TP n°3 : Découverte de la coloration de GRAM et étude de la flore d

 1ère STL BTK -­‐ 24/09/2015 TP n°3 : Découverte de la coloration de GRAM et étude de la flore d’un lait cru Ce TP doit vous permettre d’acquérir des gestes de base de microbiologie concernant l’observation microscopique et l’identification de structures cellulaires. À quoi sert la coloration de Gram ? D’où vient le nom de Gram ? Pourquoi parle-­‐t-­‐on de bactéries à Gram positif ou négatif ? Peut-­‐on utiliser cette coloration pour observer la flore d’un lait pasteurisé ? Contexte : en 1884, Hans Christian Gram, un médecin d’origine danoise travaillant à Berlin, a trouvé accidentellement une méthode qui est encore aujourd’hui à la base de l’identification bactérienne. Au cours de ses études sur les tissus de poumons de patients morts de pneumonie, il découvre que les colorants permettent de mieux observer les cellules bactériennes transparentes. Il s’aperçoit aussi que certaines bactéries sont colorées par les colorant qu’il emploie, tandis que d’autres ne le sont pas. Quelques années plus tard, Hans Gram développe une procédure de coloration qui sépare la population bactérienne en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. Cette coloration est toujours utilisée dans les laboratoires de microbiologie du monde entier. Elle est l’étape indispensable et préliminaire à toute identification bactérienne. Découvrons la coloration de Gram. I. Coloration de Gram sur un bouillon de composition inconnue ü
Matériel et réactif Ø Un bouillon impur de bactérie Ø Réactifs de la coloration de Gram. ü Mode opératoire Ø Réaliser un état frais sur le bouillon. Ø Réaliser un frottis sur le bouillon. Ø Procéder à la coloration de Gram du frottis. Ø Observer le frottis ainsi colorés à l’immersion. ü Compte rendu 1) Décrire les résultats des observations (type, taille, forme, mode de groupement, mobilité (uniquement visible à l’état frais), Gram + ou -­‐). 2) Conclure à l’issue de la coloration, sur la couleur des bactéries à Gram -­‐ et des bactéries à Gram + II. Étude séquentielle du Gram ü Mode opératoire Ø Réaliser un nouveau frottis à partir du mélange. Ø La coloration de Gram va être réalisée de manière séquentielle pour découvrir le rôle des réactifs et l’intérêt des différentes étapes. Répartition les activités en 5 groupes de travail : Page 1 sur 3
1ère STL BTK -­‐ 24/09/2015 Étapes de la coloration de Gram à effectuer Groupes d’élèves Violet de gentiane + rinçage eau 1 Jusqu’à l’ajout de lugol + rinçage eau 2 Jusqu’à l’ajout d’éthanol + rinçage eau 3 Coloration intégrale classique 4 Coloration témoin à la fuchsine 5 Consignes communes Sécher le frottis. Observer au microscope à l’immersion (x100). ü Compte rendu 1) Recopier le tableau ci-­‐dessous en faisant une mise en commun des observations de tous les groupes : Réactifs employés Violet de gentiane Violet de gentiane + lugol Violet de gentiane + lugol + éthanol Violet de gentiane + lugol + éthanol + fuchsine Fuchsine seule Faire un schéma Coque à Gram + Bacille à Gram -­‐ 2) Déduire des observations le rôle visible de chaque réactif. 3) Justifier le nom de chaque étape de la coloration de Gram présenté dans le tableau ci-­‐
dessous : Réactifs ajoutés Violet de gentiane Lugol Éthanol Fuchsine Nom des étapes Coloration primaire Mordançage (accentuation de la coloration) Décoloration différentielle Contre-­‐coloration III.
Coloration de Gram de la flore du lait cru Matériel et réactif Ø Culot de centrifugation d’un échantillon de lait cru. Ø Réactifs de la coloration de Gram. ü Mode opératoire Ø Réaliser un frottis à partir du culot de centrifugation du lait cru. Ø Procéder à la coloration de Gram. Ø Observer à l’immersion. ü
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1ère STL BTK -­‐ 24/09/2015 ü Compte rendu 1) Qu’est-­‐ce qu’un lait cru ? 2) Quels sont les autres laits que vous connaissez ? 3) Décrire les résultats de l’observation microscopique. 4) Conclure sur la composition microbiologique de la flore du lait cru. Page 3 sur 3