrode et la bactérie qui permet de catalyser la réduction
électrochimique du dioxygène. Il apporte une meilleure compréhension de ces mécanismes, et
de l’ensemble des résultats présentés pourrait finalement émerger de nouvelles applications
autres que la production d’énergie, notamment un projet en détection de biocontamination
lors des premières étapes d’adhésion.
131
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143
Annexes
Annexes
144
Annexes
Annexe I : Liste des abréviations
ADN : acide désoxyribonucléique
I : intensité
ATCC : American Type Culture Collection
MFC : microbial fuel cell
CA : chronoampérommétrie
MOB : manganese oxidizing bacteria
CHU : Centre Hospitalo-Universitaire
MRS : milieu de Man, Rogosa et Sharpe
CIP : Collection de l’Institut Pasteur
NADH : nicotinamide adénine
DMSO : dimethylsulfoxide
dinucléotide H
DO : densité optique
NASA : National Aeronautics and Space
E : potentiel
Administration
ECS (SCE en anglais) : électrode au
PCM : pile à combustible microbienne
calomel saturée
PCR : polymerase chain reaction
ELISA : enzyme-linked immunosorbent
PSM : poste de sécurité microbiologique
assay
QS : quorum sensing
EPS : exopolysaccharide
RT-PCR : reverse transcriptase PCR
ESH : électrode standard à hydrogène
SDS : sodium dodecyl sulfate
FERMAT : fédération Fluides, Energie,
TS : milieu Trypcase Soja
Réacteurs, Matériaux et Transferts
UFC : unité formant colonie
GC-MS : gaz chromatography-mass
VC : voltammétrie cyclique
spectrometry
145
Annexes
Annexe II : Table des figures
Figure I.1 Formule développée des alginates. ____________________________________ 14
Figure I.2. Représentation schématique des différentes étapes de formation d’un biofilm de
P. aeruginosa et visualisation par microscopie à transmission : 1 adhésion réversible, 2
adhésion irréversible/formation de micro-colonies, 3 et 4 maturation, 5 détachement (Stoodley
et al., 2002)._______________________________________________________________ 16
Figure I.3. Mécanisme moléculaire du quorum sensing chez P. aeruginosa (Ruimy et
Andremont, 2004). _________________________________________________________ 19
Figure I.4. Facteurs génétiques et phénotypiques intervenant lors de la formation du biofilm à
P. aeruginosa (Davey et O'Toole, 2000). ________________________________________ 21
Figure I.5. Nombre de publications concernant les piles à combustible microbiennes en
fonction de l’année de publication (données issues de l’ISI Web of Science). ___________ 23
Figure I.6. Principe d’une pile à combustible microbienne (http://pcm-lgc.blogspot.com/). 24
Figure I.7. Densités de puissance de PCM, normalisées par rapport à la surface d’électrode
(Logan, 2009). Les données représentées par des cercles proviennent d’études publiées entre
1999 et 2006 par différents groupes de recherche utilisant du dioxygène à la cathode (Logan
et Regan, 2006). Les triangles représentent des études plus récentes avec des densités de
puissance plus élevées, pour lesquelles la puissance a été normalisée par rapport à la surface
de la cathode puisque la puissance est limitée par la cathode. ________________________ 25
Figure I.8. Environnements utilisés comme sources de micro-organismes électroactifs pour
ensemencer le compartiment anodique des piles à combustible microbiennes. Entre
parenthèses est précisé le nombre de publications mentionnant la source de micro-organismes
électroactifs citée. Cette étude est basée sur un total de 57 publications (Parot, 2007)._____ 26
Figure I.9. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons indirect entre
une bactérie et une électrode via des médiateurs exogènes. __________________________ 30
Figure I.10. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons entre une
bactérie et une électrode via des médiateurs endogènes. ____________________________ 31
Figure I.11. Formule semi-développée de la molécule de riboflavine. _________________ 32
Figure I.12. Formules semi-développées de trois transporteurs d’électrons suspectés dans une
pile à combustible microbienne à E. coli (Zhang et al., 2008b). ______________________ 32
Figure I.13. Mécanisme hypothétique de transfert d’électrons entre E. coli et une électrode
(Qiao et al., 2008) (A) et formules semi-développées de la quinone (B) et de l’hydroquinone
(C).______________________________________________________________________ 33
Figure I.14. Formule semi-développée de la molécule de pyocyanine._________________ 33
146
Annexes
Figure I.15. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons direct entre
une bactérie et une électrode via des pili conducteurs. ______________________________ 34
Figure I.16. Représentation schématique du mécanisme de transfert d’électrons direct entre
une bactérie et une électrode via des protéines membranaires.________________________ 36
Figure I.17. Modèle du transfert d’électrons chez Geobacter sulfurreducens depuis le NADH
issu de l’oxydation de matières organiques vers une électrode (Lovley, 2008).___________ 37
Figure I.18. Représentation schématique du dépôt et de la ré-oxydation du manganèse utilisés
comme réaction cathodique (Rhoads et al., 2005). _________________________________ 41
Figure I.19. Distributions par application et par micro-organisme du nombre de travaux
concernant la détection de pathogènes (Lazcka et al., 2007)._________________________ 43
Figure I.20. (a) Nombre approximatif d’articles utilisant différentes techniques pour détecter
et/ou identifier des bactéries pathogènes. (b) Evolution du nombre de travaux publiés sur la
détection de bactéries pathogènes de 1985 à 2005 (Lazcka et al., 2007). _______________ 44
Figure I.21. Représentation schématique des principales stratégies d’immobilisation et des
étapes clé. Adsorption directe : a1, nettoyage de la surface ; a2, immersion dans la solution
d’anticorps ; a3, lavage ; a4, addition de l’échantillon ; a5, détection. Système avidinebiotine : b1, nettoyage de la surface ; b2, fixation de l’avidine ; b3, addition d’anticorps
biotinylés ; b4, lavage ; b5, addition de l’échantillon ; b6, détection. Monocouches autoassemblées : c1, nettoyage de la surface ; c2, formation de la monocouche auto-assemblée ;
c3, activation ; c4, immobilisation des anticorps ; c5, lavage ; c6, addition de l’échantillon ;
c7, détection. ______________________________________________________________ 47
Figure II.1. Electrodes utilisées dans cette étude : électrode de carbone vitreux (A), électrode
en acier inoxydable (B), contre-électrodes en platine (C et D) et électrode de référence au
calomel saturée (E)._________________________________________________________ 58
Figure II.2. Exemple d’un voltammogramme cyclique illustrant la réduction du dioxygène.
Les flèches marquent le sens du balayage de potentiel effectué à 100 mV/s._____________ 59
Figure II.3. Montage à trois électrodes en bécher._________________________________ 60
Figure II.4. Photographie du montage pour les mesures de chronoampérométrie en réacteur
sous PSM. ________________________________________________________________ 62
Figure III.1. Etudes en voltammétrie cyclique des mutants non pilié de P. aeruginosa PAKNP pilA-/ladZ25 (A), PAK-NP pilA-/IC41 (B), PAK-NP pilA-/ladN66 (C). Tampon
phosphate après ajout des bactéries (ligne a) et après une heure de contact entre les bactéries
et les électrodes sous agitation (ligne b)._________________________________________ 84
147
Annexes
Figure III.2. Intensité du pic de réduction du dioxygène catalysée par P. aeruginosa PA01 en
fonction de la racine carrée de la vitesse de balayage. Valeurs moyennes et écarts-types
calculés sur trois expériences indépendantes. Régression linéaire : R² = 0,9957. _________ 85
Figure III.3. Voltammogrammes cycliques après 1h de contact entre les électrodes et une
suspension de P. aeruginosa à des concentrations différentes évaluées par la densité optique
(DO) à 640 nm. ____________________________________________________________ 86
Figure III.4. Représentation graphique de la quantité d’électricité (aire sous la courbe de la
catalyse de la réduction du dioxygène) en fonction de la concentration en bactéries évaluée
par la densité optique (DO) à 640 nm. Régression linéaire : R² = 0,9327. _______________ 86
Figure III.5. Voltammogramme cyclique sur du tampon phosphate seul (ligne a), après ajout
du lysat de P. aeruginosa PA01 (ligne b), et après une heure de contact entre le lysat et les
électrodes sous agitation (ligne c). _____________________________________________ 87
Figure III.6. Voltammogramme cyclique sur du tampon phosphate seul (ligne a), sur du
filtrat de P. aeruginosa PA01 inactivé (ligne b), et après une heure de contact entre ce filtrat et
les électrodes sous agitation (ligne c).___________________________________________ 88
Figure III.7. Voltammogrammes cycliques sur du milieu liquide TS seul (ligne a), après ajout
de P. aeruginosa PA01 (ligne b), et après une heure de contact entre les bactéries et les
électrodes (ligne c). _________________________________________________________ 89
Figure III.8. Etudes en voltammétrie cyclique de la souche sauvage TBwt (A) et de la souche
mutée qui ne produit pas de rubrédoxine TB PA5349 KO mutant (B). Tampon phosphate
(ligne a) après ajout des bactéries (ligne b) et après une heure de contact entre les bactéries et
les électrodes sous agitation (ligne c).___________________________________________ 90
Figure III.9. Voltammogrammes cycliques de la souche pigmentée (A) et de la souche non
pigmentée (B) à 100 mV/s. Tampon phosphate (ligne a) après ajout des bactéries (ligne b) et
après une heure de contact entre les bactéries et les électrodes sous agitation (ligne c). ____ 91
Figure III.10. CA continue sur une suspension de P. aeruginosa PA01 dans du tampon à
potentiel imposé (-0,35 V/ECS). _______________________________________________ 92
Figure III.11. CA discontinue témoin sur du tampon seul à potentiel imposé (-0,35 V/ECS).
Les temps annoncés correspondent aux temps d’attente sous agitation du tampon en présence
des électrodes. _____________________________________________________________ 93
Figure III.12. CA discontinue sur une suspension de P. aeruginosa PA01 dans du tampon à
potentiel imposé (-0,35 V/ECS). Les temps annoncés correspondent aux temps d’attente sous
agitation de la suspension bactérienne en présence des électrodes. ____________________ 94
Figure IV.1. VC sur du filtrat de P. aeruginosa seul (ligne a), sur du filtrat de P. aeruginosa
PA01 après ajout de S. aureus (ligne b) et après 1h d’attente sous agitation (ligne c). ____ 109
Figure IV.2. Voltammogrammes cycliques sur des cellules de S. aureus (A) et E. coli (B) et
sur des cellules de S. aureus et E. coli préalablement soumise à un stress oxydant à l’H2O2
148
Annexes
(respectivement C et D). Tampon phosphate (lignes a) après ajout des bactéries (lignes b) et
après 1h (lignes c) et 3h (lignes d) de contact entre les bactéries et les électrodes sous
agitation. ________________________________________________________________ 110
Figure IV.3. Voltammogrammes cycliques obtenus pour a) un isolat incapable de catalyser la
réduction électrochimique du dioxygène (GQ398344 : Massilia timonae), b) un isolat capable
d’une faible catalyse (GQ398350 : Variovorax paradoxus) et c) un isolat capable d’une forte
catalyse (GQ398335 : Aeromonas sharmana). Les courbes grises correspondent aux
voltammogrammes obtenus avant l’ajout des cellules et les courbes noires aux
voltammogrammes obtenus après 3 h (a) et 1 h (b et c) de contact entre les électrodes et la
suspension bactérienne (Lyautey et al., en préparation). ___________________________ 112
Figure IV.4. Nombre d’isolats testés produisant une catalyse de la réduction électrochimique
du dioxygène bien marquée, une catalyse faible ou aucune catalyse, en fonction des classes de
bactéries. Gram négatif : Flavobacteria, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria et γ-Proteobacteria
et Gram positif : Actinobacteria et Bacilli. ______________________________________ 115
Figure V.1. Effets de différents traitements au méthanol sur la catalyse de la réduction du
dioxygène par P. aeruginosa PA01. A : VC sur le tampon seul (ligne a) après ajout de cellules
de PA01 préalablement traitées au méthanol (ligne b) et après une heure sous agitation (ligne
c). B : VC sur du tampon seul (ligne a), après ajout de cellules de PA01 (ligne b) et après une
heure d’agitation l’électrode de travail est enlevée, traitée au méthanol et plongée dans du
tampon phosphate propre (ligne c).____________________________________________ 121
Figure V.2. Formules de l’hémine (A), de la porphyrine de magnésium (B) et de la
prophyrine de fer (C). ______________________________________________________ 122
Figure V.3. VC témoin après avoir immergé l’électrode dans du DMSO pur pendant 30 min.
Ligne a tampon seul, ligne b après modification de l’électrode au DMSO. _____________ 123
Figure V.4. VC avec la catalase (A), l’hémine (B), la porphyrine de fer (C) et la porphyrine
de magnésium (D). Ligne a : témoin sur du tampon seul, ligne b : après fixation de la
molécule sur l’électrode par le DMSO._________________________________________ 124
Figure 1. Proposition du mécanisme de transfert d’électrons entre l’électrode et la bactérie
dans le cas de la catalyse de la réduction électrochimique du dioxygène. ______________ 128
149
Annexes
Annexe III : Table des tableaux
Tableau I.1. Liste non exhaustive des micro-organismes dont l’électroactivité a été
démontrée et caractérisation de cette électroactivité. _______________________________ 26
Tableau II.1. Souches bactériennes d’intérêt médical utilisées dans cette étude : origine et
particularité._______________________________________________________________ 51
Tableau II.2. Souches de P. aeruginosa utilisées dans cette étude : origines et particularités
phénotypiques._____________________________________________________________ 52
Tableau II.3. Indentification des isolats environnementaux provenant de biofilms épilithiques
électroactifs par séquençage de l’ADN 16S (Emilie Lyautey du Laboratoire d’Ecologie
Fonctionnelle à Toulouse). ___________________________________________________ 53
Tableau II.4. Composition du bouillon biofilm modifié.____________________________ 54
Tableau IV.1. Electroactivité, taxonomie et caractérisation phénotypique des isolats à Gram
négatif de biofilms épilithiques électroactifs. Estart, Ipic et Epic proviennent des tests en
voltammétrie cyclique effectués après 1h ou 3h de contact entre la suspension bactérienne et
113
les électrodes.
Tableau IV.2. Electroactivité, taxonomie et caractérisation phénotypique des isolats à Gram
positif de biofilms épilithiques électroactifs. Eshift, Ipic et Epic proviennent des tests en
voltammétrie cyclique effectués après 1h ou 3h de contact entre la suspension bactérienne et
114
les électrodes.
150
Annexes
Annexe IV : Titre et résumé en anglais
Title:
Microbial catalysis of the electrochemical reduction of oxygen
Summary:
Electroactive bacteria are able to directly exchange electrons with electrodes and thus
produce current. This property was discovered in the early 2000s and is very interesting for
microbial fuel cells applications. Many studies have been devoted to the analysis of electronic
transfer from bacteria to electrodes (anodic reaction) but very few to the reverse phenomenon
(cathodic reaction).
The objectives of the present work were first to search for the capacity of catalyzing a
cathodic reaction (oxygen reduction) among a wide range of bacteria including Gram - and
Gram + and second to analyse the mechanisms involved in such a transfer of electrons using
Pseudomonas aeruginosa. Our results show that this property is widespread among bacteria
and suggest that membrane-bound enzymes with porphyrin active sites may be involved.
Finally, this phenomenon could be used to design an interesting tool in the field of bacterial
adhesion detection.
Keywords:
Electroactive bacteria
Oxygen reduction
Pseudomonas aeruginosa
Porphyrins
Detection
151
AUTEUR : Amandine DE ALMEIDA COURNET
TITRE : Etude de la catalyse microbienne de la réduction électrochimique du dioxygène
DIRECTRICES DE THESE : Christine ROQUES et Marie-Line DELIA
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Toulouse, le 30 avril 2010
RESUME :
Les bactéries électroactives sont capables d’échanger directement des électrons avec
une électrode et ainsi de générer du courant. Cette propriété mise en évidence au début des
années 2000 est très intéressante pour la mise au point de piles à combustible microbiennes.
De nombreuses études se consacrent au transfert d’électrons de la bactérie vers l’électrode
(réaction anodique), mais très peu analysent le phénomène inverse (réaction cathodique).
Les objectifs de ce travail ont été de rechercher cette capacité à catalyser une réaction
cathodique, en l’occurrence la réduction du dioxygène, chez un grand nombre de bactéries,
Gram – et Gram +, et d’étudier les mécanismes impliqués dans ce transfert d’électrons chez
Pseudomonas aeruginosa. Nos résultats démontrent l’ubiquité du phénomène et suggèrent
l’implication d’enzymes membranaires porphyriniques. La propriété mise en évidence dans ce
travail pourrait être utilisée pour mettre en place un outil de détection d’adhésion de bactéries.
Titre et résumé en anglais au recto de la dernière page
MOTS-CLES : bactéries électroactives, réduction du dioxygène, Pseudomonas aeruginosa,
porphyrines, détection
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Ingénieries Microbienne et Enzymatique
INTITULE ET ADRESSE DES LABORATOIRES :
-
LU49, Adhésion bactérienne et formation de biofilms, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, 35 chemin des Maraîchers, 31062 TOULOUSE cedex 9
Laboratoire de Génie Chimique CNRS UMR 5503, 4 allées Emile Monso,
31432 TOULOUSE cedex 4