Écologie microbienne du lait et des fromages. Delphine Cuvillier Centre Fromager de Bourgogne
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Écologie microbienne du lait et des fromages Delphine Cuvillier Centre Fromager de Bourgogne Le fromage LE LAIT + de la présure + des ferments = De nombreuses possibilités Importance des microorganismes présents au départ dans le lait sur l ’acidification, le goût, la texture Plan du cours • Généralités sur la microbiologie du lait et des fromages • Origine des flores du lait • Les différents types de flores Introduction • Lait cru = lait n ’ayant pas été chauffé à T °>40°C • Les microorganismes sont présents partout : – 10 000 milliards dans le gros intestin humain!! – Dans le pain (saccharomyces) – Dans la bière (saccharomyces cerevisiae) – Dans la terre, les végétaux… Introduction Les microorganismes sont présents partout : LA PREUVE ? • – – – Laissez un fromage frais type « St Moret » ouvert dans votre cuisine, et observez au bout de quelques jours . Vous verrez se développer des levures et de moisissures à la surface Ces microorganismes viennent de l’air que vous respirez ! Pourquoi s’intéresser à la flore bactériologique du lait ? • Un enjeu pour les produits fermiers : – Flore spécifique utile pour la technologie – Diversité et quantité de flores : typicité des produits Problème de sécurité alimentaire : Historique : Loi Godefroy qui impose de compter les germes totaux (= en simple, « tout ce qui pousse » à 30°C) Aujourd’hui : les germes pathogènes sont réglementés par le Paquet Hygiène (réglementation en vigueur) Qui sont les microorganismes? Organismes vivants, de taille restreinte, dont l’observation nécessite une loupe binoculaire ou le plus souvent, un microscope Ils sont présents partout et sont la plupart du temps indispensables Les Les Les Les bactéries (et les spores) : 0,3 à 10 microns levures : 10 microns 1 micron = 1 millième de moisissures :100 microns milimètre virus des bactéries (bactériophages) : 100 fois plus petits que les bactéries Définitions • Bactérie : microorganisme constitué d ’une seule cellule de 0,3 à 10 microns se reproduisant par scissiparité (division en 2) • Levure : microorganisme se reproduisant par bourgeonnement (~10μm) • Moisissure : champignon inférieur, caractérisé par une structure mycélienne, se reproduisant par sporulation (~100 μm) La reproduction des moisissures Exemple du Mucor (responsable de l’accident du poil de chat) Sédimentation Dissémination par : air, eau, matériel Germination (formation des filaments = mycelium) Bourgeons remplis de Mûrissement et éclatement des spores bourgeons remplis de spores La reproduction des levures • Champignons unicellulaires • Se multiplient par bourgeonnement Source : http://cgdc3.igmors.u-psud.fr/genetique/intr_06.htm http://www.ujf-grenoble.fr/JAL/Choler/BDE/diri/champi_fichiers/slide0023_image115.gif La croissance d’une population bactérienne 1 cellule mère = 2 cellules filles ... ... ... 1 bact. E.coli à 37°C 2 bact. 17 min. ... 4 bact. 34 min. 2.4 millions de bact. en 6 h !!! Croissance bactérienne Nombre de bactéries (logarithme) La bactérie s ’habitue au milieu 1 Les bactéries se multiplient et consomment les nutriments 2 3 Les bactéries se multiplient et consomment les nutriments, et rejettent des déchets dans le milieu 4 Moins de nutriments, plus de déchets... 1 : phase de latence 2 : phase de croissance exponentielle 3 : phase stationnaire 4 : phase de déclin Croissance des bactéries Substances nutritives pH Eau Fer, manganèse… etc Oxygène Température Interactions entre facteurs Influence de la teneur en oxygène du produit Micro-aérophile Qui a besoin d’oxygène mais en faible concentration Absence Faible Normale Anaérobie strict Aérobie strict Ne se multiplie qu’en absence d’oxygène Qui ne se multiplie qu’en présence d’oxygène Ex : moisissures, Pseudomonas Aéro-anaérobie ou aérobie facultatif : peut se multiplier quelles que soient les conditions d’oxygénation L’ambiance de la cave d’affinage est donc importante : il faut maintenir une bonne aération Influence du pH sur la croissance des bactéries Milieu de + en + ACIDE NEUTRALITE Pâtes pressées 0 4,2 Lactique 5 6,6 6,7 7 10 Lait Pâtes molles affinées Acidophile : qui se développe bien en milieu acide (pH de 4,4 à 5,2) Milieu de + en + BASIQUE 14 soude Alcalinophile : qui se développe bien en milieu basique (pH de 9,2 à 10) Influence du pH sur la croissance des bactéries (suite) En vert les bactéries potentiellement pathogènes Microorganismes Minimum pH Optimum Maximum Staphylocoques 4 6,8 à 7,5 9,8 Salmonella 4,5 6 à 7,5 8à9 Levures 2 à 2,5 4 à 6,5 8 à 10 Moisissures 1,5 à 2 4à7 9 à 11 Bactéries lactiques E. coli 3 5,5 8 4,3 6à8 9 à 10 Pâte lactique Caillé doux Les bactéries potentiellement pathogènes sont sensibles au pH acides. D’où l’intérêt d’acidifier rapidement le lait Influence de la teneur en sel Salage en fromagerie au sel sec : en général de 1 à 1,5% En saumure : bain de sel avec une concentration allant de 18 à 28% Rôles du salage : - Complément d’égouttage - oriente et freine le développement de microorganismes indésirables - Exhausteur de goût Application : en techno lactique une concentration en sel à 2% va favoriser la croissance des moisissures et des levures, au détriment de G. candidum sensible au sel. On risque d’avoir une implantation de P. roqueforti (bleu). Microorganisme halophile : qui est capable de se développer à des concentrations en sel> 3,5% (ex. P. roqueforti) Influence de l’eau • Aw = activité de l’eau; représente l’eau « libre », disponible pour les microorganismes aw = Humidité Relative/100 Varie entre 0 et 1 • intervalles de développement – Moisissures : entre 0,6 et 0,8 – Levures : entre 0,7 et 0,9 – Bactéries : 0,9 à 1 • Actions tendant à baisser l’aw : salage, pressage, séchage Exemple de S. aureus : quand aw de 1 à 0,9, vitesse de croissance de 10% Un fromage frais sera plus sensible aux contaminations qu’un fromage affiné, et plus encore qu’une pâte pressée cuite. Température et croissance Température (°C) 60 40 Mésophiles 20 8-12 Frigos, tank chambre froide 0 Bactéries lactiques (yaourt) Thermophiles 0 Bactéries lactiques du lait, levures, moisissures Psychrotrophes Psychrophiles P. Fluorescens L. Monocytogenes Certains coliformes Température et croissance taux de croissance mésophiles psychrophiles thermophiles Les 4 pathogènes Leuconostocs Listeria monocytogenes es h p ro les t so phi é m mo er h t es h p ro t ro es h y c hi l p s op és m 0 7 10 Streptococcus thermophilus 20 30 40 50 55 60 Application : importance de la T° dans la conservation du lait Au dessus de 12°C : bonnes et mauvaises bactéries se développent très vite Entre 8 et 10°C : bonnes et mauvaises bactéries se développent lentement Entre 4 et 8°C : seules les mauvaises bactéries se développent En dessous de 4°C : les mauvaises bactéries se développent très lentement et la structure chimique du lait se déstabilise Évolution de la flore totale du lait en fonction de la température et du temps écoulé après la traite Plan du cours • Généralités sur la microbiologie du lait et des fromages • Origine des flores du lait • Les différents types de flores Origines des flores du lait Animaux excréteurs Contamination mains, air, ustensile… Infections mammaires Environnement : fourrages, paille, fèces, litière, terre… Contamination des mains, lavettes, vêtements, murs et sol du lieu de traite… Contamination de l’air Multiplication de la flore Origines des flores du lait •Dans la mamelle, le lait est quasiment stérile (sauf mammite...) • principalement de microcoques, corynébactéries et de bactéries lactiques (comprise entre 100 et 1 000 germes / ml) si l’animal est en bonne santé Origines des flores du lait • Canal du trayon : stérile en l’absence d’infection, le canal du trayon peut être à l’origine de 50 à 100 000 germes / ml suite à une infection mammaire ou une contamination durant la traite. Les principaux germes incriminés sont les coliformes, les streptocoques, les staphylocoques et les pseudomonas vérifier absence de fissures, boutons, … pouvant être signes d ’infection sur la mammelle élimination des 1ers jets de laitsurveillance et palpation Origines des flores du lait •L ’extérieur du trayon : mamelle sale : apport de flore mésophile banale, germes psychrotrophes, thermorésistants… plus problématique en vache qu ’en chèvre (fécès plus sec en chèvre) Origines des flores du lait • La Machine à traite : – concentré de flores donc déterminante de la qualité des laits – endroits difficiles au nettoyage – matériaux propices au logement de microorganismes – aspiration d ’air aérocontamination – formation de biofilms Qu ’est ce qu ’un biofilm ? • couche de micro-organismes, contenus dans une matrice solide, se formant sur des surfaces en contact avec de l'eau • spécifique du milieu dans lequel il se forme, et notamment du produit alimentaire associé à l’atelier ou au matériel • formation d’une couverture pouvant aller de 1 micron à plusieurs centimètres d’épaisseur, recouvrant totalement ou partiellement la surface du support • construction suit toujours le même schéma (voir diapo suivante) Qu ’est ce qu ’un biofilm ? Transport Adhésion Cellule planctonique Cellule adhérente Cellule+organite Consolidatio n Multiplication Agrégation/érosio n Flux du milieu (ex : lait) Matrice+cellule = biofilm Qu ’est ce qu ’un biofilm ? • systèmes biologiques dotés d’un haut niveau d’organisation, où les bactéries forment des communautés fonctionnelles, structurées et coordonnées. • Conséquences de leur présence : – résistance des micro-organismes aux procédures de nettoyage – contamination des laits pouvant multiplier par 1000 le nombre de germes Origines des flores du lait • Environnement : souillures macroscopiques (poils, excréments, particules, poussières,…) dans lesquelles nous pouvons retrouver l’ensemble des microorganismes de contamination (levures, moisissures, coliformes,…) ; Origines des flores du lait • L’eau : le réseau d’eau ou une source qui alimentent les installations de traite et la fromagerie peuvent également contaminer le lait en germes d’altération. Des modifications au niveau de la tuyauterie, de grandes sécheresses modifiant les nappes phréatiques peuvent apporter des germes comme les pseudomonas ou les coliformes. Origines des flores du lait • L’air : levures et moisissures sont présentes dans l’air de la salle de traite et de fabrication. On y retrouve aussi des bactéries. Si l’ambiance est humide et poussiéreuse, on augmente le nombre de ces microorganismes. Sachant qu’une machine à traire aspire 20 à 50 litres d’air par min, c’est un critère important à prendre en compte. éviter de nourrir les animaux pendant la traite, préférer une salle de traite séparée Origines des flores du lait • Conservation du lait : en cas d’absence de réfrigération (15 – 25°C), on observe un développement de la flore mésophile acidifiante (lactiques, coliformes,…). En cas de mauvaise réfrigération (vitesse trop lente ou température supérieure à 8°C), il y a un développement de la flore psychrotrophe et des coliformes. Origines des flores du lait flore totale = flore originelle + flore de contamination + développement de celles-ci. Importance relative des contaminations du lait (d ’après CHATELIN, 1973) Source de contamination Nombre relatif de bactéries Intérieur de la mamelle 1à5 Animal (mamelle surtout) Etable Matériel de traite manuelle Matériel de traite mécanique 20 à 200 1 à 10 50 à 500 1000 à 10 000 Plan du cours • Généralités sur la microbiologie du lait et des fromages • Origine des flores du lait • Les différents types de flores Les germes totaux • = Flore Mésophile Aérobie Revivifiable «Ensemble des bactéries mésophiles aérobies qui se développent à 30°C en 72 h sur milieu nutritif gélosé non spécifique» – permet de mesurer le niveau de contamination globale du lait – ne permet pas toujours d’évaluer les risques liés à certains groupes microbiens La flore bactériologique du lait Flore utile Flore d’altération • Flore acidifiante (lactique) • Flore psychrotrophe • Flore d’affinage • Flore thermorésistante • Flore coliforme Flore pathogène S. Aureus L. Monocytogenes E. Coli Salmonella Les flores utiles Pour la fabrication La flore acidifiante Caractéristiques : Lactobacilles, leuconostocs, lactocoques Acide lactique à partir du lactose Pas de croissance en dessous de 8-10°C Destruction par pasteurisation Eliminées par nettoyage efficace Ferments naturels Protection contre certains germes indésirables goût des fromages (protéolyse) et texture Origines : Végétaux (ensilages, graines…), animaux (peau, poils…) Effet du développement des bactéries lactiques sur le développement des flores indésirables Culture de ferments lactiques à 30°C Courbe C : croissance Courbe A : Acidification Courbe GP : déclin germes pathogènes => L’acidification joue un rôle protecteur contre les pathogènes Les différentes voies de fermentation du lactose par les bactéries lactiques HOMOLACTIQUE Lactose Acide lactique à 90% Homofermentaires : Streptocoques, entérocoques, lactocoques, certains lactobacilles, pédiocoques HETEROLACTIQUE Lactose CO2, éthanol et acide lactique Hétérofermentaires : leuconostocs et certains lactobacilles Les bactéries lactiques les plus courantes Bactéries Rôle Mésophiles Lactococcus lactis lactis acidifiant Lactococcus lactis cremoris acidifiant Lactococcus lactis aromatisant diacetylactis Leuconostocs lactis Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus acidophilus gazogène gazogène acidifiant Thermophiles Streptococcus thermophilus acidifiant Lactobacillus bulgaricus acidifiant Lactobacillus helveticus acidifiant Utilisation Lactique, PM, PP Lactique, PM, PP Lactique, PM, PP en mélange avec L. lactis lactis/cremoris Gouda, Pâte persillée Gouda, Pâte persillée Parfois pâte pressée, pâte persillée Yaourt, PP Yaourt Pâte pressée Quelles bactéries pour quelles applications ? MESOPHILES (T°optimale 20-30°C) Dans toutes les technologies où la T° de fabrication ne dépasse pas 34°C Lactique PM Certaines PPNC Choix des espèces Pouvoir acidifiant : mésophile homo acidifiant Pouvoir aromatisant : mésophile homo aromatisant Gazogène : mésophile hétéro (leuconostoc) Quelles bactéries pour quelles applications ? THERMOPHILES (T° optimale : 38-45°C) Systématique lorsque la T° du produit dépasse 38°C Conseillé lorsque la T° dépasse 36°C Si l’on souhaite une texture de pâte élastique Conduites à tenir pour un bon développement des thermophiles o Maintenir une T° des fromages en moule les 4 premières heures > 30°C o T° salle : 30°C o Acidification rapide les 4 premières heures d’égouttage : pH à 4h = 5,4-5,6 La flore d’affinage Levures et moisisures : • Origines : eau, poussières, sol… • Activités : consommation acide lactique, formation de composés d’arômes… Microcoques et corynébactéries o Origines : peau des hommes et animaux, eau, air sol… o Participation à la formation de la croûte et composés d’arômes Quelques microcoques et corynébactéries intervenant dans l’affinage des fromages Microcoques Bactéries corynéformes Corynebacterium Brevibacterium (B. linens) Microbacterium Arthrobacter Protéolyse, dégradation des acides aminés Protéolyse, dégradation des acides aminés, coloration de la pâte Quelques levures et moisissures intervenant dans l’affinage des Levures fromages Kluyveromyces Debaromyces Saccharomyces Production de composants d’arômes Moisissures Penicillium camemberti Geotrichum candidum Désacidification, protéolyse, lipolyse, production de composants d’arôme Protéolyse, lipolyse, production de composants d’arôme Certaines flores dites « utiles » peuvent être à l’origine d’altérations de la qualité des fromages • Les leuconostocs : la production de gaz par dégradation du lactose peut entraîner la formation de « bulles d’air » dans les caillés : gonflements précoces ou défaut des mille trous • Les levures : peuvent également produire du gaz ou des odeurs de défaut Flores qui participent à la fabrication des fromages LAIT Flore lactique, d’affinage, psychrotrophe (Pseudomonas) AFFINAGE Neutralisation du milieu par la flore acidophile et multiplication d’une autre flore d’affinage (microcoques, corynébactéries, entérocoques) COAGULATION EGOUTTAGE Multiplication de la flore lactique : acidification, inhibition des pathogènes RESSUYAGE DEBUT D’ AFFINAGE Multiplication des flores acidophiles : levures et moisissures Les flores d’altération Ces flores peuvent être à défauts de fabrication en mais ne présentent pas de les consomme l’origine de fromagerie risque si on Pseudomonas fluorescens : accident du fluo Les coliformes : gonflements précoces La flore psychrotrophe • Caractéristiques : – développement en dessous de 7° C – détruites par la thermisation – inhibées par pH acides (pH < 5.4) – production d’enzymes thermorésistantes lipolytiques et protéolytiques défauts de goût (rance, amer, piquant…) défauts de couleur (Pseudomonas fluorescens) diminution des rendements fromagers • Origines : – extérieur mamelle – eau – matériel de traite ou de stockage – défaut de réfrigération Essentiellement problème d ’hygiène La flore psychrotrophe • aptitude à se développer dans un intervalle de température très large. • dénombré de façon classique par ensemencement sur milieu gélosé après incubation de 10 jours à 7°C • bactéries sont les plus aptes à s'y développer et à y provoquer des altérations. • Les plus fréquemment rencontrées : Pseudomonas, notamment P. fluorescens. Mais aussi genres Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aeromonas, Enterobacter, Escherichia… et d'autre part souches bactériennes Gram + habituellement non psychrotrophes parmi lesquelles des Microcoques et des Streptocoques. La flore psychrotrophe Influence de la corrosion du matériel sur la contamination du lait Traitements N° Nombre de bactéries aérobies mésophiles par ml au ler mois au 12e mois Pot-broyeur lisse corrodé Pot-trayeur lisse corrodé 1 37.000 18.000 6.500 2 20.000 44.000 14.000 230.000 3 8.000 15.000 240.000 4 22.000 18.000 16.000 640.000 5 11.000 10.000 630.000 6 14.000 50.000 6.500 210.000 Moyenne 19.000 69.000 11.000 370.000 200.000 84.000 (D'après CHATELAIN et RICHARD, 1981) 250.000 La flore coliforme Caractéristiques : espèces de la famille des entérobactéries lactose acides + gaz moyennement acidifiantes développement freiné par pH < 4.5 détruites par pasteurisation gonflements précoces et mauvais goûts sur produits au lait cru ou thermisé peu sensibles aux résidus d’antibiotiques : importants gonflements et défauts d’acidification si présence Origines : zones encrassées du matériel de traite mamelle témoin d’un manque d’hygiène La flore coliforme On distingue : • Coliformes totaux : • Coliformes fécaux : – dont E coli – dans intestin de l ’homme, des animaux – origine : litière, mammites, eau de nettoyage, ou rarement Ne se développent pas à T<8°C matériel de fromagerie Ne résiste pas à pH faible Se multiplie très vite entre 30 et 40°C – germes saprophytes de l ’environnement – origine : principalement MAT ou stockage, rare en fromagerie Les butyriques : gonflements tardifs Apparition des gonflements après entrée des fromages en affinage Caractéristiques : résistent à la pasteurisation différentes classes selon sévérité du traitement pour les détruire : les plus thermorésistantes sont les bactéries sporulées (spores butyriques) butyriques persistance dans les produits après le traitement thermique altération du goût et de la texture Origines : eaux, sols, litières, fourrages,ensilages mamelles sales apportée au lait par des équipements de traite mal nettoyés Quelques moisissures pouvant être responsables d’altérations L’accident du poil de chat (ou MUCOR) Description : touffes gris clair, marron – noir poils longs ou courts Apparition possible dans les trois premiers jours de la fabrication Caractère invasif et brutal Souvent associé à des changements (climatiques, travaux…) L’accident du poil de chat (ou MUCOR) d’où viennent –ils ??? la terre comme toutes les autres moisissures les végétaux, fourrages moisis, poussières d’aliments Pourquoi les retrouvent – on dans la fromagerie ??? l’air transporte la contamination de l’extérieur vers l’intérieur dans la salle de fabrication, les mucors sont dans des conditions optimales (Température, Humidité) et ils se multiplient Les spores de Mucor se déposent sur les fromages L’accident du « bleu » Espèces responsables : P. expansum, P. roqueforti, P. janthinellum, P. viridicatum, P. brevi compactum et P. verrucosum. Origines : l’air et sur les équipements de fromageries, ensilage de maïs moisi Conditions de développement : optimum à 25°C,peuvent se développer sur des produits réfrigérés, un milieu légèrement acide (optimum 5 à 6) est favorable à la germination et à la croissance de la plupart des moisissures, besoin absolu d’oxygène pour se développer (P. roqueforti est moins exigent et peut se développer à 80% de CO2 et 4% d’O2) Les flores pathogènes Les bactéries pathogènes • Assez sensibles à l’acidité, inhibées par bactéries lactiques en transformation : – Salmonella spp – Listeria monocytogenes – Staphylococcus aureus – Escherichia coli – Brucella • Mais aussi : Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, certains streptocoques Les bactériophages • Virus des bactéries (parasites) • peuvent se multiplier dans leur hôte • se multiplient 1000 fois plus vite que les bactéries • spécifiques à un type de bactérie • très résistants • présents dans les laits, les ferments et le lactosérum (riche en bactéries lactiques) Lactosérum : Liquide libéré au cours de l'égouttage du caillé Les bactériophages conséquences sur transformation fromagère : • moins de bactéries lactiques donc acidification plus lente • mais diversité de flore lactique remèdes : • désinfection drastique de la MAT et du matériel de fromagerie (eau de javel) • évacuation rapide du lactosérum • changement de ferments Conclusion : quelques règles à respecter • Etat sanitaire du troupeau : – renouveler la litière – surveiller l ’apparition de mammites – voire éliminer les premiers jets • Entretien du matériel de traite et de stockage : – nettoyage du matériel et des locaux à chaque fin de traite – tank nettoyé après chaque utilisation – contrôler la MAT tous les ans minimum Conclusion : quelques règles à respecter • Paramètres de transformation – Acidifier le plus rapidement possible (pour éviter les pathogènes) dans la mesure du possible – Maitrise des différentes températures indispensable Conclusion : quelques règles à respecter • Stockage du lait : – refroidir à 4°C si utilisé plus de 2h après la traite – ou maturation longue (1% de ferments lactiques à 10°C pendant 12 h • Qualité bactériologique de l ’eau : – si réseau privé : faire analyser l ’eau 1 fois par an
