Les progrès de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose

INT J TUBERC LUNG DIS 1 (2): 95-100
©1997 IUATLD
Auteur pour correspondence : Ian M. Orme, Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology.
Colorado State University, Fort Collins, CO 80523 USA. Tel: [phone]. Fax: [phone].
[Traduction de l’article "Progress in the development of new vaccines against tuberculosis" Int J Tuberc Lung
Dis 1997; 1 (2): 95-100.]
EDITORIAL
Les progrès de la recherche sur les vaccins contre la
tuberculose
I. M. Orme
Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology. Colorado State University, Fort Collins,
Etats-Unis
____________________________________________________________________RESUME
Au cours de ces dernières années, la mise au point de nouveaux vaccins antituberculeux a connu un
renouveau d’intérêt. L’article qui suit passe en revue brièvement les progrès en ce domaine, qui ont vu
apparaître de nouvelles méthodes innovantes, comme le recours à des vaccins à vecteur plasmidique de
l’ADN, des vaccins par BCG recombinant et mutant, et des sous-unités vaccinales.
MOTS-CLES : vaccins ; BCG ; sous-unités vaccinales ; vaccins à ADN ; modèle animal.
COMME CELA A DEJA été démontré dans d’aut-
res article,1-3 les variations d’efficacité du vaccin
par le BCG dans diverses parties du monde,
ajoutées à d’autres facteurs préoccupants, telle
l’épidémie due au virus de l’immunodéficience
humaine (VIH), et l’augmentation croissante des
cas de tuberculose chimiorésistante, ont stimulé les
recherches visant au développement de meilleurs
vaccins antituberculeux. Chose encourageante, ces
recherches ont donné le jour à des méthodes très
novatrices, en particulier la recherche de vaccins à
vecteur plasmidique de l’ADN, de vaccins par
BCG recombinant et mutant, de sous-unités vac-
cinales, etc. Encore plus encourageant : les
premières observations en ce domaine indiquent
que plusieurs de ces méthodes pourraient se
révéler très prometteuses.
LA REPONSE IMMUNITAIRE DE L’HOTE A
LA TUBERCULOSE ET SON
ACCELERATION PAR LA VACCINATION
Après ingestion par un macrophage à la surface
des alvéoles pulmonaires, le bacille Mycobacte-
rium tuberculosis peut être tué, ou bien passer des
poumons à l’estomac. Si le bacille n’est pas tué, le
macrophage peut s’aplatir et adhérer à la surface
du poumon en y provoquant une lésion locale ; il
peut aussi transporter le bacille vers les tissus lym-
phoïdes drainant le poumon.
Les macrophages restant à la surface des alvéo-
les engendreront des molécules de l’inflammation,
favorisant une perméabilité accrue des vaisseaux
locaux, et l’expression de molécules d’adhésion,
qui attirent les cellules de l’inflammation (mono-
cytes, en particulier) et provoquent une pneumonie
interstitielle localisée. Le macrophage initial peut
mourir au moment où les bacilles se divisent, et
ces derniers sont absorbés par d’autres monocytes
ou macrophages envahissant la lésion. Toutes ces
cellules se différencient en macrophages épithé-
lioïdes et se divisent, augmentant la taille de la
lésion.
Au bout de 2 à 3 semaines, des nombres impor-
tants de lymphocytes T envahissent la lésion, en
provenance de vaisseaux sanguins de plus fort
calibre, et créent des colonies organisées de
lymphocytes (« wedges ») dans les rangs des
cellules épithélioïdes. A ce stade, on peut détecter
une augmentation de la libération de cytokines
dans ces tissus par RT-PCR, en particulier d’inter-
leukine (IL)-12 et d’interféron (IFN)-, ce qui est
caractéristiques de la réponse protectrice des CD4
TH1.4 Pendant et après ce stade, de nombreux
macrophages présentent un aspect inactivé « mous-
seux » (« foamy »), les bacilles acido-alcoolo-

2 The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
résistants ne sont retrouvés que dans quelques
cellules, et le nombre total de bactéries viables
observées est stable ou diminue. Etant donné la
nécessité centrale pour les lymphocytes de relayer
cette réponse protectrice, le processus est un
exemple classique d’immunité à médiation cellu-
laire (IMC).
Pendant la phase de réponse cellulaire primaire
à l’infection tuberculeuse, nous présumons
également qu’un certain pourcentage des
lymphocytes T CD4 quittent le site infectieux et
repassent dans la circulation sanguine ou lympha-
tique. En l’absence d’antigène, ils cessent de
sécréter de l’IFN et réintègrent le pool circulant.
Ils peuvent toutefois être distingués des lympho-
cytes T « vierges » par l’expression nouvellement
acquise des protéines de surface LFA-1 (hétéro-
dimère de 2-intégrine, de 275 kDa), et VLA-4
(dimère de VB16-intégrine, de 150 kDa).
Lorsque des antigènes mycobactériens sont
injectés dans le derme, ils sont ingérés, assimilés
et présentés par des macrophages et des
lymphocytes locaux. Ces cellules sécrètent
diverses molécules, en particulier des amines vaso-
actives qui peuvent, comme décrit précédemment,
augmenter la perméabilité des cellules endothé-
liales des vaisseaux locaux, et permettre un afflux
de liquide intra-tissulaire (induration). Si la
réponse inflammatoire est marquée, les vaisseaux
peuvent aller jusqu'à laisser passer des érythro-
cytes dans la zone concernée (érythème).
La production de facteur de nécrose tumorale
(TNF) par les macrophages locaux induit, sur
l’épithélium vasculaire, l’expression des ligands
ICAM-1 (glycoprotéine de 115 kDa) et de VCAM-
1 (protéine de 110 kDa), qui se lient aux LFA-1 et
au VLA-4 à la surface des lymphocytes T
circulants, et permet leur passage vers le site
inflammatoire local, où ils reconnaissent des
peptides antigéniques spécifiques. Les lympho-
cytes T sécrètent alors des chimiokines qui favori-
sent l’entrée de monocytes venus du sang (infiltra-
tion). Ce processus n’est pas instantané mais prend
24 à 48 heures, d’où le terme d’hypersensibilité
retardée (HSR).
On notera que ces deux mécanismes fonda-
mentaux ont un mode d’action opposé. Dans
l’IMC, les macrophages tentent d’abord de
contrôler l’infection et de présenter des antigènes,
puis ils sont rejoints par des lymphocytes T
sensibilisés, qui les activent au moyens de
cytokines les rendant aptes à tuer les bacilles. Dans
l’HSR, en revanche, un pool de lymphocytes T
circulants est nécessaire pour favoriser la réaction
et attirer des monocytes sur place. En termes phy-
siologiques, ce mécanisme est probablement
apparu pour prévenir la dissémination de la
maladie, en refermant rapidement les sites secon-
daires d’infection au moyen d’une réaction mono-
cytaire rapide. On notera également que notre
définition diffère de celle de Dannenberg, qui
décrit l’HSR comme une réaction de lésion
tissulaire responsable de la nécrose centrale des
granulomes observés chez les cobayes et les
lapins.5
La primo-infection par des mycobactéries
virulentes induit une mémoire immunitaire,
relayée par les lymphocytes T.6 Les cellules qui
relaient l’HSR participent probablement à ce
mécanisme. L’objectif de la vaccination est par
conséquent d’induire un état prolongé de
résistance accrue à l’infection, par l’intermédiaire
d’une population de lymphocytes T auparavant
sensibilisés à des antigènes bactériens spécifiques,
qui traduisent rapidement la présence d’une
infection secondaire. Comme nous le verrons plus
loin, des avancées importantes ont été effectuées
ces derniers temps, autour de stratégies vaccinales
radicalement différentes, pour répondre à la
définition qui précède.
LES NOUVEAUX TYPES DE VACCINS
Vaccins à ADN bactérien
L’une des découvertes récentes les plus surpre-
nantes est la constatation que des séquences
d’ADN codant des antigènes de mycobactéries
peuvent immuniser des souris contre l’infection
tuberculeuse. De fait, cette stratégie vaccinale a
montré son efficacité dans plusieurs modèles
expérimentaux d’infection virale, bactérienne et
parasitaire.
Les premières observations dans le domaine de
la tuberculose ont été faites par Silva et
Lowrie,8qui ont découvert que l’immunisation de
souris syngéniques par une lignée cellulaire de
macrophages d’origine tumorale (1774) infectés
par le gène hsp60 de M. leprae, protégeait ces
souris d’un inoculat intraveineux (5 x 106) de M.
tuberculosis H37Rv ou de BCG. Cette protection
se manifeste par un déclin relativement lent, sur
plusieurs semaines, de la charge bactérienne dans
le foie et la rate des souris vaccinées. L’étude ne
comprenait pas de groupe témoin vacciné par le
BCG, mais d’autres études6 ont montré que chez
les souris infectées par le BCG ou ayant une
immunité ancienne, la protection s’exprime rapide-
ment, ce qui suggère un mécanisme d’action diffé-
rent de celui des souris immunisées par lignée
macrophagique. La différence pourrait être due au

De nouveaux vaccins contre la tuberculose 3
délai nécessaire pour que les lymphocytes T
sensibilisés par le vaccin détectent la présence de
l’hsp60 exprimé au cours de la réinfection, ce qui
est compatible avec la notion que cette protéine
n’est pas exprimée par des M. tuberculosis en
croissance exponentielle, et n’est reconnue par le
système immunitaire qu’à un stade relativement
tardif de la réponse.9,10
Comme nous l’avons déjà fait remarquer,3 l’un
des principaux problèmes que soulèvent ces
observations est le déroulement des réinfections
chez les sujets témoins. Plusieurs laboratoires
indiquaient récemment que 5 x106 germes d’une
souche H37Rv constituent une dose mortelle, et
pourtant, le nombre des bacilles dans le foie et la
rate des souris du groupe témoin, dans l’étude de
Silva et Lowrie, n’avait pas changé notablement
pendant les cinq semaines du protocole expérimen-
tal ; il était même légèrement inférieur au nombre
observé pour la dose atténuée (non mortelle) de
BCG réinjecté.
Dans un autre article décrivant cette stratégie
vaccinale, Lowrie et coll.31 ont transféré des
colonies de lymphocytes T de souris vaccinées
chez des souris irradiées, à qui ils ont administré
M. tuberculosis. Les lignées cellulaires avaient été
clonées contre la cellule-cible, plutôt que contre
l’antigène hsp60, et exposées à un stimulant de la
mitose. Il n’avait cependant pas été constitué de
témoin à partir d’une lignée cellulaire non
compétente cultivée de la même manière.
Les résultats de ces expériences ont montré que
les clones de CD8, mais non les clones de CD4 ou
de lymphocyte T , véhiculaient cette protection
et que celle-ci était augmentée de manière
spectaculaire (de 2 log) si les trois types de
cellules étaient administrés ensemble.
Si l’on prend en compte la forte relation entre
hsp60 et arthrite auto-immune,12 les protéines
secrétées/exportées, reconnues plus tôt dans la
réponse de l’hôte et reconnues directement par les
CD4 TH1 sécrétant de l’IFN-, seraient peut-être
de meilleures protéines-cibles. Se fondant sur cette
théorie, Huyghen et coll. ont élaboré un vecteur
plasmidique d’ADN codant la forme sécrétée de la
principale protéine trouvées dans les filtrats de
culture : Ag85A (une mycolyl-transférase de 30-32
kDa)13 , en ayant recours à la séquence signal de
l’activateur de plasminogène tissulaire, et à une
forme d’Ag85A ne contenant pas de séquence
signal. Après injection intramusculaire du
plasmide, les souris montraient des signes de
divers processus réactionnels : lympho-prolifé-
ration, réponse humorale, sécrétion de cytokines
(IFN-, IL-2), formation de T cytotoxiques.
Après exposition à un aérosol de M. tuberculo-
sis, la numération bactérienne pulmonaire chez les
souris immunisées par le plasmide à ADN était
divisée par 10 au bout d’un mois. Dans le même
modèle, la vaccination par le BCG (106 s.c.) donne
approximativement le même niveau de protection.
Ces résultats indiquent que la vaccination par
plasmide à ADN peut induire la formation d’une
population de lymphocytes T capables de
reconnaître la présence de l’infection dans les
poumons et de sécréter de l’IFN pour la contenir.
On ne sait pas encore quelle est la durée de cette
effet, mais des études chez la souris ont noté
l’expansion d’une population (possible) de
cellules-mémoire CD4 CD5.5RBlo/neg, et des études
chez le cobaye montrent la stabilité des effets du
vaccin pendant au moins 20 semaines (Orme,
résultats non publiés). Toutes indiquent que cet
effet pourrait donc être de longue durée.
Un autre modèle plasmidique expérimental a
été décrit par Tascon et coll.14 Il utilise des gènes
codant les protéines hsp60 et à 36 kDa de M.
leprae. La vaccination de souris par ces plasmides
a réduit la charge bactérienne du foie et de la rate à
des niveaux comparables à ceux obtenus par le
BCG après ensemencement intrapéritonéal de M.
tuberculosis. Cependant, les résultats ont varié
selon la souche de souris utilisée. Dans tous les
cas, le plasmide codant la protéine hsp60 a paru le
plus efficace.
Ces dernières études sont très encourageantes,
et cette technique expérimentale sera certainement
étendue à d’autres antigènes des mycobactéries
dans un futur proche. L’aptitude apparente du
plasmide à ADN à rester dans les cellules mus-
culaires pendant un certain temps suggère que des
antigènes pourraient être produits de manière
prolongée ou permanente, ce qui rend cette
méthode très séduisante ; de même, les résultats
suggérant que les CD4 et les CD8 pourraient être
sensibilisés. Manifestement, la durée de l’effet doit
être confirmée, ainsi que la sécurité de la méthode,
en particulier si l’on doit envisager le recours à des
protéines de choc thermique ou de stress. D’autres
questions, comme celle de recourir à cette méthode
en association à d’autres vaccins nouveaux, ou son
utilisation pour réactiver l’immunité d’une popu-
lation déjà vaccinée par le BCG, devront être
abordées.
Vaccins utilisant des protéines de filtrat
cellulaire
Une nouvelle nomenclature est-elle nécessaire ?
Les antigènes protéiques des mycobactéries
reconnus au cours de la réponse lymphocytaire ont

4 The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
été décrits par plusieurs termes : protéines
sécrétées/exportées, protéines extracellulaires,
filtrat cellulaire; « leakage proteins »; antigènes
métaboliques, etc. Aucun de ces termes n’est
véritablement satisfaisant. Pour notre part, nous
pensons que le terme de protéines de filtrat
(culture filtrate proteins, CFP) est le moins
controversé, et résume à peu près la manière dont
nous les recueillons. Certaines d’entre elles
seulement, sont véritablement sécrétées ou
exportées, dans le sens où elles expriment des
séquences-signal sous leur forme cytoplasmique,
tandis que le terme de « leakage proteins »
(protéines « de fuite ») a certainement pour origine
le fait que des protéines comme l’hsp10, l’alanine
déshydrogénase, ou les mycolyl transférases Ag85,
participaient normalement à l’élaboration des
parois cellulaires du bacille en voie de division
avant de passer dans le milieu environnant. Le
terme de « protéines extracellulaires » est certaine-
ment plus difficile à expliquer, et on peut lui
opposer le fait que si l’on dépose des bactéries
lavées viables dans un milieu de culture frais,
aucune protéine extracellulaire n’y apparaît.
Les antigènes CFP, antigènes-clé de
protection
Même si la conception de sous-unités vaccinales à
partir de CFP focalise aujourd’hui l’attention, des
observations évoquant la reconnaissance préféren-
tielle des CFP par rapport aux protéines constitu-
tives avaient été obtenues dans notre laboratoire il
y a déjà une dizaine d’années15 et confirmées par
deux autres articles publiés deux ans plus tard, en
1988.6,16 En 1992, nous avons de plus démontré10
que les lymphocytes T cultivés à partir de M.
tuberculosis au pic d’expression de l’immunité
protectrice, sécrétaient de grandes quantités d’IFN-
 contre de multiples cibles dans le pool d’anti-
gènes CFP, observation confirmée par la suite par
d’autres.17 Plus tard cette même année, une étude
de Hubbard et coll.18 a montré que des souris
immunisées par des CFP fractionnées étaient
protégées contre une réinfection par aérosol. Cette
étude était la première à metre en évidence que les
antigènes CFP étaient capables d’induire une
immunité protectrice contre une exposition par M.
tuberculosis in vivo.
Deux autres études chez la souris corroborent
ces observations. Andersen, qui outre son travail
sur les vaccins a publié d’élégants travaux sur la
composition précise des CFP,17-19 a pu démontrer
une protection permanente contre l’exposition
intraveineuse chez des souris immunisées par une
phase à log faible de CFP dans un adjuvant
DDA,20 avec une diminution de la charge bacté-
rienne comparable à celle obtenue par le BCG.
Une étude similaire de notre laboratoire a atteint
des conclusions similaires, bien que les effets de
notre vaccin (CFP dans adjuvant de Freunds
incomplet) contre une exposition par aérosol de M.
tuberculosis se soient estompés peu à peu par
rapport au BCG, 150 jours après vaccination. Ce
qui suggère que ce type de vaccination n’induit pas
une mémoire immunitaire durable.21
La publication de l’étude Hubbard a été suivie,
à la fin de cette même année, par les premières
preuves que les antigènes CFP pourraient immu-
niser des cobaye contre l’infection par aérosol de
M. tuberculosis. Dans cette étude,22 Pal et Horwitz
ont préparé un filtrat de « protéines extracellu-
laires » qui, chose surprenante étant donné la mise
en culture relativement courte, contenaient en pro-
portion prédominante la protéine de stress hsp70.
Une étude ultérieure de Horwitz et coll.23 a eu
recours à une sous-unité vaccinale plus vraie, en
purifiant individuellement plusieurs des princi-
pales protéines de M. tuberculosis Erdman,
recueillies dans le filtrat du milieu de culture in
vitro. Des cobayes ont ensuite été immunisés avec
ces protéines dans une formule contenant un
adjuvant Syntex (deux ou trois fois, à 3 semaines
d’intervalle) puis, 3 semaines plus tard, ont été
exposés à un aérosol de M. tuberculosis.
Les cobayes ainsi vaccinés ont montré de fortes
réactions d’HSR aux protéines immunisantes. De
plus, ces animaux étaient protégés contre la perte
de poids et la mortalité caractéristiques observées
chez les témoins non protégés, et ont pris du poids
régulièrement pendant les 10 semaines qui ont
suivi l’exposition à l’aérosol. A l’inverse, les
sujets-témoins ont perdu du poids pendant les 3-4
premières semaines avant de se stabiliser.
Malgré les différences de poids marquées
(jusqu'à 200 g) à la fin des 10 semaines entre
cobayes vaccinés et cobayes-témoins, la différence
entre numération bactérienne dans les poumons
était de 0,7 ± 0,1. La déclaration d’Horwitz et
coll., selon lequel cette différence est « impres-
sionnante » et « comparable à celle qu’a conféré
aux cobayes la vaccination par BCG au cours de
plusieurs études » n’est à notre avis pas compatible
avec les études au cours desquelles 2-4 log de
protection après BCG ont été observés.24-26 Ce
point est bien sûr discutable, étant donné que
l’étude Horwitz n’incluait pas de groupe BCG
témoin.
Que l’on cherche à remplacer le BCG par une
nouvelle sous-unité vaccinale, ou simplement à
augmenter ou stimuler son efficacité, les résultats

De nouveaux vaccins contre la tuberculose 5
actuels obtenus chez le cobaye nous éclairent peu.
Contrairement à la souris, le cobaye constitue de
grands granulomes au sein desquels des
macrophages épithéloïdes peuvent dégénérer et
donner un foyer caséeux nécrotique finalement
fatal pour l’animal. Il ne s’agit pas d’une transfor-
mation immédiate, mais qui peut demander
plusieurs semaines.26 Pour exploiter véritablement
cette importante caractéristique du cobaye (présen-
tée par ses défenseurs comme un aspect primordial
et un critère de supériorité) il faudrait démontrer
que de telles lésions nécrotiques n’apparaissent
pas chez les animaux recevant du CFP ou d’autres
types de vaccins. Cela n’a pas encore été fait.
Nouveaux vaccins BCG recombinants
Une méthode logique de conception de nouveaux
vaccins a été de commencer par le vaccin BCG
existant et d’essayer de l’améliorer, en conservant
ses propriétés utiles, en particulier sa capacité à
persister dans l’environnement intracellulaire avec
ses qualités initiales.
A cet égard, le BCG s’est révélé être un véhicu-
le de transport sûr et efficace, pour des antigènes
étrangers et pour des protéines de mammifères
comme les cytokines.27,28 Ainsi, le bacille a été
utilisé comme vecteur de la protéine OspA de
l’agent causal de la maladie de Lyme,29 du princi-
pal antigène de surface des Leishmania (gp63),30 et
de la nef, une protéine régulatrice du VIH.31
De même, une avancée importante en ce
domaine a été d’exprimer des gènes de cytokines
murines dans le BCG.32,33 Cette méthode pourrait
nous rendre capables d’affiner la réaction de l’hôte
au vaccin, en modulant la réponse pro-inflamma-
toire pour attirer des sous-groupes importants de
lymphocytes T, et d’induire chez ces cellules la
réponse d’immunité prolongée indispensable.
Vaccins à mycobactéries auxotrophes
Les patients immunodéprimés, telles les personnes
VIH-positives, constituent une population à risque
accru de contracter la tuberculose. Dans le cas du
VIH, la vaccination par le BCG n’est pas
recommandée, étant donné le risque de dissémina-
tion de la maladie à partir du vaccin vivant.
Toutefois, Jacobs et coll. ont mis au point une
nouvelle méthode fondée sur l’utilisation de
mutants auxotrophes du BCG, qui pourrait
permettre de contourner le problème.
A partir d’une technique basée sur l’insertion
de transposons pour entraver l’expression de gènes
spécifiques, trois auxotrophes, deux pour la
leucine et un pour la méthionine, ont été isolés.
Lorsqu’ils ont été testés sur les souris, aucun des
deux mutants pour la leucine n’a été capable de se
multiplier, et tous deux ont été lentement élimi-
nés.34 Le remplacement du gène LeuD a restauré
leur abilité à croître au sein des macrophages.35
Chez l’animal, les mutants auxotrophes pour le
BCG semblent capables de protéger contre les
expositions au bacille, ce qui suggère qu’ils survi-
vent suffisamment longtemps pour engendrer des
populations de lymphocytes T compétents avant
d’être détruits.
Vecteurs mycobactériens non virulents
A l’heure où nous écrivons, nous savons que plu-
sieurs laboratoires tentent de recourir à des
vecteurs mycobactériens non virulents, parmi les-
quelles M. vaccae et M. smegmatis, pour sur-
exprimer certaines protéines mycobactériennes :
les antigènes 19kDa, Ag85, et 45kDa, en
particulier. A ce jour, la plupart n’ont pas encore
été testées sur des modèles d’infection in vivo.
Autres méthodes génétiques
Deux autres méthodes doivent être brièvement
mentionnées. La première étudie les différences
génétiques entre des souches atténuées comme le
BCG et ses cousins virulents, au moyen de
résultats récents36 fondé sur une hybridation
soustractive, qui identifie trois locus séparés de
différence entre le BCG et une souche virulente de
M. bovis. L’un de ces locus, désigné par le sigle
RD1, serait un segment d’ADN de 9,5 kb, absent
de toutes les souches de BCG testées, mais présent
dans tous les isolats cliniques disponibles de M.
bovis et de M. tuberculosis. La réintroduction de
ce locus dans le BCG a réprimé l’expression d’au
moins 10 protéines visibles sur les gels bidimen-
sionnels. La conséquence de cette observation est
que ces protéines contribuent à la virulence, et il
sera intéressant de préciser leur identité,
lorsqu’elles auront été isolées.
Autre progrès qui devrait avoir un impact sur la
mise au point d’un vaccin : la découverte, d’abord
par Gicquel et coll.37 puis, plus récemment, par
Jacobs,38 qu’un échange d’allèles est possible chez
les mycobactéries. Cette technique, relativement
facile à mettre en œuvre chez de nombreux micro-
organismes, s’est jusqu’ici montrée très difficile à
pratiquer chez les mycobactéries.
Dans l’étude de Gicquel, un vecteur « suicide »
— conçu à partir d’un gène de l’uréase — a été
mis au point, au moyen d’un marqueur à la
kanamycine pour entraver la séquence génique,
afin de produire un BCG uréase-négatif. Dans
l’étude de Jacobs, le gène LeuD a été inactivé, au
moyen de long substrats recombinants produits par