Habilitation à diriger des Recherches Marie Bodinier 2014

Habilitation à diriger des Recherches
Université de Nantes
Ecole Doctorale VENAM
Marie Bodinier
2014
« Etudes mécanistiques du système immunitaire pour
aider à la compréhension, au diagnostic et au
traitement de certaines pathologies notamment des
allergies alimentaires. »
UR 1268 BIA
Equipe Allergie
Rue de la géraudière BP 71627, 44316 Nantes cedex 01
Illustration issue de Gurumed, 11 fév. 2013 : Des cellules de notre système immunitaire se rappellent de
microbes qu'elles n'ont jamais rencontrés auparavant
SOMMAIRE
DOSSIER SCIENTIFIQUE……………………………………………………………….....4
Curriculum Vitae……………………………………………………………………………..5
Liste des publications…………………………………………………………………………9
Introduction……………………………………………………………………………….…15
I.
II.
III.
Le système immunitaire……………………………………………………………....15
A. Deux systèmes : l’inné et l’adaptatif………………………………………….15
B. La reconnaissance par le système immunitaire…………………………….....16
C. La médiation du système immunitaire………………………………………..16
D. Les lymphocytes T……………………………………………………………16
1.Les différents types de lymphocytes T et leur fonction………………16
2.Les récepteurs des lymphocytes T…………………………………....19
Les Allergies Alimentaires……………………………………………………………21
A. Généralités sur les allergies…………………………………………………...21
1. Prévalence…………………………………………………………….21
2. Les allergies alimentaires…………………………………………..…22
3. L’allergie alimentaire au blé………………………..………………...23
B. Les mécanismes de la tolérance orale et de l’allergie alimentaire……………24
1. La tolérance orale…………………………………………………….24
2. La réponse allergique…………………………………………………26
3. Modèles cellulaires et animaux……………………………………….29
a. Modèles cellulaires et organes ex vivo………………………..29
b. Modèles animaux……………………………………………..30
Des stratégies nutritionnelles pour lutter contre les allergies alimentaires…………...31
A. La stratégie des prébiotiques, des probiotiques et des synbiotiques …….…...31
B. La stratégie des polyphénols………………………………………………….33
Notice des titres et travaux retraçant les résultats les plus significatifs depuis le début de
carrière………………………………….……………………………………………………34
De 1998 à 2001 : Résultats marquants au cours de mon doctorat : les mécanismes associés
aux lymphocytes T CD8 dans le cancer et les infections virales……………………………..35
I.
II.
III.
Etude 1 : Rôle du CD8 et du TCR dans la sélection des lymphocytes T anti-viraux...35
A. But et intérêt scientifique……………………………………………………..35
B. Programme et méthode de recherche………………………………………....35
C. Résultats………………………………………………………………………36
Etude 2 : Rôle du CD8 et du TCR dans l’activation des lymphocytes T anti-viraux...36
A. Programme et méthode de recherche………………………………………....36
B. Résultats………………………………………………………………………37
Etudes collaboratives visant à développer des stratégies immuno-thérapeutiques pour
traiter certains cancers (leucémie et mélanome) à l’aide des tétramères CMHpeptide………………………………………………………………………………...38
A. Méthode……………………………………………………………………....38
B. Résultats………………………………………………………………………38
1
IV.
Bilan du doctorat……………………………………………………………………...39
De 2002 à 2003 : Expérience marquante au cours de ma carrière de chercheur hospitalier :
application potentielle des tétramères CMH-peptide en recherche fondamentale et en
recherche clinique…………………………………………………………………………….39
De 2003 à maintenant : Résultats marquants obtenus au cours de ma carrière de chercheur à
l’INRA: les mécanismes des allergies alimentaires et leur modulation par l’alimentation….40
I.
II.
III.
Problématique de recherche…………………………………………………………..40
Etude des mécanismes des allergies alimentaires.…….……………………………...42
A. Action 1 : Etude de la translocation des allergènes à travers l'épithélium
intestinal…………………………………………………………….………...43
1. Problématique …………………………………………………….43
2. Résultats…………………………………………………………...44
B. Action 2 : Etude de l’impact des allergènes natifs ou modifiés sur le système
immunitaire et leur capacité à sensibiliser l’organisme in vivo ………….…...46
1. Problématique …………………………………………………….46
2. Résultats…………………………………………………………...46
C. Action 3 : Etude de la phase de déclenchement correspondant à la
dégranulation mastocytaire induite par les allergènes…………..………….....48
1. Problématique …………………………………………………….48
2. Résultats……………………………………………………….......49
D. Action 4 : Etude des mécanismes de la marche atopique…………..…………50
1. Problématique …………………………………………………….50
2. Résultats…………………………………………………… ……..51
E. Conclusion sur l’étude des mécanismes de l’allergie alimentaire…………….52
Prévention ou réduction de la réaction allergique par l’alimentation : la stratégie des
prébiotiques…………………………………………………………………………...53
A. Action 5 : Effet des prébiotiques sur le système immunitaire et la prévention
des allergies………………………………………………….………………..53
1. Problématique ……………………………………………….……53
2. Résultats………………………………………………….……......54
B. Projet complémentaire aux prébiotiques: effets des fibres sur le système
immunitaire…………………………………………………………………...56
1. Problématique ……………………………………………….…...56
2. Résultats………………………………………………………......57
C. Conclusion sur la prévention ou la réduction de la réaction allergique par
l’alimentation…………………………………………………………….........58
Projet de recherche original pour l’avenir : « Compréhension des mécanismes
d’interaction de l’aliment (natif, modifié, supplémenté) avec le système immunitaire et la
barrière de l’intestin pour élaborer des stratégies pour agir sur les
allergies. »……………………………………………………………………………………60
2
I.
Etude des mécanismes précoces de la réaction allergique engendrés par
l’aliment………………………………………………………………………………60
A. Contexte………………………………………………………………………60
B. Objectifs scientifiques………………………………………………………...62
C. Méthodologie…………………………………………………………………64
D. Résultats attendus et retombées scientifiques ………………………………..67
E. Projets envisagés pour réaliser cette étude…………………………………....68
Stratégies
nutritionnelles
pour
réduire
ou
prévenir
les
allergies
alimentaires……….......................................................................................................69
A. Contexte………………………………………………………………………69
B. Objectifs scientifiques………………………………………………………...70
C. Méthodologie…………………………………………………………………71
D. Résultats attendus et retombées scientifiques ...……………………………...76
E. Projets envisagés pour réaliser cette étude……………………………………76
Conclusion sur le projet de recherche original……………………………………..…78
II.
III.
Bibliographie………………………………………………………………………………...79
ACTIVITES D’ENCADREMENT…………………………………………………………93
Responsabilités d’encadrement et collaborations lors de mon parcours à l’INSERM U463 de
1998 à 2003…………………………………………………………………………………...94
Responsabilités d’encadrement et collaborations lors de ma carrière de chercheur à l’INRA de
2003 à maintenant…………………………………………………………………………….94
Liste des étudiants encadrés…………………………………………………………………..95
I.
II.
III.
A.
B.
C.
D.
E.
IV.
Post-doctorats ………………………………………………………………………...95
Thèses…………………………………………………………………………………96
Masters………………………………………………………………………………..96
Master II en ‘Science de l’Aliment et Nutrition humaine (SANH). UFR des Sciences
et des Techniques de Nantes………………………………………………………….96
Master II INAPG- ENSIA Science des Aliments, Massy, Paris……………………...96
Master II BBRT (Biologie, Biotechnologies et Recherche Thérapeutique), UFR de
Nantes…………………………………………………………………………………96
Master II ENSA, Biologie Production animale et Qualité, UFR de Rennes…………97
Master I en « Biologie cellulaire, spécialité physiologie animale », UFR de Rennes..97
Licence professionnelle………………………………………………………………97
ANNEXES……………………………………………………………………………………99
Annexe 1 : Organigramme de l’unité Biopolymères Interactions et Assemblages…….100
Annexe 2 : Liste des 5 publications représentatives de mes activités…………………...101
3
DOSSIER SCIENTIFIQUE
4
CURRICULUM VITAE
Marie BODINIER
Née le 09/07/1975 – Mariée
Chargée de Recherche 1ère classe
INRA- UR 1268 BIA – Equipe allergie
Rue de la Géraudière- B.P.71627- 44 316 Nantes cedex 03
 02 40 67 50 35, Fax : 02 40 67 50 25
e-mail : [email protected]
Formation
1998-2001: Thèse de doctorat de l'université de Nantes
Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie ; Spécialité : Immunologie.
Mention : Très honorable avec félicitations du Jury
1997-1998: Diplôme d'étude approfondie (UFR de Nantes)
Discipline : Biologie Cellulaire ; Option : Immunologie et santé. Mention : Assez bien
1996-1997: Maîtrise de Biologie Cellulaire et Physiologie (UFR de Nantes)
Option: Microbiologie. Mention: Assez bien
1995-1996: Licence de Biologie Cellulaire et Physiologie (UFR de Nantes)
Mention: Assez bien
1994-1995: DEUG des Sciences de la Vie et de la Santé (UFR de Nantes)
Option Biologie-Recherche. Mention: Assez bien.
Carrière
2007 à maintenant : Chargée de Recherche 1ère classe - Centre INRA de Nantes, Unité
BIA, équipe allergie. Domaine de recherche : Etude des mécanismes de l’allergie alimentaire
(AA). Modulation du système immunitaire et de la réaction allergique par l’alimentation
(procédés, prébiotiques, fibres).
2003-2007 : Chargée de Recherche 2ème classe - Centre INRA de Nantes, Unité BIA,
équipe allergie. Domaine de recherche : Etude des mécanismes de l’allergie alimentaire (AA)
– Développement de modèles cellulaires et animaux.
2002-2003 : Ingénieur hospitalier. Laboratoire : INSERM U463, Institut de Biologie,
Nantes. Responsabilité : Mise en place d’une plateforme de production de protéines
recombinantes. Formation de personnel technique à la production de tétramères HLA-peptide.
1998-2001: Thèse de Doctorat, Titre de la thèse : “Etude de la contribution relative du TCR,
du CD8 et des molécules accessoires dans l'activation et la sélection des lymphocytes T
cytotoxiques humains”. Laboratoire d’accueil: INSERM U463. Directeur de thèse: Professeur
François Lang, Faculté de Pharmacie, Nantes.
Compétences
Compétences scientifiques :
Immunologie : étude des populations cellulaires et moléculaires du système immunitaire
(lymphocytes T, cellules dendritiques, cytokines, molécules inflammatoires).
Allergies alimentaitres : caractérisation des allergènes IgE dépendants (épitopes), des
mécanimes de transport des allergènes alimentaires (muqueuse intestinale), de sensibilisation et
de déclenchment de la réaction allergique.
Stratégies nutritionellles pour la prévention des allergies : études sur les prébiotiques, les
polysaccharides non digestibles (NPS) et les polyphénols.
Modèles animaux d’allergie : modèle souris (Balb-cJ) d’allergie aux protéines de blé ou
d’œuf, modèle souris de marche atopique (allergies alimentaire et respiratoire).
5
Compétences techniques :
Biophysique: fluorimetrie, ELISA, cytométrie de flux.
Biochimie: western blot, immuno-précipitation, purification (HPLC, chromatographie).
Radioactivité: marquage (I125), scatchard, cytotoxicité (Cr51), prolifération (H3).
Biologie cellulaire: prolifération (MTT, XTT), culture de lignée.
Biologie moléculaire: mutagenèse, PCR, RTPCR, transfection (stable et transitoire), clonage.
Modèles animaux: reproduction, prélèvements d’organes.
Compétences transversales :
Gestion de projet : détermination des objectifs de recherche, identification des partenaires,
hiérarchisation des activités, acquisition et synthèse des données par l’utilisation de ressources
appropriées.
Travail en équipe : organisation et suivi du travail et gestion de réunion.
Valorisation des résultats : synthèse des résultats obtenus, stratégie de publications, rédaction
de rapports d’avancement des travaux.
Rayonnement scientifique
1999-2013 Articles scientifiques :
- 19 publications dans des revues internationales (12 en tant que CR INRA et 7 en thèse).
- 7 articles dans des revues professionnelles de médecine.
2000-2013 Communications:
- oral : 3 présentations dans des congrès internationaux dont 1 récompensée par un prix, 6
présentations invitées dans des congrès nationaux.
- poster : 8 congrès internationaux, 7 congrès nationaux.
- séminaires : 1 à Kiel en Allemagne (avril 2013), 1 à Gent en Belgique (octobre 2012) et 1 à
Wageningen aux Pays-Bas (février 212).
Animation scientifique
2011-à maintenant : Responsabilité au sein de la tâche 3 du projet européen Fibebiotics
FP7-KBBE (54 mois, coord. J. Mees, UR Wageningen, Hollande) : effet des fibres sur le
système immunitaire (WP3).
2011-à maintenant : Responsable de l’axe 1 du projet REAL2 (REseau ALlergies
REspiratoires et Alimentaires, 2011-2014) financé par la Région Pays de la Loire. Objectif :
améliorer la compréhension des mécanismes de la marche atopiques et élaborer des stratégies
de traitement et de prévention par des modèles précliniques.
2009-2012 : Responsable de tâche du projet PREDEXPITOPE financé par l'ANR
(Prédiction in-silico des épitopes, des allergènes et validation expérimentale sur le blé) :
analyse de la sensibilisation aux allergènes (translocation intestinale).
2008-2011 : Coordinateur de la tâche 3.3 du projet ANR OVONUTRIAL (Impact des
procédés technologiques sur la valeur nutritionnelle et l’allergénicité des protéines d’œuf) :
analyse de la translocation intestinale des protéines d’œuf.
2007-2011 : Responsable de tâche du projet NUPEM financé par la Région Pays de la
Loire (nutrition périnatale et empreinte métabolique) : étude de l’effet des prébiotiques sur le
risque allergique.
Depuis 2012 : Membre du comité scientifique du CRNH (Centre de Recherche en
Nutrition Humaine) Grand Ouest : responsable de la thématique Allergie.
2009- 2013: Membre élu dans le collège CR et DR au conseil d’unité BIA.
6
Collaborations et réseaux
Le partenariat avec les allergologues cliniciens:
- Prof Moneret-Vautrin: service d’Allergologie CH E Dürckheit Epinal.
- Dr Paty: Pneumologie et Allergologie, Hôpital Necker, Paris.
- Dr Drouet: Service d’Allergologie, Hôpital Universitaire d’Angers.
- Pr Magnan et Dr Pipet : plateforme d’allergologie du CHU de Nantes.
-Dr Matysiak-Budnik : service de gastroentérologie du CHU de Nantes (IMAD).
Le partenariat INRA:
- M. Champ, C. Michel, J.P. Segain : Etudes sur les prébiotiques, la perméabilité intestinale,
modèle cellulaire d’épithélium intestinal, UMR 1280 INRA PHAN, CHU de Nantes.
- J.M. Wal et K. Adel-Patient: développement de modèles souris d'allergie, Unité INRA
d'Immuno-Allergie Alimentaire, CEA de Saclay.
- F. Nau et D. Dupont: Science et technologie de l'œuf et du lait, unité INRA STLO, Rennes.
Collaborations avec des immunologistes de l'INSERM:
- U. Blank, INSERM Bichat, Paris. Collaboration sur le développement du modèle cellulaire
de dégranulation des basophiles (lignée cellulaire RBL-SX38).
- M. Heyman, INSERM, Hôpital Necker, Paris. Collaboration sur les études de perméabilité
intestinale en utilisant des chambres de Ussing et une lignée cellulaire Caco-2.
- A. Magnan, INSERM UMR1087, CNRS UMR 6291, IRT, Institut du Thorax, Nantes.
Collaboration sur les modèles murins d'allergie.
-M. Neunlist, INSERM UMR 913, Neuropathie du système nerveux entérique et pathologies
digestives, CHU de Nantes. Collaboration sur la physiologie intestinale (chambre de Ussing,
perméabilité, motricité).
-M. Grégoire, INSERM UMR 892, Equipe n° 4 : Biologie des cellules dendritiques et
applications thérapeutiques (mésothéliome et LAM) - Directeur scientifique de la Plateforme
de Développement et Transfert Clinique (CIC Biothérapies 503). Collaboration pour
l’utilisation des cellules dendritiques.
Activité d’expertise
Depuis le 16 juillet 2012 : Nomination en tant que membre du comité d’experts
spécialisés en « Nutrition humaine » de l’agence national de sécurité sanitaire de
l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES, Unité d'évaluation des risques liés à
la nutrition, Direction de l'évaluation des risques, Maisons-Alfort).
2013 et 2012 : Expertises pour l’ANSES : Evaluation de l’allégation « hypoallergénique »
d’une préparation pour nourrissons. Analyse du risque allergique des graines de Chia.
2012 : Expertise d’un projet de thèse pour une bourse délivrée par le centre de recherche et
l’université de Wageningen (WUR, Pays Bas).
2011 : Consultance pour la société IEEP (Siège social : 21 rue Leblanc, 75015 Paris). Projet
d’étude : Effet de certains compléments alimentaires sur le système immunitaire.
2008 : Evaluation d’un projet pour une demande de financement de stage post-doctoral –
demande faite par AXA assurance.
Activités d’encadrement
Encadrement de stagiaires en formation de base :
Licence professionnelle (1 à 100%).
Master II Recherche (6 à 100% et 1 à 50%), Master I Recherche (1 à 100%).
Encadrement de stagiaires en formation doctorale et post-doctorale :
Doctorat achevé (1 à 80%).
Doctorats en cours (1 à 33% et 1 à 20%).
Post-doctorats (4 à 100%).
7
Activités d’enseignement
2012 -2013: Elaboration d’une Unité d’Enseignement (UE) de Master 1 originale centrée
sur l'enseignement de la pathologie allergique et des voies de recherche qui l'entourent dans le
cadre du projet REAL². 1ère UE de M1 en France consacrée délibérément à la recherche en
allergologie et validée pour la rentrée universitaire de septembre 2012. Cours : Modèles
animaux d’allergie alimentaire : description et approche thérapeutique.
De 2003 à 2013, un cours magistral de 2h par an pour les troisièmes années d’école
d’ingénieur à l’ENITIAA de Nantes (module sécurité alimentaire). Le cours traite du risque
allergique : les allergies et les allergènes alimentaires.
De 2006 à 2013, un cours magistral de 3h par an pour le Master 2 Science de l’Aliment et
Nutrition Humaine (SANH) de l’UFR Sciences et Techniques et de l’UFR Médecine de
Nantes. Module sécurité alimentaire. Titre : ‘Allergie Alimentaire. Appréciation
expérimentale de l’allergénicité. Application aux protéines de blé’. Réalisation chaque année
d’un sujet d’examen et correction des copies.
2010: Participation au projet FODAGRO du CNAM : réalisation d’une vidéo d’un cours
sur « Les risques associés aux protéines alimentaires : Les allergies et les allergènes
alimentaires ». Participation au séminaire INRA Réflexives (linguistique et pratiques de
recherche) avec mon doctorant P. Gourbeyre.
2003 : DEA de Sciences Alimentaires, INA P-G Paris. Appréciation expérimentale de
l’allergénicité. Application aux protéines de blé.
Formations
- Anglais : CNAM de Nantes (65h en 2003/2004, 20h en 2005, 5h en 2006, 20h en 2007, 5h
en 2011).
- Formation pour la conduite d’entretien d’évaluation : 7h en 2007.
- Formation pour la conduite et la gestion de projets : 28h en 2007.
- Formation management et animation d’équipe : 14h en 2011.
- Séminaire réflexives : en 2011.
- Participation à deux écoles chercheurs (EC) : EC CEPIA sur les enjeux de la construction
de la qualité des aliments en juin 2006 ; EC ALIMH, CEPUIA et MICA sur «les interrelations aliments, microbiote et hôte à l’air de la métagénomique » en septembre 2009 ;
Particpation aux réunions de préparation de cette école regroupant la DS-NHSA et les
départements AlimH, Mica et Cepia.
8
LISTE DES PUBLICATIONS
Depuis le début de mon doctorat, on peut dénombrer 19 articles scientifiques publiés dans des
revues avec comités de lecture, 1 artcile soumis, 7 articles publiés dans des revues
professionnelles de médecine, 1 brevet, 7 posters nationaux, 8 posters internationaux, 9
conférences dans des congrès dont 6 invitées et une récompensée par un prix « de la meilleur
présentation ».
Les 19 articles relèvent principalement du domaine de l’allergie, de l’immunologie et de la
science des aliments (Food Science and Technology). Les revues sont classées dans le tableau
1 suivant le référentiel NORIA (Notoriété des Revues et Indicateurs d’Articles) qui sert de
référence à l’INRA pour les évaluations collectives et individuelles. A partir des facteurs
d’impact des revues, renseignés par l’outil Journal of Citation Report (JCR®-Thomson
Reuters), les revues d’une même discipline (avec appartenance à plusieurs catégories dans
certains cas) sont classées en 5 groupes de notoriété selon la distribution du facteur d’impact.
Ces cinq groupes sont 4 quartiles et un groupe de valeurs atypiques qui correspondent à une
notoriété exceptionnelle (1er quartile en rouge), excellente (2ème quartile en vert), correcte (3ème
quartile en bleu foncé), acceptable (4ème quartile en bleu clair), gris (médiocre). Ce
référencement est repris pour évaluer les articles publiés (Tableau 1). L’analyse biliométrique
de mes articles publiés est représentée dans le tableau 2.
Tableau 1 : Classement des revues selon le référentiel CREBI de l’INRA et nombre d’articles
publiés par M. Bodinier.
Titre du journal
Journal of Immunology
Nature Medicine
Transfusion
European Journal Of
Immunology
Blood
International Journal of
Cancer
Allergy
Journal of Agricultural
and Food Chemistry
International Archives
of
Allergy
and
Immunology
Revue française
d’allergologie et
d’immunologie clinique
Journal of Leucocyte
Biology
British
Journal
of
Nutrtion
Molecular Nutrition and
Food Research
Nbre
1
1
1
1
F.I.1
5.52
22.864
3.526
4.97
Classification
immunology
biochem.mol.biol. ; cell biol. ; med.,res.exp.
hematology
immunology
2
1
9.8
6.198
hematology
oncology
2
5
5.883
2.906
allergy ; immunology
agric.multidiscip. ; chem.,appl. ; food sci.technol.
1
2.248
allergy ; immunology
1
0.236
allergy
1
4.568
hematology ; immunology ; cell biol.
1
3.45
nutr.diet.
1
4.31
food sci.technol.
1
Notoriété à 2 ans en 2012 sur les indicateurs de l’année 2011
Notoriétés : Exceptionnelle , Excellente, Correcte, Acceptable, Médiocre
(Interprétation des facteurs d'impact à 2 ans du JCR® Science Edition 2010 version 1 – Référentiel des
Notoriétés Magri/Solari)
9
Tableau 2 : Analyse Bibiométrique des articles de M. Bodinier (extraction de Web Of Science
du 19/02/2014)
Author of 19 articles in peer-reviewed journals1
Papers as first author/last author: 32%/26%
Total number of citations: 401
Average Citations per Item: 23.321
1
Hirsch index (H): 10
M index : 0.782
1 data from ISIwebofknowledgeTM ; 2 computed as H/career length
Articles liés à mon activité de recherche
1-
2-
3-
4-
5-
6-
7-
8-
9-
Articles sans encadrement de doctorants/post-doctorants :
S. Denery-Papini, M. Bodinier, C. Larré, C. Brossard, F. Pineau, S. Triballeau1, M. Pietri,
F. Battais, T. Mothes, E. Paty4, D-A. Moneret-Vautrin. Allergy to deamidated gluten in
patients tolerant to wheat: specific epitopes linked to deamidation. 2012. Allergy, 67,
1023-1032. FI: 5.883.
M. Bodinier, C. Brossard,S. Triballeau, M. Morisset, C. Guerin-Marchand, F. Pineau, P.
de Coppet, D.A. Moneret-Vautrin, U. Blank and S. Denery-Papini. Evaluation of an in
vitro mast cell degranulation test in the context of food allergy to wheat. 2008. Int Arch
Allergy Immunol, 146, 307–320.FI: 2.248.
S. Denery-Papini, M. Laurière, G. Branlard, M. Morisset, C. Pecquet, D. Choudat, M.
Merlino, F. Pineau, Y. Popineau, E. Boulenc, I. Bouchez-Mahiout, M. Bodinier, and D.A.
Moneret-Vautrin. Influence of the Allelic Variants Encoded at the Gli-B1 Locus,
Responsible for a Major Allergen of Wheat, on IgE Reactivity for Patients Suffering from
Food Allergy to Wheat. 2007. J. Agric. Food Chem., 55, 799-805. FI: 2.906.
M. Bodinier, M.A. Legoux, F. Pineau, S.Triballeau, J.P Segain, C. Brossard and
S.Denery-Papini. Intestinal Translocation Capabilities of Wheat Allergens Using the Caco2 Cell Line. 2007. J. Agric. Food Chem, 55, 4576-4583.FI: 2.906.
F. Battais, T. Mothes, D.A. Moneret-Vautrin, F. Pineau, G. Kanny, Y. Popineau, M.
Bodinier and S. Denery-Papini. Identification of IgE-binding epitopes on gliadins for
patients with food allergy to wheat. 2005. Allergy, 60, 815-821. FI: 5.883.
Articles avec encadrement de doctorants/post-doctorants :
P. Gourbeyre, G. Bouchaud, T. Bihouée-Roussey, P. Aubert, D. Lair, M.A. Cheminant, S.
Denery-Papini, M. Neunlist, A. Magnan and M. Bodinier. Dissecting the
immunophysiology of atopic march using an original mouse model combining food and
respiratory allergies. Submitted to Clinical and Experimental Allergy. FI: 4.789.
P. Gourbeyre, N. Desbuards, G. Grémy, O. Tranquet, M. Champ, S. Denery-Papini and M.
Bodinier. Perinatal and Postweaning Exposure to Galactooligosaccharides/Inulin
Prebiotics induced Biomarkers linked to Tolerance Mechanism in a Mouse Model of
strong Allergic sensitisation. J. Agric. Food Chem. 2013, 61 (26), 6311–6320. FI: 2.906.
P. ourbeyre, N. Desbuards, . rémy, S. Le all, M. Champ, S. Denery-Papini and M.
Bodinier. Exposure to a Galactooligosaccharides/Inulin Prebiotic Mix at Different
Developmental Time Points Differentially Modulates Immune Responses in Mice. J.
Agric. Food Chem. 2012, 60, 11942−11951. FI: 2.906.
P. Gourbeyre, S. Denery, C. Larré, J.C. Gaudin, C. Brossard and M. Bodinier. Wheat
gliadins modified by deamidation are more efficient than native gliadins in inducing a Th2
response in Balb/c mice experimentally sensitized to wheat allergens”, 2012. Molecular
Nutrition and Food Research, 56(2), 336-344. FI: 4.31.
10
10-
11-
12-
13-
N. Desbuard, P. Gourbeyre, V. Haure-Mirande, D. Darmaun, M. Champ and M. Bodinier
“Impact of perinatal prebiotic consumption on gestating mice and their offspring: a
preliminary report”, Br J Nutr. 2011 Sep 12:1-4. FI: 3.45.
P. Gourbeyre, S. Denery and M. Bodinier. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: impact
on the gut immune system and allergic reactions. Review. 2011. Journal of Leukocyte
Biology (89), 685-695.FI: 4.568.
M. Bodinier, M. Leroy, S. Ah-Leung, F. Blanc, O. Tranquet, S. Denery-Papini, J.-M. Wal,
and K. Adel-Patient. Sensitization and elicitation of an allergic reaction to wheat gliadins
in mice. 2009. J Agric Food Chem, 57(4), 1219-25. FI: 2.906.
M. Bodinier, M. Leroy, K. Adel-Patient. Animal models of food allergy. Application to
wheat proteins. 2008. Revue française d’allergologie et d’immunologie clinique 48,
526–532. FI: 0.236.
Articles au cours de ma thèse :
14- D. Sauce, N. Rufer, P. Mercier, M. Bodinier, J.P. Remy-Martin, A. Duperrier, C. Ferrand,
P. Herve, P. Romero, F. Lang, P. Tiberghien and E. Robinet. Retrovirus-mediated gene
transfer in polyclonal T cells results in lower apoptosis and enhanced ex vivo cell
expansion of CMV-reactive CD8 T cells as compared to EBV-reactive CD8 T cells.2003.
Blood. 102: 4. FI: 9.8.
15- N. Labarrière, L. Bretaudeau, N. Gervois, M. Bodinier, G. Bougras, E. Diez, F. Lang, M.
Grégoire and F. Jotereau. Apoptotic-body loaded dendritic cells efficiently cross-prime
CTL specific for NA17-A but not for Melan-A/MART-1 antigens. 2002. Int. J. Cancer.
Sep 20; 101(3):280-6. FI: 6.198.
16- D. Sauce, M. Bodinier, M. Garin, B. Petracca, N. Tonnelier, A. Duperrier, J. Melo, J.
Apperley, C. Ferrand, P. Hervé, F. Lang, P. Tiberghien and E. Robinet. Retrovirusmediated gene transfer in primary T lymphocytes impairs their anti-EBV potential through
both culture-dependent and gene transfer-dependent mechanisms. 2002. Blood. 99: 1165.
FI: 9.8.
17- X. Saulquin, M. Bodinier, M.A. Peyrat, A. Hislop, E. Scotet, F. Lang, M. Bonneville and
E. Houssaint. Frequent recognition of BCRF1, a late lytic cycle protein of Epstein-Barr
virus, in the HLA-B*2705 context: evidence for a TAP-independent processing. 2001 Eur.
J. Immunol. 31: 708. FI: 4.97.
18- F. Lang and M. Bodinier. MHC-peptide multimers: tools of choice for detecting and
sorting antigen-specific T-cells. Transfusion. 2001 May;41(5):687-90. FI : 3.526.
19- M. Bodinier, M.A. Peyrat, C. Tournay, F. Davodeau, F. Romagne, M. Bonneville and F.
Lang. Efficient detection and immunomagnetic sorting of specific T cells using multimers
of MHC class I and peptide with reduced CD8 binding. 2000. Nature Medicine (New
tech.) 6:707. FI: 22.864.
20- M. Bodinier, C. Couedel, M.A. Peyrat, M. Bonneville, F. Davodeau and F. Lang.
Selection and longterm persistence of reactive CTL clones during an EBV chronic
response are determined by avidity, CD8 variable contribution compensating for
differences in TCR affinities. 1999. J. Immunol. 162:6351. FI: 5.52.
Articles dans des revues professionnelles :
1M. Bodinier and P. Gourbeyre. Les prébiotiques : une stratégie pour lutter contre les
allergies? La lettre du Pneumologue. 2012.
2M. Bodinier. Des prébiotiques pour prévenir l’allergie au blé ? En direct des Labos. Juillet
2012.
3M. Bodinier. Un modèle de souris pour évaluer le potentiel allergisant d’un procédé.
Illustration avec la désamidation du gluten de blé. En direct des Labos. Juillet 2012.
11
45-
6-
7-
1-
M. Bodinier and P. Gourbeyre. Relations entre le microbiote intestinal et les allergies
alimentaires. 2011. Nutrition & Endocrinologie. Hors-série allergies alimentaires N°1.
M. Bodinier. INRA, BIA. 2008. Plaquette réalisée avec la SEM des pays de la Loire (pole
enfants). PROGRAMME NUPEM. Impact des prébiotiques sur la prévention des allergies
alimentaires chez l’enfant.
M. Bodinier. INRA, BIA. 2008. Résumé d’un article «A novel tool for the detection of
allergic sensitization combining protein microarrays with human basophils. J. Lin et al.
Clinical and Experimental Allergy 2007; 37: 1854-1862» publié dans Alim’Inter.
M. Bodinier. Revue NAFAS. - VOL. 5, N° 5, OCT. 2007, Les allergies alimentaires. La
revue NAFAS s’adresse aux médecins généralistes, aux pharmaciens, aux diététiciens aux
différents acteurs des métiers de l’alimentation et à tous ceux qui s’intéressent aux
problèmes de la nutrition. Elle a pour but d’apporter une information scientifique,
économique et technique, validée et actualisée.
Brevet :
Brevet INSERM FR2798128 (Mars 2001): Moyens de détection et de purification de
populations lymphocytaires T CD8+ spécifiques de peptides présentés dans le contexte
HLA. Inventeurs: F. Lang, M. Bodinier, F. Davodeau, M. Bonneville. Extension
internationale WO 0118053. Licence d'exploitation accordée à Beckman Coulter
International (BCI). Janvier 2013 : étude clinique dans le contexte du mélanome (PHRC).
Communications affichées dans congrès (posters):
Posters nationaux:
1- Avril 2012 : 7ème Congrès Francophone d’Allergologie, Palais des Congrès, Paris. Effet
de la période d’exposition à un mélange de prébiotiques sur l’orientation du système
immunitaire. P. Gourbeyre, N. Desbuards, G. Grémy, O. Tanquet, M. Champ, S. DeneryPapini and M. Bodinier.
2- Avril 2011 : 6ème Congrès Francophone d’Allergologie, Palais des Congrès, Paris.Des
prébiotiques capables d’induire des mécanismes de tolérance sans réduire les symptômes
d’allergie chez la souris. P. GOURBEYRE, N.DESBUARD, G.GREMY ,
S.TRIBALLEAU, M. CHAMP, S. DENERY and M.BODINIER.
3- Juin 2010 : journée jeunes chercheurs de BIA, et rencontres du grand ouest : “Les
prébiotiques peuvent-ils agir sur la maturation intestinale et prévenir du risque allergique
alimentaire chez le nouveau-né ?”, présenté à la journée jeunes chercheurs de BIA et aux
rencontres du grand ouest. Nantes. P. GOURBEYRE, N.DESBUARD, G.GREMY ,
S.TRIBALLEAU, C.MICHEL, M. CHAMP, S. DENERY and M.BODINIER.
4- Novembre 2008 : Journées francophones de nutrition. Brest. M. BODINIER, C. MICHEL,
C. ROUX, M. CHAMP. Impact de prébiotiques sur le développement de la réponse
allergique à l'ovalbumine chez la souris.
5- Octobre 2007 : 4ème Symposium du CICBAA. Nancy: M. LEROY, M. BODINIER, S.
AH-LEUNG, F. BLANC, S. DENERY-PAPINI, J.-M. WAL, K. ADEL-PATIENT. Choix
de la souche de souris Balb/cJ dans le développement d’un modèle d’allergie alimentaire
aux gliadines de blé: manifestations biochimiques et cliniques.
6- Octobre 2007 : 4ème Symposium du CICBAA. Nancy: M. BODINIER, C. BROSSARD, S.
TRIBALLEAU, M. MORISSET, C. GUERIN-MARCHAND, F.PINEAU, P. DE COPPET,
DA. MONERET-VAUTRIN, U. BLANK and S. DENERY-PAPINI. Évaluation d'un test
in vitro de dégranulation mastocytaire dans le contexte de l'allergie alimentaire à la farine
de blé.
12
7- Septembre 2006 : M. BODINIER, S. TRIBALLEAU, C. GUERIN-MARCHAND,
F.PINEAU, M. MORISSET, DA. MONERET-VAUTRIN, U. BLANK and S. DENERYPAPINI. Wheat allergen detection using a mast cell degranulation test, comparison with
ELISA. 13th world congress of Food Science and technology (IUFOST). Nantes.
Posters internationaux:
1- Juin 2013: EAACI-WAO Congress. Milan (Italie). Study of immunological mechanism
implicated in atopic march using an original mouse model of food and respiratory
combined allergy- Bouchaud G., Gourbeyre P., Bihouée-Roussey T., Aubert P., Lair D.,
Denery-Papini S.,Neunlist M., Magnan A., Bodinier M.
2- Juin 2012: 31th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology.
Genève (Suisse). Impact of the exposure period to GOS/inulin prebiotics on immune
system orientation. P GOURBEYRE, N. DESBUARDS, G. GRELMY, O. TRANQUET,
M. CHAMP, S. DENERY-PAPINI and M. BODINIER.
3- Juin 2011: 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology.
Istanbul (Turquie): Assessment of allergenicity of diploid and hexaploid wheat
genotypes: identification of allergens in the albumin/globulin fraction. C. Larré, R. Lupi
,G. Gombaud, DA. Moneret-Vautrin, H. Rogniaux, M. Bodinier, S. Denery-Papini.
4- Juin 2011: 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology.
Istanbul (Turquie):“Prebiotics induce tolerance mechanisms but are not able to alleviate
allergic symptoms in a mouse model of wheat allergy.” P. GOURBEYRE,
N.DESBUARD, G.GREMY , S.TRIBALLEAU, M. CHAMP, S. DENERY and
M.BODINIER.
5- Décembre 2007 : M. BODINIER, M. LEROY, S. AH-LEUNG, F. BLANC, O.
TRANQUET, S. DENERY-PAPINI, J-M. WAL and K. ADEL-PATIENT. Balb/c mouse
model of allergy to wheat gliadins: biochemical and clinical manifestations. XX World
allergy congress (WAC). Bangkok (Thaïlande).
6- Juin 2005 : M. BODINIER, M.A LEGOUX, F. PINEAU, S. TRIBALLEAU and S.
DENEY-PAPINI. Passage of wheat allergens through intestinal epithelium using a model
of caco-2 cells. World Allergy Congress. Munich (Allemagne).
7- Juin 2004 : F.BATTAIS, M.BODINIER, Y.POPINEAU, DA.MONERET-VAUTRIN,
G.KANNY and S.DENERY. Characterisation of allergens involved in food allergy to
wheat. XXII EAACI congress. Amsterdam (Pays-Bas).
8- Juin 2003 : F.BATTAIS, M.BODINIER, F.PINEAU, Y.POPINEAU, G.KANNY,
DA.MONERET-VAUTRIN and S.DENERY. Food allergy to wheat. Congrès « Food
Allergy and Intolerance ». Bruxelle (Belgique).
Communications orales dans congrès:
Conférences invitées nationales:
1- Octobre 2011: Colloque PONAN. Communication orale. Un régime enrichi en
oligosaccharides prébiotiques exerce-t-il un effet préventif sur la survenue d'une allergie
future ? Etude chez un modèle murin. Marie Bodinier, BIA - INRA ANGERS-NANTES,
ÉQUIPE ALLERGIE. Ifremer. Nantes (France).
2- Avril 2010 : 5ème Congrès Francophone d’Allergologie, Palais des Congrès, Paris
(France). M.BODINIER. Apport de la biologie dans l’anaphylaxie alimentaire induite par
l’effort (AAIE)
3- Octobre 2009 : Congrès CICBAA Nancy (France). M. BODINIER, S. TRIBALLEAU, F.
PINEAU, M.A. LEGOUX, M. LEROY, B. BAKAN, D. MARION and S. DENERY.
Allergénicité des LTP de blé.
4- Mai 2009 : Congrès SAICO . Angers (France). M. BODINIER, S. DENERY. Allergènes
et épitopes du blé : leur caractérisation et leur présence dans différents types de blé.
13
5- Octobre 2007 : M. BODINIER. Les allergies alimentaires. Forum Santé Active, thème :
santé et alimentation. CPAM de la Sarthe. Le Mans (France).
6- Septembre 2007 : M. BODINIER. Les allergies alimentaires. Université d’été de nutrition.
Clermont-Ferrand (France).
Présentations internationales sélectionnées:
7- Juin 2012: 31th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology.
GENEVE (SUISSE). Impact of the exposure period to GOS/inulin prebiotics on immune
system orientation. P GOURBEYRE, N. DESBUARDS, G. GRELMY, O. TRANQUET,
M. CHAMP, S. DENERY-PAPINI and M. BODINIER.
8- Juin 2006 : XXV Congress of the European Academy of Allergology and Clinical
Immunology (EAACI). VIENNE (AUTRICHE). M. BODINIER, S. TRIBALLEAU , C.
GUERIN-MARCHAND, F. PINEAU, M. MORISSET, DA. MONERET-VAUTRIN, U.
BLANK and S. DENERY-PAPINI. Wheat allergen detection using a mast cell
degranulation test, comparison with ELISA.
Présentation internationale récompensée par un prix:
9- Juin 2011 : 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical
Immunology. ISTANBUL (TURQUIE). Comparison of IgE-binding epitopes on wheat
gliadins for patients with food allergy and experimentally sensitized mice. M.BODINIER,
S.DENERY, O.TRANQUET. Prix de la meilleure présentation.
14
INTRODUCTION
Afin de mieux appréhender l’ensemble de mes travaux de recherche, j’aimerais
auparavant faire une brève introduction sur le système immunitaire, les allergies alimentaires
et les stratégies nutritionnelles émergentes pour lutter contre ces pathologies.
I.
Le système immunitaire :
Le terme « immunitaire » vient du latin immunis, signifiant « exempt », qui dans le
contexte du système immunitaire fait référence aux agents envahissants étrangers. Le système
immunitaire est notre armée collective : un milliard de globules blancs, la moelle osseuse, des
anticorps, des cytokines et le thymus. Il permet d’identifier et de détruire des millions de
microbes (bactéries, virus, parasites et champignons) qui pénètrent dans nos organismes
chaque jour ainsi que les milliers de cellules qui sont devenues génétiquement anormales ou
cancéreuses. En faisant ce travail vital notre organisme est conservé, sans cela, nous serions
morts en quelques jours.
A. Deux systèmes : l’inné et l’adaptatif
La protection de l’organisme vis-à-vis des infections (bactéries, virus, champignons et
parasites) est la tâche majeure du système immunitaire qui a mis en place deux lignes de
défense (1). La première, l’immunité innée, est la plus ancienne au regard de l’évolution,
hautement conservée parmi les différentes espèces. Elle comprend principalement les cellules
phagocytaires, certaines protéines du sang et les cellules NK, et fait intervenir les barrières
naturelles de l’organisme (peau et muqueuses). Ses stratégies de défense sont basées sur la
reconnaissance de structures moléculaires typiques communes à un grand nombre de
pathogènes. Après l’intrusion d’un pathogène dans l’organisme, les mécanismes de
l’immunité innée entrent rapidement en action, généralement en quelques heures. Lorsque
l’infection échappe à l’immunité innée, la seconde ligne de défense se met en place :
l’immunité adaptative.
L’immunité adaptative, mécanisme plus récent du point de vue de l’évolution, est basée sur la
présence de récepteurs d’une haute affinité pour certaines régions (épitopes) du pathogène.
Cette réponse génère une mémoire immunitaire garantissant une réponse plus rapide et plus
efficace à chaque nouvelle infection avec le même agent pathogène. Les principaux acteurs de
la réponse immunitaire adaptative sont les lymphocytes T et B (LT et LB) ainsi que des
cellules capables de leur présenter un antigène (CPA) (figure 1). Ces dernières expriment à
leur surface un récepteur particulier : le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).
Lorsque les CPA captent un antigène, elles le digèrent et présentent des fragments au niveau
de leur CMH. Cette liaison CMH-peptide antigénique est indispensable pour la
reconnaissance de l’antigène par le récepteur des lymphocytes T (TCR). Après avoir reconnu
l’antigène, les lymphocytes T s’activent et prolifèrent pour éliminer l’agent infectieux.
15
B. La reconnaissance par le système immunitaire :
Avant que notre système immunitaire ne détruise les envahisseurs ou les cellules
cancéreuses, il doit les reconnaître (1). La grande majorité de nos cellules, qui sont saines, ne
doivent pas être touchées. En d’autres termes, le système immunitaire doit être capable de
détecter lui-même ce qui lui est étranger. Ainsi, dans le cas d’une cellule génétiquement
endommagée, elle doit être capable de lire les signaux révélant un problème dans la cellule.
La reconnaissance joue donc un rôle essentiel dans l’immunité, et c’est le problème le plus
complexe pour le système immunitaire : notre organisme et ses cellules sont en constante
évolution et nous sommes sans cesse exposés à de nouveaux envahisseurs. Un équilibre
délicat est demandé. Si le système immunitaire est hyperactif, nous finissons par attaquer
notre propre organisme, comme dans le cas des maladies auto-immunes et des allergies. Si le
système immunitaire est trop « laxiste », les envahisseurs causent de graves dommages à notre
organisme et les cancers peuvent se développer de manière incontrôlée.
C. La médiation du système immunitaire :
Toutes les réponses du système immunitaire sont obtenues par médiation des globules
blancs (les leucocytes, y compris les cellules T, B et lymphocytes NK, les monocytes, les
phagocytes, les basophiles, les neutrophiles et les éosinophiles), des cellules spécialisées dans
divers tissus (macrophages, mastocytes) ainsi que des hormones et autres messagers
chimiques transportés par les systèmes sanguins et lymphatiques. La grande majorité des
cellules du système immunitaire provient des précurseurs de la moelle osseuse et circule dans
le sang et les tissus. Par exemple, les lymphocytes T et B, qui fonctionnent grâce au système
lymphatique, ont leur origine dans la moelle osseuse. Les cellules T vont ensuite migrer vers
le thymus où elles parviennent à maturité (d’où « cellule T »).
D. Les lymphocytes T :
1. Les différents types de lymphocytes T et leur fonction
On distingue deux grandes sous populations de lymphocytes T (LT) : les LT portant le
marqueur CD8 (CD8+) sont des lymphocytes T cytotoxiques et les LT portant le marqueur
CD4 (CD4+) sont des lymphocytes T auxiliaires (T helper : Th).
Parmi les lymphocytes T CD4+ auxiliaires activés, on distingue trois sous populations
majeures : les lymphocytes Th1, Th17 et Th2. L’interleukine 12 (IL-12) induit la
différentiation des lymphocytes Th0 naïfs en lymphocyte Th1 impliqués dans les voies de
défenses cytotoxiques contre les pathogènes intra-cellulaires (certaines bactéries : Listeria
monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis; tous les virus) via la sécrétion de cytokines
inflammatoires telles que l’IL-2 ou l’IFN (2). L’IL-1, l’IL-6 et le T Fβ induisent la
différentiation des lymphocytes Th0 naïfs en lymphocytes Th17 (3). Ces cellules sécrètent
l’IL-17 et l’IL-22, jouant un rôle pro-inflammatoire notable. Les lymphocytes Th17 sont
impliqués dans les voies de défenses cytotoxiques contre les pathogènes extra-cellulaires
16
(certaines bactéries : Streptococcus pneunomoniae, Salmonella typhi, Clostridium tetani;
champignons; vers), dans certaines maladies auto-immunes et hypersensibilités de type IV
(4). L’IL-4 induit la différenciation des lymphocytes Th0 en lymphocytes Th2, sécrétant l’IL4 et l’IL-5, impliqués dans les mécanismes de défense contre les parasites mais également
dans certaines hypersensibilités (5). Les cellules dendritiques constituent des cellules
présentatrices d’antigènes professionnelles et jouent ainsi un rôle crucial pour l’activation et
la maturation des lymphocytes Th0 en lymphocytes Th1 ou Th2. Les lymphocytes T CD4+
activés contribuent à la différenciation des lymphocytes B (LB) en plasmocytes capables de
sécréter des immunoglobulines (Ig) (Figure 1a).
Les immunoglobulines sont les récepteurs de l’antigène des lymphocytes B (BCR). Elles sont
exprimées à la surface des LB mâtures et sécrétées dans le sang par les plasmocytes. Ce sont
des glycoprotéines composées de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères
identiques. Les chaînes lourdes et légères possèdent à leur extrémité des domaines variables
impliqués dans la reconnaissance de l’antigène. Il existe plusieurs formes
d’immunoglobulines :
- les IgG sont les immunoglobulines majoritaires du sérum. On distingue quatre sous classes
d’Ig : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. Ces immunoglobulines sont toujours rencontrées sous
forme sécrétée. Elles sont monomériques.
- les IgA sont majoritairement monomériques bien qu’elles puissent dans certains cas former
des dimères. Les IgA sont sécrétées dans le sang mais aussi dans de nombreux autres
fluides corporels tels que la salive, les sécrétions du système bronchique, les voies
urinaires, les larmes, le lait maternel et au niveau des intestins où elles jouent un rôle
majeur pour l’immunité mucosale.
- les IgM forment le plus souvent des complexes pentamériques. Une faible proportion
demeure sous forme monomérique et constitue des immunoglobulines de surface des
lymphocytes B matures.
- l’IgD est une autre immunoglobuline fréquemment trouvée à la surface des LB humains.
- les IgE sont très peu présentes dans le sérum des individus sains. Elles sont impliquées
dans les formes d’hypersensibilité de type 1 et jouent également un rôle important dans la
défense contre les parasites.
Le lymphocyte T CD8+ (figure 1b) est capable de lutter contre les organismes intracellulaires
(les virus, certaines bactéries...) et les cellules tumorales. Lorsqu’il entre en contact avec la
cellule infectée (reconnaissance avec le complexe CMH I-peptide via son TCR) le LT CD8+
va libérer des granules d'exocytose qui vont sortir de la cellule CD8 grâce à une
réorganisation de son cytosquelette et induire l'apoptose de la cellule infectée puis le LT
CD8+ repart. Les LT CD8+ sont très processifs : ils peuvent induire à la chaine la mort de
beaucoup de cellules infectées. Ils possèdent différentes molécules capables de lyser les
cellules cibles :
-
perforine (protéine formant des pores) et granzymes (sérine protéinases qui
activent l'apoptose) sont présents dans des vésicules préformées et prêtes à l'emploi
Fas Ligand/Fas
17
-
autres systèmes ligand/récepteur de la famille du TNF : TRAIL ou TNFα. Ces
molécules sont à la fois secrétées et de surface.
Figure 1 : Les lymphocytes T
Figure 1a : Activation des lymphocytes T CD4+ : lorsqu’un pathogène est capté par une
CPA, il est digéré par cette dernière capable alors de présenter un peptide antigénique par
l’intermédiaire du CMH à un LT. Les LT CD4+ contribuent à la différenciation des LB en
plasmocytes capables de sécréter des Ig dirigées contre le pathogène initialement reconnu.
Figure 1b : Activation du lymphocyte T CD8+. Le LT CD8+, via son TCR, va reconnaitre
sur la cellule infectée (virus, bactéries) des peptides issus des protéines de l’agent pathogène.
Il va alors s’activer et sécréter une protéine, la perforine, et des enzymes protéolytiques qui
vont former des pores et lyser la cellule infectées.
18
2. Les récepteurs des lymphocytes T
Les lymphocytes T (figure 2a) présentent à leur surface un récepteur à l’antigène (TCR) (1)
constitué de glycoprotéines hétérodimériques  ou  très diversifiées associées à des
chaînes invariantes et  du CD3). Ce récepteur est capable de reconnaître des peptides
antigéniques présentés par des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de
classe I ou II. Le CMH de classe I est constitué d’une chaîne lourde ( domaines
et) et d’une chaine invariante la 2-microglobuline (2m) alors que le CMH de
classe II est composé de deux chaînes (et)et (et). Le TCR est associé à un
co-récepteur CD4 ou CD8 qui conditionne la restriction CMH classe I ou II de la
reconnaissance antigénique (figure 2b). Ce co-récepteur a une fonction de stabilisation du
complexe TCR-CMH-peptide en se fixant à des domaines peu polymorphes de la chaîne
lourde du CMH (domaine 3 du CMH I et régions 2 et 2 sur le CMH II) et participe à la
transduction des signaux d’activation (figure 2c) en s’associant à la protéine tyrosine kinase
p56lck au niveau du complexe TCR (figure 2d). L’interaction entre le TCR du lymphocyte T
et le complexe CMH-peptide de la cellule présentatrice d’antigènes est donc stabilisée par les
co-récepteur CD4 ou CD8 mais aussi par de nombreuses autres molécules que l’on appelle
accessoires telles que les molécules de co-stimulation CD28/B7 ou les molécules d’adhésion
CD2/LFA-3, LFA-1(CD11a/CD18) /ICAM-1 (CD54), VLA4/VCAM-1, CD40/CD40L.
Figure 2 : Interaction TCR-CD8-CMH/peptide
Figure 2a : Structure du TCR associé au CD3.
19
Le CD4 se lie à une portion non
polymorphique de la chaîne  du
CMH II à distance du site
d’interaction avec le TCR.
Le CD8 se lie à une portion non
polymorphique de la chaîne  du CMH I
à distance du site d’interaction avec le
TCR.
Figure 2b : Rôle des co-récepteurs (CD4 et CD8) dans la stabilisation de l’interaction
TCR-CMH.
LT CD4+
LT CD8+
Figure 2c : Rôle des co-récepteurs dans l’activation lymphocytaire.
20
Figure 2d : La transduction du signal par le TCR (d’après (6) :l’interaction TCR-ligand
déclenche la transduction du signal. Les kinases Fyn et Lck sont mises en jeu et recrutent
ZAP-70. La phospholipase γ1 (PLCγ1) puis la calcineurine, la protéine kinase C (PKC) et
p21ras sont activées. Les facteurs de transcription Fos, Jun, NFAT, NFκB et Oct se fixent sur
les séquences promotrices du gène IL2, entraînant sa transcription. PIP2 : phosphatidyl
inositol-bisphosphate ; DAG: diacylglycérol.
II.
Les Allergies alimentaires
A. Généralités sur les allergies
1. Prévalence :
En 1998, dans les pays industrialisés, environ un enfant sur cinq présentait une
pathologie allergique comme l’asthme, la rhinite allergique ou la dermatite atopique (7). La
prévalence de la dermatite atopique a doublé, voire triplé, dans les pays industrialisés au cours
des trois décennies passées, affectant de 15 à 30% des enfants et de 2 à 10% des adultes (8).
Les cas d’anaphylaxies sévères touchent 1 à 3 personnes sur 10 000 par an et sont souvent
récurrentes (9-12). L’anaphylaxie se caractérise par des symptômes cliniques très sévères
comme l’insuffisance circulatoire ou l’angio-œdème du larynx. Ces anaphylaxies sont létales
dans 0,65% à 2% des cas (12, 13). La fréquence de ces anaphylaxies a été multipliée par cinq
entre 1980 et 1992 (10, 14). Les allergies ont été classées au 4e rang mondial des problèmes
de santé publique.
En France, les allergies alimentaires touchent 3,34% de la population et sont plus souvent
fréquentes chez les enfants (4 à 8,5%) (15). Sur 402 cas d’anaphylaxies sévères reportés entre
2004 et 2006, 248 concernaient des allergies alimentaires dont 38,7% touchaient des enfants
et 61,3% touchaient des adultes (10). D’après une étude récente basée sur une analyse de
21
données (entre 2000 et 2012), ces pathologies toucheraient environ 5,9% de la population
européenne tout âge confondu (16). Selon une étude Américaine, la prévalence cumulée des
allergies alimentaires serait de 3 à 6 % (17). De nombreuses études suggèrent une
augmentation de cette prévalence, mais les méthodes d’analyse utilisées dans ces travaux
justifient d’être prudent sur ce concept. La prévalence varie en fonction de l'âge,
l'emplacement géographique (18), et peut-être la race et l’ethnie (17).
2. Les allergies alimentaires :
L’allergie alimentaire se définit comme une réponse anormale et exagérée du système
immunitaire à des composants d’un aliment (allergène) (19). Elle est généralement provoquée
par les IgE via l’activation des mastocytes et des basophiles et correspond la plupart du temps
à une hypersensibilité de type I. L’allergie alimentaire diffère de l’intolérance alimentaire qui
correspond à un autre type de réaction de l’organisme contre l’aliment, de nature
physiologique avec des prédispositions génétiques et souvent non immunologique.
Bien que de nombreuses protéines alimentaires puissent être des allergènes, 90% des allergies
alimentaires sont causées par quelques aliments (20). L’incidence des allergies alimentaires
dépend des habitudes alimentaires, variables en fonction de l’âge des individus (nouveauxnés, enfants, adultes) et de facteurs culturels (16, 21, 22). Chez l’enfant, cinq aliments sont
responsables de la majorité des cas d’allergie alimentaire : l’œuf (34,25% des allergies
alimentaires), l’arachide (25,07%), le lait de vache (8,9%), le poisson (5,14%) et les noix
(5,39%) (23). Ainsi, les enfants sont plus couramment sensibilisés par des allergènes d’origine
animale que par des allergènes d’origine végétale. Chez l’adulte, une tendance inverse est
constatée dans la mesure où les allergènes majeurs sont d’origine végétale (fruits rosacés,
allergènes du groupe latex, noix, céréales,…) et rarement d’origine animale (24). Les allergies
alimentaires les plus courantes varient en fonction des pays.
L’allergie alimentaire à l’arachide est l’une des plus courantes et sérieuses réactions
d’hypersensibilité immédiate à des aliments en terme de persistance et de sévérité (25). À
l’inverse des autres allergies alimentaires, les symptômes cliniques disparaissent rarement
avec l’âge et un risque d’aggravation des symptômes est fréquent lors d’une nouvelle
exposition accidentelle (26). La prévalence de l’allergie à l’arachide varie entre 0,5 et 1,1% en
fonction de la population étudiée (27, 28). En France, elle est la deuxième allergie alimentaire
la plus commune chez l’enfant de moins de trois ans après l’allergie à l’œuf (19). Les deux
allergènes majeurs de l’arachide sont Ara h 1 et Ara h 2 (29). Ces deux molécules sont
résistantes à la digestion ce qui accroît leur pouvoir allergénique (30). La résistance d’un
allergène à la dénaturation lors de la digestion gastro-intestinale est en effet une
caractéristique propre à de nombreux allergènes alimentaires (31).
L’allergie au lait de vache est l’allergie alimentaire la plus courante chez les enfants de moins
d’un an avec une prévalence d’environ 2,5% (32, 33). À l’inverse de l’allergie alimentaire à
l’arachide, elle disparaît en général naturellement à partir de la troisième année de vie. Sa
forte prévalence chez le nourrisson explique la recherche de substituts alimentaires hypoallergéniques. Les allergènes majeurs reconnus par les IgE des patients sont la fraction
22
caséine, la β-lactoglobuline et l’α-lactalbumine, ainsi que des protéines mineures du lait
comme la sérum albumine bovine (BSA), les immunoglobulines ou la lactoferrine (34, 35).
L’allergie alimentaire à l’œuf de poule est la principale allergie alimentaire de l’enfant âgé de
moins de trois ans (22, 36). Cette allergie disparaît avec l’âge cependant, dans certains cas,
elle peut perdurer à l’âge adulte. Les allergènes majeurs de l’œuf sont présents dans le blanc
d’œuf : ovalbumine, ovomucoïde, lysozyme et conalbumine. Le jaune d’œuf semble moins
allergisant (37).
Des réactions croisées peuvent être observées entre différents allergènes alimentaires de
familles botaniques proches, et également entre allergènes alimentaires et allergènes de
pollen, d’acariens ou du latex (38, 39). Ces phénomènes de réactivité croisée entre allergènes
s’expliquent par de fortes homologies de séquence ou de structure. Les allergènes
responsables de ces réactions sont des protéines ubiquitaires assurant des fonctions
indispensables à la survie de l’organisme et donc très conservées au cours de l’évolution.
C’est notamment le cas de la protéine de transfert des lipides (LTP) présente chez de très
nombreuses espèces végétales (40).
3. L’allergie alimentaire au blé:
Le blé est une des céréales les plus cultivées au monde. Deux types de blé sont
particulièrement cultivés : le blé dur (Triticum durum) qui est utilisé pour la fabrication de
pâtes alimentaires et en semoulerie, ainsi que le blé tendre (Triticum aestivum) qui est utilisé
dans la panification et la biscuiterie. La farine de blé, obtenue par mouture des grains et
tamisage, est composée de 75 à 80% d’amidon et de 7 à 14% de protéines. Parmi ces
protéines, certaines sont solubles dans l’eau et les tampons salins (les albumines et les
globulines) et d’autres ne le sont pas (les prolamines ou protéines du gluten). Le grain de blé
tendre renferme dans son tissu de réserve, l’albumen, entre 8 et 15% de protéines appelées
prolamines car riches en prolines et en glutamines. Elles ont la propriété unique de pouvoir
former, après hydratation, une masse cohérente, insoluble et viscoélastique : le gluten (41).
Cette propriété confère au gluten un pouvoir texturant qui est très employé par les industries
agroalimentaires. Deux types de prolamines peuvent être distingués : les gliadines (αgliadines, β-gliadines, γ-gliadines, ω-gliadines) qui sont solubles dans l’éthanol et les
gluténines (gluténines de bas poids moléculaire et de haut poids moléculaire) qui ne peuvent
être solubilisées que dans des tampons très dénaturants à base de SDS et de mercaptoéthanol.
Le blé fait partie des six aliments (lait, œuf, blé, soja, arachide et poisson) responsables
approximativement de 90% des allergies alimentaires de l’enfant (42) et il est fréquemment
impliqué dans les anaphylaxies induites par l’effort (15). En France, le blé arrive au 8e rang de
l’allergie chez l’enfant et au 12e rang de l’allergie chez l’adulte (43). L’allergie alimentaire au
blé toucherait moins de 1% de la population Européenne tout âge confondu (44). Les
manifestations cliniques de l’allergie alimentaire au blé sont assez classiques affectant la
peau, le tractus digestif et les voies respiratoires (45). Cette allergie est présente chez l’enfant
et chez l’adulte avec des symptômes cliniques parfois très différents. Chez l’enfant l’allergie
alimentaire au blé se manifeste par une dermatite atopique associée, ou non, à des symptômes
23
respiratoires et des troubles digestifs (46-49). Chez l’adulte, cette pathologie entraîne plutôt
une anaphylaxie induite par l’effort, un choc anaphylactique, de l’urticaire récidivante ou
chronique (50-52), ou plus rarement des troubles intestinaux (53, 54). Les - et -gliadines,
de même que certaines protéines de la fraction albumine/globuline, sont des allergènes
importants chez les enfants souffrant de dermatite atopique (55, 56). Chez les adultes,
souffrant d’anaphylaxie induite par l’effort ou d’urticaire chronique, les 5-gliadines et les
sous-unités gluténines de faibles poids moléculaires sont des allergènes majeurs (55).
B. Les mécanismes de la tolérance orale et de l’allergie alimentaire
En temps normal, l'ingestion d’aliment induit un phénomène appelé "tolérance orale" :
le système immunitaire réagit faiblement à l'introduction des protéines alimentaires dans
l'organisme. Chez certaines personnes, ce phénomène fait défaut pour certaines molécules
dont l'ingestion entraîne une allergie alimentaire.
1. La tolérance orale
La tolérance orale est le mécanisme mis en place, par défaut, par le système
immunitaire en présence des protéines alimentaires. Ainsi, une exposition orale à des
antigènes chimiques ou alimentaires entraine une diminution de la réponse immunitaire vis à
vis du composé en question, que ce soit chez l’homme (57-60) ou chez l’animal (58, 61, 62).
Ce mécanisme s’accompagne d’une augmentation de la sécrétion de certaines Ig (IgG et IgA),
ainsi que d’une inhibition de la voie Th2 (voie conduisant à l’induction de l’allergie). La
réponse Th1 est également capable de moduler l’intensité de la réponse Th2, de sorte qu’il
existe une « balance Th1/Th2 » (63) (Figure 3). La voie Th1 est ainsi considérée comme une
voie inhibitrice des réponses d’hypersensibilité de type I.
Figure 3 : La balance Th1/Th2 : l’IL-12 induit la différentiation des LT Th0 naïfs en LT Th1
(IFNγ) impliqués dans les voies de défense cytotoxiques contre les pathogènes. L’IL-4 induit
la différentiation des LT Th0 en LT Th2 (IL-4 et l’IL-5) impliqués dans les voies de défense
contre les parasites et les hypersensibilités de type I et IV. Ces deux sous-populations de LT
CD4+ sont capables de s’inhiber l’une et l’autre, de sorte qu’il existe une « balance
Th1/Th2 ».
24
Cependant, la balance Th1/Th2 n’explique pas, à elle seule, le mécanisme de la tolérance
orale. Cette dernière met en effet en jeu d’autres processus liés à d’autres lymphocytes T
CD4+ : les cellules T régulatrices (Treg). De nombreux Treg ont été décrits à ce jour. Deux
sous-groupes peuvent être distingués : les lymphocytes T régulateurs naturels (CD4+ CD25+
FoxP3+) qui se différencient au niveau du thymus et les lymphocytes T régulateurs induits
comme les lymphocytes Th3 et les lymphocytes Tr1 (64). Les lymphocytes Th3 sécrètent
majoritairement du TGF, ainsi que de faibles niveaux d’IL-4 et d’IL-10. Le TGF est une
cytokine jouant un rôle important dans le processus de tolérance notamment en stimulant la
sécrétion des IgA (65). Il a été prouvé que cette cytokine peut réduire la réaction
d’hypersensibilité retardée dans un modèle de souris lorsqu’elle est administrée de manière
systémique avant la provocation (66). Il a aussi été montré que les cellules épithéliales,
présentes au niveau du duodénum d’enfants présentant une allergie alimentaire, exprimaient
peu le TGF (67). Les lymphocytes Tr1 sécrètent l’interleukine 10. L’IL-10 est produite par
les cellules des plaques de Peyer; ceci a notamment été mis en évidence dans un modèle
animal de tolérance à la β-lactoglobuline (68). Cette cytokine joue par conséquent un rôle
important dans le processus de tolérance. Enfin, les lymphocytes Treg naturels CD4+ CD25+
ont des propriétés immuno-suppressives et ont été décrits comme capables de supprimer la
réponse d’hypersensibilité retardée chez la souris (69). Cependant, il semble que ce sous-type
de lymphocytes Treg n’exerce pas de rôle dans le mécanisme de la tolérance orale.
Différents facteurs peuvent moduler la tolérance orale, parmi lesquels : les propriétés physicochimiques de l’antigène, la voie d’immunisation, le fond génétique, l’âge et le microbiote.
Ainsi, un antigène soluble entraîne plus facilement la tolérance qu’un antigène agrégé : ceci a
notamment été prouvé chez la souris avec l’ovalbumine, pour laquelle la forme soluble
entraînait peu de sécrétion de cytokines (IL-4, IFNγ), alors que la forme encapsulée de la
protéine ne baissait pas l’intensité de la réponse T (70).
La voie orale semble être la seule voie pouvant conduire à la tolérance aux antigènes
alimentaires. En effet, une exposition cutanée avec des allergènes d’arachide induit
directement la voie allergique de type Th2; il en est de même pour une sensibilisation
épicutanée avec de l’ovalbumine (71-73).
Le lait maternel semble jouer un rôle important dans les processus de tolérance (présence
d’IgA, de T Fβ, voire de faibles doses d’allergènes) et il a notamment été montré que le lait
pouvait prévenir de certaines réponses immunitaires antigènes-spécifiques (74-76). Il a été
observé chez la souris que seuls les antigènes alimentaires apportés par la voie orale étaient
retrouvés dans le lait. En effet, des antigènes injectés dans le sang par voie intra-veineuse ne
sont pas détectés dans le lait (75).
Parmi les différentes études réalisées chez la souris, il a été constaté que le fond génétique des
individus avait une influence majeure sur l’acquisition de la tolérance orale. Ainsi, lorsque la
tolérance orale est induite chez différentes souches de souris, l’intensité de la tolérance est très
variable d’une souche à une autre (71, 77). L’âge des individus influence également fortement
le mécanisme d’acquisition de la tolérance orale. Chez des individus très jeunes, chez qui le
système immunitaire est considéré comme immature, la tolérance semble plus difficile à se
25
mettre en place. Chez la souris, une administration d’ovalbumine le premier jour de vie
entrainera une réponse immunitaire spécifique à l’âge adulte. En revanche, la même
administration après la première semaine de vie entrainera la tolérance de l’individu (75, 78,
79). Il semble que cette forte immaturité immunologique à la naissance soit une particularité
des rongeurs et que les nouveaux nés humains soient plus proches des souris de 7 jours (75,
79, 80). De plus, s’il est assez facile d’induire la tolérance chez un sujet adulte (souris de 8
mois), il est plus difficile de l’induire chez un sujet âgé (souris de 20 mois) (81). Chez
l’homme, la tolérance aux antigènes alimentaires semble se dérouler dans une fenêtre
d’exposition aux protéines critique et précoce du développement (82). Cette fenêtre de temps
n’est pas claire. Actuellement nous avons certaines évidences pour dire que cette période se
déroulerait à l’âge de 4 et 6 mois (82).
Enfin, des études menées chez des souris axéniques (dépourvues de microbiote) ont mis en
évidence l’importance du microbiote dans les processus d’acquisition de la tolérance (71, 81,
83)). Des études de flores chez l’homme ont montré que des altérations du microbiote
conduisaient à une rupture de la tolérance et à l’émergence d’intolérances et d’allergies
alimentaires (84).
2. La réponse allergique
L’immunoglobuline majeure de l’allergie est l’IgE. Elle est l’immunoglobuline la
moins abondante dans le corps : chez l’adulte sain, son taux physiologique moyen avoisine les
100 ng/ml, soit une concentration 100 000 fois plus faible que celle des IgG (85, 86). Chez les
individus atopiques, le taux moyen d’IgE est beaucoup plus élevé mais subit des variations
physiologiques intra- et inter-individuelles (87, 88).
La réaction allergique est un processus se déroulant en deux phases :
- Au cours de la phase de sensibilisation (Figure 4), une molécule allergénique franchit la
muqueuse et est capturée par une CPA. Cette CPA présente la molécule allergénique à des
lymphocytes Th0 naïfs qui se différencient alors en lymphocytes Th2 en présence d’IL-4. Les
lymphocytes activés produisent des cytokines de type Th2, comme l’IL-4, l’IL-5 ou l’IL-13,
ce qui active la production d’IgE spécifiques de l’allergène par les plasmocytes (89). L’IL-4 et
l’IL-5 régulent également la colonisation et l’activation de cellules de l’inflammation comme
les mastocytes et les granulocytes basophiles. De plus, les IgE sécrétées se lient aux
récepteurs FcRI, également appelés « récepteurs de haute affinité aux IgE », qui sont
abondamment exprimés à la surface des mastocytes et des basophiles (90, 91).
- Lorsqu’un nouveau contact a lieu avec le même allergène, la phase de déclenchement est
induite (Figure 4). Lors de cette deuxième phase de la réponse allergique, l’allergène se lie
directement aux IgE spécifiques fixées à la surface des mastocytes. Lorsqu’au moins deux
récepteurs FCRI sont activés, les granules présents dans le mastocytes sont expulsés, libérant
de nombreux médiateurs de l’inflammation. Parmi ces composés sont retrouvés : l’histamine,
la tryptase, la -hexosaminidase, ainsi que d’autres médiateurs de l’inflammation, impliqués
dans la phase clinique de la réponse allergique.
26
Figure 4 : Mécanisme de l’allergie : au cours de la phase de sensibilisation, l’allergène
franchit la barrière épithéliale et est capturée par une CPA. Il est présenté à un LT naïf se
différenciant en LT Th2 sécrétant l’IL-4. La production d’IgE spécifiques de l’allergène est
ainsi activée. Ces IgE se fixent ensuite sur les mastocytes. Lors de la phase de
déclenchement de l’allergie, un nouveau contact avec l’allergène induit la dégranulation des
mastocytes, libérant de nombreux médiateurs de l’inflammation. Ces molécules augmentent la
perméabilité para-cellulaire, favorisant le passage des allergènes à travers la muqueuse et
amplifiant la réponse allergique.
Les phases de sensibilisation et de déclenchement de la réaction allergique sont conditionnées
par le transport de l’allergène au niveau de la muqueuse intestinale pour que celui-ci puisse
être au contact du système immunitaire (92). Il faut rappeler qu’environ 90% des protéines
alimentaires sont dégradées par les protéases gastrique, pancréatique et intestinale (au niveau
des bordures en brosse). Ainsi, seulement 10% des protéines sont non dégradées et donc
capables de franchir la barrière. En effet, de l’ovalbumine a été retrouvée intacte dans le sang
après consommation d’œuf (93), il en est de même pour l’HRP, l’-et la -lactoglobuline
(94). Le transport des protéines alimentaires dépend de leur taille, polarité, forme, statut
d’agrégation et structure 3D. Il peut se procurer par voie paracellulaire ou transcellulaire (92)
(figure 5). Le transport paracellulaire se fait au niveau de l’espace intercellulaire entre les
cellules intestinales et il est régulé par l’intégrité des jonctions serrées. Lors de ce transfert, les
protéines ne sont pas exposées aux lysosomes dans l’entérocyte et sont donc non dégradées.
Le transport transcellulaire est induit par diffusion passive, par des transporteurs spécifiques
ou par endocytose (la plus fréquente). L’endocytose peut conduire à des formes dégradées,
peu dégradées (endosomes) ou intactes (voie non lysosomiale) de la protéine. La prise en
charge de l’antigène au niveau de la barrière intestinale peut être réalisée par l’entérocyte (la
cellule la plus abondante), les cellules M (cellules épithéliales spécialisées présentes au niveau
des plaques de Peyer, (95)) ou la cellule dendritique capable d’émettre des dendrites au niveau
des jonctions serrées sans perturber la barrière intestinale pour capturer l’antigène dans la
lumière intestinale (96).
27
Figure 5 : Les différentes voies de passages des antigènes à travers la barrière intestinale
(d’après (92)).
Il n’a pas été observé de défaut constitutif de la perméabilité intestinale chez des sujets
allergiques (97). En effet, après un régime d'exclusion, les valeurs de perméabilité,
augmentées en phase active de la maladie, retournent à la normale après un régime
d'exclusion (98). La réaction allergique est donc initiée par un transport transcellulaire de
l’allergène (figure 6). Ainsi, l’allergie semble se dérouler en deux temps. La première phase
dite « indépendante du mastocyte » correspond au passage de l’allergène par transcytose à
travers les cellules épithéliales intestinales pour induire la sensibilisation et le déclenchement
de la réaction. Des complexes allergène-IgE peuvent aussi être transportés par transcytose de
la lumière de l’intestin vers la séreuse via le récepteur aux IgE de basse affinité FcRII
(CD23) exprimé à la surface des entérocytes (99, 100) (figure 6). Il existe deux isoformes de
ce récepteur : le CD23a localisé sur les deux pôles, apical et basal, de l’entérocyte et le
CD23b uniquement présent en apical. L’isoforme CD23a est impliquée dans le transport
bidirectionnel des IgE et le transport des complexes IgE-allergène du compartiment apical
vers le compartiment baso-latéral est assuré par le CD23b (101). Ces différentes formes de
CD23 permettent d’apporter des IgE dans l’espace luminal et de transporter l’allergène lié à
un IgE au niveau de la séreuse qui est riche en mastocytes (Figure 5). Ce transport des
complexes allergène-IgE les protège de la dégradation par les lysosomes, ce qui fait que les
formes allergéniques sont intactes au niveau de l’environnement séreux (102). La deuxième
phase de l’allergie, dite « dépendante du mastocyte », conduit à une augmentation de la
perméabilité intestinale de façon non spécifique (103) (figure 6). En effet à ce stade, le
mastocyte activé par l’IgE va sécréter de la tryptase qui va à son tour activer le récepteur 2
protéase dépendant sur les cellules épithéliales coliques causant ainsi une redistribution des
protéines des jonctions serrées et induisant un renforcement du transport de l'allergène via la
voie paracellulaire (99, 104). Ce phénomène va alors permettre d’amplifier la réaction
allergique.
28
Phase « mastocyte
indépendante »
Phase « mastocyte
dépendante »
Figure 6 : Passage de l’allergène et rôle du CD23 (d’après (99)) : lors de la phase de
sensibilisation, l’allergéne est transporté par endocytose et seuls des peptides sont présentés
aux CPA. Les IgE sécrétées dans le compartiment séreux sont transportées dans le
compartiment luminal par transcytose via leur adhésion au récepteur CD23. Des complexes
allergène/IgE se forment alors. Ces complexes peuvent ensuite être internalisés par un
mécanisme identique, participant ainsi à la phase de déclenchement de la réponse allergique.
A ce stade, le mastocye activé va sécréter de la tryptase qui va perturber l’intégrité de la
barrière intestinale et conduire à un transport paracellulaire de l’allergène.
3. Modèles cellulaires et animaux
Les allergies sont des phénomènes complexes car systémiques qui nécessitent ainsi
des modèles à l’échelle de la cellule, mais surtout à l’échelle de l’organisme, pour comprendre
les mécanismes mis en jeux dans ces réactions.
a. Modèles cellulaires et organes ex vivo
Des modèles cellulaires ont été développés pour étudier certains aspect de l’initiation
de l’allergie (modèles d’épithélium pour étudier le passage des allergènes comme les cellules
Caco-2 ou HT-29) (105) ou du déclenchement de la réponse allergique (basophiles capables
de dégranuler comme les cellules RBL) (106, 107). Il est également possible de dériver des
cellules dendritiques à partir d’échantillons sanguins (monocytes du sang périphérique) (108).
Ces lignées sont souvent dérivées de cellules cancéreuses dont les propriétés physiologiques
demeurent éloignées des cellules saines. Elles restent cependant d’intéressants modèles pour
étudier les mécanismes de l’allergie et ont été très utilisées. Les propriétés des tissus
épithéliaux sont fortement liées aux différents types cellulaires qui les composent. C’est
pourquoi, des modèles de co-culture de différents types cellulaires ont été développés (109112) afin d’augmenter la complexité des interactions avec l’allergène, et ainsi de s’approcher
d’un contexte physiologique.
Il est également possible d’étudier le passage d’allergènes à travers un fragment d’intestin
obtenu par biopsie par la méthode ex vivo des chambres de Ussing (113, 114) (Figure 7).
Cette technique permet d’atteindre des conditions encore plus physiologiques que le modèle
Caco-2, mais demeure invasive (besoin d’une biopsie).
29
Figure 7 : Montage expérimental d’une chambre de Ussing (d’après Stewart et al., 1997,
Adv. Drug Del. Rev)
b. Modèles animaux
Les modèles cellulaires présentent, certes, des avantages pour étudier des aspects très
précis de la réponse allergique, mais il serait réducteur de ne pas employer des modèles à
l’échelle de l’organisme. À ce titre, les modèles animaux permettent de mieux appréhender la
complexité de la réponse allergique dans le but de mieux la comprendre. De nombreux
modèles d’animaux allergiques ont été développés : porcs, chiens, cobayes, rats et souris
(115-119). Bien que la souris constitue un modèle intéressant pour étudier les allergies, son
système digestif présente une surface de contact très faible vis à vis du bol alimentaire,
comparativement à celui de l’homme. C’est pourquoi des modèles de porcs sont plus souvent
employés pour étudier la physiologie intestinale. Parmi les différents modèles utilisés, l’un
des plus employés reste néanmoins le modèle souris (119-127).
La souris présente en effet un certain nombre d’avantages qui font de cet animal un modèle de
choix : c’est un animal de petite taille, son cycle de reproduction est court, son immunologie
est bien connue et assez proche de celle de l’homme (128), son génome a été entièrement
séquencé, il peut être modifié génétiquement et de nombreux biomarqueurs impliqués dans la
réaction allergique sont décrits chez cet animal. De nombreuses techniques ont aussi été
développées pour étudier la physiologie de son organisme. Contrairement à l’homme, la
souris ne sécrète pas d’Ig 4 et ses types d’Ig sont : IgG1, IgG2a, IgG2b et IgG3. Chez la
souris, l’IL-4 induit la sécrétion d’Ig 1 dans un premier temps, puis d’IgE (129); l’IFNγ a été
montré comme induisant la sécrétion d’Ig 2a (130, 131). Ainsi, chez la souris, une exposition
à des allergènes induit une production d’immunoglobulines spécifiques (Ig 1, puis IgE),
associée au développement d’une réaction immédiate d’hypersensibilité après une
provocation avec l’allergène (132), voire des symptômes d’anaphylaxie après provocation
avec une forte dose d’allergène (119). Cette réponse doit être provoquée par une
administration d’allergène car les souris, exception faite de la souche NC/Nga (133), ne
développent pas spontanément d’allergie. L’efficacité et le niveau d’induction de la voie Th2
varient fortement en fonction de divers paramètres tels que le fond génétique de la souris, la
30
voie d’administration de l’allergène, sa dose, sa fréquence d’administration et le type
d’adjuvant utilisé (132).
III.
Des Stratégies nutritionnelles pour lutter contre les allergies alimentaires
A ce jour, il n’existe pas de traitement pour lutter contre les allergies alimentaires, seule
l’éviction pure et simple de l’aliment responsable est possible. Toutes les stratégies, visant
donc à diminuer et/ou à prévenir ce risque allergique, doivent être explorées. De nombreuses
pistes existent notamment celles des prébiotiques, des probiotiques, des synbiotiques et des
polyphénols.
A. La stratégie des prébiotiques, des probiotiques et des synbiotiques :
Les prébiotiques (tableau 1 : FOS, OS, inuline, …) sont des ingrédients alimentaires nondigestibles. Ils stimulent la croissance de certaines bactéries au sein du microbiote autochtone
considéré comme bénéfique en terme de santé pour le nouveau-né (134-136). Ces
prébiotiques ont ainsi une action indirecte sur le système immunitaire intestinal en diminuant
le risque infectieux (137, 138) et en l’orientant vers la tolérance (139). Ils renforcent aussi la
barrière intestinale (140-143). Ils pourraient également exercer une action directe sur le
système immunitaire, notamment en interagissant avec des protéines se liant aux glycanes,
appelées «galectines », qui peuvent exercer des propriétés immunomodulatrices (induction de
cellules Treg ou inhibition des cellules T effectrices) en se fixant à certains récepteurs des
lymphocytes T (144, 145). Ces effets sur le système immunitaire et la barrière intestinale ont
conduit à l’utilisation des prébiotiques en alimentation postnatale chez l’homme (136, 146) et
chez la souris (147-150) pour prévenir des allergies. Ces études réalisées chez l’enfant ou
chez la souris adulte restent peu nombreuses et hétérogènes mais convergent vers un effet
protecteur des prébiotiques vis-à-vis de l’allergie.
Il existe aussi d’autres prébiotiques qui sont naturellement présents dans le lait maternel : les
oligosaccharides du lait humain (HMO) (151). Ce sont des glycanes complexes qui sont très
abondants dans le lait maternel humain. Les formules infantiles ne contiennent que des traces
de ces oligosaccharides. L’effet bénéfique des HMO dans le lait maternel pour l'enfant allaité
est actuellement inconnu. Il est généralement admis que les HMO ont des effets prébiotiques.
Ils semblent avoir de multiples autres effets : limiter l’adhésion des pathogènes, réduire
l'adhérence des leucocytes, l’extravasation et l’activation cellulaire, modifier les surfaces
épithéliales, la machinerie de glycosylation des cellules épithéliales intestinales et les profils
d'expression de l'attachement des agents pathogènes. Mais leurs effets in vivo restent à
élucider. De plus en plus, les préparations pour nourrissons sont complétées avec des
oligosaccharides non-HMO, comme les galactooligosaccharides (GOS) et les fructooligosaccharides (FOS). Ces formules pour enfants sont donc enrichies en oligosaccharides
qui ne sont pas naturellement présents dans le lait maternel et qui sont structurellement très
différents des HMO. La plupart des effets attribués aux HMO semblent être très dépendants
de leur structure. Par conséquent, les oligosaccharides des formules infantiles peuvent avoir
31
des effets très différents des HMO. Des recherches approfondies sur les HMO et leurs effets
santé sont donc nécessaires pour comprendre leurs avantages fonctionnels.
Les probiotiques sont aussi une piste intéressante pour la réduction ou la prévention
des allergies. La définition actuelle de « probiotiques » est « micro-organimes qui, lorsqu’ils
sont consommés en quantités adéquates, exercent un effet bénéfique sur la santé de leur
hôte ». Ces microorganismes sont, le plus souvent, ingérés vivants et doivent, auquel cas,
résister aux conditions physico-chimiques drastiques du tractus digestif (152). Les genres
bactériens les plus fréquemment employés comme probiotiques sont Bifidobacterium et
Lactobacillus (153, 154), bien qu’il n’ait jamais été prouvé que ces genres étaient plus
efficaces en tant que probiotiques que d’autres microorganismes tels que Escherichia coli,
Lactococcus ou encore Saccharomyces. Ces différents probiotiques ont été testés bien avant
que la composition du microbiote humain soit connue et, de fait, les souches choisies comme
probiotiques potentiels dépendent plus souvent d’un contexte historique particulier plutôt que
d’une analyse plus poussée d’un panel de souches et de leurs effets sur l’organisme (155). Les
probiotiques sont ainsi des microorganismes allochtones qui sont à différencier du microbiote
(microorganismes autochtones). De nombreux effets des probiotiques sur la santé animale et
humaine ont été décrits. Ces bactéries exercent des effets protecteurs non-immuns en sécrétant
des molécules anti-microbiennes pouvant perturber la croissance d’autres espèces
bactériennes (156); elles peuvent aussi limiter l’adhérence d’autres bactéries aux cellules
épithéliales (157). Des effets des probiotiques ont également été mis en évidence sur le
renforcement de la barrière intestinale (jonctions serrées, mucines) (158, 159). Certaines de
ces bactéries peuvent moduler l’activité des cellules de l’immunité innée (cellules NK,
macrophages) (160). Elles peuvent aussi agir sur les effecteurs de l’immunité adaptative (160)
bien que leurs effets sur la deuxième ligne de défense du système immunitaire demeure
encore controversée à cause de résultats très variables en fonction des souches utilisées. De
nombreuses souches de probiotiques ont été utilisées lors des recherches réalisées chez
l’homme pour la prévention des allergies, mais l’une d’entre elles a été plus particulièrement
étudiée : Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (161-163). De manière surprenante, même si
cette souche est administrée dans des conditions similaires, elle semble présenter des effets
contradictoires. Ainsi, parmi les deux analyses réalisées en périnatal avec LGG (162, 164),
une seule établit une diminution de l’incidence de l’atopie chez les enfants à 2 ans qui persiste
à 4 ans et à 7 ans (164 , 165). De plus, lorsque LGG est administré uniquement aux enfants,
aucun effet préventif n’est observé (163). Les études réalisées chez l’animal semblent décrire
un effet bénéfique des probiotiques sur le traitement de l’allergie. Cependant à ce jour, les
résultats des travaux cliniques humaines ne permettent pas de conclure sur leur efficacité,
notamment sur le long terme (166).
Un autre concept découle des probiotiques et des prébiotiques : les synbiotiques. Les
synbiotiques (« syn » pour synergie) ont été définis comme « un produit contenant une
combinaison de probiotique(s) et de prébiotique(s) » (167). Ce mélange particulier a pour but
d’augmenter la survie des bactéries allochtones et de stimuler leur implantation dans le tractus
gastro-intestinal. Des expériences ont ainsi été conduites pour tester différentes combinaisons
et leur efficacité sur la survie des bactéries administrées (168). Le lait maternel constitue un
32
synbiotique naturel dans la mesure où il contient à la fois des bactéries vivantes (169) et des
oligosaccharides potentiellement prébiotiques (170). L’effet des synbiotiques sur la
prévention et le traitement de l’allergie a été très peu étudié. Deux études cliniques ont été
effectuées : une concernant leur effet préventif (171) et l’autre, leur effet curatif (172). On
recense une seule analyse chez l’animal pour évaluer leur effet préventif (173). Toutes ces
études concluent sur l’efficacité de ces combinaisons de suppléments alimentaires, mais
l’absence de travaux complémentaires ne permet pas, à l’heure actuelle, de tirer de conclusion
générale de ces recherches.
B. La stratégie des polyphénols :
Les liants polymériques alimentaires semblent avoir des propriétés intéressantes pour réduire
l’allergénicité des protéines alimentaires. Ces polyphénols sont classés principalement selon
leurs propriétés chimiques de structure : la fixation d'un ou plusieurs groupes hydroxyle au
noyau aromatique (groupes phénol) permet de les distinguer des autres composés chimiques.
Les grandes classes de polyphénols les plus courantes et les mieux caractérisées sont : les
acides phénoliques (acides hydroxycinnamiques, acide caféique), les flavonoïdes (catéchine,
quercétine, cyanidine, rutine), les lignanes (phyto-œstrogènes) et les stilbènes (resvératrol).
Certaines classes de polyphénols peuvent influencer le développement des réponses
immunitaires allergiques à deux étapes critiques, principalement au cours de la sensibilisation
allergique et lors de la ré-exposition à l'allergène. Lors de la phase de sensibilisation, certains
polyphénols tels que les acides caféique et férulique seraient capables de former des
complexes insolubles avec les protéines potentiellement allergènes diminuant ainsi leur
allergénicité. Les polyphénols appartenant au groupe des flavonoïdes sont aussi connus pour
avoir un effet soit direct sur la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques (DC),
soit indirect en inhibant à la surface de la cellule l’expression du CMH-II et des molécules de
co-stimulation (CD80, CD86) conduisant à la présentation inefficace de l’antigène. Ils
peuvent aussi avoir un impact sur la fonction de la DC en inhibant la production de cytokines
(174, 175). Chez les personnes sensibilisées, la ré-exposition à l’allergène conduit à la
différenciation et l'expansion des cellules T CD4 auxiliaires de type 2 (Th-2) qui
conditionnent la réponse immune adaptative en sécrétant des médiateurs de la réaction
allergique comme les cytokines IL-4 , IL-5 et IL- 13. Ces cellules Th-2 jouent un rôle
important pour la production d’IgE par les cellules B ainsi que pour la sécrétion de
chimiokines qui attirent les cellules de la réaction allergique telles que les mastocytes et les
éosinophiles sur les sites inflammatoires. Les polyphénols tels que les catéchines et leurs
dérivés sont capables d'inhiber la production de cytokines Th-2 (176-179) et d’agir sur
l'activation, la prolifération et le recrutement des lymphocytes T (180-183). Le recrutement
des cellules B aux sites inflammatoires et la production d'IgE semblent également être inhibés
par la consommation de polyphénols (178, 184-186). L’effet immunologique d’un polyphénol
tel la quercétine a été bien étudié dans le contexte des allergies. Elle est capable d’inhiber la
dégranulation notamment la libération d'histamine par les mastocytes et les basophiles (187190). Ainsi, deux mécanismes sont proposés : un où les polyphénols impactent sur la
formation de complexes IgE-allergène et un autre où ils agissent sur la fixation de ces
complexes à leur récepteur (FcRI) sur les mastocytes et les basophiles (191-194).
33
NOTICE DES TITRES ET TRAVAUX RETRAÇANT LES RESULTATS LES PLUS
SIGNIFICATIFS DEPUIS LE DEBUT DE CARRIERE
Nous verrons tout au long de ce manuscrit que mes recherches, depuis plus de 14 ans,
se sont toujours basées sur le même type d’approche. En effet, j’ai systématiquement réalisé
des études mécanistiques de certains acteurs du système immunitaire pour aider à la
compréhension, au diagnostic et au traitement de certaines pathologies (infections virales,
cancer et allergies alimentaires). Ce type de raisonnement permet de donner un sens à mes
recherches en termes d’applications potentielles pour la santé.
J’ai tout d’abord réalisé mon doctorat de Science (spécialité immunologie) de 1998 à 2001 au
sein de l’unité 463 INSERM de Nantes spécialisée en immunocancérologie et
immunopathologie. Ce travail a porté sur « l’étude de la contribution relative du TCR, du
CD8 et des molécules accessoires dans l'activation et la sélection des lymphocytes T
cytotoxiques humains ». J’ai ensuite obtenu un contrat de chercheur hospitalier (CHU Hôtel
Dieu, Nantes) d’une durée d’un an, de 2002 à 2003, pour mettre en place une plateforme de
production de protéines recombinantes dédiée à la recherche fondamentale et la recherche
clinique. En 2003, j’ai été recrutée comme chargée de recherche 2ème classe au sein de l’unité
URPVI (Unité de Recherche sur les Protéines Végétales et leurs Interactions) de l’INRA de
Nantes intitulée désormais UR 1268 BIA (Unité de Recherche Biopolymères Interactions
Assemblages). Ma mission de recherche était d’étudier les mécanismes de la réaction
d’allergie alimentaire à travers le développement de modèles cellulaires et animaux. En 2007,
je suis devenue chargée de recherche 1ère classe. De 2007 à aujourd’hui, j’ai poursuivi mes
travaux sur l’étude des mécanismes de l’allergie alimentaire. J’ai participé à l’émergence
d’une nouvelle thématique de recherche, à ce jour inexistante en France, associant la science
de l’aliment (biochimie des protéines) à l’immunologie. Cette thématique vise à étudier
l’impact de l’alimentation (protéines alimentaires, procédés industriels, prébiotiques, fibres)
sur l’orientation du système immunitaire et les mécanismes de la réaction allergique.
Dans cette partie « notice des titres et travaux », je vous exposerai les résultats marquants
obtenus au cours de mon doctorat (1998-2001), de ma carrière de chercheur hospitalier (20022003) et surtout de chercheur à l’INRA (2003- à maintenant).
34
DE 1998 A 2001 : RESULTATS MARQUANTS AU COURS DE MON DOCTORAT :
les mécanismes associés aux lymphocytes T CD8 dans le cancer et les infections virales
J'ai réalisé mon doctorat de octobre 1998 à décembre 2001 au sein de l’INSERM U463 de
Nantes « Interactions ligands-récepteurs en immunocancérologie et immunopathologie »
dirigée par le docteur Marc Bonneville. Ce travail avait pour objectif d’évaluer la contribution
relative de certaines molécules, le TCR et le CD8, dans les mécanismes de sélection et
d’activation des lymphocytes T  au cours de la réponse immune d’origine virale (Epstein
Bar Virus EBV, cytomégalovirus CMV) ou tumorale (mélanome).
I.
Etude 1 : Rôle du CD8 et du TCR dans la sélection des lymphocytes T anti-viraux
A. But et intérêt scientifique
De nombreuses études se sont efforcées de caractériser le répertoire lymphocytaire T
dirigé contre un épitope donné en terme d’avidité et de diversité des TCRs, mais de
nombreuses questions restent en suspens. Une partie de mon travail a consisté à étudier la
diversité et la réactivité du répertoire lymphocytaire T dirigé contre une protéine de l'EBV au
cours de stimulations antigéniques répétées. Pour ce faire, nous avons effectué une analyse
approfondie des caractéristiques structurales et fonctionnelles de clonotypes dirigés contre le
même complexe CMH-peptide chez un individu donné. Nous avons également évalué la part
relative du TCR et du co-récepteur CD8 dans la sélection et la persistance à long terme de ces
clonotypes spécifiques.
B. Programme et méthode de recherche
Pour évaluer la diversité du répertoire de reconnaissance, nous avons caractérisé les deux
chaînes,  et  des TCRs des clones sélectionnés par séquençage.
Pour évaluer le profil de réactivité en fonction des chaînes Vdes clones, nous avons réalisé
une analyse par Alanine scan. Cette analyse consiste à tester la capacité des clones à tuer le
cellule B autologue chargée avec les différents peptides issus du peptide nominal mais mutés
à chaque position par une alanine.
Pour évaluer l'influence de l'avidité globale des lymphocytes T pour leur cible nous avons
évalué la quantité de peptide nécessaire pour déclencher 50% de leur réponse cytotoxique
(ED50). L’avidité est la résultante de plusieurs facteurs, comprenant l’affinité intrinsèque du
TCR pour le complexe CMH-peptide, la densité des TCRs à la surface des cellules T, le degré
d’engagement des co-récepteurs CD4 et CD8 et le degré d’expression des molécules
d’adhésion (LFA-1, VLA-4…).
Pour estimer la contribution de l’affinité du TCR dans l’avidité globale nous avons évalué la
CD8 dépendance des clones. Nous avons donc analysé l’activité cytolytique des clones en
présence ou en absence de concentration saturante d’anticorps anti-CD8.
35
C. Résultats
Nous avons constaté que l'ensemble de ces clones sélectionnés in vivo avaient une même
avidité pour leur cible malgré des différences d'affinité de leurs TCRs. Cette différence
d'affinité était compensée par une contribution variable du co-récepteur CD8 dans l'interaction
TCR-CMH/peptide, préservant ainsi les différents clonotypes au sein de cette fenêtre
d’avidité. L'ensemble de ces résultats a fait l'objet d'une publication : Bodinier, M., Couedel,
M, Peyrat, MA, Bonneville, M, Davodeau, F and Lang, F. Selection and longterm persistence
of reactive CTL clones during an EBV chronic response are determined by avidity, CD8
variable contribution compensating for differences in TCR affinities. 1999. J. Immunol.
162:6351.
II.
Etude 2 : Rôle du CD8 et du TCR dans l’activation des lymphocytes T antiviraux
Cette première étude avait démontré l'importance du CD8 dans la sélection des clones
antiviraux au cours de la réponse immune. J’ai donc par la suite cherché à redéfinir chez
l’homme les signaux activateurs dépendants de l’interaction entre le TCR et le complexe
CMH-peptide et du co-récepteur CD8 avec le CMH en s’affranchissant totalement des
molécules accessoires. Pour s’affranchir des signaux fournis par les molécules de costimulation présentes sur les APC, nous avons réalisé des molécules HLA solubles biotinylées
qui peuvent être chargées en peptides et tétramérisées par la streptavidine. Ce réactif, appelé
tétramère HLA, a la capacité de se fixer sur le récepteur des lymphocytes T commis contre le
peptide correspondant. Il a été très utilisé dans de nombreuses publications pour identifier par
cytofluorométrie le répertoire lymphocytaire T dirigé contre un épitope donné au cours
d’infections virales ou bactériennes ou dans un contexte tumoral.
A. Programme et méthode
Génération de molécules HLA solubles chargées en peptides et biotinylées :
La génération de complexe CMH de classe I-peptide est illustrée sur la figure 8. Pour ces
complexes, la chaîne lourde et la 2m sont produites séparément sous forme de corps
d’inclusion dans la bactérie E. Coli et solubilisées dans l’urée 8M. Ces deux chaînes sont
ensuite mélangées avec le peptide d’intérêt pour ensuite permettre la formation de monomères
CMH-peptide-2m. Ces monomères sont biotinylés par l’enzyme recombinante BirA et ils
sont ensuite purifiés sur colonne échangeuse d’ions. Ils peuvent être tétramérisés avec de la
streptavidine fluorescente.
Pour évaluer la contribution du CD8 dans l'activation des lymphocytes T, nous avons réalisé
un tétramère HLA-A*0201 muté au niveau de son domaine d’interaction avec le CD8. Il a été
démontré que la molécule HLA-Aw68 est incapable de fixer le co-récepteur CD8 du fait du
remplacement de l’alanine en position 245 par une valine (195). Nous avons donc choisi
d’introduire cette mutation AlaVal dans la molécule HLA-A0201. Une fois la construction
36
effectuée, les tétramères ont été produits selon la technique décrite auparavant et la mutation a
été introduite.
Figure 8 : Représentation schématique de la génération des tétramères
CMH-peptide (196).
Nous avons réalisé une étude comparative de l'efficacité de marquage et d'isolement de
cellules spécifiques des tétramères natifs et mutés. Une des applications majeures des
téramères CMH-peptide est de marquer spécifiquement des cellules T au sein d’une
population polyclonale et de les analyser par cytofluorimétrie (FACS: Fluorescence Activated
Cell Sorter). L'autre application des téramères CMH-peptide consiste à trier de cellules T
spécifiques. Cette technique est basée sur l’utilisation de billes magnétiques chargées en
streptavidine sur lesquelles il est possible de fixer les monomères CMH-peptide biotinylés.
Nous avons réalisé une étude comparative du profil de phosphorylation obtenu après
stimulation d'un clone avec le tétramère natif ou avec le tétramère muté. Pour réaliser cette
étude nous avons effectué des analyses par Western-Blot de la phosphorylation sur tyrosine
des protéines de la signalisation et une technique d’immunoprécipitation des chaînes  du
CD3.
B. Résultats
La mutation en 245 d'une alanine par une valine s'est avérée très efficace pour augmenter la
capacité des tétramères HLA-A*0201-peptide à détecter et isoler des populations
lymphocytaires T spécifiques. Cependant, elle ne nous a pas permis d'évaluer le rôle du co37
récepteur dans la transduction du signal d'activation car elle n'abrogeait pas totalement la
fixation du CD8 au CMH. Ce travail a fait l’objet :
- d’un article scientifique : Bodinier, M., Peyrat, MA, Tournay, C, Davodeau, F,
Romagne, F, Bonneville, M and Lang, F. Efficient detection and immunomagnetic
sorting of specific T cells using multimers of MHC class I and peptide with reduced
CD8 binding. 2000. Nature Medicine (New tech.) 6:707.
- d’une revue : Lang F, Bodinier M. MHC-peptide multimers: tools of choice for
detecting and sorting antigen-specific T-cells. Transfusion. 2001 May;41(5):687-90.
De plus, nous avons déposé un brevet (numéro: 3311199) sur la molécule mutée elle-même et
sur ses applications en immunothérapie et en diagnostic. Nous avons accordé la licence
d'exploitation à la société Beckman Coulter International (BCI).
III.
Etudes collaboratives visant à développer des stratégies immuno-thérapeutiques
pour traiter certains cancers (leucémie et mélanome) à l’aide des tétramères
CMH-peptide :
Mon travail de thèse a fait l'objet de certaines collaborations avec l'équipe du Professeur
Francine Jotereau (INSERM U463 de Nantes) et celle du docteur Eric Robinet (INSERM E0119 de Besançon). Ces deux équipes ont pour objectif d'obtenir in vitro des populations
lymphocytaires T spécifiques d'antigènes viraux ou tumoraux pour les réinjecter ensuite aux
patients cancéreux (leucémie et mélanome). J’avais aussi entrepris une collaboration plus
fondamentale avec le Dr Houssaint (INSERM U463 de Nantes) sur le rôle de certains
épitopes issus de l'EBV restreints par le HLA-B27 (HLA de forte susceptibilité aux arthrites
chroniques) chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR), de syndrome de Reiter
ou de spondylarthropathies.
A. Méthode :
Ma contribution technologique dans ces études a été de réaliser les différents tétramères HLApeptides :
-
-
le tétramère HLA-A0201/BMLF1 (protéines de l'EBV).
les tétramères HLA-A2/NA17-A ou Melan-A (peptides de mélanome). Ces tétramères
une fois produits selon la technique décrite auparavant sont ensuite utilisés pour
détecter le pourcentage de cellules spécifiques après stimulation par marquage mais
aussi pour purifier ces cellules d’intérêt par tri immunomagnétique.
le tétramère HLA-B27/ BCRF1 (protéine de l’EBV). Ces tétramères B27/BCRF1 ont
ensuite été utilisés pour marquer et isoler des populations lymphocytaires T
spécifiques de ce contexte.
B. Résultats :
Ces travaux ont fait l’objet de nombreuses publications :
38
Saulquin, X., Bodinier, M, Peyrat, MA, Hislop, A, Scotet, E, Lang, F, Bonneville, M and.
Houssaint, E. Frequent recognition of BCRF1, a late lytic cycle protein of Epstein-Barr virus,
in the HLA-B*2705 context: evidence for a TAP-independent processing. 2001 Eur. J.
Immunol. 31: 708.
Sauce, D, Bodinier, M, Garin, M, Petracca, B, Tonnelier, N, Duperrier, A, Melo, J, Apperley,
J, Ferrand, C, Hervé, P, Lang, F, Tiberghien, P and Robinet, E.. Retrovirus-mediated gene
transfer in primary T lymphocytes impairs their anti-EBV potential through both culturedependent and gene transfer-dependent mechanisms. 2002. Blood. 99: 1165.
Labarrière, N, Bretaudeau, L, Gervois, N, Bodinier, M, Bougras, G, Diez, E, Lang, F,
Grégoire, M and Jotereau, F. Apoptotic-body loaded dendritic cells efficiently cross-prime
CTL specific for NA17-A but not for Melan-A/MART-1 antigens. 2002. Int. J. Cancer. Sep
20;101(3):280-6.
Sauce D, Rufer N, Mercier P, Bodinier M, Remy-Martin JP, Duperrier A, Ferrand C, Herve
P, Romero P, Lang F, Tiberghien P, Robinet E. Retrovirus-mediated gene transfer in
polyclonal T cells results in lower apoptosis and enhanced ex vivo cell expansion of CMVreactive CD8 T cells as compared to EBV-reactive CD8 T cells.2003. Blood. 102: 4.
IV.
Bilan du doctorat :
Au cours de mon doctorat j’ai donc apporté de nouvelles données sur la compréhension du
rôle de certains acteurs moléculaires du système immunitaire notamment le TCR et le CD8
dans les mécanismes de sélection et d’activation des lymphocytes T au cours de réponses
immunes virales et tumorales. Ce travail a permis d’éclaircir l’importance de ces mécanismes
dans ces pathologies et de développer un nouvel outil, le tétramère CMH-peptide, qui s’avère
très intéressant en recherche fondamentale et en recherche clinique (diagnostic et
thérapeutique).
DE 2002 A 2003 : EXPERIENCE MARQUANTE AU COURS DE MA CARRIERE DE
CHERCHEUR HOSPITALIER : application potentielle des tétramères CMH-peptide
en recherche fondamentale et en recherche clinique
Après l'obtention de ma thèse en décembre 2001, j'ai été engagée en tant qu’ingénieur
hospitalier au sein de l’INSERM U463. L’objectif de ce poste a été de mettre en place une
plateforme de production de protéines recombinantes. En effet, devant la demande
grandissante pour les tétramères CMH-peptide et compte-tenue de mon expertise reconnue
dans ce domaine, notre objectif au sein de cette plateforme a été de développer de nouveaux
tétramères de classe I et de classe II qui puissent être utilisés en recherche fondamentale et en
recherche clinique. Ce travail m’a permis de valoriser l’expérience et les compétences que
j’avais acquises au cours de mon doctorat et d’en mesurer les applications potentielles pour la
santé de l’homme.
39
DE 2003 A MAINTENANT : RESULTATS MARQUANTS OBTENUS AU COURS DE
MA CARRIERE DE CHERCHEUR A L’INRA : les mécanismes des allergies
alimentaires et leur modulation (réduction, prévention) par l’alimentation
I.
Problématique de recherche
En février 2003, j’ai été recrutée à l’unité URPVI (unité de recherche sur les protéines
végétales et leurs interactions) de l’INRA de Nantes en tant que chercheur CR2 au sein de
l’équipe 3A (Assemblage, Agrégation, Allergie) dirigée par un DR2 (Y. Popineau). Je
travaillais au sein du groupe « allergie » (2CR, 1TR) en étroite collaboration avec S. Denery
(CR1) qui s'intéressait déjà depuis plusieurs années à l'allergie alimentaire à la farine de blé
(AAFB). Ses objectifs étaient de caractériser les allergènes majeurs et les épitopes reconnus
par les IgE des patients, d’examiner l'influence du polymorphisme des protéines de blé sur
leur allergénicité, d’étudier leur résistance aux hydrolyses digestives ainsi que l'impact de
divers procédés de transformation. Ma mission était de compléter ces recherches par l’étude
des mécanismes de la réaction allergique à l’aide de nouveaux modèles in vitro et in vivo. Je
cherchais notamment à évaluer la capacité des allergènes à franchir la barrière intestinale, à
sensibiliser l’organisme (production d’IgE) et à déclencher la réaction allergique. La finalité
de nos études était de réduire l’allergénicité des protéines de blé soit par la voie génétique
(recherche de variétés possédant des allèles hypoallergéniques ou nuls), soit par divers
traitements technologiques.
En 2005, lors de la formation de la nouvelle unité BIA (Biopolymères Interactions
Assemblages), l’équipe Allergie aux protéines végétales (ALL) dirigée par Sandra DENERY
a été créée.
En 2007, j’ai obtenu le passage en CR1. J’ai alors poursuivi mes travaux de recherche
sur l’étude des mécanismes de l’allergie alimentaire (AA) et nous avons fait émerger avec
mes collègues de l’équipe Allergie un nouveau thème de recherche visant à moduler le
système immunitaire et la réaction allergique par l’alimentation (prébiotiques, fibres, procédés
de transformation). Cette thématique émergeante et inexistante en France est très originale car
elle associe deux domaines très différents : la science de l’aliment (biochimie des protéines
alimentaires) et l’immunologie.
Aujourd’hui, l’unité BIA est constituée de 7 équipes thématiques, de 2 équipes
transdisciplinaires et d’une équipe de direction et logistique (voir annexe 1 : Organigramme
de l’Unité BIA). Le projet de l’unité a trois objectifs finalisés majeurs: (1) le contrôle de la
qualité des productions végétales issues des plantes de grande culture pour répondre aux
différents usages (alimentaires et non-alimentaires) dans un contexte d’agriculture durable et
de changement climatique, (2) le développement de matériaux bio-sources et d’aliments
fonctionnels dans une perspective d’écoconception, (3) l’amélioration de la valeur « santé »
des aliments. Ces objectifs sont déclinés dans le projet d’unité en trois thèmes scientifiques :
Thème 1 : Assemblage des biopolymères dans les organes végétaux au cours du
développement ; contrôle de la variabilité en lien avec les propriétés d’usages.
Thème 2 : Assemblages et propriétés des matrices alimentaires et matériaux bio-sourcés.
40
Thème 3 : Les structures, facteurs clé des aliments « santé » : réactivité, bio-accessibilité des
nutriments et micronutriments et des allergènes alimentaires.
L’équipe allergie aux protéines alimentaires s’insère dans le thème 3 de l’unité BIA. Cette
équipe depuis 2005 s’est agrandie et elle est désormais constituée de 4 chercheurs (CR1), 2
ingénieurs, 2 assistants ingénieurs et 2 techniciennes. L’équipe travaille sur 2 aliments à la
base de notre alimentation (œuf et blé) qui contiennent des allergènes alimentaires majeurs.
Ses objectifs sont : 1) d’apporter des connaissances sur la structure des allergènes et des
épitopes, et sur les mécanismes des allergies alimentaires (AA) pour améliorer le diagnostic
des patients allergiques; 2) de déterminer des marqueurs pour prédire la sévérité ou
l’évolution de l’allergie; 3) d’évaluer l’influence de certains facteurs (digestion, procédés
alimentaires et génétique) sur l’allergénicité des protéines alimentaires (collaboration avec les
équipes ISD et FIP de l’unité BIA); 4) de développer des approches pour réduire les risques
liés aux AA par exemple l’utilisation de prébiotiques comme un moyen de prévention des AA
via l’alimentation périnatale. Les thèmes de recherches de l’équipe sont donc basés sur la
compréhension de l’allergénicité des aliments au travers de deux aspects : l’allergène et sa
structure et les mécanismes biologiques. Elle met en avant deux axes de recherche. Le
premier axe vise à acquérir des données structurales permettant de décrire les allergènes et
leurs épitopes et tente de comprendre certains aspects de leur allergénicité en lien avec les
données cliniques. Le deuxième axe, que je développe tout particulièrement, a pour objectif
d’identifier les mécanismes biologiques de la réaction allergique et de les prévenir ou réduire
par l’alimentation (prébiotiques). Concernant les mécanismes de l’allergie, j’étudie la
translocation précoce de certains allergènes à travers la barrière intestinale à l’aide de lignées
cellulaires in vitro (cellules Caco-2) et de modèles ex vivo à partir de fragments d’intestin
(souris, homme) montés en chambre d’ussing (action 1). J’évalue l’impact des allergènes
sous forme native ou modifiée par certains procédés technologiques (désamidation) sur le
système immunitaire et leur capacité à sensibiliser l’organisme à l’aide de modèles animaux
(action 2). Je m’intéresse aussi à l’effet des allergènes sur la phase de déclenchement de la
réaction allergique c’est-à-dire leur capacité à faire dégranuler le basophile à l’aide de la
lignée cellulaire RBL de rat (action 3). Depuis 2011, je cherche à comprendre les mécanismes
de la marche atopique (passage de l’allergie alimentaire lors de l’enfance à l’allergie
respiratoire à l’âge adulte) au travers du projet régional REAL2 en collaboation avec le
Professeur Antoine Magnan (action 4). En 2008, j’ai choisi, en associtation avec mes
collègues de l’équipe Allergie, de l’unité BIA (équipe PVPP : Marc Lahaye et Luc Saulnier)
et de l’unité Phan (UMR 1280, INRA de Nantes, M. Champ), de développer un nouveau
thème de recherche associant deux domaines très différents : la science de l’aliment et
l’immunologie. Il est basé sur la modulation du système immunitaire et de la réaction
allergique par l’alimentation. Ce travail permet d’appliquer la compréhension des mécanismes
de l’allergie à l’élaboration future de stratégies de réduction ou de prévention de cette
pathologie. Ainsi, j’évalue l’influence de certains compléments alimentaires comme les
prébiotiques sur le système immunitaire et la prévention de l’allergie (action 5). Chaque
action est indiquée sur la figure 9.
41
Procédés technologiques (désamidation)
Action 2
Antigènes
Microbiote
prébiotiques
Action 5
alimentaires
lumière intestinale
Barrière intestinale
Action 1
Individu sain
Patient allergique
CPA
Th0
Action 2
Th1
Th2
Th3
Tr1
CD4+/CD25+ IFNγ
TGFβ
IL-10
IgA
TGFβ
Y
IgG2a Y
IL-4
Sensibilisation
Y Y Y
YIgE
Th0
Th1
Action 3
mastocyte
Balance Th1/Th2
IFNγ
TOLERANCE
Th1
IL-4, IL-5
antigène induit Treg
Th2
ALLERGIE ALIMENTAIRE
antigène induit Th2
Figure 9: Réponses du système immunitaire aux antigènes alimentaires : notion de balance
entre la tolérance et la réaction allergique : mise en évidence des actions majeures de mon
projet de recherche.
Tout au long de ma carrière de chercheur à l’INRA, j’ai donc cherché à comprendre les
mécanismes de la réaction allergique et leurs associations avec les protéines alimentaires pour
ensuite envisager des stratégies thérapeutiques ou de prévention. Je vais désormais vous
exposer les résultats majeurs obtenus au cours de ma carrière à l’INRA de 2003 à 2013.
II.
Etude des mécanismes de l’allergie alimentaire
Rappel : La majeure partie du temps les protéines alimentaires sont tolérées par l’organisme,
dégradées dans 90% des cas et absorbées au niveau de la barrière intestinale. Elles sont
ensuite présentées au système immunitaire muqueux qui va s’activer et induire une réponse
immune de tolérance (réponses Th1 et T régulatrice, IgA). Au cours des réactions d’allergie
42
alimentaire (197), la protéine allergène va être capable de passer dans le tractus digestif et de
traverser l’épithélium pour ensuite aller activer le système immunitaire (lymphocyte T CD4
de type Th2) et induire la production d’IgE spécifiques. Ces IgE vont aller se fixer à la surface
des mastocytes via le récepteur de haute affinité au fragment Fc des IgE (FcRI). Il s’agit de
la phase de sensibilisation, silencieuse cliniquement. Lors d’un contact ultérieur avec le même
allergène, celui-ci va de nouveau franchir la barrière intestinale et être directement reconnu
par les IgE présents à la surface des mastocytes. Il y a alors activation des mastocytes et
induction d’un signal permettant ainsi la sécrétion des médiateurs de l’allergie (histamine,
leucotriènes…) puis l’apparition des symptômes cliniques. Cette étape correspond à la phase
de déclenchement. L’ensemble de ces mécanismes reste très peu élucidé à ce jour. Or, cette
pathologie ne cesse de croitre et il n’existe pas de traitement. Il est donc indispensable de
développer des travaux de recherche sur la compréhension fine et précise des mécanismes de
la réaction allergique (translocation, sensibilisation, déclenchement) pour ensuite aider au
diagnostic et à la mise en place de stratégies de traitement et de prévention. C’est donc ce que
je me suis proposé de faire.
A. Action 1 : Etude de la translocation des allergènes à travers l'épithélium
intestinal
1. Problématique :
Les allergènes alimentaires sont capables de franchir la muqueuse intestinale pour ensuite
orienter le système immunitaire vers la voie lymphocytaire Th2 (réaction allergique) plutôt
que la voie de la tolérance orale (voir figure 9). Ces mécanismes très précoces de
translocation intestinale des allergènes sont très mal connus à l’heure actuelle. La barrière
intestinale est constituée de différentes cellules telles que les entérocytes, les cellules M, les
cellules caliciformes sécrétrices de mucus et les cellules de Paneth sécrétrices de peptides
anti-microbiens (198). Les cellules épithéliales sont reliées entre elles par des jonctions
serrées assurant ainsi l’étanchéité de la barrière intestinale et jouant ainsi un rôle important
dans les processus de perméabilité intestinale paracellulaire. Les types cellulaires et les voies
(transcelluaire et paracellulaire) impliqués dans les mécanismes de transport des allergènes
sont aussi peu décrits. Certaines études ont montré un transport paracellulaire des allergènes
(99, 199, 200). D’autres travaux démontrent aussi un passage transcellulaire notamment pour
la -lactoglobuline (201) et pour un allergène du soja : Glym Bd 30K (202). Ce dernier était
transporté par endocytose via les voies clatherine et calvéoline dépendantes (202). La cellule
dendritique semble aussi capable de piéger l’allergène dans la lumière de l’intestin via
l’émission de dendrites entre les jonctions serrées (96). Après sensibilisation, des complexes
allergène-IgE peuvent aussi être transportés de la lumière de l’intestin vers la séreuse via le
récepteur aux IgE de basse affinité FcRII (CD23) exprimé à la surface des entérocytes (99,
100). Ce transport des complexes allergène-IgE les protège de la dégradation par les
lysosomes, ce qui fait que les formes allergéniques sont intactes au niveau de l’environnement
séreux (102). La plupart des études ont porté sur des allergènes modèles comme l’ovalbumine
(203-207) ou la -lactoglobuline (201, 208-210). Il semble que certains procédés industriels
de fabrication des aliments tels que le chauffage (210-212), la réduction/alkylation (201), la
43
glycation (203), la pasteurisation (213) et d’autres encore modifient la structure des allergènes
et donc leur capacité à traverser la barrière de l’intestin. Des données suggèrent que les types
cellulaires impliqués dans le transport des allergènes diffèrent en fonction de leur structure.
En effet, la -lactoglobuline une fois agrégée par le chauffage va être préférentiellement
transportée au niveau des cellules M situées dans les plaques de Peyer de l’intestin (213).
Les objectifs de ce thème recherche sont donc d’approfondir nos connaissances sur les
mécanismes précoces de translocation des allergènes. Pour cela, nous cherchons :
-à évaluer les effets des allergènes sur la perméabilité intestinale : sont-ils capables d’ouvrir
les jonctions serrées, de modifier la perméabilité paracellulaire et donc de perturber la
fonction barrière ? Ou au contraire sont-ils transportés par la voie transcellualire sans atteindre
l’intégrité de l’épithélium intestinale ?
-à caractériser les formes et les structures des allergènes capables d’être transportées au
niveau de l’épithélium intestinal.
-à évaluer l’influence de certaines modifications (chauffage, désamidation, hydrolyse,
aggrégation) des allergènes sur leur capacité à être transportés.
Pour réaliser ce travail, nous disposons de différentes collaborations avec l’UMR1280 PHAN
de l’INRA de Nantes, l’INSERM de l’hôpital Necker à Paris (Dr M. Heyman), l’INSERM U
913 du CHU de Nantes (Dr M. Neunlist). Nous disposons aussi de contacts avec le service de
gastroentérologie du CHU de Nantes (Dr Tamara Matysiak-Budnik et Dr C. Trang).
2. Résultats :
De par les compétences de l’équipe, j’ai choisi d’étudier le transport des allergènes du blé et
de l’œuf au niveau de l’épithélium intestinal. J’ai dans un premier temps évalué les effets de
ces allergènes sur la perméabilité paracelluaire et donc l’intégrité de la barrière intestinale.
J’ai ensuite cherché à savoir quels étaient les allergènes capables de franchir cette barrière
puis j’ai étudié l’impact d’un traitement, la désamidation, sur le passage des gliadines de blé.
Pour réaliser ce travail, les cellules Caco-2 dérivées d’un adénocarcinome de colon humain
ont été utilisées. Ces cellules ont la capacité de se différencier spontanément en une monocouche de cellules polarisées comparables à l'entérocyte de l’intestin grêle. La culture de ces
cellules sur un support perméable (insert composé de deux compartiments, apical et basal,
séparés par une membrane) permet d’évaluer l'effet des molécules ajoutées au milieu sur la
perméabilité intestinale par la mesure de la résistance électrique trans-épithéliale. J’ai aussi
choisi de développer un système plus physiologique ex vivo de montage de fragments
d’intestin (de souris ou de biopsies humaines) en chambre de Ussing.
Ces travaux ont été réalisés en partie dans le cadre de deux stages de Master II en 2004
(Virginie Dubois) et en 2013 (Fatmé Mteirek).
44
Les allergènes du blé :
Les protéines de blé n’ont pas modifié la perméabilité paracellulaire des cellules Caco-2. Elles
n’ont pas non plus affecté la viabilité et la prolifération des cellules. Ces résultats sont
contraires à certaines études effectuées sur des patients atteints de la maladie cœliaque (214,
215). Dans notre analyse immunochimique, les différentes protéines de blé n'ont pas été
détectées au même degré dans les milieux de culture basaux des inserts. Nos travaux ont
notamment montré une translocation intestinale de deux protéines du blé, la LTP et l’gliadine, connues pour être des allergènes majeurs (216). Nous pouvons présumer qu'il y a un
rapport entre l’allergénicité des protéines et leur capacité à préserver leur antigénicité après
passage de l'épithélium intestinal sous forme peu dénaturée. Ce travail a donné lieu à une
publication (216): Bodinier et al., Intestinal translocation capabilities of wheat allergens
using the caco-2 cell line, J.Agric.Food Chem., 2007, 55 : 4576-4583.
Dans le cadre du projet ANR PREDEXPITOPE (2009-2012), nous avons démontré en
collaboration avec Martine Heyman (Hopital Necker) que la LTP était transportée à travers la
monocouche de cellules CaCo-2 ou HT29-19A sous forme peu dégradée. Des essais de
transport de cette protéine à travers des biopsies intestinales d’enfants allergiques ont été
réalisés mais elles n’ont donné aucun résultat probant.
La désamidation du gluten est capable d’induire des AA sévères chez des individus au départ
tolérants au blé (217). Notre équipe a montré que cette nouvelle AA au gluten désamidé était
surtout médiée par les - et 1,2-gliadines (218). J’ai donc cherché à évaluer si ces deux
protéines de blé, les - et 1,2-gliadines, étaient capables de franchir la barrière intestinale.
J’ai comparé leur translocation en fonction dans leur état natif, désamidé et/ou hydrolysé à la
pepsine. Nous avons montré que ces deux gliadines n’avaient pas eu d’effet sur la
perméabilité paracellulaire. Nous avons observé que toutes les formes d’ -gliadines étaient
transportées à travers les cellules Caco-2. Cependant le taux de passage des -gliadines
désamidé était très largement supérieur (350 à 50 fois plus) à celui des autres formes de la
protéine. Ces premiers résultats tendent donc à démontrer que le processus de désamidation
augmente la translocation des gliadines de blé.
Les allergènes de l’œuf :
Dans le cadre de l’ANR OVONUTRIAL (2008-2011), nous avons étudié la translocation de
quatre allergènes de l’œuf (ovalbumine, ovomucoïde, ovotransferrine, lyzozyme) à travers la
barrière intestinale à l’aide du modèle Caco-2 et nous n’avons observé aucun effet de ces
protéines sur la perméabilité paracellulaire intestinale. Elles n’étaient pas non plus détectées
par HPLC dans les milieux de culture en basal donc aucun transport intestinal n’a été mise en
évidence.
Il semble que les protéines (œuf et blé) ne soient pas toutes à même de traverser la barrière
intestinale. Ainsi, la translocation intestinale des allergènes est certainement très dépendante
des propriétés physicochimiques et structurales des protéines.
45
B. Action 2 : Etude de l’effet des allergènes natifs ou modifiés sur le système
immunitaire et leur capacité à sensibiliser l’organisme
1. Problématique :
Il existe peu de données sur les relations entre la structure des protéines et leur capacité à
activer le système immunitaire et à induire une réaction allergique. L’impact des procédés de
transformation des protéines sur ces mécanismes immunologiques sont aussi peu décrits. Nos
objectifs dans l’équipe allergie sont donc de mieux appréhender les effets des allergènes sous
différentes formes sur le système immunitaire dans sa globalité et sur la réaction allergique.
Pour aider à la réalisation de ses travaux, j’ai entrepris de développer des modèles animaux
d’allergie alimentaire. Ces modèles ont été mis en place dans le cadre du stage postdoctoral de
Michaël Leroy en 2007.
2. Résultats :
a. Effet d’un allergène de blé natif sur le système immunitaire : mise
en place d’un modèle animal d’allergie alimentaire au blé
Pour étudier l’effet des allergènes de blé sur le système immunitaire, j’ai choisi de mettre en
place un premier modèle animal d’allergie alimentaire au blé et de le valider en comparant la
réponse allergique avec celle obtenue chez l’homme. Après des essais non concluant avec le
rat Brown Norway, je me suis ensuite intéressée au modèle souris qui est plus pertinent d’un
point de vue immunologique car nous disposons d’une étendue très large de réactifs
biologiques (anticorps). Pour cela, j’ai établi une collaboration avec Karine Adel-Patient
(équipe de J.M Wal : Laboratoire INRA d'Imuno-allergie alimentaire IAA, CEA de Saclay,
département AlimH) qui est spécialisée dans le développement de modèles souris Balb-c
allergiques à la -lactoglobuline et à l’arachide. Notre objectif était de développer un modèle
de souris allergique à un extrait de gliadines, une fraction insoluble du blé contenant les
allergènes majeurs, en testant différents protocoles. Trois souches de souris (Balb/c, les
C3H/HeJ, B10.A) ont été immunisées avec 4 injections intra-péritonéales successives de
gliadines. L’influence de la dose de gliadines sur la production d’IgE et d’Ig 1 spécifiques,
sur la production cytokinique des lymphocytes T et sur l’induction de la réaction allergique a
été évaluée. Le développement de la réaction allergique a été comparé en testant la production
de cytokines de type Th2 et l’afflux d’éosinophiles dans le liquide de lavage
bronchoalvéolaire (BAL) après stimulation intranasale avec les gliadines totales. La souris
Balb/c présentait une meilleure sensibilisation avec une production d’IgE et d’Ig 1
spécifiques plus importante que dans les deux autres souches, quelle que soit la dose. Cette
réponse était confirmée par le profil cytokinique Th2 des splénocytes activés par les gliadines.
L’afflux massif d’éosinophiles et la production de cytokines de type Th2 dans les BALs ont
également permis de mettre en évidence une sensibilité accrue des souris Balb/c aux deux
doses utilisées. A l’opposé, la stimulation intranasale n’a pas induit de réaction allergique
chez les souches C3H/HeJ et B10.A à 10 µg. Cette étude démontre pour la première fois
l’intérêt de la souris Balb/c comme modèle animal dans le contexte de l’allergie au blé. Ce
travail a fait l’objet d’une publication (121) : M. Bodinier et al. Sensitization and elicitation
46
of an allergic reaction to wheat gliadins in mice. 2009. J Agric Food Chem, 57(4), 1219-25.
Une revue a aussi été écrite (219): M. Bodinier et al. Animal models of food allergy.
Application to wheat proteins. 2008. Revue française d’allergologie et d’immunologie
clinique 48, 526–532.
La pertinence de notre modèle souris Balb/c d’allergie au blé (121 , 219) a été renforcé en
démontrant une correspondance très forte entre les épitopes IgE des souris et des patients
allergiques. Ce travail a été publié (220) : Denery-Papini et al. Immunoglobulin-E-binding
epitopes of wheat allergens in patients with food allergy to wheat and in mice experimentally
sensitized to wheat proteins. 2011. Clin Exp Allergy, 41(10):1478-92. Je l’ai présenté au
congrès européen de l’allergie en 2011 à Istanbul (EAACI) : j’ai reçu le prix de la meilleure
présentation. Ce modèle souris d’allergie est désormais utilisé en routine au sein de l’équipe
pour répondre à de nombreuses questions de recherche notamment étudier in vivo l’impact de
l’aliment modifié par différents traitements sur les mécanismes de la réaction allergique.
b. Effet d’un allergène de blé modifié sur le système immunitaire et la
réaction allergique
Contexte : en collaboration avec les chercheurs de l’axe 1 de l’équipe spécialisés sur les
relations structure/allergénicité, j’ai donc évalué l’influence d’un procédé technologique, la
désamidation, sur la capacité de certaines protéines de blé connues pour être des allergènes
(les gliadines) à induire une réaction allergique. Rappelons que le gluten de blé peut être
modifié par un traitement enzymatique ou chimique (isolats de blé) appelé désamidation pour
améliorer ses propriétés fonctionnelles, augmenter sa solubilité et donc élargir son champ
d’application dans l’industrie agroalimentaire. La désamidation du gluten est un processus au
cours duquel, en milieu acide, des résidus glutamines de la protéine sont modifiés en acide
glutamique. Ces modifications du gluten semblent capables d’induire des allergies
alimentaires chez des individus au départ tolérants au blé. L’équipe de Leduc (217) a publié le
1er cas d’anaphylaxie après ingestion d’une viande reconstituée contenant de l’isolat de blé.
Notre équipe a montré qu’un patient réactif au gluten désamidé possédait des IgE contre des
séquences linéaires des domaines répétés des - et 1,2-gliadines (218). Ce résultat suggérait
que certains traitements industriels pouvaient augmenter le risque de développer une allergie.
Disposant au laboratoire d’un modèle de souris allergiques aux gliadines de blé (121, 219),
notre objectif a été dans un premier temps de comparer in vivo l’allergénicité des gliadines
sous formes natives et désamidées.
Ce travail a été réalisé en 2010 dans le cadre de la thèse de Pascal Gourbeyre (2009 à 2011).
Résultats : nous avons donc sensibilisé les souris avec l’extrait de gliadines natif ou désamidé
puis nous avons comparé les niveaux d’expression des différents marqueurs de la réaction
allergique (IgE, cytokines Th2 ou Th1, histamine). Les résultats obtenus mettent en évidence
une plus forte sensibilisation (plus fortes productions de cytokines de type Th2 et d’IgE) des
souris par les gliadines désamidées que par les gliadines natives ainsi que des profils de
réactivités des IgE distincts. En effet, contrairement aux souris sensibilisées avec les gliadines
natives, les souris sensibilisées avec les gliadines désamidées reconnaissent plus fortement les
- et les 1,2-gliadines. Ces résultats corrèlent avec ceux obtenus chez les patients allergiques
47
au gluten désamidé et permettent ainsi de démontrer qu’il est possible d’évaluer l’impact d’un
procédé technologique à l’aide d’un modèle souris. Ce travail a été publié (221) : Gourbeyre
et al.. Wheat gliadins modified by deamidation are more efficient than native gliadins in
inducing a Th2 response in Balb/c mice experimentally sensitized to wheat allergens. 2012.
Molecular Nutrition and Food Research, 56(2):336-344. Il a été diffusé dans la lettre "En
direct des labos". Différentes hypothèses peuvent expliquer le renforcement de l’allergénicité
des gliadines par la désamidation : ce procédé rendrait les protéines plus solubles et donc plus
à même de franchir la barrière intestinale, favoriserait la formation d’agrégats protéiques qui
seraient alors plus résistants à la digestion gastrique ou renforcerait la reconnaissance des
gliadines par les cellules T impliquées dans l’allergie. Ces travaux interpellent sur la
dangerosité de certains procédés technologiques qui dans certains cas peuvent augmenter
l’allergénicité des protéines voir former des néo-allergènes.
C. Action 3 : Etude de la phase de déclenchement correspondant à la dégranulation
mastocytaire induite par les protéines de blé
1.
Problématique :
L’allergénicité d’une protéine dépend de sa capacité à fixer une IgE spécifique mais surtout
de sa capacité à activer un acteur cellulaire primordial de la réaction allergique que l’on
appelle le mastocyte. Celui-ci possède à sa surface un récepteur au fragment Fc capable de
fixer les IgE (FcRI). Pour activer le mastocyte un même allergène doit être capable de fixer
deux IgE, il y a alors induction d’un signal et sécrétion des médiateurs de l’allergie.
Les données de Sandra Denery sur la caractérisation des protéines (222) et des épitopes (218)
de blé reconnus par les IgE des patients ont été obtenues par des méthodes immunochimiques
comme l’ELISA et le Western-Blot. Ces travaux (218 , 222 , 223) sur les réponses IgE aux
différents allergènes de blé ont montré l’extrême diversité du répertoire. Or ces tests mettent
en évidence une interaction antigène/anticorps et non un phénomène biologique tel que
l’activation mastocytaire. On pouvait donc se demander si l’ensemble de ces IgE était apte à
activer les mastocytes, ce qui est l’origine du développement des symptômes cliniques. Pour
confirmer ces données, j’ai réalisé une étude plus physiologique sur l’activation des
basophiles par les différentes protéines de blé purifiées. Pour cela j’ai travaillé en
collaboration avec le docteur U. Blank de l’unité INSERM E 0225 de Paris qui a mis au point
un modèle cellulaire de basophiles de rat humanisés (Rat Basophilic Leukemia, RBL). Ces
cellules sont capables de se lier aux IgE du sérum de patients et de dégranuler après
incubation avec l’allergène spécifique. Ces cellules sont intéressantes car elles sont facilement
cultivables et permettent de remplacer les mastocytes humains difficilement isolables à partir
du sang frais.
Ce travail a été réalisé en partie dans le cadre d’un stage de Master II en 2006 (Aurélie
Mauray) et d’un stage de licence professionnelle en 2007 (Valérie Echasserieau).
48
2. Résultats :
J’ai donc dans un premier temps étudié la capacité des protéines de blé en présence de sérum
de patients allergiques alimentaires au blé à faire dégranuler le modèle de basophiles de rat
humanisé. Nous avons travaillé avec 30 sérums: 13 d’enfants et 1 d'adulte souffrant du
syndrome de dermatite atopique associé à de l’eczéma (SDAE), 4 d’adultes atteints d’urticaire
(U), 1 d’enfant et 1 d’adulte souffrant d’anaphylaxie (A) et 10 d’adultes déclenchant des
anaphylaxies induites par l’effort (AIE). Nous avons fait 2 groupes selon les données ELISA
obtenues dans l’étude précédente (224) : un groupe de patients SDAE et un groupe de patients
U, A et AIE. Ces deux groupes de sérums de patients ont été testés contre l'- et l’5gliadines, les gluténines de faible poids moléculaire (FPM), la LTP et les
albumines/globulines. Le modèle de mastocytes d’U. Blank a été sélectionné de par sa
capacité à exprimer les ARNm des 3 chaînes  et  du FcRI (RT-PCR quantitative), à
fixer les IgE humaines spécifiques de l’allergène et à dégranuler. Pour les patients souffrant
du SDAE, généralement des enfants, nous avons confirmé par le test de dégranulation des
basophiles les données obtenues par ELISA sur la fraction albumines/globulines (224). Ces
protéines étaient principalement reconnues par les IgE de ces patients. Par ce test, nous avons
montré que seulement 27% des patients SDAE reconnaissaient les -gliadines (64% en
ELISA). Cet essai biologique opposé à l'ELISA réduisait donc l'importance des prolamines
dans cette pathologie. Nous avons observé que 56 % de ces patients reconnaissaient la LTP.
Pour la première fois, la LTP était considérée comme un allergène du blé capable de faire
dégranuler le basophile. Pour le groupe des patients souffrant d’U, d’A et d’AIE, nous avons
confirmé, par le test de dégranulation des RBL, le rôle important des gluténines de FPM.
Cependant, les résultats étaient discordants pour les 5-gliadines qui étaient très mal
reconnues dans ces conditions (31 % des patients) par rapport à l’ELISA (81 % des patients).
Nous avons montré que cette faible réponse des sérums du groupe 2 vis-à-vis des 5gliadines dans le test de dégranulation n’était pas liée à une faible concentration en IgE
spécifiques. Le test in vitro de dégranulation des basophiles de rat humanisés s’est donc révélé
une bonne méthode pour évaluer plus physiologiquement l’allergénicité et le pouvoir
déclenchant d’un allergène. Il permet de s’affranchir des paramètres de variabilité qui sont
liés à l’utilisation de basophiles de sujets allergiques. En effet ces sujets sont la plupart du
temps poly-sensibilisés ce qui provoque des stimulations permanentes des basophiles par de
nombreux allergènes et conduit à des dégranulations spontanées de ces cellules rendant
difficile leur utilisation. Cette étude préliminaire a montré que ces réponses IgE très diverses
étaient la plupart du temps cliniquement relevantes et donc en accord avec les essais
immunochimiques. Les résultats obtenus de cette étude ont fait l’objet d‘une publication
(106) : M. Bodinier, et al. Evaluation of an in vitro mast cell degranulation test in the context
of food allergy to wheat. 2008. Int Arch Allergy Immunol, 146, 307–320.
Le test in vitro de dégranulation est désormais utilisé en routine au sein de l’équipe pour
valider l’allergénicité de certaines protéines. Nous avons notamment confirmé que certaines
protéines du gluten (gliadines) modifiées par le procédé de désamidation étaient capables de
faire dégranuler le basophile en présence de sérum de patients allergiques à ce gluten modifié
(225). Nous avons aussi démontré, à l’aide du modèle RBL, l’allergénicité d’une nouvelle
49
protéine de blé : la serpine (226). Ce travail montre l’importance des tests cellulaires in vitro
physiologiquement proches de la réaction allergique pour cribler les néo-allergènes. Il
démontre aussi l’influence des traitements technologiques sur la formation de néo-allergènes.
D. Action 4 : Etude des mécanismes de la marche atopique
1. Problématique:
Parmi les troubles allergiques, on retrouve les allergies cutanées, alimentaires et respiratoires.
Les allergies respiratoires constituent la forme la plus fréquente d'allergie observée dans les
pays occidentaux (227-229) et touchent environ 20% à 30 % de la population européenne
(230). Les symptômes respiratoires sont la rhinite ou rhinosinusite combinée ou non avec la
conjonctivite allergique (227, 231) et l'asthme. Les allergies cutanées, principalement le
syndrome de dermatite atopique associé à l’eczéma, sont plus fréquentes chez les nourrissons
(232, 233) avec une prévalence de 15-30 % par rapport à 2-10 % chez les adultes (234). Ces
valeurs sont augmentées en cas d’antécédents familiaux ou de prédispositions génétiques. Les
allergies alimentaires touchent environ 5-8 % des enfants, avec une prévalence plus forte dans
les premières années de la vie (234, 235). Les symptômes cliniques sont très divers : troubles
gastro-intestinaux (nausées, vomissements, diarrhée (236), dommages de la peau (urticaire ,
œdème de Quincke ou dermatite atopique (237), problèmes respiratoires (asthme , rhinite
(237)) et réactions généralisées (anaphylaxie induite par l'exercice (237)). Les maladies
atopiques varient avec l'âge. Pendant la petite enfance, les allergies cutanées et alimentaires
prédominent (233, 238) alors que chez l’adulte on retrouve surtout des allergies respiratoires
(233, 234). Cette progression est appelée " la marche atopique " (233, 239). Certaines études
cliniques ont mis en évidence le lien potentiel entre deux allergies : cutanées puis respiratoire
(234, 240) ou alimentaire puis respiratoire (238, 241-244). La marche atopique a été
modélisée par des modèles animaux pour élucider ses mécanismes. Ces travaux ont permis de
comprendre certains mécanismes potentiels expliquant la transition d’une sensibilisation
cutanée à des symptômes respiratoires et d'identifier des biomarqueurs clés. Néanmoins, le
passage de l'allergie alimentaire à l'allergie respiratoire n'a jamais été exploré, les mécanismes
spécifiques expliquant cette progression sont totalement inconnus.
Les objectifs de cet axe de recherche ont été de disséquer les mécanismes de cette marche
atopique c’est à dire de déterminer « comment on peut passer d’une sensibilisation à un
allergène alimentaire pendant la petite enfance à une sensibilisation à un allergène respiratoire
à l’âge adulte ». Pour cela, nous avons développé un modèle souris très novateur combinant
l’allergie alimentaire aux protéines de blé (gliadines modifiés par désamidation) (121, 221) et
l’allergie respiratoire aux acariens (extrait de Dermatophagoides farinae). Grâce à ce modèle,
caractérisé au niveau systémique (rate, thymus), du tube digestif et du poumon, nous
souhaitons comprendre les mécanismes d’activation du système immunitaires mis en jeu au
cours de la marche atopique et définir un certain nombre de biomarqueurs et de cibles
thérapeutiques potentiels à même de prédire ou de prévenir la survenue d’une allergie
respiratoire chez les sujets porteurs d’allergie alimentaire. Ces travaux aideront à la mise en
place de nouvelles biothérapies à même de prévenir ou de traiter ces maladies.
50
Ce travail est réalisé en collaboration avec le Pr A. Magnan (INSERM UMR1087, CNRS
UMR 6291, IRT de Nantes) dans le cadre du projet régional, REAL2 (2011-2014). Ce projet
regroupe un réseau Ligérien de chercheurs et de cliniciens sur la thématique de l’allergie. Il
possède un volet recherche fondamentale visant à comprendre les mécanismes de la marche
atopique à l’aide d’un modèle animal. Il est aussi constitué d’un volet clinique dont les
objectifs sont de réaliser des cohortes de familles allergiques pour effectuer un suivi
observationnel des maladies atopiques au cours de la vie et une stratégie de prévention des
futurs enfants à risque (probiotiques).
Cette étude constitue pour l’équipe une étape cruciale permettant de comprendre finement les
mécanismes de sensibilisation aux allergènes alimentaires et leurs répercussions sur
l’organisme puis à terme sur la survenue d’autres pathologies allergiques comme les allergies
respiratoires. râce à ce projet, j’ai ainsi élargi au niveau régional mon réseau de
collaborations avec les allergologues et les chercheurs de l’Inserm pour ensuite construire de
nouveaux projets. La proximité avec les chercheurs de l’Inserm de Nantes nous permet de
travailler ensemble sur les modèles animaux et cellulaires et de partager nos outils
expérimentaux.
Ce travail a été réalisé dans le cadre de deux stages postdoctoraux en 2012 (Pascal Gourbeyre)
et en 2013 (Grégory Bouchaud).
2. Résultats :
Dans le projet REAL2, je suis responsable du volet recherche fondamentale et je vais donc
vous exposer les résultats obtenus dans cet axe. Le modèle souris d’allergies croisées
(allergies alimentaire et respiratoire) a été réalisé et nous avons exploré les réponses
immunologiques, physiologiques et allergiques sur différents organes : la rate, le thymus, le
tube digestif et le poumon. Les études concernant l’intestin ont été réalisées en collaboration
avec M. Neunlist de l’INSERM UMR 913 (CHU de Nantes), celles sur le poumon étaient
faites par les chercheurs de l’équipe AVENIR dirigée par A. Magnan responsable du projet
REAL2 (INSERM UMR1087, CNRS UMR 6291, IRT de Nantes). Les souris ont été
sensibilisées par voie intrapéritonéale et par voie orale à l’allergène alimentaire (les gliadines
de blé désamidées) puis exposées en intranasal à l’allergène respiratoire (un extrait
d’acariens : Derp). Après exposition combinée aux deux allergènes, les souris présentaient des
quantités très fortes de marqueurs sanguins allergiques: IgE spécifiques de chaque allergène et
taux d’histamine. Par ailleurs, la sécrétion par les splénocytes d'IL-4 et IL-17 étaient
augmentée alors que des taux plus faibles d’'IFN- étaient observés Dans les plaques de
Peyer, les lymphocytes T sécrétaient des taux plus élevés d'IL-4 avec une diminution des
productions d’IFN-, d’IL-10 et de TGF-. Les intestins de ces souris présentaient des flux
paracellulaires augmentés, une perméabilité transcellulaire modifiée et des atteintes
digestives. En revanche, l’hyperréactivité bronchique, les cellules inflammatoires et les
cytokines dans le poumon demeuraient inchangés par rapport au modèle d'allergie
respiratoire. Ainsi, l’exposition aux allergènes alimentaire (blé) et respiratoire (acariens)
augmente les biomarqueurs liés aux allergies alors qu’elle diminue la réponse de tolérance.
Toutefois, la double exposition agit en synergie pour modifier les fonctions de l'intestin, mais
51
elle n'a aucun effet supplémentaire sur les fonctions respiratoires. Dans ce travail, nous
montrons donc pour la première fois l'impact d'une première exposition à un allergène
alimentaire puis d’une exposition ultérieure à un aéroallergènes sur les phases de
sensibilisation et de déclenchement de l'allergie. Ces données permettent de faire un pas de
plus dans l'élucidation des mécanismes reliant l'immunité et les allergènes de l'environnement
dans le développement la marche atopique. Nous souhaitons valoriser ces résultats à travers
une publication ciblant le secteur de l’immunologie des muqueuses : Gourbeyre et al.
Dissecting the immunophysiology of atopic march using an original mouse model combining
food and respiratory allergies. Clinical and Experimental Allergy, soumis.
E. Conclusion sur l’étude des mécanismes de l’allergie alimentaire:
Suite au développement des outils méthodologiques (lignées cellulaires Caco-2, test de
dégraulation RBL, modèles animaux d’allergie), j’ai donc pu aborder des questions de
recherches pointues sur les mécanismes de mise en place de la réaction allergique.
J’ai commencé à obtenir des données sur la phase de sensibilisation de la réaction :
notamment sur les effets des allergènes de blé et d’œuf sur la barrière intestinale et leur
transport (perméabilité paracellulaire inchangée et transport transcellulaire) (216). Cependant,
il reste à élucide de nombreux autres mécanismes sur cette phase : les voies de passage
transcellulaire, les zones et les cellules intestinales impliquées dans le transport, les formes
d’allergènes transloquées et leur capacité à activer le système immunitaire. Ces travaux
constitueront un des axes de recherche que je souhaite poursuivre dans mon projet de
recherche à venir.
J’ai évalué l’effet in vivo des allergènes sur le système immunitaire et la réaction allergique
par la mise en place d’un modèle souris d’allergie alimentaire très pertinent, reproductible et
proche du patient allergique. Celui-ci s’est révélé être un outil précieux pour évaluer in vivo
l’impact d’un traitement, la désamidation, des gliadines de blé sur la réaction allergique. Ce
travail, démontrant un renforcement de l’allergénicité des protéines de blé par ce procédé, a
permis de valider notre stratégie d’évaluation. Nous sommes désormais capables à l’aide de
notre modèle animal d’allergie alimentaire d’évaluer l’impact des traitements sur
l’allergénicité in vivo des aliments. Nous projetons désormais d’élargir cette étude à d’autres
traitements (aggrégation, hydrolyse) et à d’autres allergènes : de l’œuf et du blé. Nous
souhaitons à terme être à même de prédire les risques allergiques d’un aliment donné
(modifié).
J’ai pu aussi étudier in vitro, à l’aide du modèle de basophile RBL, la phase de déclenchement
de la réaction allergique et donc démontrer la capacité des protéines de blé à induire une
dégranulation des basophiles (106). Ce travail a permis de valider physiologiquement le
pouvoir déclenchant et donc clinque des différents allergènes de blé. Ce test cellulaire est
désormais utilisé en routine par de nombreux chercheurs de l’équipe.
A travers le projet régional REAL2, j’ai contribué à l’amélioration de la compréhension des
mécanismes de la marche atopique. Notamment, nous avons démontré pour la première fois
qu’une sensibilisation à un allergène alimentaire pouvait influencer fortement la
52
sensibilisation ultérieure à un aérollergène. En effet, grâce à la pertinence de notre modèle
souris d’allergies combinées, nous avons observé une amplification de la réponse immune de
type allergique et des altérations intestinales après exposition aux deux allergènes (blé puis
acarien) (Gourbeyre et al, soumis à Clinical and Experimental Allergy). Nous souhaitons,
toujours en collaboration avec Antoine Magnan, poursuivre ces travaux de recherche dans les
années à venir à condition d’obtenir de nouveaux financements.
III.
Prévention ou réduction de la réaction allergique par l’alimentation : la stratégie
des prébiotiques
Un accroissement de la prévalence des maladies atopiques dans les pays industrialisés a été
observé au cours des dernières décennies et plus particulièrement celui des allergies
alimentaires au cours des 10-15 dernières années (245). Les modifications du mode de vie et
du régime alimentaire dans ces mêmes pays au cours de cette période amènent à étudier les
liens potentiels et à rechercher les facteurs du régime alimentaire impliqués dans le
développement ou la prévention des maladies allergiques. Peu de données sont actuellement
disponibles quant à la forme et la composition sous lesquelles les aliments doivent être
consommés afin de (1) limiter la sensibilisation allergique et favoriser l’acquisition de
tolérance, (2) favoriser une accoutumance chez un individu sensibilisé ou (3) limiter les
réactions allergiques ou leur gravité. Ces connaissances sont indispensables pour développer
une nutrition préventive ou thérapeutique mieux adaptée à la population allergique. Afin de
réduire la sensibilisation allergique par l’alimentation, plusieurs pistes ont été étudiées :
- la stratégie des modifications des aliments par différents traitements : hydrolyse, chauffage,
émulsion. L’hypothèse est de dire qu’en modifiant la structure, la séquence ou la taille de
l’allergène, il est possible de réduire voir abroger l’allergénicité de la protéine.
- la stratégie des suppléments alimentaires comme les prébiotiques qui auraient un impact sur
le microbiote intestinal et/ou le système immunitaire et pourraient ainsi pallier aux allergies
alimentaires.
J’ai choisi d’évaluer la stratégie des prébiotiques à l’aide du modèle animal d’allergie
alimentaire au blé. Ce travail a pour objectif de prévenir ou réduire la réaction allergique par
l’aliment. Il permettra à terme d’aider à la mise en place de stratégies nutritionnelles pour
lutter contre les allergies alimentaires.
A. Action 5 : Effet des prébiotiques sur le système immunitaire et la prévention des
allergies
1. Problématique :
Les prébiotiques constituent les substrats de bactéries bénéfiques du microbiote intestinal
(voir l’introduction). Ce sont généralement des oligosaccharides (OS) non-digestibles et
fermentés dans le côlon. À ce jour, les principaux prébiotiques utilisés sont l’inuline et ses
dérivés, les fructooligosaccharides (FOS) et les galactooligosaccharides (GOS).
53
Contrairement au lait de vache, le lait maternel contient une proportion importante d’OS
spécifiques (les HMO,12 g/L) capables d’exercer un effet sur la maturation de l’intestin du
nouveau-né en terme de flore et de perméabilité (246). Certaines préparations pour nourrisson
sont donc supplémentées en OS prébiotiques ((136): GOS/inuline; (247): GOS/FOS) et
agissent sur la diminution du risque infectieux (137, 138). Néanmoins, les effets des OS sur le
système immunitaire et l’allergie demeurent méconnus en raison d’études peu nombreuses,
controversées et hétérogènes (136, 247-249). La petite enfance semble une période clé pour
l’orientation du système immunitaire (250, 251) et l’implantation du microbiote gastrointestinal (252). Il est connu que les bactéries composant ce microbiote peuvent exercer des
effets sur le système immunitaire, notamment via leur métabolisme (166, 253). C’est pourquoi
une stratégie visant à moduler le microbiote autochtone par l’utilisation de prébiotiques,
pourrait avoir un effet majeur sur « l’éducation » du système immunitaire, en particulier si
l’exposition s’effectue très tôt : par exemple par le biais de la mère, puis du nouveau-né. Des
études menées chez l’individu adulte et chez de jeunes souriceaux ont montré que des FOS
pouvaient agir au niveau des plaques de Peyer de l’intestin en augmentant l’expression des
IgA et du récepteur aux IgA (139, 254). De telles données prouvent que les prébiotiques
peuvent agir sur le système immunitaire, en revanche leur effet sur les voies du système
immunitaire est peu documenté. Notre objectif est de déterminer à quelle période le
prébiotique doit être apporté dans l’alimentation pour agir au mieux sur le système
immunitaire et la barrière intestinale pour ensuite prévenir de l’allergie.
Ce travail a été réalisé dans le cadre de la thèse de Pascal Gourbeyre (2008-2011) en
collaboration avec l’UMR PHAN de l’INRA de Nantes (AlimH, Martine Champ) et à l’aide
d’un financement obtenu par la région sur le projet NUPEM (2007-2011).
2. Résultats :
Notre objectif a été dans un premier temps de vérifier que les prébiotiques pouvaient avoir un
effet sur le système immunitaire et la physiologie intestinale et de définir la période
d’exposition la plus judicieuse pour agir au mieux sur ces deux paramètres. Nous émettions
l’hypothèse que la période périnatale (gestation et allaitement) serait la plus à même de
remplir cette fonction car cette période semble jouer un rôle clé sur l’orientation du système
immunitaire et l’établissement de la physiologie intestinale (micobiote et maturation de la
barrière intestinale). Une fois avoir validé la stratégie d’administration, nous avons ensuite
évalué son impact sur la survenue de la réaction allergique.
Effet des prébiotiques sur le système immunitaire et la barrière intestinale et choix de la
période d’exposition :
L’objectif de cette étude était de caractériser précisément l’effet de la période d’exposition
aux prébiotiques sur l’orientation du système immunitaire et sur la physiologie de l’intestin.
Deux études ont été réalisées : l’une où les prébiotiques ont été apportés en périnatal (pendant
la gestation et l’allaitement) puis en postnatal (après le sevrage), et l’autre étude où les
prébiotiques ont été apportés uniquement en postnatal chez le souriceau sevré. Nous avons
utilisé un mélange de deux OS, 90% de OS et 10% d’inuline, utilisé dans certaines
préparations pour nourrissons et testé cliniquement en postnatal chez le nouveau-né pour la
54
prévention des allergies (136). Afin de caractériser l’effet de la supplémentation en
prébiotiques dans les deux études, nous avons étudié le statut immunitaire (tolérance : IgA,
IL-10, TGF-, IgG2a et IFN-γ ; allergie : IgE, IgG1 et IL-4) et l’expression de certains
marqueurs intestinaux (AGCC, protéines des jonctions serrées : ZO-1, MUC-2) des souris :
mères et souriceaux. Lorsque les prébiotiques étaient apportés en période périnatale puis
postnatale, nous avons observé une augmentation des taux de certains marqueurs
immunologiques impliquées dans la tolérance comme l’IL-10, les IgA et les IgG2a. Nous
avons aussi constaté une plus forte expression de certains marqueurs intestinaux impliqués
dans le renforcement de la barrière intestinale (MUC-2, ZO-1) et une plus forte production
d’un A CC, le propionate, dans les contenus caecaux. Le lait des mères ayant reçu un régime
enrichi en prébiotiques contenait des concentrations plus élevées en IgA et en TGFß. Les
prébiotiques apportés uniquement en période postnatale ont eu peu d’effet sur le système
immunitaire (taux d’Ig 2a inchangés et d’IgA diminués). Quelle que soit la période
d’exposition, les taux d’IgE et Ig 1 restaient les mêmes. L’ensemble de ces résultats atteste
que les prébiotiques sont capables d’agir sur la physiologie intestinale et le système
immunitaire du souriceau de manière très marquée s’ils sont administrés en périnatal puis en
postnatal. Ceci démontre l’importance d’un contact avec les prébiotiques lors du début de la
vie de l’individu à des périodes telles que la gestation ou l’allaitement. Ce travail a été
valorisé par une publication (255) : Gourbeyre et al. Exposure to a
galactooligosaccharides/inulin prebiotic mix at different developmental time points
differentially modulates immune responses in mice. 2012. J Agric Food Chem,
60(48):11942-51.
Effets des prébiotiques donnés en période périnatale puis postnatal sur la réaction allergique :
L’exposition aux prébiotiques en période périnatale puis postnatal, ayant montré une forte
efficacité sur l’orientation du système immunitaire vers la tolérance et sur le renforcement de
la barrière intestinale, nous avons cherché à savoir si ces conditions expérimentales pouvaient
assurer une prévention efficace contre les allergies. Pour cette étude, nous avons utilisé le
modèle souris d’allergie aux gliadines désamidées sensibilisé par voie intra-péritonéale (IP)
(221). Les souris Balb/c ont été alimentées avec un régime supplémenté (+Prb), ou non (Prb), avec 4% de OS/inuline ratio 9:1. Les taux d’IgA, IgE, Ig 1, Ig 2a totales et
spécifiques ont été déterminés par ELISA. La sécrétion de cytokines par les splénocytes (IL-4,
IL-10, INFγ et T Fβ) a été étudiée. Après une provocation intra-péritonéale à l’allergène, les
taux sanguins d’histamine et les symptômes cliniques ont été étudiés. Après sensibilisation,
les souris présentaient de forts taux d’IgE et d’Ig 1 totales et spécifiques quel que soit leur
régime alimentaire. Cependant, les souris +Prb présentaient des taux d’Ig 2a et d’IgA totales
et spécifiques nettement plus forts que ceux des souris –Prb. Seules les souris +Prb
produisaient de l’IL-10, de l’INFγ et du T Fβ. La sécrétion d’IL-4 était équivalente quel que
soit le régime. Après provocation, les symptômes cliniques et les taux d’histamine étaient
identiques. Ainsi, à l’issue de la sensibilisation, les voies de tolérance étaient plus fortement
induites chez les souris +Prb que chez les –Prb. Cependant, une forte réponse Th2 et des
symptômes sévères étaient observés quel que soit le régime. L’administration de prébiotiques
en périnatal n’a donc pas permis de contrebalancer la réponse Th2 induite par voie intra55
péritonéale. En revanche, il est intéressant de constater que ce régime a permis de maintenir
les niveaux d’induction des voies de la tolérance orale. Ce travail a donné lieu à une
publication (256) : Gourbeyre et al. Perinatal and postweaning exposure to
galactooligosaccharides/inulin prebiotics induced biomarkers linked to tolerance mechanism
in a mouse model of strong allergic sensitization. 2013. J Agric Food Chem, 61(26):6311-20.
Projet annexe et étude fortuite : L’étude de l’impact des prébiotiques sur le développement
des allergies alimentaires lorsqu’ils sont donnés en périnatal a donné lieu à des résultats
inattendus concernant le comportement des mères lors de la gestation et le développement du
souriceau. Cette étude était la première à fournir des preuves des effets bénéfiques d'un
régime alimentaire supplémenté en prébiotiques administrés pendant la gestation. Ce régime
réduisait l'incidence du cannibalisme chez les mères et induisait une augmentation du poids
corporel des souriceaux au moment du sevrage. Cette augmentation du poids a surtout été
associée à une hausse de la masse musculaire, sans aucune augmentation de la masse grasse.
Ce travail a été publié (257) : Desbuards et al. Impact of perinatal prebiotic consumption on
gestating mice and their offspring: a preliminary report. 2011. Br J Nutr:1-4.
B. Projet complémentaire aux prébiotiques : effets des fibres sur le système
immunitaire :
1. Problématique:
Mes compétences acquises sur le système immunitaire et les prébiotiques m’ont permis de
participer depuis janvier 2012 à un projet européen Fibebiotics FP7-KBBE (2011- 54 mois,
«Dietary fibers supporting Gut Immune Function- From polysaccharide compound to health
claim»). Ce projet, coordonné par J. Mess (Food & Biobased Research, Wageningen,
Hollande), a pour objectif de développer des ingrédients alimentaires fonctionnels et des
produits bénéfiques pour la santé humaine (intestin et système immunitaire) et la qualité de
vie d’une grande partie de la population (surtout les personnes âgées). Il se concentre sur des
polysaccharides non digestibles (NPS), l'une des stratégies alimentaires les plus prometteuses
pour promouvoir la santé, mais pour laquelle des données sont manquantes pour compléter la
justification « allégation santé » (exigence de l’EFSA). Le projet permettra :
Tâche 1 : d'effectuer des analyses biochimiques pour étudier les composés NPS, leur
biodisponibilité et l’effet des traitements.
Tâche 2 : de développer des méthodes standardisées de dépistage in vitro pour être en mesure
de prédire les effets des NPS in vivo.
Tâche 3 : de réaliser des analyses in vivo et ex vivo pour étudier les mécanismes d'action des
NPS et valider des biomarqueurs.
Tâche 4 : d’utiliser et de valider ces connaissances dans une étude clinique visant à réduire
certaines maladies infectieuses comme le rhume et la grippe des personnes âgées.
J’interviens dans la tâche 3 (effet des NPS sur le système immunitaire) et mon objectif est
d’évaluer l’effet de certains NPS (arabinoxylanes, -glucanes, pectines…) sur les cellules
dendritiques (DC) de donneurs sains de plus de 60 ans. Pour cela, j’ai développé une
collaboration avec la plateforme de Développement et Transfert Clinique (CIC Biothérapies
503) du CHU de Nantes (M. Grégoire et D. Coulais). Plus précisément, nous avons analysé
56
l’impact de différents NPS sur la maturation des cellules dendritiques (production de
cytokines et expression de marqueurs de maturation : CD80, CD83, CD86, CD40, HLA-DR)
et leur capacité à activer les lymphocytes T (polarisation des cellules T CD4+ : Th1, Th2 et
Th17).
Ce travail a été réalisé par un assistant ingénieur (Julie Le Luhant) en contrat à durée
déterminée (1an) en 2013.
2. Résultats :
Pour évaluer l’effet des NPS sur les cellules dendritiques, il a fallu dans un premier temps
vérifier leur contamination en endotoxines (LPS). Ces dernières sont des toxines bactériennes
qui peuvent stimuler le système immunitaire (réponse inflammatoire) et ainsi biaiser les
résultats de nos expériences. Nous avons mis en place des méthodes de détection et de
déplétion des endotoxines puis nous avons choisi de travailler avec des fibres peu
contaminées comme l’inuline (fructane de chicoré), la wellmune (glucane de levure
Saccharomyces cerevisiae) et la oatwell (glucane d’avoine). Nous avons donc évalué
l’effet de ces 3 fibres sur la maturation des DC issus de 5 donneurs sains de plus de 60 ans.
Pour cela, nous avons caractérisé phénotypiquement et fonctionnellement les DC après
maturation. L’expression de certains marqueurs de maturation sur les DC ont été évalué
(CD80, CD83, CD86, CD40, HLA-DR, par cytométrie de flux). Nous avons aussi analysé la
capacité des DC maturées en présence de fibres à sécréter des cytokines (IL-10 et IL-12 par
ELISA) et à activer les lymphocytes T CD4+ pour induire leur polarisation en lymphocytes
Th1, Th2 et Th17 (par dosage intracytoplasmique de cytokines en cytométrie de flux).
Nos résultats démontrent alors que les DC maturées en condition classique avaient un
phénotype attendu avec une forte expression des marqueurs de maturation. Cependant, nous
avons observé que ces cellules avaient une activité fonctionnelle altérée. En effet, elles
sécrétaient des quantités très faibles de cytokines et induisaient une faible activation des
lymphocytes T CD4. Cette faible activité des DC de ces donneurs de plus de 60 ans est peut
être liée à l’âge des cellules et donc à leur vieillissement. De plus, nous avons observé une
hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des DC en fonction des donneurs (niveau
d’expression des marqueurs de maturation et sécrétion de cytokines par les DC très variables).
Ces différences peuvent être liées à l’histoire immunologique du patient (plus de 60 ans).
Dans l’ensemble nous n’avons pas eu d’effet marqué des fibres sur la maturation des DC, leur
phénotype et leur fonction n’ont pas été altérés. Cependant, on a noté des tendances :
L’inuline a eu tendance à augmenter la capacité des DCs à présenter l’Ag (↑HLA-DR) et à
stimuler les lymphocytes T (↑marqueurs de co-stimulation: CD80, CD83, CD86). Elle
semblait avoir des effets sur la fonction de la DC mature. Notamment, elle a modifié la
sécrétion de cytokines par la DC (↓IL-12 et ↑IL-10). Elle a affecté la capacité des DC à
activer les lymphocytes T CD4 (diminution de la sécrétion d’IL-4 par les lymphocytes).
57
La wellmune n’a pas eu d’effet notable sur le phénotype des DC matures. Cependant, elle
semblait affecter leur fonction. On a observé une diminution de la sécrétion de cytokines
(↓IL-12) et un faible pouvoir d’activation des lymphocytes T (↓ IL4).
La oatwell a eu un effet néfaste sur la maturation des DC en diminuant sa capacité à présenter
l’antigène (↓HLA-DR) et à stimuler les lymphocytes T et B (↓CD40 et CD83). Elle semblait
aussi avoir des effets sur la fonction de la DC matures notamment en diminuant la sécrétion
de cytokines (↓IL-12).
Ces résultats suggèrent que ces trois fibres n’ont pas eu d’effet notable sur le système
immunitaire notamment sur la maturation de la DC. Cette absence d’effet est peut-être due
aux fibres en elles-mêmes ou bien au choix des DC. En effet, nous avons travaillé avec des
DC de donneurs de plus de 60 ans et nous avons remarqué que ces cellules de base avaient
une activité fonctionnelle affectée. Nous aurions peut être observée des effets des fibres avec
des cellules de donneurs plus jeunes. Nous souhaitons désormais comprendre pourquoi la
fonction des DC matures de donneurs de plus 60 ans est altérée.
Nos données sont en accord celles obtenues en clinique. En effet, une étude clinique a été
effectuée pour évaluer la capacité de ces fibres à stimuler le système immunitaire des
personnes de plus de 60 ans lors de la vaccination contre la grippe. Ils ont voulu savoir si ces
fibres allaient augmenter l’efficacité de la vaccination. Cependant, aucun effet n’a été
observé.
Retombées :
Ce projet va contribuer à la compréhension des mécanismes d’interaction des fibres (NPS,
prébiotiques) avec le système immunitaire et aidera à la justification de l’allégation santé pour
ces composés. Ces données seront ensuite très intéressantes pour notre équipe car elles nous
permettront de sélectionner de nouveaux composés pour prévenir des allergies.
C. Conclusion sur la prévention ou la réduction de la réaction allergique par
l’alimentation:
Nos travaux sur les prébiotiques prouvent, pour la première fois, qu’une exposition périnatale
puis postnatale à des compléments alimentaires (prébiotiques GOS/inuline) exerce un effet
santé notable sur l’organisme notamment un renforcement de la barrière intestinale et une
orientation du système immunitaire vers les voies de tolérance ce qui aurait pour conséquence
de prévenir des allergies. Ce projet mérite d’être exploré plus profondément dans les années à
venir. Il faudra définir plus précisément la période d’exposition aux prébiotiques, notamment
de savoir si la période périnatale suffit-elle à elle seule pour agir sur le système immunitaire et
la réaction allergique. Le modèle souris d’allergie devra être modifié pour faire en sorte
d’obtenir une réponse allergique plus modérée et d’ainsi visualiser à la fois au niveau
mécanistique et clinque l’effet préventif des prébiotiques.
Ces dix années de recherche à l’INRA dans l’équipe Allergie montrent que mes
activités s’orientent de plus en plus vers la compréhension des mécanismes d’interaction de
58
l’aliment (modifié ou non, supplémenté en prébiotiques, NPS) avec le système immunitaire et
la barrière de l’intestin pour ensuite élaborer des stratégies pour agir sur les allergies. Mon
projet de recherche pour les années à venir va donc s’orienter vers ce type d’étude.
J’ai désormais acquis une certaine expertise sur l’impact de l’aliment sur le système
immunitaire et la santé. A ce titre, j’ai donc été nommée le 16 juillet 2012 comme membre du
comité d’experts spécialisé « Nutrition humaine » de l’agence nationale de sécurité sanitaire
de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES).
59
PROJET DE RECHERCHE ORIGINAL POUR L’AVENIR :
« Compréhension des mécanismes d’interaction de l’aliment (natif, modifié,
supplémenté) avec le système immunitaire et la barrière intestinale en vue d’élaborer
des stratégies agissant sur les allergies. »
Mes perspectives de recherche sont désormais centrées sur les approches mécanistiques
que j’ai déjà engagées. Ainsi, je souhaite prioriser mes travaux de recherche sur l’étude des
mécanismes précoces (translocation intestinale, sensibilisation, activation du système
immunitaire) de la réaction allergique engendrés par l’aliment. L’impact des modifications de
l’aliment par certains procédés technologiques (agrégation, désamidation, hydrolyse,
émulsion) sur ces mécanismes sera aussi évalué. En liaison avec la compréhension de ces
mécanismes, je souhaite mettre en place des stratégies de prévention ou de réduction des
allergies via l’utilisation de certains suppléments alimentaires (prébiotiques/ polyphénols).
L’interaction de ces suppléments avec le système immunitaire et l’intestin sera étudiée. Ainsi
mon projet de recherche va se décliner en deux grands axes de recherches complémentaires :
1/ comprendre les mécanismes précoces d’interaction de l’aliment (sous différentes
formes) avec le système immunitaire et l’intestin au cours d’une réaction allergique.
2/ élaborer des stratégies utilisant l’aliment pour réduire et/ou prévenir des allergies.
I. Etude des mécanismes précoces de la réaction allergique engendrés par l’aliment
A. Contexte
L’allergie alimentaire est une maladie multifactorielle, influencée par des facteurs génétiques
et environnementaux, qui se traduit par l'expansion d'une sous-population de cellules Th2 qui
activent les cellules B productrices d’anticorps IgE spécifiques de l'allergène (258). Certains
acteurs clés impliqués dans les mécanismes pathologiques favorisant l'allergie ont été
identifiés (259) mais de nombreuses questions restent en suspens notamment sur les
mécanismes précoces de sensibilisation aux allerggènes.
La pathologie survient après un contact entre l’épithélium intestinal et l’allergène. Celui-ci va
franchir la muqueuse saine pour ensuite orienter le système immunitaire vers la voie
lymphocytaire de type Th2 (pour induire la réaction allergique) plutôt que la voie de la
tolérance orale. Ce transport semble se produire par la voie vésiculaire transépithéliale des
entérocytes (260) ou des cellules M (213). Notre équipe l’a observé pour certaines protéines
de blé connues pour être des allergènes majeurs (216). Les cellules dendritiques (DC) peuvent
aussi jouer ce rôle. En effet, elles peuvent étendre leurs dendrites entre les jonctions serrées et
capturer l’allergène dans la lumière intestinale (96). Ces mécanismes de translocation
intestinale des allergènes sont mal connus à l’heure actuelle. Les portions de l’intestin, les
types cellulaires et les voies (transcelluaire et paracellulaire) impliqués sont peu décrits (voir
problématique Action 1, travaux antérieurs).
60
Une fois la barrière intestinale franchie, l’allergène est pris en charge par une cellule
présentatrice d’antigène qui va ensuite activer les cellules du système immunitaire et induire
une réaction allergique. La DC joue un rôle majeur dans cette présentation de l’allergène soit
directement en piégeant l’antigène dans la lumière intestinale soit indirectement après
transcytose de l’antigène à travers la cellule épithéliale (261). Elle active alors les différentes
populations de lymphocytes T résidants dans l’intestin ou celles présentes en périphérie après
migration dans les ganglions lymphatiques. Il existe différentes sous population de DC dans
l’intestin : celles issues des macrophages (CX3CR1+ CD103-), de la lignée myéloïde
(CD103+CX3CR1- CD11b+) et de la lignée lymphoïde (CD103+CX3CR1- CD11b-) (261).
Les rôles joués par ces différentes populations de DC restent cependant à ce jour très peu
documentés. De plus, des données récentes ont montré que les cellules épithéliales de
l’intestin ne jouent pas seulement un rôle de barrière mais elles sont aussi cruciales pour
coordonner la réponse immune en sécrétant des cytokines (262). Par exemple, elles sécrètent
la lymphopoïétine thymique stromale (TSLP) qui inhibe la production d’IL-12 par les DC en
réponse aux bactéries, et induit ainsi une polarisation des cellules Th2 (263). Elles sont aussi
capables de produire du TGF- et de métaboliser la vitamine A en acide rétinoïque pour
induire le développement de DC tolérogènes caractérisées par une augmentation de
l’expression de CD103+ chez l’humain (264). Il semble donc y avoir une vraie coopération
entre les DC et les cellules épithéliales pour moduler la réponse lymphocytaire T.
L’activation de la réponse T par les DC et/ou les cellules épithéliales dans la réaction
allergique est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux acteurs cellulaires.
Depuis de nombreuses années, le développement de la réaction allergique a été interprété
comme un déséquilibre entre les réponses Th1 et Th2 (265). Plus récemment, d'autres souspopulations de cellules T, telles que les lymphocytes T CD4 + régulateurs (Tregs) ont été
mises en évidence comme des acteurs importants dans le développement de l’allergie (266).
En effet, les Tregs modulent la biodisponibilité de cytokines telles que l'IL-10 ou le TGF-β,
régulant ainsi la balance Th2/Treg. À ce jour, deux sous population de Treg ont été décrites,
naturelle et induite, mais leurs différences phénotypiques et fonctionnelles ainsi que leurs
effets sur les réponses immunitaires restent encore largement inconnus (267). Une nouvelle
sous-population de lymphocytes T, les cellules CD4 + IL17 + (Th17), a été identifiée et
semble jouer un rôle crucial dans l'allergie. De même, les cellules Th22 (CD4 +, IL-22 +, IL17-) ont été caractérisées comme ayant un rôle dans le maintien de l’homéostasie des cellules
épithéliales intestinales (268). Néanmoins, leur rôle dans les mécanismes allergiques reste
inexploré notamment dans la phase précoce de l’allergie alimentaire. Les molécules
impliquées dans cette phase sont aussi peu connues. L’'initiation de la réponse immunitaire
dans le tractus gastro-intestinal semble être régulée, entre autres, par la TSLP, l’IL-25 et l’IL33 qui sont des cytokines associées à l’épithélium (269). Dans des modèles murins d‘allergie,
l’élévation de la production de TSLP est associée à l'apparition de symptômes de l’allergie
alors que l’IL-33 et, dans une moindre mesure, l’IL-25 sont impliquées dans l’initiation de la
réponse Th2 en induisant l'expression d’OX40L sur les cellules dendritiques (270).
Les mécanismes de l’allergie alimentaire se complexifient d’autant plus lors des
modifications de l’aliment par les procédés de transformation industriels. Ces transformations
61
toujours plus poussées peuvent contribuer à l’apparition de néoallergènes ou au renforcement
de l’allergénicité des aliments. Il semble que certains procédés industriels de fabrication des
aliments tels que le chauffage (210-212), la réduction/alkylation (201), la glycation (203), la
pasteurisation (213) ou d’autres procédées modifient la structure des allergènes et donc leur
capacité à traverser la barrière de l’intestin. Des données suggèrent que les types cellulaires
impliqués dans le transport des allergènes diffèrent en fonction de la structure des allèrgènes.
En effet, la -lactoglobuline une fois agrégée par le chauffage va être préférentiellement
transportée au niveau des cellules M situées dans les plaques de Peyer de l’intestin (213) alors
que ce même allergène non chauffé privilégiera la voie entérocytaire. Notre équipe a montré
que certaines protéines de blé, les - et les 2-gliadines, étaient impliquées dans l’allergie
alimentaire au gluten désamidé formé à la suite d’un procédé technologique de transformation
du gluten (chauffage à pH acide) (225). Les patients touchés par cette nouvelle pathologie
développent des symptômes forts comme l’anaphylaxie (217) et nous avons montré que la
désamidation augmentait la sensibilisation des souris aux gliadines de blé (221). Différentes
études ont montré que la torréfaction de l’arachide augmente son allergénicité (271, 272).
Pour comprendre les mécanismes impliqués dans l'allergie alimentaire, différents modèles
animaux et cellulaires ont été développés. Il existe notamment des modèles animaux adéquats
capables de reproduire au mieux la pathologie humaine (121 , 273, 274). Les mécanismes de
translocation des allergènes sont souvent étudiés à l’aide de lignées cellulaires
intestinales (Caco-2, HT-29 et cellules M : co-culture de Caco-2 et de Raji) (205, 207, 216,
275, 276) et de modèles animaux (rat, souris) (102, 200, 202, 213). Ils ont très rarement été
analysés à l’aide de biopsies intestinales humaines (53, 277-279).
Ainsi, les mécanismes de la réaction allergique sont très complexes et encore peu élucidés
notamment les mécanismes précoces de translocation des allergènes et d’activation du
système immunitaire. Les acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu au commencement de
l’allergie alimentaire sont peu connus. On note aussi encore peu de données sur l’impact de
l’aliment et de ses transformations sur ces phénomènes allergiques.
B. Objectifs scientifiques
Au vue de la littérature, il est donc fondamental d’étudier les mécanismes initiateurs de la
réaction d’allergie alimentaire ainsi que l’impact des procédés industriels sur ces phénomènes.
Cette démarche de compréhension mécanistique permettra d’optimiser les stratégies visant à
réduire et à prévenir des allergies alimentaires. Elle permettra aussi de développer des outils
permettant d’appréhender l’allergénicité des aliments natifs ou transformés par les procédés
industriels. Ce projet se concentrera plus particulièrement sur trois objectifs spécifiques
comme suit (Figure 10) :
Objectif 1: étudier les mécanismes de translocation des allergènes au niveau de l’épithélium
intestinal notamment identifier les zones de l’intestin, les voies et les cellules impliqués dans
ces phénomènes de transport.
Objectif 2 : étudier les mécanismes de prise en charge des allergènes par les DC et les
cellules épithéliales au niveau de l’intestin.
62
Objectif 3: étudier les mécanismes d’activation de la réponse lymphocytaire T mis en jeu au
cours de la réaction allergique. Ceci permettra de définir précisément les mécanismes
responsables de la balance entre tolérance et allergie orchestrés par l’immuno-surveillance.
Ces trois objectifs seront dans un premier temps abordés à partir de modèles d’allergènes
simples et connus comme ceux du blé (gliadines) et de l’œuf (ovalbumine). Nous pourrons
ensuite avec l’aide de mes collègues immunochimistes et physico-chimistes (S.Denery, C.
Larré, C. Brossard, O. Tranquet) évaluer l’impact des procédés technologiques de
transformation de ces deux allergènes sur les différents mécanismes traités dans les objectifs
1, 2 et 3. Pour établir un lien entre ces mécanismes précoces et la symptomatique de la
réaction allergique nous évaluerons l’effet du traitement de l’aliment sur le déclenchement de
la réaction allergique (objectif 4).
Figure 10 : Objectifs du projet d’étude des mécanismes précoces de la réaction allergique
engendrés par l’aliment (d’après (280))
63
C. Méthodologie
Le projet vise à élucider précisément les mécanismes précoces des allergies alimentaires. En
tant que tel, le projet englobera l’étude du passage de l'allergène à travers la barrière
intestinale et la compréhension des mécanismes immunologique induisant une sensibilisation
aux allergènes puis une allergie alimentaire à part entière. Ce projet alliera la biologie
cellulaire pour définir le transport de l'antigène à travers la barrière intestinale et l'immunophysiologie pour définir la prise en charge des allergènes par les APC et les processus de
différentiation des cellules immunitaire telles que les lymphocytes T et l’orientation donnée
au système immunitaire.
Objectif 1: Identifier les mécanismes régulant le transport des allergènes à travers la
barrière épithéliale intestinale
Pour analyser comment les propriétés des allergènes influent sur la reconnaissance, le
transport et la voie utilisée pour franchir la barrière intestinale, nous utiliserons des approches
in vitro, ex vivo et in vivo.
Approche in vitro :
A l’aide de lignées cellulaires (Caco-2, HT-29, cellules M), qui miment la barrière intestinale,
nous évaluerons le transport des protéines à travers la monocouche cellulaire en fonction de
leurs propriétés au niveau quantitatif et qualitatif.
- L’effet des protéines sur la perméabilité intestinale paracellulaire sera évalué en dosant le
transport d’acide sulfonique-FITC à travers la monocouche de cellules.
- La quantification des protéines traversant le tapis cellulaire sera évaluée par ELISA.
- L’analyse qualitative des protéines alimentaires (protéines entières ou fragments) traversant
la barrière intestinale sera réalisée par spectrométrie de masse via la plate-forme INRA
«BIopolymères et Biologie Structurale (BIBS) ».
- La localisation des protéines donnant des indications sur les voies de passage et les cellules
impliquées sera analysée par cytométrie en flux et microscopie confocale.
- Les voies cellulaires de transport seront déterminées par différentes méthodes d’inhibition
ou de microscopie confocale. Nous étudierons particulièrement l’endocytose (phagocytose et
pinocytose : clathrine dépendant lysosomial ou non, calvéoline médiée, calvéoline et
clatherine indépendant et macro-pinocytose), les lipides rafts et l’exocytose.
- Le rôle du CD23 dans le transport des allergènes sera aussi évalué à l’aide de la lignée
MDCK transfectée avec le CD23a ou le CD23b.
- L’effet des protéines sur les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales sera aussi
évalué. Nous analyserons notamment leur capacité à sécréter différentes cytokines (TSLP, IL33, IL-25) par ELISA ou qPCR
Approche ex vivo :
Le transport des allergènes natifs ou modifiés sera aussi analysé à l’aide de différents
fragments d’intestins (duodénum, jéjunum, iléon et colon proximal) avec ou sans plaque de
Peyer. Ils seront prélevés sur des souris naïves ou allergiques et seront montés en chambre de
Ussing puis mis en contact avec l’allergène dans le compartiment muqueux (environ 3h). Le
passage de l’allergène à travers les différentes portions de l’intestin sera évalué par :
- la résistance trans-épithéliale pour déterminer la perméabilité globale
64
- le dosage de l’acide sulfonique-FITC donnant la perméabilité paracellulaire
- le dosage de l’HRP pour la perméabilité transcellulaire
- la quantification des protéines dans les milieux muqueux et séreux par différentes
approches : ELISA, HPLC, marquage par des fluorochromes, spectrométrie de masse.
Pour se rapprocher au mieux de la physiologie de l’épithélium intestinal, nous réaliserons des
cultures primaires issues de fragments d’intestin de souris allergiques ou non. Cette approche
nous permettra d’évaluer l’effet des protéines sur un panel plus large de cellules intestinales
spécialisées (cellules de Paneth, cellules M, entérocytes, cellules caliciformes). Nous
analyserons la perméabilité intestinale, le transport et la sécrétion de cytokines par le tapis de
cellules primaires en réponse à l’allergène. Cette étude nous permettra d’évaluer le rôle des
différentes cellules intestinales dans le transport des allergènes.
Approche in vivo :
Le transport des allergènes pourra être directement évalué in vivo chez la souris. Pour cela,
nous ferons des mesures qualitative et quantitative du passage des protéines alimentaires dans
les liquides biologiques (sang, urine, contenu caecal etc…) après gavage intra-gastrique des
souris avec les protéines ayant subies différents traitements (chauffage, hydrolyse,
désamidation).
Objectif 2 : Etudier les mécanismes de prise en charge des allergènes natifs ou modifiés par
les DC et les cellules épithéliales.
Pour évaluer le rôle des DC et des cellules épithéliales dans la présentation des allergènes,
nous utiliserons des approches in vitro et ex vivo.
Approche in vitro :
Nous réaliserons des co-cultures de cellules intestinales avec des DC. Les cellules intestinales
pourront être des cellules caco-2, HT-29 ou des cellules M et les DC seront dérivées de
monocytes humains et/ou de souris.
Approche ex vivo :
Des co-cultures de cellules primaires de l’intestin de souris allergiques ou non avec des DC
humaines ou murines seront réalisées.
Dans les deux approches, nous évaluerons l’impact de l’allergène sur le phénotype et l’état
d’activation de la DC et de la cellule épithéliale par cytométrie de flux. Pour cela, nous
regarderons différents marqueurs exprimés à la surface de ces cellules (DC : CD11c, CD11b,
CD1a, CD14, CD80, CD86, CD83, CD40, CD103, CD123, CX3CR ; cellule épithéliale :
CD23, TLR, HSP, ZO-1, occludine, MUC, GP2) ainsi que leur capacité à sécréter différentes
molécules effectrices telles que les cytokines (TSLP, TGF-, IL-10,…).
Objectif 3: Comprendre les mécanismes d’activation de la réponse lymphocytaire T au cours
de la réaction allergique.
Pour évaluer la capacité des allergènes natifs ou modifiés, une fois présentés par la DC ou la
cellule épithéliale, à induire la polarisation de la réponse T (Th1, Th2, Th17, Trégulatrice),
nous développerons à la fois une approche in vivo chez l’animal et une approche sur des
modèles cellulaires in vitro et ex vivo. Pour caractériser finement les populations
lymphocytaires T activées, nous utiliserons la technique de cytométrie en flux 3 lasers.
65
Approche in vivo:
Nous évaluerons l’apparition de certains marqueurs moléculaires de l’allergie et surtout
l’émergence de populations de lymphocytes T et de cellules dendritiques à chaque étape de
la phase de sensibilisation de la réaction allergique grâce à l’utilisation de modèles murins
d’allergie au blé et/ou à l’œuf. Des souris Balb/cj âgées de 6 semaines seront sensibilisées par
trois injections intra-péritonéales (IP, 3 injections de 10µg de protéines avec 100µl d’alum
espacées de 10 jours : J1, J10 et J20) avec les allergènes natifs ou modifiés. Après chaque
sensibilisation, des souris seront sacrifiées par dislocation cervicale et différents prélèvements
seront effectués pour évaluer l’apparition des différentes populations cellulaires et des
marqueurs moléculaires.
*Populations cellulaires : Les cellules issues des organes lymphoïdes (rate, ganglions,
plaques de Peyer) des souris seront isolées et marquées après chaque étape pour analyser par
cytométrie en flux les caractéristiques des populations immunes : populations lymphocytaires
T (Th1, Th2, Th17, Treg et Th22) et cellules dendritiques :
 Th1 (CD3+ CD4+, IFNγ+, IL-4-)
 Th2 (CD3+ CD4+, IL-4+ IFNγ-)
 Th17 (CD3+ CD4+ IL-17+ IFNγ-)
 Th22 (CD3+ CD4+ IL-22+ IL-17-)
 Treg naturelle (CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3+ Neuropilin-, ICOS-)
 Treg induit (CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3+ Neuropilin+, ICOS+)
 DC inflammatoires (CD11c+, CD8+, CD103-)
 DC dérivées de monocytes (CD11c+ CD8-, CD103+)
 DC résidentes (CD11c+, CD11b-, CD103+)
*Marqueurs moléculaires : Des prises de sang seront réalisées à chaque étape du protocole
au niveau du plexus rétro-orbitaire chez toutes les souris afin de doser, par ELISA, diverses
immunoglobulines totales et spécifiques de l’allergène (Ig 1, Ig 2a et IgE). Des
prélèvements de tissus intestinaux (jéjunum, iléon, côlon) seront également réalisés pour
analyser l’expression de certains marqueurs par immunohistologie et western blot : des
récepteurs associés au système immunitaire (CD23, CMH, récepteurs de cytokines et de
chémokines, protéines d’adhésion, protéines de différenciation des cellules dendritiques), des
marqueurs de l’intégrité de la barrière épithéliale (HSP25, HSP72, caspase 3, zonuline,
occludine, mucine) et des marqueurs inflammatoires (MCP-1, IL-6).
Approches in vitro et ex vivo :
Nous réaliserons des modèles de co-culture de cellules intestinales (caco-2, HT-29, cellules
M, cellules primaires de l’intestin de souris allergiques ou non), de DC (monocytes de souris
et/ou humains) et de lymphocytes T CD4 (obtention par sélection négative CD4 à partir de
lymphocytes T intra-épithéliaux de souris, de splénocytes de souris ou de lymphocytes du
sang périphérique humain). L’allergène natif ou modifié sera mis en contact avec ce modèle
de co-culture puis nous évaluerons comme dans l’approche in vivo chez l’animal par
cytométrie en flux les caractéristiques des populations immunes : populations lymphocytaires
T (Th1, Th2, Th17, Treg et Th22) et cellules dendritiques.
66
Objectif 4 : Etudier les répercussions des mécanismes de sensibilisation de la réaction
allergique sur la symptomatique.
Les mécanismes précoces de la réaction allergique induits par l’allergène modifié ou non
vont ensuite conditionner l’apparition et la sévérité des symptômes. Il est donc indispensable
dans notre approche mécanistique de vérifier quel est l’impact du traitement de l’allergène sur
la phase de déclenchement de la réaction caractérisée par la dégranulation des basophiles ou
mastocytes et l’observation de signes cliniques. Pour évaluer ces paramètres nous utiliserons
les approches in vitro (modèle de dégranulation des basophiles) et in vivo (modèle animal
d’allergie) que j’ai mis en place lors de mes travaux antérieurs.
Approche in vitro:
Nous évaluerons la capacité des allergènes modifiés (œuf et blé) par le traitement à induire in
vitro la dégranulation de la lignée de basophiles de rat humanisés (RBL). Cette étude nous
permettra de voir si le traitement favorise ou non la phase de déclenchement.
Approche in vivo:
Nous analyserons l’impact des traitements de l’allergène sur la phase de déclenchement des
symptômes de l’allergie grâce à l’utilisation de modèles murins d’allergie (œuf et blé). Des
souris Balb/cj âgées de 6 semaines seront sensibilisées par injections intra-péritonéales (IP, 3
injections de 10µg de protéines avec 100µl d’alum espacées de 10 jours : J1, J10 et J20) puis
par gavages (2 gavages avec 20mg de protéines à 2 jours d’intervalle : J31 et J33) avec les
allergènes de blé ou d’œuf natifs ou modifiés. Après la sensibilisation, la réaction allergique
sera déclenchée à J43 par gavage oral (rappel) avec les mêmes allergènes (20mg). La
température corporelle des souris sera surveillée après déclenchement et les symptômes seront
évalués. A la fin du protocole, une prise de sang sera réalisée au niveau du plexus rétroorbitaire chez toutes les souris afin de doser les marqueurs de l’allergie : IgG1, IgG2a et IgE
ainsi que l’histamine.
Cette analyse permettra de comprendre les relations entre les mécanismes initiateurs de
l’allergie induit par l’aliment modifié et la symptomatique de la pathologie.
D. Résultats attendus et retombées scientifiques
Ce projet permettra d’apporter de nouvelles données sur :
 L’effet des allergènes de blé et d’œuf sous formes native et modifiée sur la perméabilité
paracellullaire de la barrière intestinale.
 L’évaluation du transport transcellulaire de ces allergènes transformés ou non.
 L’identification des voies transcellulaires de transport de ces allergènes (endosomes,
lysosomes, exosomes…).
 L’identification des sections intestinales responsables du transport de ces allergènes :
intestin grêle (duodénum, jéjunum, iléon) et colon.
 Le rôle des différents types cellulaires intestinaux sur le passage des allergènes : cellules
M, entérocytes, colonocytes.
 L’identification des mécanismes de capture des allergènes par les cellules intestinales
(clatherine, calvéoline, lipid raft…).
 Le type de cellules dendritiques impliquées dans la prise en charge, l’initiation et le
développement de la réaction d’allergie alimentaire et son évolution.
67
 La caractérisation et le rôle des populations lymphocytaires T à un stade précoce de la
réaction allergique et leur évolution au cours du développement de la pathologie.
 La caractérisation des acteurs moléculaires impliqués précocement dans l’allergie
alimentaire et leur implication au cours de la pathologie.
 Les relations entre les mécanismes initiateurs de l’allergie et les symptômes cliniques.
L’ensemble de ces résultats permettra d’apporter des informations nouvelles sur la
compréhension des mécanismes à l’origine de la réaction d’allergie alimentaire et sur
l’identification des bio-marqueurs très précoces impliqués dans la pathologie. A ce jour, les
allergies sont étudiées chez l’homme et chez l’animal au stade tardif de la maladie lors de
l’apparition des symptômes cliniques. Cette étude, très précoce et novatrice, permettra
d’évaluer l’allergie au stade cliniquement muet de la sensibilisation. Elle apportera de
nombreuses connaissances sur l’impact de certaines transformations des aliments sur le
système immunitaire et donc leurs répercussions sur les mécanismes mis en jeu au cours de
l’allergie alimentaire.
A plus long terme, ce projet pourrait conduire à un changement dans la prise en charge
clinique des patients allergiques avec une meilleure prévention et une meilleure
compréhension de la pathologie aboutissant à une meilleure qualité de vie de ces patients. Audelà de la santé humaine, mes résultats seront également d'une grande utilité pour les
industriels potentiellement prêts à respecter les règles sur le processus de transformation des
aliments et désireux d’obtenir de nouveaux outils leur permettant un diagnostic rapide et une
évaluation forte de leurs procédés.
E. Projets envisagés pour réaliser cette étude :
Pour réaliser cette étude, nous avons obtenu différents financements pour l’équipement et les
salaires à travers différents appels à projet :
-
-
Bourse européenne IEF Marie-Curie de 2 ans (juillet 2014-juillet 2016) pour mon
collègue Grégory Bouchaud actuellement en stage post-doctoral. Titre du projet:
« Impact of Gluten properties on Immune system and development of Food Allergy
(IGIFA) ». Je suis coordinatrice du projet.
Bourse AgreenSkills complétée par un salaire INRA (janvier à juin 2014) pour
Grégory Bouchaud.
Subvention de la région Pays de la Loire dans le cadre du « Renforcement des
équipements de laboratoires » pour l’achat d’une partie d’un cytomètre analyseur BD
FACS Canto II. Le complément du financement a été demandé dans différents appels
d’offre ANR et au niveau de l’unité BIA.
Pour financer le fonctionnement de cette recherche, nous souhaitons répondre à différents
appels d’offres auprès de l’ANR (jeune chercheur, projets collaboratifs, défi santé et bienêtre) et de la région Pays de la Loire (« paris scientifiques régionaux »).
Pour renforcer cet axe de recherche, je participe depuis octobre 2013 au co-encadrement de la
thèse de Mathilde Claude qui est encadrée par ma collègue C. Brossard et sous la direction de
Sandra Denery. La thèse a pour titre : « Etude du pouvoir sensibilisant et déclenchant des
allergènes alimentaires en systèmes aqueux ou émulsionnés ». Afin de progresser sur la
68
connaissance de l’impact de l’alimentation sur les réactions allergiques, nous proposons de
préciser au cours de cette thèse le rôle joué par les phénomènes d’agrégation en phase aqueuse
et en modèle émulsionné sur la capacité des allergènes modifiés ou non à traverser la barrière
intestinale, sensibiliser l’organisme et déclencher la réaction allergique
II.
Stratégies nutritionnelles pour réduire ou prévenir les allergies alimentaires
A. Contexte :
Dans l’introduction de ce manuscrit, nous avons pu voir qu’il existait des stratégies de
réduction et/ou prévention du risque allergique. Au cours de mes travaux antérieurs j’ai initié
une étude innovante sur la prévention des allergies par les prébiotiques. Je souhaite continuer
à explorer cette piste et développer une nouvelle approche avec ma collègue Colette Larré :
celle des polyphénols.
Les études utilisant les prébiotiques chez l’enfant ou chez la souris adulte restent peu
nombreuses et hétérogènes mais convergent vers un effet protecteur des prébiotiques vis-à-vis
de l’allergie (136, 146-150). Un certain nombre de travaux suggèrent que la période périnatale
constituerait une fenêtre d’action pertinente pour l'induction de la tolérance immunologique et
le renforcement de la barrière intestinale (281, 282). Dans mes travaux antérieurs, lors de la
thèse de P. Gourbeyre (2009-2011), nous avons notamment démontré que l’introduction d’un
mélange de prébiotiques de type GOS/inuline pendant les périodes périnatale et de postsevrage contrairement au post-sevrage seul stimule les voies liées à la tolérance (réponses
Treg et Th1, fortes productions d'IL-10, de TGF-d'Ig) et renforce la barrière intestinale
(expressions augmentées de HSP-25, MUC-2 et ZO-1) (255). Ces résultats suggèrent que la
gestation, la mise bas et l'allaitement sont potentiellement des périodes clés durant lesquelles
les réponses immunitaires peuvent être significativement modulées. Cette modulation du
système immunitaire ouvre la voie à une possible prévention de l’allergie. Pour valider cette
hypothèse, nous avons donc choisi d’évaluer l’impact du mélange de OS/inuline donné en
périnatal poursuivi du post-sevrage sur un modèle de souris allergique (121, 219, 221). Ce
travail a confirmé que l’administration précoce des prébiotiques GOS/inuline (périnatale +
post-sevrage) favorise un maintien des voies de la tolérance mais aucune diminution de la
réponse allergique n’a été observée (256). Cette observation peut s’expliquer par notre
protocole de sensibilisation trop drastique qui en orientant fortement le système immunitaire
vers la voie de l’allergie a masqué l’effet tolérogène induit par les prébiotiques. Ces travaux
encourageants sur l’effet du mélange OS/inuline donné en périnatal puis en post-sevrage se
doivent d’être poursuivis dans les années à venir.
Les polyphénols comme annoncé dans l’introduction de ce manuscrit semblent avoir
différents effets sur le système immunitaire et pourraient ainsi moduler les réactions
allergiques : action sur la DC, sur la production de cytokines de type Th2, sur les lymphocytes
T, sur la production d’IgE par les lymphocytes B et sur la dégranulation des mastocytes. Dans
le contexte de l’allergie au blé, l’utilisation des polyphénols semblent une piste intéressante
pour réduire le risque allergique. En effet, il a été démontré que certains liants polymériques
alimentaires pouvaient avoir un effet de « masquage » de gluten, spécifiquement vis-à-vis de
69
la gliadine, au niveau intestinal. Des résultats in vitro montrent que la gliadine a une capacité
de liaison aux polyphénols supérieure à celle des protéines du jus de pomme (283). Des
études ont montré des interactions entre la gliadine et certains polyphénols, les acides
tannique et gallique (284-286). Ces données démontrent la pertinence d'exploiter les
propriétés d'interactions des polyphénols avec les gliadines et d’évaluer leurs répercussions
sur les réactions allergiques. On peut se demander si ces interactions vont augmenter ou
diminuer la capacité de cet allergène du blé à stimuler le système immunitaire et induire une
réaction allergique.
B. Objectifs scientifiques:
Ma priorité est de mettre en place des stratégies pour réduire, traiter et prévenir des allergies
via l’alimentation. Je souhaite continuer à explorer la piste des prébiotiques de type
GOS/inule et élargir cette étude à de nouveaux prébiotiques comme les HMO. Une nouvelle
stratégie prometteuse, celle des polyphénols, sera aussi évaluée.
Pour développer cet axe de recherche, je mettrai en œuvre une approche pré-clinique sur
des modèles animaux. Celle-ci permettra de tester mes hypothèses et de démontrer l’intérêt
de ces deux stratégies dans le contexte de l’allergie alimentaire. J’ai d’ores et déjà obtenus des
résultats pertinents sur l’utilisation des prébiotiques qui nécessitent d’être approfondis chez la
souris pour ensuite être validés dans des approches cliniques. Ainsi, cette stratégie continuera
à se développer chez l’homme par le développement de protocoles cliniques en collaboration
avec des cliniciens (Hugues Piloquet, CHU de Nantes) et lors de mon expérience de mission
longue durée en Australie avec le Professeur Susan Prescott (Université de l’Ouest de
l’Australie, Hôpital Princess Margaret, Perth).
1.
Approche pré-clinique :
Pour évaluer ces deux stratégies de prévention, je travaillerai à l’aide de modèles animaux
d’allergie. Je me placerai plus particulièrement dans le contexte des allergies alimentaires au
blé de par mon expérience plus spécifique sur cette pathologie depuis environ une dizaine
d’années.
a. Stratégie des prébiotiques :
Je continuerai à m’intéresser à la stratégie des prébiotiques qui me préoccupe déjà depuis
environ 5 ans et pour laquelle nous avons des résultats encourageants. En effet, nous avons
montré, pour la première fois, qu’une exposition périnatale à des prébiotiques (mélange
OS/inuline au ratio 9:1) exerce un effet santé notable sur l’organisme (barrière intestinale
renforcée, terrain immunitaire inducteur de la tolérance orale, développement du nouveau-né,
comportement maternel). Cependant des questions restent en suspens. Il est désormais
indispensable de définir plus précisément la nature, la durée et la chronologie d’exposition et
les mécanismes d’action des prébiotiques pour prévenir au mieux des allergies. Mes objectifs
dans ce projet seront les suivants :
Objectif 1 : déterminer précisément la fenêtre d’exposition aux prébiotiques de type
GOS/inuline la plus efficace pour prévenir de l’allergie. La combinaison des périodes
70
périnatale et post-sevrage est efficace mais une introduction en périnatal seule (gestation et
allaitement) ou en anténatale seule (gestation) ne suffit-elle pas ?
Objectif 2 : caractériser plus précisément les mécanismes d’action des prébiotiques de type
GOS/inuline au niveau du système immunitaire et de l’intestin.
Objectif 3 : évaluer l’effet des prébiotiques de type GOS/inuline sur le microbiote intestinal.
Objectif 4 : évaluer l’efficacité de nouveaux prébiotiques notamment des HMO.
b. Stratégie des polyphénols :
Je souhaite aussi m’orienter vers une nouvelle piste de réduction de la réaction allergique
celle des polyphénols. Mes objectifs seront les suivants :
Objectif 5 : déterminer si les polyphénols, par leur capacité d’interaction avec les protéines
allergènes, sont capables d’influer sur la phase de sensibilisation de l’allergie.
Objectifs 6 : évaluer si les polyphénols peuvent aussi influer sur la phase symptomatique de
l‘allergie.
Objectif 7 : caractériser les mécanismes d’action des polyphénols.
2. Approche clinique :
La stratégie des prébiotiques étant prometteuse, je souhaite, en collaboration avec les
pédiatres du CHU de Nantes et ceux de l’hôpital Princess Margaret à Perth, évaluer leur
intérêt pour prévenir de la dermatite atopique chez le nouveau-né. Les objectifs de cette
approche sont :
Objectif 1 : de tester les prébiotiques dans la prévention de la dermatite atopique chez
l’enfant.
Objectif 2 : de déterminer la fenêtre d’exposition aux prébiotiques (périnatal, périnatal
associé au postnatal) la plus efficace pour prévenir de l’allergie chez l’homme.
Objectif 3 : de valider cliniquement chez l’homme les données obtenues chez l’animal.
C. Méthodologie
1. Approche pré-clinique chez l’animal :
a. Stratégie des prébiotiques :
Modèles animaux d’exposition aux prébiotiques: souris Balb/cJ (voir figure 11)
Au cours de cette étude, notre objectif est de tester différentes périodes d’exposition aux
prébiotiques et de définir celle qui est la plus à même d’induire un terrain tolérogène et d’ainsi
prévenir de l’allergie. Les périodes d’exposition aux prébiotiques seront les suivantes (voir
figure 11) :
71
- période anténatale seule: pendant la gestation seulement (mère sous prébiotiques de la
reproduction à la naissance).
- période périnatale seule : pendant la gestation et l’allaitement (prébiotiques donnés à la mère
de la reproduction à la fin de l’allaitement, c’est-à-dire jusqu’à 3 semaine de vie du
souriceau).
- période périnatale combinée au post-sevrage (prébiotiques donnés à la mère de la
reproduction à la fin de l’allaitement puis donnés au souriceau dans l’aliment solide de 3 à 10
semaines de vie).
Nous induirons ensuite l’allergie aux gliadines de blé chez la souris selon le protocole déjà
décrit (121, 221). Dans cette nouvelle étude nous choisirons de réaliser un modèle souris de
sensibilisation à l’allergène moins drastique que lors de nos travaux antérieurs (256). Pour
cela, nous réaliserons seulement deux injections intra-péritonéales (protocole antérieur : 4
injections) avec l’allergène à 6 semaines de vie espacées de 16 jours et une exposition orale
(protocole antérieur : exposition intra-péritonéale) à 10 semaines de vie.
Ce travail sera réalisé dans un premier temps avec les prébiotiques GOS/inuline déjà utilisés
lors de mes travaux antérieurs. Une fois que nous aurons déterminé la période d’exposition la
plus tolérogène nous pourrons évaluer l’efficacité de nouveaux prébiotiques comme les HMO.
Analyses mécanistiques de l’effet des prébiotiques :
Avant l’induction de la réponse allergique, nous pourrons évaluer l’effet des prébiotiques sur :
- l’orientation du système immunitaire périphérique et associé aux organes lymphoïdes (rate,
plaque de Peyer, ganglions mésentériques) :
- caractérisation in vivo des populations lymphocytaires T (Th1, Th2, T
régulatrices, Th17, Th22) et des DC au niveau phénotypique et fonctionnel.
- étude de la capacité des DC à polariser les lymphocytes T naïfs (en présence de
prébiotiques) dans des systèmes de co-culture ex vivo et/ou in vitro.
- l’intestin : perméabilité intestinale (in vivo: dextran FITC et ex vivo: chambre de Ussing),
transit intestinal, expression de marqueurs de l’intégrité de la barrière épithéliale (HSP25,
HSP72, caspase 3, zonuline, occludine, mucine), de marqueurs inflammatoires (MCP-1,
IL-6) et de certains récepteurs associés aux cellules épithéliales (TLR, NOD, galectines,
lectines). .
- le microbiote: séquençage des genres et espèces bactériens issus des fèces des souriceaux.
Après l’induction de la réponse allergique nous analyserons l’effet de ces suppléments
alimentaires sur :
- la sensibilisation allergique: analyse de la réponse T (Th1, Th2, Tregulateur), de la
production de cytokines (IL-4, IFN, TGF, IL-10) et d’immunoglobuline (IgE, Ig 1,
IgG2a, IgA).
- le déclenchement des symptômes cliniques : scores, dosage d’histamine, prise de
température.
72
- le microbiote.
- l’intestin.
Périodes combinées périnatale et post-sevrage:
Souriceaux: 9 semaines sous prébiotiques
Mères: sous prébiotiques
naissance
Sevrage
3
semaines
6 semaines
10 semaines
Etude périnatale + post-sevrage
Gestation
Allaitement
2 Injections IP de
gliadines: 16
jours d’intervalle
Provocation orale avec les
gliadines 8 jours après
dernière sensibilisation
Induction de l’allergie
Période périnatale :
Mères: sous prébiotiques
naissance
Sevrage
3
semaines
6 semaines
10 semaines
Etude périnatale
Gestation
Allaitement
Période anténatale :
Induction de l’allergie
Mères: sous prébiotiques
naissance
Sevrage
3
semaines
6 semaines
10 semaines
Etude anténatale
Gestation
Allaitement
Figure 11 : Modèle animal d’exposition aux prébiotiques et induction de l’allergie.
73
b. Stratégie des polyphénols :
Sélection des complexes polyphénoliques : évaluation in vitro de leur capacité à masquer le
gluten :
Cette tâche a pour objectif de sélectionner les polyphénols susceptibles de réduire
l’allergénicité du gluten par masquage. Elle débutera par la mise au point d’une méthode de
mesure des interactions polyphénols/protéines de blé s’inspirant des modèles actuels in vitro
(287-291). Les extraits polyphénoliques seront pré-selectionnés en fonction des données de la
littérature et de notre expérience. Certains liants polymériques alimentaires pouvant avoir un
effet de «masquage » du gluten au niveau intestinal ont déjà été identifiés. Il s’agit notamment
des polyphénols de raisin (Vitis vinifera) utilisés en œnologie, de noix de galle d’Alep
(Quercus infectoria ou robur) utilisés dans le tannage des protéines de la bière, de châtaigner
(Castanea sativa) utilisés pour le tannage des protéines en nutrition animale, ou encore des
polyphénols de thé, thym, café, pomme, et romarin. Ces polyphénols pourraient donc
probablement avoir des effets intéressants pour le traitement ou la prévention de l’allergie
alimentaire. Nous évaluerons aussi l’effet des polyphénols sur la digestion des gliadines in
vitro. Pour cela, nous mettrons au point les paramètres d’hydrolyse (pepsine et trypsine,
temps, pH) et nous caractériserons les produits d’hydrolyse par électrophorèse et
immunochimie. Cette tâche permettra notamment de choisir des hydrolysats d’intérêt pour,
ensuite, évaluer leur allergénicité résiduelle in vitro avec des sérums de patients allergiques et
des lignées cellulaires. Nous analyserons notamment la capacité des gliadines complexées
aux polyphénols (digérées ou non) à :
- être reconnues par les IgE des patients allergiques en ELISA.
- être transloquées au niveau de la barrière intestinale mimée par des cellules CaCo2.
- déclencher une réaction allergique, mimée par des RBL humanisées.
Les extraits de polyphénols montrant un effet de masquage du gluten in vitro (réduction de la
reconnaissance par les IgE, du transport intestinal et de la dégranulation des basophiles)
seront sélectionnés pour être utilisés dans les essais chez l’animal.
Etude de l’efficacité des polyphénols sur des modèles souris d’allergie au blé, analyse des
mécanismes d’action :
Cette tâche consistera à évaluer in vivo l’effet des gliadines complexées aux polyphénols sur
la réaction allergique. Pour cela, nous utiliserons le modèle souris Balb/cJ d’allergie au blé.
Nous réaliserons 4 groupes de souris : un groupe contrôle négatif (animaux sains), un groupe
contrôle positif (animaux sains traités avec les polyphénols), un groupe d'animaux allergiques
et un groupe d'animaux allergiques traités avec les polyphénols pendant la phase de
sensibilisation. La sensibilisation allergique aux gliadines de blé sera réalisée selon le
protocole classiquement utilisé par l’équipe (121, 221). Nous ferons 3 injections intrapéritonéales avec l’allergène à 6 semaines de vie espacées de 10 jours et une voir deux
expositions orales à 10 semaines de vie espacées de 2 jours. Nous évaluerons au cours et en
fin de protocole différents paramètres:
74
- physiologiques : mesure de la prise alimentaire, du poids, de la fonction intestinale
(perméabilité intestinale in vivo et ex vivo en chambre de Ussing), état de la muqueuse
intestinale (analyse histologique des fragments intestinaux : scores histo-pathologiques).
- immunologiques : mesure des Ig (IgE, IgG1, IgG2a, IgA) dans le sang, caractérisation des
populations lymphocytaires T et des DC au niveau des plaque de Peyer, des ganglions
mésentériques, de la rate par cytométrie de flux.
- microbiologiques : caractérisation du microbiote intestinal par séquençage des genres et
espèces bactériens dans les fèces et par analyse de la production d’acides gras à chaine courte
dans le contenu caecal.
Ces données nous permettront de démonter in vivo si le polyphénol a eu un impact sur la
réaction allergique engendrée par la gliadine de blé.
2. Approche Clinique chez l’homme
L’objectif de l’étude clinique est de valider chez l’homme la stratégie « des prébiotiques » et
de définir la période d’exposition la plus efficace pour prévenir de l’allergie (anténatale ou
anténatale combinée au postnatal). Le choix du prébiotique se fera en fonction des résultats
obtenus chez l’animal et en concertation avec les cliniciens.
Pour développer cette approche, nous réaliserons une étude prospective contrôlée par placebo
et en double aveugle. Nous procéderons à un recrutement de femmes enceintes dont l'enfant à
naître est à risque d'atopie de premier degré (mère atopique, père atopique ou premier enfant
atopique). Ces patientes pourront être inclues par le service de Pédiatrie du CHU de Nantes
(Hugues Piloquet) ou par l’hôpital Princess Margaret à Perth (Susan Prescott).
Les patientes seront randomisées en trois groupes :
- Goupe anténatal combiné au postnatal: les femmes enceintes recevant le prébiotique de 33
semaines de grossesse à l’accouchement et leurs nourrissons recevant le produit pendant 6
mois.
- Groupe anténatal seul: les femmes enceintes recevant le prébiotique de 33 semaines de
grossesse à l’accouchement et leurs nourrissons recevant le placebo pendant 6 mois.
- Groupe contrôle : les femmes enceintes et leurs nourrissons recevant le placebo.
Le prébiotique ou le placebo sera d'abord donné (poudre ou capsule) à la mère, depuis
l’inclusion dans l'étude (33 semaines de grossesse) et jusqu'à l'accouchement, puis soit à la
mère allaitante ou dans le biberon du nourrisson (lait infantile enrichi en prébiotique) jusqu'à
l'âge de 6 mois.
Les mères et les nourrissons seront ensuite suivis à 6 mois, 1 an, 2 ans, 3 ans et 5 ans. Au
cours du suivi, les patients subiront un examen clinique et un questionnement pour la
recherche de signes de dermatite atopique et d'autres maladies atopiques. Des tests
supplémentaires (tests cutanés, IgE spécifiques), des collections d'ADN et d’ARN et des
prélèvements de sang, de selles et de lait seront également réalisés pour l'analyse du
microbiote, du système immunitaire et la formation de biocollections pour poursuivre des
études mécanistiques.
75
D. Résultats attendus et retombées scientifiques
1. Approche pré-clinique
-
-
Stratégie des prébiotiques :
Les prébiotiques peuvent-il prévenir la mise en place d’une allergie ?
Le post-sevrage est-il nécessaire pour avoir une action des prébiotiques sur le système
immunitaire et le système intestinal ?
L’administration anténatale suffit-elle à elle seule pour agir sur les 2 systèmes ?
Quels sont les prébiotiques les plus efficaces pour prévenir de l’allergie ?
Quelle est la période d’administration du prébiotique le plus efficace pour prévenir de
l’allergie ?
Quels sont les mécanismes d’action des prébiotiques sur le système immunitaire,
l’intestin et le microbiote ?
Les prébiotiques sont-ils capables de réduire les symptômes cliniques de l’allergie ?
Stratégie des polyphénols :
Les polyphénols sont-ils capables de se complexer aux gliadines ?
Les gliadines complexées aux polyphénols sont-elles moins bien reconnues par les IgE
des patients allergiques ?
Les gliadines complexées aux polyphénols induisent-elles une plus faible
dégranulation des mastocytes et basophiles ?
Les gliadines complexées aux polyphénols sont-elles capables de sensibiliser la souris
et d’induire une réaction allergique ?
2. Approche clinique
-
Les prébiotiques sont-ils capables de prévenir de la dermatite atopique chez l’enfant ?
Faut-il les donner à la mère seulement pendant la grossesse ou à la mère et l’enfant
pour prévenir de la dermatite atopique ?
Quels sont les effets mécanistiques des prébiotiques chez l’enfant et la mère : sur le
microbiote, le système immunitaire et l’intestin ?
E. Projets envisagés pour réaliser cette étude :
1. Approche pré-clinique
Pour réaliser cette étude, j’ai déjà entrepris des demandes de financements pour du
fonctionnement et du salaire à travers différents contrats et projets avec des industriels.
J’ai notamment établi un contrat de collaboration de recherche avec la « Laiterie de
Montaigu » sur le projet suivant : « Etude de l’effet de la période d’exposition (périnatale et
post-sevrage) aux prébiotiques de type OS/inuline sur la prévention de l’allergie alimentaire
chez la souris». Cet industriel développe une gamme de laits infantiles en poudre et souhaite
proposer des formulations innovantes en mettant à profit les applications de travaux de
recherches fondamentales. Le contrat s’inscrit dans le cadre de l’institut Carnot Qualiment qui
porte sur la qualité nutritionnelle et sensorielle des aliments dont les membres sont l’INRA,
76
l’Université d’Auvergne, le CNRS, l’Université de Bourgogne, AgroSup Dijon, Welience et
AgroParisTech.
Nous avons obtenu en septembre 2013 le financement par les Fonds Uniques Interministériels
(FUI) d’un projet déposé par l’industriel
F (Guaranteed Gluten Free). Ce projet
(coordonné au niveau de l’INRA par Colette Larré) appelé ProtAlSafe a pour titre « produits
nutritionnels et services innovants pour une stratégie novatrice dédiée à la prise en charge des
malades cœliaques ». Le projet ProtAlSafe vise à mettre au point une nouvelle offre de
produits alimentaires à haute densité nutritionnelle pour permettre d’améliorer les conditions
de vie des malades cœliaques et des allergiques alimentaires au blé, notamment leurs
problèmes de carences et déficits nutritionnels et de déséquilibre de leur flore intestinale. Il est
question en autre dans ce projet de constituer des produits (produits panifiables, compléments
alimentaires) enrichis en liants polymériques pour réduire la toxicité du gluten ingéré de façon
involontaire, en se liant avec des peptides du gluten. L’objectif clinique est de limiter les
anomalies histologiques de la muqueuse intestinale et de réduire la réponse immunologique
des malades. Le consortium réunit 5 partenaires en Picardie et en Pays de la Loire : la PME
GGF (coordinateur) leader des produits sans gluten, la PME ABCD Nutrition fabricant des
produits bio et des compléments alimentaires, Biofortis (Mérieux), ainsi que les partenaires
académiques Lasalle Beauvais et l’INRA BIA. Dans ce cadre, je participe depuis mars 2014
au co-encadrement de la thèse de Maxime Perot dirigée par Pascale Gadonna enseignante
chercheur à l'Institut Polytechnique Lasalle Beauvais. Elle a pour titre : « mise en place et
validation d’une stratégie nutritionnelle visant à réduire le développement d’allergies
alimentaires ». Cette thèse se déroule dans le cadre du projet FUI ProtAlSafe. Elle est
financée en tant que bourse CIFRE auprès de l’industriel GGF.
2. Approche clinique :
Nous avons répondu en octobre 2013 à l’appel d’offre ANR autour du Défi « Santé et bienêtre », axe 2 : Améliorer la Santé par la médecine personnalisée, le diagnostic, la prévention et
la thérapie, les stratégies palliatives, en concevant le vivant dans son environnement (sous axe
16 : recherche translationnelle en santé). Le projet est dénommé API-CUP (Atopic Prevention
In Children Using Prebiotics), il vise à améliorer la santé par l'élaboration de stratégies visant
à prévenir des allergies par les prébiotiques. Deux étapes sont définies. Dans un premier
temps, des modèles animaux sont utilisés pour comparer l'efficacité et explorer les effets
mécanistiques des prébiotiques. Dans un second temps, une étude clinique est menée pour
confirmer les effets des prébiotiques chez les enfants notamment la prévention de la dermatite
atopique. Ce projet est réalisé en collaboration avec le service de Pédiatrie du CHU de Nantes
(Hugues Piloquet : coordinateur du projet), l’UMR INRA 1280 Phan de Nantes (Martine
Champ), l’UMR INRA 1319 Micalis de Jouy-en-Josas (équipe ProbiHôte, Claire Cherbuy),
l’Inserm UMR 1087/ institut du thorax, IRT de Nantes (Magnan Antoine), l’INSERM U 913/
CHU de Nantes (Michel Neunlist) et deux industriels : la Laiterie de Montaigu et Glycom. En
mars 2014, nous avons appris que la lettre d’intention n’avait pas été selectionnée. Nous
souhaitons représenter ce projet l’année prochaine à l’ANR et à la région Pays de la Loire
(projets collaboratifs).
77
Pour renforcer mon expérience professionnelle et développer une recherche translationnelle
avec des études cliniques, j’ai entrepris de réaliser en 2016 une mission de recherche de
longue durée (1an) au sein de l’équipe du professeur Susan Prescott, pédiatre en allergie et
immunologiste, de l’université de l’ouest de l’Australie (Perth). Cette mission basée sur
l’usage des prebiotiques dans l’allergie alimentaire aura pour objectif de suivre les cliniciens
au cours des protocoles cliniques et de leur apporter ma vision de chercheur fondamentaliste,
mon expérience en immunologie et en biologie cellulaire pour consolider leur projet de
recherche et poser de nouvelles questions de recherche. Pour financer cette mission à
l’étranger, je vais demander une bourse individuelle Marie Curie (Horizon 2020, Global
Fellowships : GFs, appel d’offre de 2014 et de 2015 en fonction du résultat).
III. Conclusion sur le projet de recherche original
Ce projet de recherche est construit à partir de deux axes de recherche très
complémentaires. En effet l’axe 1 basé sur la compréhension des mécanismes précoces et
l’identification des bio-marqueurs impliqués dans la réaction d’allergie alimentaire va
permettre d’établir quels sont les acteurs et les événements clés de la pathologie qu’il faut
cibler pour ensuite améliorer le diagnostic, le traitement et la prévention. L’axe 1 va donc
permettre d’apporter de nombreuses connaissances pour la réalisation de l’axe 2 visant à
élaborer des stratégies nutritionnelles pour réduire ou prévenir les allergies alimentaires. Cette
démarche scientifique qui allie à la fois la recherche fondamentale basée sur la mécanistique
et la recherche appliquée à la santé est à ce jour et restera toujours le mode de raisonnement
que je souhaite apporter à mes recherches. Il est pour moi indispensable et permet de donner
un sens concret à mes travaux. De plus, ma mission en Australie avec le Dr Susan Prescott va
me permettre d’apprécier l’apport de la recherche fondamentale dans la clinique notamment
dans le domaine de la prévention de l’allergie.
78
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ACTIVITES D’ENCADREMENT
93
Responsabilités d’encadrement et collaborations lors de mon parcours à l’INSERM
U463 de 1998 à 2003 :
Au cours de mon expérience de doctorat et de chercheur hospitalier à l’INSERUM U463 de
Nantes, j’ai pu transférer mes compétences techniques (production des tétramères) et
scientifiques à différents étudiants en master et en thèse mais aussi à des chercheurs de
l’unité. J’ai établi des collaborations avec des équipes INSERM de mon laboratoire
spécialisées en virologie et en cancérologie (équipes des professeurs E. Houssaint et F.
Jotereau), avec une équipe INSERM de Strasbourg (Unité 1110, Dr E. Robinet) travaillant sur
« les interactions virus-hôte et les maladies hépatiques » et avec la société Immunotech
(France).
Responsabilités d’encadrement et collaborations lors de ma carrière de chercheur à
l’INRA de 2003 à maintenant:
Pour bien visualiser dans quels projets scientifiques les activités d’encadrement ont été
effectuées vous pouvez vous réferer au tableau 3 : synthèse de la participation aux projets.
Au cours de ma carrière de chercheur à l’INRA, j’ai notamment été le responsable
scientifique de la thèse de Pascal Gourbeyre (bourse ministérielle, 2009-2011). Ce travail a
permis d’obtenir des résultats marquants sur l’impact d’un allergène de blé modifié par un
traitement sur les mécanismes de l’allergie (Action 2, (221)) et sur l’utilisation de
prébiotiques pour prévenir des allergies (Action 5, (255, 256 , 257)). Il a donné lieu à quatre
articles scientifiques (221, 255, 256, 257) et à une revue (166). Il a été réalisé dans le cadre du
projet régional NUPEM (2007-2011, effet des prébiotiques sur le risque allergique) en
collaboration avec les chercheurs de l’UMR 1280 INRA Phan de Nantes (M. Champ, C.
Michel, D. Darmaun). Je suis désormais responsable du co-encadrement de deux autres
thèses : celle de Mathilde Claude (bourse ministérielle, octobre 2013 à 2016) sur « l’étude de
l’agrégation protéique et modulation du pouvoir sensibilisant et déclenchant des allergènes
alimentaires » et celle de Maxime Perot (bourse CIFRE, mars 2014 à 2017) sur « la mise en
place et validation d’une stratégie nutritionnelle visant à réduire le développement d’allergies
alimentaires ». Cette dernière s’effectue dans le cadre du projet FUI ProtAlSafe avec
l’industriel
F.
J’ai aussi encadré quatre chercheurs post-doctorants. Le travail de Michaël Leroy (bourse
INRA, 2007) a permis de mettre en place les modèles souris d’allergie alimentaire (action 2)
et a donné lieu à deux publications (121, 219). Il est désormais vétérinaire en Belgique
(Comines). Nicolas Desbuards (bourse régionale NUPEM, 2010) a participé aux travaux sur
les prébiotiques dans le cadre du projet NUPEM (Action 5, 3 articles : (255, 256 , 257)). Il
travaille actuellement dans la gendarmerie scientifique à Orléans. Pascal Gourbeyre, suite à
son doctorat, a été recruté pendant un an (2012, bourse régionale REAL2) sur le projet
régional REAL2 (2011-2014) pour étudier les mécanismes de la marche atopique (action 4).
Ce travail a été réalisé en collaboration avec A Magnan (coordinateur de REAL2, INSERM
UMR1087, CNRS UMR 6291, IRT de Nantes) pour le développement des modèles animaux
d’allergies croisées et avec M. Neunlist (INSERM UMR 913, CHU de Nantes) pour l’étude
94
de la physiologie intestinale. Ce travail a donné lieu à une publication (soumise). Pascal
Gourbeyre est désormais chercheur post-doctorant jusqu’en 2016 à l’unité INRA de
Toxicologie Alimentaire (ToxAlim) de Toulouse. Grégory Bouchaud, recruté pour un an
(2013) sur le projet régional REAL2, a continué le travail initié par Pascal Gourbeyre sur la
marche atopique (action 4, 1 publication soumise) et a participé à l’étude sur les prébiotiques
(action 5, article en cours d’écriture) financée par un contrat avec l’industriel « la laiterie de
Montaigu ». Grégory Bouchaud est désormais recruté en tant que chercheur post-doctorant
dans notre équipe pour deux ans et demi suite à l’obtention de deux bourses que je coordonne
(AgreenSkills de janvier à juin 2014 et une bourse européenne IEF Marie Curie de juillet
2014 à juillet 2016).
J’ai formé huit étudiants en Master et un en Licence Professionnelle. Ces stagiaires ont
participé aux travaux de recherche sur les mécanismes de la réaction allergique et la
prévention des allergies par les prébiotiques.
Pour le développement de mes travaux de recherche, j’ai donc établi des collaborations
étroites avec des chercheurs Nantais de l’INRA (UMR Phan : M. Champ, projet NUPEM) et
de l’INSERM (INSERM UMR1087 : A. Magnan, INSERM UMR 913 : M. Neunlist). Ces
interactions demeurent très importantes pour le développement de mes futurs projets. J’ai
aussi collaboré avec d’autres équipes de recherche de Paris (unité INRA UIAA : K. AdelPatient ; INSERM Bichat : U. Blank), de Rennes (unité INRA STLO : F. Nau, projet
Ovonutrial) et des cliniciens (allergologues, gastroentérologues). Mes compétences sur les
prébiotiques m’ont conduit à participer au projet européen Fibebiotics qui me permet
désormais d’élargir mon réseau de collaboration à l’échelle de l’Europe (Université de
Wageningen : J. Wells; laboratoire « Food and Biobased Research » de Wageningen : H
Wichers). Ce travail a aussi permis de développer une nouvelle collaboration avec l’équipe
INSERM de Nantes de M. Grégoire (UMR 892) spécialisée sur la cellule dendritique.
Liste des étudiants encadrés (se référer au tableau 3 pages 97-98 pour les projets
scientifiques):
I. Post-doctorats
2013: G. Bouchaud dans le cadre :
- du projet régional REAL2 : étude mécanistique de la marche atopique.
- du contrat avec l’industriel « la laiterie de Montaigue » : utilisation des prébiotiques en
périnatal comme stratégie de prévention des allergies alimentaires.
Encadrement à 100% (1 article soumis).
2012 : P. Gourbeyre dans le cadre du projet régional REAL2. Etude des mécanismes de la
marche atopique à l’aide modèles animaux d’allergies. Encadrement à 100% (1 article
soumis).
2010 : N. Desbuards dans le cadre du projet régional NUPEM : utilisation des prébiotiques
comme stratégie de prévention des allergies. Encadrement à 100% (3 articles).
2007 : Michaël Leroy financé par une bourse INRA de post-doctorat pour chercheurs
étrangers. Contribution à la mise en place des modèles animaux d’allergie alimentaire.
Encadrement à 100% (2 articles).
95
II. Thèse
Mars 2014 à maintenant : Maxime Perot, bourse CIFRE avec l’industriel GGF. Titre :
« Mise en place et validation d’une stratégie nutritionnelle visant à réduire le développement
d’allergies alimentaires ». Co-encadrement avec des enseignants chercheurs de l'Institut
Polytechnique Lasalle Beauvais Pascale Gadonna (directeur de thèse) et Carine Delayre. Dans
le cadre du projet ProtAlSafe accepté à l’appel d’offre des Fonds unique interministériel
(FUI) de soutien aux projets de R&D. Porteur : GGF. Encadrement à 33%.
Octobre 2013 à maintenant : Mathilde Claude, bourse ministérielle. Titre : « Etude de
l’agrégation protéique et modulation du pouvoir sensibilisant et déclenchant des allergènes
alimentaires ». Co-encadrement avec C. Brossard et S. Denery (directeur de thèse).
Université de Nantes, Ecole doctorale VENAM. Encadrement à 20%.
2009-2011: Pascal Gourbeyre, bourse ministérielle. Titre : « Etude de l’effet d’un mélange
d’oligosaccharides prébiotiques sur le système immunitaire, la barrière intestinale et la
prévention d’une allergie, au moyen d’un modèle souris d’allergie au blé ». Université de
Nantes, Ecole doctorale VENAM. Responsable scientifique et encadrement avec S. Denery
(directeur de thèse). Encadrement à 80% (5 articles).
III. Masters
A. Master II en ‘Science de l’Aliment et Nutrition humaine (SANH). UFR des
Sciences et des Techniques de Nantes: Encadrement à 100%.
2014 : Laure Castan. Etude de la prévention des allergies alimentaires par les prébiotiques.
Mémoires de Master et de fin d’étude d’école d’ingénieur ENITIAA- Nantes.
2013 : Fatmé Mteirek. Etude des mécanismes précoces mis en jeu au cours du développement
de l’allergie alimentaire au blé.
2008 : Clémence Roux. Impact des prébiotiques sur la réponse allergique à une protéine
animale, l’ovalbumine, chez la souris. Mémoires de Master et de fin d’étude d’école
d’ingénieur ENITIAA- Nantes.
B. Master II INAPG- ENSIA Science des Aliments, Massy, Paris : Encadrement à
100%.
2006 : Aurélie Mauray (Option : Aliment et bio-produits - Nutrition et santé). Etude de la
réactivité des IgE de patients à un allergène de blé (5 gliadines) à l’aide d’un modèle de
dégranulation mastocytaire (1 article).
2004 : Virginie Dubois (Option : Sécurité Alimentaire - Nutrition et Santé). Etude de l’effet
des protéines de blé sur la perméabilité intestinale (1article).
C. Master II BBRT (Biologie, Biotechnologies et Recherche Thérapeutique), UFR de
Nantes: Encadrement à 50%.
2012 : Tiphaine Roussey. Caractérisation d’un nouveau modèle d’allergie alimentaire et
respiratoire chez la souris. Projet REAL2 en coordination avec A. Magnan (1 article soumis).
96
D. Master II ENSA, Biologie Production animale et Qualité, UFR de Rennes :
Encadrement à 100%.
2005 : Marouan Dali. Mise au point d’un dosage quantitatif des IgE totales et spécifiques de
sérums humains.
E. Master I en « Biologie cellulaire, spécialité physiologie animale », UFR de
Rennes: Encadrement à 100%.
2008 : Nawel Tabti. Impact des prébiotiques sur la réponse allergique à une protéine animale,
l’ovalbumine, chez la souris.
IV. Licence professionnelle : Encadrement à 100%.
2007 : Valérie Echasserieau. Choix d’une lignée cellulaire de basophiles de rat humanisés.
Licence professionnelle de ‘Biotechnologie en santé et Alimentation’. UFR des Sciences
et des Techniques de Nantes.
Tableau 3 : Tableau de synthèse de la particpation de M. Bodinier aux différents projets de
recherche
Titre projet
IGIFA :
Bourse
européenne
IEF MarieCurie
Durée
Juillet
2014 à
Juillet
2016 :
2 ans
Objectif
Comprendre l’impact
des procédés industriels
sur le développement de
la réaction immune au
cours de l’allergie
alimentaire
Participation
Supervision du bon
déroulement de la
bourse
Coordination
Equipe
Allergie UR
1268 BIA
INRA, Nantes
- Marie
Bodinier
IGIFA :
Bourse
AgreenSkills
Janvier à
juin
2014 :
6mois
Définir les marqueurs et
les mécanismes
allergiques
induits lors de
l’initiation de l’allergie
Supervision du bon
déroulement de la
bourse
ProtAlSafe
Avril
2014Avril
2017 :
3 ans
Mettre au point une
nouvelle offre de
produits alimentaires
pour permettre
d’améliorer les
conditions de vie des
malades cœliaques et
des allergiques
alimentaires au blé
Participation lot 4 :
Validation de
l’efficacité des
produits chez
l’animal et chez
l’Homme et étude
des mécanismes
d’action chez
l’animal
Equipe
Allergie UR
1268 BIA
INRA, Nantes
- Marie
Bodinier
Industriel GGF
(Guaranteed
Gluten Free)
Contrat
recherche
avec la
laiterie de
Montaigu
2013 et
2015 :
2 ans
Etudier
l’effet de la période
d’exposition (périnatale
et post-sevrage) aux
prébiotiques sur la
prévention de l’allergie
alimentaire chez la
souris
Supervise les
recherches, les
relations avec
l’industriel et les
finances
Equipe
Allergie UR
1268 BIA
INRA, Nantes
- Marie
Bodinier
Financeur
Europe - Marie
Curie IntraEuropean
Fellowships
for Career
Development
(IEF)
Programme
coordonné par
l’INRA et
Agreenium cofinancés par
l’Europe, FP7
Fonds uniques
interministériels
de soutien aux
projets de R&D
Industriel
« Laiterie de
Montaigu »
97
Titre projet
Fibebiotics
Durée
2011
à 2016 :
4 ans et
demi
Objectif
Encourager le
développement
d’ingrédients
fonctionnels bénéfiques
pour le système
immunitaire intestinal
améliorer la
compréhension des
mécanismes de marche
atopique et élaborer des
stratégies de
prévention/traitement
des allergies
Participation
Participation lot 3 :
effet des fibres sur
le système
immunitaire
Coordination
J. Mees, UR
Wageningen,
Pays Bas
Financeur
Projet Européen
FP7-KBBE2011,
collaborative
project
REAL2
20112014 :
3ans
Responsable Axe
1 : Etudes
précliniques
Inserm UMR
1087/ institut
du thorax, IRT
de NantesAntoine
Magnan
Région Pays de
La Loire : Volet
« Emergence
collective »
Predexpitope
20092012 :
3 ans
Prédiction in-silico des
épitopes, des allergènes
et validation
expérimentale sur le blé
Responsable lot 5 :
potentiel de
sensibilisation des
allergènes et
épitopes
ANR-PRA
Ovonutrial
20082011 :
3 ans
Impact des procédés
technologiques sur la
valeur nutritionnelle et
allergénicité des
protéines d’œuf
Participation tâche
3.3 : Impact des
procédés
alimentaires sur la
digestibilité des
protéines d’œuf :
translocation
intestinale des
protéines d’œuf
Equipe
Allergie UR
1268 BIA
INRA, Nantes
- Sandra
Denery
STLO-INRA
de RennesFrançoise Nau
NUPEM
20072011 :
4 ans
Comprendre l’impact
de plusieurs
constituants des
aliments, sur le
nourrisson et le futur
adulte
Responsable axe 2 :
« Effets de la
supplémentation en
prébiotiques chez le
nouveau-né
sur le risque
allergique
alimentaire »
GIP CRNH,
Unité Phan
INRA, Nantes,
Martine
CHAMP
ANR - PNRA
Région Pays de
La Loire : Volet
« Emergence
collective »
98
ANNEXES
99
Annexe 1
100
Annexe 2
Liste des 5 publications représentatives de mes activités
1/ M. Bodinier, M.A. Legoux, F. Pineau, S.Triballeau, J.P Segain, C. Brossard and S.DeneryPapini. Intestinal Translocation Capabilities of Wheat Allergens Using the Caco-2 Cell Line.
2007. J. Agric. Food Chem, 55, 4576-4583.
2/ M. Bodinier, M. Leroy, S. Ah-Leung, F. Blanc, O. Tranquet, S. Denery-Papini, J.-M. Wal,
and K. Adel-Patient. Sensitization and elicitation of an allergic reaction to wheat gliadins in
mice. 2009. J Agric Food Chem, 57(4), 1219-25.
3/ P. Gourbeyre, S. Denery, C. Larré, J.C. Gaudin, C. Brossard and M. Bodinier. Wheat
gliadins modified by deamidation are more efficient than native gliadins in inducing a Th2
response in Balb/c mice experimentally sensitized to wheat allergens”, 2012. Molecular
Nutrition and Food Research, 56(2), 336-344.
4/ P. ourbeyre, N. Desbuards, . rémy, S. Le all, M. Champ,S. Denery-Papini, and M.
Bodinier. Exposure to a Galactooligosaccharides/Inulin Prebiotic Mix at Different
Developmental Time Points Differentially Modulates Immune Responses in Mice. 2012. J.
Agric. Food Chem., 60, 11942−11951.
5/ P; Gourbeyre, N. Desbuards, G. Grémy, O. Tranquet, M. Champ, S. Denery-Papini and M.
Bodinier. Perinatal and Postweaning Exposure to Galactooligosaccharides/Inulin Prebiotics
induced Biomarkers linked to Tolerance Mechanism in a Mouse Model of strong Allergic
sensitisation. 2013. J. Agric. Food Chem., 61 (26), 6311–6320.
101