Projet de fin d`études en physique/ biologie Les ailes de cigale et les

Projet de fin d’études
en physique/ biologie
Les ailes de cigale et les surfaces antimicrobiennes
Auteure : Lucie Brouillette département de biologie/biotechnologie
Dans le cadre d’un projet de collaboration entre le collège Ahuntsic, le
département de physique de l’université Concordia et la Polytechnique de
l’université de Montréal
Matériel :
4 ailes de cigale
Surfaces antimicrobiennes (choisies par les étudiants)
Réactifs pour coloration Gram
Lames et lamelles
Microscope
Nettoyant à lentilles
Huile à immersion/microscopie
Pipettes stériles
Pétris de microbiologie/ tubes et milieux divers (selon la souche
microbienne)
Souches microbiennes diverses à tester (Gram +, Gram-, levures….)
Brûleur
Pot d’alcool
Pinces à bout plat
Scalpel stérile
Spectrophotomètre et cuvettes jetables de cap. 2,5ml (lecture dans le
visible)
Incubateur de microbiologie à 37 oC
Carrés de gaze stérile
Bac de coloration
Méthodes :
Travailler stérilement autour de la flamme lorsque vous prélevez et
ensemencez des microorganismes!!!
1. Coloration Gram :
Cette technique de coloration différentielle permet de diviser les
bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et les
bactéries à Gram négatif.
Pour procéder à cette coloration, on doit d’abord préparer un frottis.
La préparation du frottis est la première étape des différents
types de coloration. Un bon frottis est une mince couche de
culture bactérienne que l’on laissera sécher sur une lame
propre, avant de le fixer à la chaleur.
Le frottis sera ensuite coloré à l’aide du violet de cristal. Un mordant,
une solution d’iode, sera ensuite ajouté. Un complexe iodine-violet
de cristal (de taille supérieure au violet de cristal seul) sera ainsi
formé. À ce moment, toutes les bactéries sont colorées en violet.
Ensuite, le frottis sera décoloré à l’aide d’une solution d’alcool (ou
d’acétone). À cette étape, une différence est observée : certaines
bactéries gardent le colorant violet de cristal (Gram +), alors que
d’autres le perdent (Gram -). Finalement, de la safranine sera utilisée
afin de contre-colorer en rose les bactéries Gram -.
Il est important de procéder à la coloration de Gram à partir d’une culture
dans laquelle les cellules sont en phase de croissance. En effet, les cellules
mortes avant la préparation du frottis réagissent comme des cellules Grampeu importe les propriétés qu’elles avaient de leur vivant. Par ailleurs, en
vieillissant, certains genres de bactéries Gram + réagissent à la coloration
comme si elles étaient Gram –.
Trucs importants/ coloration Gram :
 Éviter de décolorer trop longtemps le frottis : les bactéries Gram+
seraient elles aussi décolorées.
 Éviter de décolorer insuffisamment le frottis : le complexe iode-violet
de cristal ne serait pas complètement éliminé des bactéries Gram
négatives.
 Utiliser des cultures fraîches (18-24 heures).
2. Préparation de la suspension microbienne (frais)
Stérilement, ensemencez le milieu de culture liquide adéquat (selon
la souche microbienne utilisée) avec la souche vivante. Incubez à la
température optimale (temp. pièce ou 37oC) pour 1 nuit.
Le jour de l’expérimentation, de cette culture, en prélevez
stérilement 2 ml et transférer cette suspension bactérienne dans une
cuvette jetable/ spectrophotomètre. Lire la densité optique (D.O.) à
600nm puis jeter adéquatement cet échantillon. Stérilement, faire
une dilution en série de la suspension microbienne pour obtenir
finalement 5 X107 cellules/ml de milieu de culture.
1 D.O. 600nm = 5 X 108 cellules/ml
3. Mise en présence des matériaux avec la suspension microbienne
Pour les ailes de
, vous devrez couper l’aile en 2 morceaux
avec un scalpel stérile. Ainsi, vous aurez 2 surfaces à utiliser.
Autour de la flamme, dans un ou plusieurs Pétris stériles vierges,
vous déposerez les sections de matériaux à tester puis, sur ces
surfaces, pipettez 100µL de la suspension microbienne (5 X107
cellules/ml de milieu de culture) et laissez en contact pendant 30
minutes à la température de la pièce.
Avec des pinces stériles, autour de la flamme, prendre les surfaces
ayant été en contact avec les microorganismes et les transférer sur
un carré de gaze stérile afin d’enlever ce liquide.
La surface ayant été en contact avec les microorganismes est ensuite
déposée directement sur une gélose (milieu selon la souche
microbienne) puis incubée à 37oC ou température de la pièce, 24 à 48
heures selon les souches.
4. Prise des résultats
Sans ouvrir les Pétris, observez la croissance des microorganismes.
N’oubliez pas de faire vos contrôles expérimentaux (positifs et
négatifs!!!)
L’analyse des surfaces pourra être faite avec des instruments à la
Polytechnique de l’Université de Montréal, de concert avec des
étudiants gradués et ou chercheurs de l’institution concernée.
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