Spectrophotomètre : Principe de fonctionnement et applications

CAMARA ABDOULAYE
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SPECTROPHOTOMETRE
C’est quoi un spectrophotomètre
Un spectrophotomètre est un appareil de laboratoire qui utilise la lumière pour analyser un
échantillon. Il mesure la quantité de lumière absorbée ou transmise par une substance afin de
déterminer sa concentration ou certaines de ses propriétés. Dans les laboratoires de biologie
médicale, il est utilisé dans de nombreux automates de biochimie pour réaliser des analyses
fiables, comme le dosage du glucose, de la créatinine ou du cholestérol et il est également utilisé
dans d’autre domaine comme l’industrie pharmaceutique, l’industrie agroalimentaire,
l’environnement et du recherche scientifique.
I. Principe de fonctionnement
Le fonctionnement d'un spectrophotomètre peut être divisé en 8 étapes principales.
1. La source de lumière (Source polychromatique)
La lampe produit une lumière contenant plusieurs couleurs (plusieurs longueurs d'onde). On
appelle cela une lumière polychromatique.
Le rôle de la lampe ici est de produire une lumière suffisamment intense qui servira à analyser
l'échantillon.
Exemples de lampes : Lampe au tungstène (lumière visible), Lampe au deutérium (ultraviolet)
2. Le monochromateur
La lumière provenant de la lampe contient beaucoup de couleurs. Le monochromateur agit
comme un filtre très précis, il sélectionne une seule longueur d'onde, c'est-à-dire une seule
couleur de lumière, adaptée à l'analyse.
Son rôle est de séparer la lumière et ne laisser passer qu'une seule longueur d'onde.
3. Le diaphragme
Après le monochromateur, la lumière passe dans le diaphragme. Le diaphragme est une petite
ouverture qui contrôle le faisceau lumineux.

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Il permet :
• D’obtenir un faisceau bien droit ;
• D’éviter que la lumière se disperse ;
• D’améliorer la précision de la mesure.
À ce niveau, l'intensité de la lumière est appelée : I₀ (I zéro) c'est la lumière incidente, c'est-à-
dire la quantité de lumière avant qu'elle ne traverse l'échantillon.
Le rôle du diaphragme est de contrôler et diriger le faisceau lumineux vers la cuve.
4. La cuve contenant l'échantillon
La lumière arrive ensuite dans la cuve. La cuve est un petit récipient transparent qui contient
l'échantillon à analyser.
Lorsque la lumière traverse l'échantillon :
• Une partie de la lumière est absorbée par les molécules ;
• Une autre partie continue son chemin.
Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe de lumière.
Son rôle :
Permettre à la lumière de traverser l'échantillon.
5. La lumière transmise
Après avoir traversé l'échantillon, il reste une quantité de lumière. Cette lumière est appelée : I
C'est la lumière transmise. Elle est toujours plus faible que I₀, car une partie de la lumière a été
absorbée.
On a donc : I < I₀
Plus l'échantillon absorbe la lumière, plus I sera faible. La lumière transmise représenter la
lumière qui sort de l'échantillon.

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6. La cellule photoélectrique (Détecteur)
La lumière transmise arrive ensuite sur la cellule photoélectrique. Cette cellule est un capteur
de lumière, elle transforme la lumière reçue en un signal électrique. Plus elle reçoit de lumière,
plus le signal électrique est important et moins elle reçoit de lumière, plus le signal est faible.
Elle a pour rôle de transformer la lumière en signal électrique.
7. L'afficheur
Enfin, le signal amplifié est envoyé vers l'afficheur. L'appareil calcule automatiquement :
• L’absorbance (A) ;
• Ou la transmittance (%T) ;
• Ou parfois directement la concentration, selon le modèle.
Dans notre schéma, l'écran affiche : 0,024 A. Le "A" signifie Absorbance, Cela indique que
l'échantillon absorbe une faible quantité de lumière.
L’afficheur Afficher le résultat de la mesure.
Interprétation physique du schéma
• I₀ représente la quantité de lumière envoyée vers l'échantillon.
• L'échantillon absorbe une partie de cette lumière.
• I représente la lumière qui ressort de la cuve.

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• Le spectrophotomètre compare I à I₀.
• À partir de cette comparaison, il calcule l'absorbance selon la loi de Beer-Lambert :
𝐴 = log10 (𝐼0
𝐼)
Loi de Beer-Lambert :
Lorsqu'un faisceau de lumière monochromatique traverse une solution, l'absorbance de cette
solution est directement proportionnelle à la concentration de la substance absorbante et à
l'épaisseur de la solution traversée par la lumière.
Autrement dit plus la concentration d'une substance dans une solution est élevée, plus cette
solution absorbe la lumière.
NB : C'est sur cette loi que repose le fonctionnement du spectrophotomètre : l'appareil mesure
l'absorbance d'un échantillon, puis utilise la loi de Beer-Lambert pour déterminer la
concentration de la substance analysée.
II. Les différentes parties
1. La source lumineuse : produit une lumière stable et intense
2. Le système optique
Il dirige et sélectionne la lumière.
Il comprend généralement :
• Une fente d'entrée ;
• Des lentilles ;
• Des miroirs ;
• Un collimateur (pour rendre le faisceau parallèle) ;
• Un monochromateur.
Le monochromateur est constitué de :
• Un prisme ou un réseau de diffraction ;
• Une fente de sortie.
A=ε×l×C

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•
3. Le compartiment échantillon
Il reçoit la cuvette contenant la solution à analyser.
Il comprend :
• Le porte-cuvette ;
• La cuvette (en verre pour le visible ou en quartz pour l'UV).
Le rôle de la cuvette est de permettre au faisceau lumineux de traverser l'échantillon.
4. Le détecteur
Après la traversée de l'échantillon, la lumière est mesurée par un détecteur et convertir l'énergie
lumineuse en signal électrique.
5. Le système électronique
Il traite le signal fourni par le détecteur et calculer l'absorbance, la transmittance ou la
concentration de l'échantillon.
Il comprend :
• Un amplificateur ;
• Un convertisseur analogique-numérique (CAN) ;
• Un microprocesseur.
6. Système d'affichage
Il permet de visualiser les résultats
L'alimentation électrique
Elle fournit l'énergie nécessaire au fonctionnement de tous les composants
III. Les interventions réaliser sur le spectrophotomètre
1. Maintenance préventive
L'objectif est de prévenir les pannes et de maintenir les performances de l'appareil.
Elle comprend :