La préparation du frottis est la première étape des différents
types de coloration. Un bon frottis est une mince couche de
culture bactérienne que l’on laissera sécher sur une lame
propre, avant de le fixer à la chaleur.
Le frottis sera ensuite coloré à l’aide du violet de cristal. Un mordant,
une solution d’iode, sera ensuite ajouté. Un complexe iodine-violet
de cristal (de taille supérieure au violet de cristal seul) sera ainsi
formé. À ce moment, toutes les bactéries sont colorées en violet.
Ensuite, le frottis sera décoloré à l’aide d’une solution d’alcool (ou
d’acétone). À cette étape, une différence est observée : certaines
bactéries gardent le colorant violet de cristal (Gram +), alors que
d’autres le perdent (Gram -). Finalement, de la safranine sera utilisée
afin de contre-colorer en rose les bactéries Gram -.
Il est important de procéder à la coloration de Gram à partir d’une culture
dans laquelle les cellules sont en phase de croissance. En effet, les cellules
mortes avant la préparation du frottis réagissent comme des cellules Gram-
peu importe les propriétés qu’elles avaient de leur vivant. Par ailleurs, en
vieillissant, certains genres de bactéries Gram + réagissent à la coloration
comme si elles étaient Gram –.
Trucs importants/ coloration Gram :
Éviter de décolorer trop longtemps le frottis : les bactéries Gram+
seraient elles aussi décolorées.
Éviter de décolorer insuffisamment le frottis : le complexe iode-violet
de cristal ne serait pas complètement éliminé des bactéries Gram
négatives.
Utiliser des cultures fraîches (18-24 heures).