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BEB-1

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Introduction
Il existe dans la cellule 2 grands types de réactions biochimiques :
- les réactions de dégradation de la matière organique (catabolisme);
- les réactions de synthèse de la matière organique (anabolisme).
Ces réactions métaboliques se déroulent dans la cellule en présence d’un catalyseur biologique
(biocatalyseur) encore appelé enzyme. Les enzymes sont donc des composés biologiques de
nature protéique, doués d’activité catalytique et produites par la cellule vivante. Leurs
anciennes appellations sont les ferments ou les diastases. On écrira une réaction enzymatique de
la manière suivante:
Une enzyme fixe un substrat pour le transformer en produit. Ainsi, l'enzyme possède un
site actif formé de l'ensemble des acides aminés qui entrent en contact avec le substrat. Ce
site actif est formé de deux sites: le site de fixation du substrat et le site catalytique qui va agir
sur le substrat et lui faire subir la réaction chimique. Les acides aminés qui constituent le site
catalytique sont en général la sérine, la cystéine, l'histidine, la tyrosine et la lysine. Le site de
fixation du substrat et le site catalytique peuvent être confondus ou distincts. Certaines enzymes
sont en plus capables d'assurer la régulation des chaînes métaboliques. Cette faculté est due à
la présence d'un site régulateur (en plus du site actif) qui réagit avec des modulateurs qui viennent
d'ailleurs (allostérie). C'est le cas des enzymes allostériques.
Le rôle des enzymes est d’accélérer les vitesses des réactions biochimiques dans la
cellule. Un catalyseur est une substance qui, sans éprouver de transformation visible, et à faible
dose, modifie la cinétique d’une réaction chimique. Ainsi, la catalase catalyse la réaction de
transformation de l’eau oxygénée en une eau simple et en oxygène moléculaire:
H2O2 →H2O + ½ O2
Avec une concentration de H2O2 = 1 MOL/L, la vitesse de réaction est de 2,2.10 –13
mol/L/s sans catalyseur, de 5,4.10 –9 mol/L/s avec un catalyseur chimique (le platine colloïdal) et
de 4,5.10 –2 mol/L/s en présence de catalase.
Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, c’est-à-dire qu’elle catalyse toujours
la même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques initiaux. Les protéines
enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est déterminée génétiquement
2
: sa conservation dans le génome est favorisée par le besoin qu’éprouve cet être vivant de faire
cette réaction. Toutes les molécules qui entrent dans une réaction enzymatique et sont
définitivement modifiées sont appelées substrats. Le substrat est donc une molécule de nature
organique ou inorganique reconnue par le centre actif de l’enzyme et transformé par celuici. La nouvelle molécule qui résulte de cette transformation est appelée produit. Toutes les
molécules ayant une liaison spécifique avec une protéine sont appelées ligands. Pour chaque
ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protéine qui le reçoit. D’autres molécules non
protéiques peuvent aussi avoir une activité catalytique : les abzymes (Ac) et les ribozymes
(ARN). L’enzymologie est la science qui étudie les enzymes. Le spécialiste de cette science est
appelé enzymologiste. Le substantif « enzyme » est du genre féminin et masculin.
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Caractéristiques générales des enzymes
I- Propriétés caractéristiques des enzymes
-Les enzymes respectent les lois générales de la catalyse:
•le catalyseur agit en quantité très faible et se retrouve intact à la fin de la réaction;
•le catalyseur ne modifie ni la nature de la réaction, ni son équilibre thermodynamique;
•il accélère la vitesse de la réaction.
-Les enzymes abaissent davantage l’énergie d’activation des réactions chimiques en augmentant la
probabilité des chocs efficaces. L’énergie d’activation ou l’énergie libre d’activation (ΔGA) est
l’énergie qui doit être absorbée par les réactifs pour que leurs liaisons soient brisées. Les
réactifs doivent atteindre un état de transition instable dans lequel les liaisons sont plus fragiles et
plus faciles à briser. Même une réaction exergonique où le ΔG est négatif, requiert l’absorption
d’énergie pour atteindre l’état de transition.
Les enzymes ont la capacité d’abaisser l’énergie d’activation pour des réactions spécifiques
pour que ces réactions puissent se faire à la température normale de la cellule.
-Les enzymes présentent une grande spécificité compte tenu de leur nature protéique ;
-Leur activité peut-être modulable en fonction de l’environnement : pH, T°, Substrat, composés
activateurs ou inhibiteurs.
II- Spécificité de l’action enzymatique
La spécificité est l’une des caractéristiques principales des enzymes. Elle peut être circonscrite à
4 niveaux.
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1- Stéréospécificité ou spécificité stéréochimique
Beaucoup d’enzymes sont capables de distinguer deux isomères optiques (séries L et
D) l’un de l’autre. Elles peuvent agir sur le composé de la série L et demeurer inactives sur le
composé de la série D ou vice versa. On dit que les enzymes sont adaptées stéréochimiquement
à leurs substrats. C’est le cas de la:
-D-aminoacide déshydrogénase du foie des mammifères qui catalyse la déshydrogénation
d’un grand nombre de D-aminoacides et est inactive sur les L-aminoacides:
-lactico-déshydrogénase du muscle qui peut catalyser la déshydrogénation de l’acide L(+)lactique en acide pyruvique mais non celle de l’acide D(-)lactique;
-l’arginase qui n’hydrolyse par contre que la L(+)arginine en ornithine et urée;
-d’un certain nombre d’enzymes font la distinction entre les conformations alpha et
beta. C’est le cas par exemple des alpha et beta-glucosidases, galactosidases, fructosidases etc ;
D’autres enzymes ont une stéréospécificité vis à vis de l’isomérie cis-trans.
2- Spécificité liée à la nature de la liaison
La nature de la liaison est la condition nécessaire pour que la substance puisse être
dégradée. Ainsi, dans le cas des hydrolases, on distingue selon le type de liaison, des osidases, des
estérases, des amidases, etc. Les estérases hydrolysent seulement les liaisons esters et non les
liaisons osidiques ou peptidiques. Parmi les estérases, on peut faire la distinction entre les
carboxy-estérases, spécifiques des liaisons esters où sont engagés des acides organiques, et les
phospho-estérases qui hydrolysent les esters phosphoriques. Parmi les enzymes protéolytiques
encore appelées protéases (enzymes hydrolysant les liaisons peptidiques) on distingue les exopeptidases qui exercent leur action à l’extrémité des chaînes et détachent l’amino-acide N- ou Cterminal et les endopeptidases qui hydrolysent les liaisons peptidiques à l’intérieur des chaînes.
3- Spécificité de groupe
L’enzyme exigera que son substrat possède une liaison donnée et au moins une partie de la
molécule conforme à une structure définie (A ou B). C’est le cas de la trypsine, enzyme
protéolytique contenu dans le suc pancréatique qui hydrolyse les liaisons peptidiques des protéines
mais seulement celles auxquelles participent les groupements carboxyles de résidus de lysine ou
d’arginine. C’est le cas des a-glucosidases qui hydrolysent les liaisons osidiques entre l'a-glucose
et un alcool ou un ose. La nature de ces liaisons influencera la vitesse de la réaction .
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4- Spécificité absolue pour un seul substrat
Un certain nombre d’enzymes possèdent une spécificité tellement grande qu’elles ne
peuvent agir que sur un seul substrat, c’est le cas par exemple de:
-l’arginase qui n’agit que sur la L-arginine. Toute modification de la structure de l’arginine
même minime en un point éloigné de la liaison rompue la rend inapte à être dégradée ;
-l’uréase a comme seul substrat l’urée qu’elle hydrolyse en CO2 et NH3.
-la fructose-1,6-diphosphatase qui hydrolyse le fructose-1,6-diphosphate pour donner le
fructose-6-phosphate et le phosphate inorganique.
-l’anhydrase carbonique n’agit que sur le CO2 sur lequel elle ajoute une molécule d’eau
pour donner l’acide carbonique.
III- Nomenclature et classification
1- Nomenclature
1-1-
Conception ancienne
Pendant longtemps, on a attribué un nom à une enzyme en utilisant la dénomination du
substrat et en lui ajoutant le suffixe «ase». Par exemple, l’enzyme dont le substrat est l’urée a été
appelée uréase. On utilisait parfois le nom de la réaction catalysée auquel on ajoutait le suffixe «
ase ». Exemple: Oxydation → Oxydase. Certaines enzymes sont mêmes connues sous des noms
communs ne donnant aucune information sur la nature de leur substrat et de leur réaction
catalysée. C’est le cas de la trypsine, de la pepsine, de la papaïne, de l’invertase etc. Compte tenu
du nombre de plus en plus élevé des enzymes, une classification et une nomenclature systématique
rigoureuses ont été proposées par la commission des enzymes de l’Union Internationale de
Biochimie (UIB, 1961).
1-2-
Conception actuelle
Depuis 1961, l’Union Internationale de Biochimie a codifié la nomenclature et la
classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle. Toutes les enzymes actuellement
connues sont désignées sous le nom chimique de leur substrat et de la réaction catalysée suivi
du suffixe «ase» le tout accompagné d’un numéro portant 4 nombres séparés par des points
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et précédés de EC soit E.C.x.y.z.t. Il s’agit du nom systématique de l’enzyme. Nom systématique
de l’enzyme = substrat + réaction + ase E.C.x.y.z.t.
E.C. = Enzyme Commission
1er chiffre (x): classe de l’enzyme (type de réaction catalysée). Il en existe 6.
2ème chiffre (y) : sous-classe (mécanisme de réaction)
3ème chiffre (z): sous sous-classe (nature des molécules impliquées)
4ème chiffre (t): numéro d’ordre de l’enzyme (une indication de la sous sous-classe)
Exemple: la -D-glucosidase s’appelle en réalité D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21
Substrat : -D-glucoside
Réaction : hydrolyse
EC : Enzyme commission
3 : Classe des hydrolases
2 : Scindant les liaisons osidiques
1 : Il s’agit d’une liaison o-osidique
21 : indique le résidu anomérique -glucosyle
20 : indique le résidu anomérique -glucosyle
23 : indique le résidu anomérique galactosyle
Lorsque l'enzyme utilise 2 substrats, on les désigne tous les deux, en indiquant :
-le substrat donneur de radicaux ;
-puis le substrat accepteur du radical libéré ;
-le radical échangé ;
-le type de réaction ;
-on ajoute enfin ase.
Le tout accompagné d’un numéro portant 4 nombres séparés par des points et précédés de ‘EC’.
Par exemple :
- ATP-glucose phosphotransférase
- UDPglucose-fructose glucosyltransférase
- Glutamate pyruvate aminotransférase.
Dans le cas d'une réaction équilibrée réversible, on peut former les noms à partir des
substrats ou des produits.
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Lorsque le numéro (portant les 4 nombres) dans la nomenclature officielle se termine par
99, cela signifie qu’elle est incomplètement caractérisée. Dans un rapport ou une publication
scientifique, le nom fonctionnel continue à être utilisé mais ce dernier est toujours suivi entre
parenthèses par son numéro (portant les 4 nombres) dans la nomenclature officielle.
2- Classification des enzymes
On distingue deux types de classification des enzymes :
-la classification traditionnelle ou fonctionnelle;
-la classification structurale de Henrissat.
2-1- Classification fonctionnelle
La classification traditionnelle ou fonctionnelle ou internationale repose essentiellement
sur la spécificité de substrats. Elle est la plus ancienne et a été réalisée sur la base des
recommandations de l’Union Internationale de Biochimie. Le grand avantage de ce système, c’est
qu’il est très simple et largement appliqué par les enzymologistes. Cette classification
internationale présente cependant des limites du fait que les glycosidases sont généralement
capables d’hydrolyser plusieurs substrats. En plus, elle omet non seulement les
caractéristiques mécanistiques et moléculaires (séquence, structure…) mais aussi toute
considération liée à l’évolution de ces enzymes. Les enzymes sont regroupées dans six classes.
2-1-1- Oxydo-réductase
C’est la classe numéro 1 (EC 1). Les oxydo-réductases catalysent les réactions de transfert
d’électrons, d’atomes d’hydrogène ou fixation d’oxygène.
A red + B ox ↔ A ox + B red
2-1-2- Transférase
C’est la classe numéro 2 (EC 2). Ces enzymes transfèrent des radicaux ou des groupes
d’atomes d’une molécule (substrat donneur) à une autre molécule (substrat accepteur). Leur nom
complet comporte le donneur, l’accepteur, le radical transféré suivi de transférase. Les groupes
transportés sont: le méthyle (-CH3), l’hydroxyméthyle (-CH2OH), carboxyle (-COOH),
groupement carboné comportant des fonctions aldéhydes ou cétones (-CHO) ou (-CO-R), groupe
acyle, groupe osidyle, amine, phosphoryle, etc.
A-R + B ↔ A + B-R
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2-1-3- Hydrolase
C’est la classe numéro 3 (EC3). Les hydrolases sont des enzymes de dégradation. Elles
provoquent la coupure d’une molécule et fixent les radicaux H et OH de l’eau sur les valences
libérées. Ce sont des enzymes sans coenzymes. Elles interviennent sur les fonctions éthers,
acétals, esters phosphoriques, liaisons O-O des peroxydes, C-N des amides. Il est très difficile de
les classer. Le plus simple est d’étudier leur action sur quelques groupes de molécules.
C-X + H2O ↔ C-OH + X-H
2-1-4- Lyase
C’est la classe numéro 4 (EC4). Les lyases sont des enzymes qui enlèvent un groupement
au substrat en laissant une double-liaison, ou au contraire, fixent un groupement sur une double
liaison.
A-R + Coenz ↔ A + Coenz-R
2-1-5- Isomérase
C’est la classe numéro 5 (EC 5). Les isomérases sont les enzymes qui catalysent les
réactions d’isomérisation intramoléculaire. Elles conservent la formule brute du composé.
A-B-X ↔ X-A-B
2-1-6- Ligase ou synthétases
C’est la classe numéro 6 (EC 6). Les ligases sont des enzymes qui établissent une liaison
avec coupure simultanée d’une molécule d’ATP.
A + B↔ A-B
2-2- Classification structurale des glycosidases
De nombreuses études ont montré des similarités entre les séquences en acides aminés des
glycosidases de différentes sources, et ont suggéré que ces enzymes pouvaient dériver de voies
d’évolution similaires. Henrissat a apporté une contribution majeure à la compréhension des
glycosidases en les classant dans un système de familles avec des homologies significatives de
séquences.
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Par ailleurs, les enzymes d’une même famille ont habituellement le même arrangement du
site actif et l’on peut prédire que leur superstructure doit être similaire. En conséquence, le
mécanisme est conservé au sein des membres d'une famille donnée. Quelques similarités entre les
familles ont mené au concept de « Superfamilles » ou « Clans ». Ainsi, de la séquence d’une
enzyme l'on peut prédire les caractéristiques de spécificité de substrat ainsi que le
mécanisme. L’utilité de cette approche a été démontrée par Tews et al., (1996). Une famille est
alors définie quand deux séquences au moins montrent une similarité significative en acides
aminés et aucune similarité avec d’autres familles. Les comparaisons structurales avec les
autres familles ont amené Henrissat à suggérer la nomenclature « Clan » dans laquelle
la Superfamille 4/7 est référée comme étant le « Clan GH-A » (Clan des GlycosylHydrolases A) et
subséquemment les autres sont appelées B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M et N. On dénombre
actuellement 14 clans notés de A à N. Les glycosidases sont regroupées dans 130 familles dont
4 ont été supprimées au cours de l'avancement des travaux de classification. Les familles
supprimées sont les familles 21, 40, 41 et 60. Certaines enzymes dont les structures ont été
identifiées n'ont pas été classées en familles encore moins en clans.
IV- Structure et mécanisme d’action des enzymes
1- Structure enzymatique
1-1-
Quelques définitions
Du point de vue structure, les enzymes peuvent être divisées en deux catégories:
o les enzymes entièrement protéiques;
o et les enzymatiques formées de deux parties.
 une partie protéique appelée apoenzyme;
 et une partie non protéique appelée cofacteur.
L’apoenzyme est l’enzyme réduite à sa partie polypeptidique après élimination du ou des
cofacteurs. On appelle holoenzyme, l’enzyme fonctionnelle renfermant son ou ses cofacteurs.
Holoenzyme = apoenzyme + cofacteurs
Le coenzyme est une petite molécule organique, non protéique, associée faiblement à
l’apoenzyme, indispensable à la catalyse enzymatique. Un groupement prosthétique est un
cofacteur lié de façon covalente à l’enzyme (apoenzyme). Les cofacteurs métalliques sont des
ions minéraux qui sont indispensables à l’activité enzymatique, soit :
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 parce qu’il est responsable de la stabilité de la structure tertiaire de l’apoenzyme,
 parce qu’il intervient dans la fixation du substrat,
 parce qu’il participe directement à la catalyse.
Dans la partie protéique de l’enzyme, se trouve une zone particulière appelée centre actif
ou site actif au niveau de laquelle se déroule l’acte catalytique. Les acides aminés constitutifs
d’une enzyme sont de 3 ordres :
 les acides aminés collaborateurs, ils ne jouent aucun rôle apparent dans le centre
actif ;
 les acides aminés collaborateurs et auxiliaires, ils stabilisent la conformation
active de la protéine et du centre actif;
 et les acides aminés de contact, ils assurent la fixation et la transformation du
substrat. On les trouve par conséquent au niveau du centre actif.
Certaines enzymes sont constituées d’une seule chaîne polypeptidique, elles sont dites
monomériques. D’autres sont formées de plusieurs chaînes polypeptidiques, ce sont des enzymes
oligomériques. Lorsque les chaînes constitutives des enzymes oligomériques sont identiques,
elles sont dites homo-oligomériques, dans le cas contraire, ce sont des enzymes hétérooligomériques. Il existe dans la nature des enzymes homo-hétéro-oligomériques.
1-2-
Centre actif
1-2-1- Définitions
Du fait de leur nature protéique, l’activité des enzymes est conditionnée par l’intégrité de
leur conformation native. L’acte catalytique lui même se déroule au niveau d’une zone bien
déterminée appelée centre actif ou site actif qui englobe les sites de fixation des substrats,
d’éventuels cofacteurs et le site catalytique. Pour que la catalyse se fasse, il faut que :
 la molécule de substrat trouve exactement sa place au niveau du site de
fixation;
 les acides aminés du site catalytique puissent modifier la constitution du
substrat.
Le site de fixation du substrat est responsable de la reconnaissance spécifique d’un substrat
donné, c'est-à-dire, responsable de la stéréospécificité. Dans le cas des enzymes à coenzyme et
ion, ils interviennent directement dans la réaction, c’est lui qui constitue le site catalytique, seul ou
en association avec certains acides aminés de l’apoenzyme. Dans une classe d’enzyme donnée,
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les acides aminés du site catalytique sont souvent les mêmes car la réaction catalysée est la
même, alors que les acides aminés du site de fixation peuvent changer.
1-2-2- Etude du centre actif d’une enzyme
L’étude consiste à déterminer :
 la nature des acides aminés du centre actif;
 leur place dans la séquence;
 leur disposition dans l’espace.
Pour cela, on utilise principalement deux types de méthodes d’étude :
 les méthodes physiques ;
 et les méthodes chimiques.
1-2-2-1- Méthodes physiques
Elles sont basées sur l’utilisation de la:
 méthode de fluorescence ;
 résonance magnétique nucléaire (RMN) ;
 radio - cristallographie ;
 mesure de l’activité optique et du dichroïsme circulaire.
Parmi toutes ces méthodes, seule celle de la radio - cristallographie a retenu l’attention des
chercheurs car elle fournit le maximum d’informations sur la structure enzymatique et un éclairage
précieux sur les mécanismes d’action. Cette méthode est basée sur l’utilisation des rayons x.
Lorsqu’un faisceau de rayons x est envoyé sur une préparation cristalline d’une molécule
organique, il est réfléchi par les noyaux atomiques. L’observation de ces diffractions conduit aux
structures.
Comme nous le constatons, c’est une méthode qui requière l’utilisation de cristaux purs et
de configuration bien déterminée, des appareils très chers qui ne sont pas à la portée de tous les
laboratoires. C’est donc une méthode très coûteuse.
1-2-2-2- Méthodes chimiques
C’est une méthode relativement peu coûteuse et qui est assez simple dans sa conception.
Elle consiste en effet, de façon générale, à effectuer à l’aide de réactifs organiques des
substitutions au sein de la molécule enzymatique constituée essentiellement d’aminoacides et à
suivre les changements qui en découlent.
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 Après la substitution, si l’enzyme possède toujours un pouvoir catalytique, cela veut dire
que, soit :
 La substitution ne s’est pas faite au niveau du centre actif de l’enzyme,
 Elle s’est faite à un endroit autre que le centre actif.
La fixation de ce réactif de marquage sur l’enzyme n’a pas induit un changement de
conformation sur l’enzyme qui puisse empêcher l’acte catalytique.
 Après la substitution, si l’enzyme perd son activité, cela veut dire que :
 soit la substitution s’est faite au niveau du centre actif de l’enzyme ;
 soit à un endroit autre que le centre actif de l’enzyme.
Mais cette fixation a induit un changement conformationnel qui ne favorise pas l’acte
catalytique.
Pour avoir des précisions d’autres démarches sont nécessaires :
-protéger le centre actif de l’enzyme avec l’utilisation d’un excès de substrat, ce qui va rendre
inaccessible le résidu R-X se trouvant dans le centre actif de l’enzyme ;
-Ensuite chercher à réaliser la réaction de substitution. Si le résidu R-X n’est pas substitué, cela
veut dire que le résidu R-X se trouve au niveau du centre actif de l’enzyme dans le cas contraire, il
ne se trouve pas dans le centre actif de l’enzyme.
A partir de ces démarches, on sait maintenant que R-X se trouve dans le centre actif de l’enzyme.
Pour connaître la nature de R-X, on réalise la substitution de R-X en l’absence d’un excès de
substrat et on fait ensuite l’hydrolyse acide avec l’acide chlorhydrique 6N. Cette hydrolyse va
nous permettre de découper l’enzyme et de connaître la nature du résidu R-X.
D’une façon générale, il faut noter que les résidus amino-acides qui sont indispensables à l’activité
catalytique sont des résidus polaires. Mais on trouve aussi des radicaux non polaires tels que le
thioester de la méthionine et l’indol du tryptophane.
1-2-3- Activation des pro-enzymes
Certaines enzymes sont fabriquées sous forme de précurseurs inactifs, molécule dans
lesquelles le centre actif n’est pas fonctionnel. Le démasquage du centre actif se fait par coupure
d’un petit peptide, ce qui permet un remaniement de la structure tertiaire et permet un
rapprochement dans l’espace des trois acides aminés du site catalytique.
1-3-
Partie de la protéine ne portant pas le centre actif
Cette partie de l’enzyme est aussi importante car elle joue plusieurs rôles:
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-Rôle dans le maintien de la structure du centre actif :
La dénaturation s’accompagne de la perte d’activité enzymatique.
-Rôle régulateur :
Certaines enzymes fixent des effecteurs sur des sites situés en dehors du centre actif.
-Le reste de la molécule est spécifique d’une espèce donnée :
Deux enzymes catalysant la même réaction, sur le même substrat et provenant d’espèces
différentes, ont le même site actif, mais ont des séquences différentes en ce qui concerne le reste
de la molécule, ce sont donc des protéines différentes.
-Le reste de la molécule est spécifique d’un tissu donné :
Les isoenzymes sont des enzymes catalysant la même réaction, sur le même substrat, mais
possédant des structure différentes et donc des propriétés physico-chimiques différentes. Ce sont
des enzymes oligomériques. Selon l’organe qui les fabrique, les sous-unités sont différentes, et
donc les isoenzymes sont différentes. Les isoenzymes sont donc spécifiques d’un organe donné.
1-4-
Cofacteurs
1-4-1- Définitions et propriétés
Les cofacteurs sont des petites molécules (non polypeptidiques, non protéiques), des
molécules organiques ou inorganiques (des ions métalliques), liées plus ou moins fortement à la
protéine
et
indispensables
à
l’activité
enzymatique.
Figure 1 : classification des différents cofacteurs enzymatiques
Inorganiques
Ions
métalliques
Cofacteur
Coenzyme
Organiques
Mobiles
Cosubstrats
Liés
Groupements
prosthétiques
Il intervient obligatoirement dans une réaction chimique:
-pour transporter ou compléter un substrat ;
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-pour accepter un produit;
-comme participant à la structure de l’enzyme.
Les cofacteurs sont donc des métabolites non protéiques, de faible masse moléculaire comparée à
la masse moléculaire des enzymes.
- Ils ont une structure simple;
- Ils agissent à faible concentration et doivent, comme les enzymes, être régénérés à la fin
d’une réaction ou d’une séquence de réactions;
- Ils sont libres ou associés à l’enzyme;
- ils sont thermostables.
Les cofacteurs sont donc des ions métalliques et des coenzymes. Les coenzymes (Co), lorsqu’ils
sont libres, s’associent faiblement (liaison hydrogène ou ionique) au moment de la catalyse à la
partie
protéique
appelée
‘‘apoenzyme’’
(E)
pour
former
le
complexe
fonctionnel
apoenzymecoenzyme (E-Co) appelé Holoenzyme. Dans ce cas, ces coenzymes prennent le nom de
“ coenzymes vrais ” ou coenzymes cosubstrats. D’autres enzymes comportent dans leur
structure le coenzyme. Ce dernier est fortement lié à l’apoenzyme par une liaison covalente.
Le coenzyme est alors appelé groupement prosthétique de l’enzyme. A cet égard,
l’organisation possible d’une enzyme est la suivante:
-protéine seule;
-apoenzyme + coenzyme;
-apoenzyme + cofacteur minéral;
-apoenzyme + coenzyme + cofacteur minéral.
Le cofacteur minéral n’est pas modifié au cours de la réaction, tandis que le coenzyme peut
être réduit.
Les coenzymes sont introduits dans l'organisme des mammifères par l'alimentation
sous forme de vitamines ou de facteurs de croissance qui sont des composés indispensables au
métabolisme, agissant à dose faible, et non synthétisés par l'organisme. Presque toutes les
vitamines hydrosolubles et liposolubles connues sont impliquées dans la structure des coenzymes
sauf la vitamine C (hydrosoluble) et la vitamine A (liposoluble).
C’est sous la forme d’holoenzyme que l’enzyme acquiert une spécificité pour son substrat.
Cette spécificité peut être :
-étroite : l’enzyme n’agit que sur un substrat. La glucokinase ne phosphoryle que le
glucose :
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- lâche : l’enzyme intervient sur un groupe de substrats ayant une communauté de
structure. L’hexokinase phosphoryle tous les hexoses.
1-4-2- Dérivés de vitamines
Les coenzymes (molécules organiques) sont le plus souvent des dérivés des vitamines.
Mais toutes les vitamines ne sont pas des coenzymes. Étymologiquement, une vitamine est une
substance azotée nécessaire à la vie. Les vitamines sont des substances organiques
indispensables au métabolisme qui doivent être fournies en petite quantité à l’organisme dans la
mesure où celui-ci est incapable d’en assurer la synthèse.
Mais :
• nombreuses vitamines non aminées : vitamine C;
• beaucoup d’avitaminoses (= carences prolongées, symptômes pathologiques) non mortelles;
• une substance peut être vitamine pour une espèce animale et pas pour une autre (ex : la vitamine
C n’est pas une vitamine pour le Rat mais l’est pour l’Homme).
Tableau : Les types de vitamines
Vitamines hydrosolubles
Vitamines liposolubles
C, B
A, D, E, K
On rencontre beaucoup de vitamines du groupe B dans la structure des coenzymes
Tableau: Exemples de vitamines B à l’origine de coenzymes
1-4-3- Enzymes à cofacteurs
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Toutes les enzymes sauf les hydrolases doivent leur activité à la présence d’un cofacteur.
Les enzymes digestives sont des hydrolases et n’ont pas besoin de coenzyme : trypsine,
chymotrypsine, pepsine, uréase, peptidase, lipase. Ex : la LDH (lactate déshydrogénase)
isoenzyme à 4 monomères (H et M : H5, H4M, H3M2, H2M3, HM4, M5) a comme coenzyme le
NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide). La succinate déshydrogénase a comme coenzyme le
FAD. Les transaminases (ALAT et ASAT) ont comme coenzyme le PLP (phosphate de pyridoxal)
1-4-4- Cofacteur minéral
Il existe un nombre considérable d’enzymes qui requièrent un cation métallique (Ca++;
Mg++, Mn++, Zn++, etc..) pour leur activité. Ces enzymes sont appelées métalloenzymes. L’un
des ions les plus fréquemment rencontrés chez les métalloenzymes est l’ion Zn2+ : il est nécessaire
à l’expression de l’activité de l’anhydrase carbonique, de la carboxypeptidase, des phosphatases
alcalines et d’une foule d’autres enzymes. Ce métal est fortement lié à l’enzyme. Les cofacteurs
métalliques sont des ions minéraux qui sont indispensables à l’activité enzymatique :
-soit parce qu’ils sont responsables de la stabilité de la structure tertiaire de l’apoenzyme ;
-soit parce qu’ils interviennent dans la fixation du substrat :
-soit parce qu’ils participent directement à la catalyse.
1-4-5- Groupement prosthétique
Certaines enzymes comportent dans leur structure un cofacteur. Ce dernier est lié à
l’apoenzyme par une liaison covalente. Ce cofacteur est alors appelé groupement prosthétique de
l’enzyme. Il ne se détache pas de l'apoenzyme au cours de la réaction (exemple : FAD). Il fait
partie intégrante de l’enzyme (qui est alors une hétéroenzyme). L'enzyme elle-même le remet en
état initial. Les groupements prosthétiques appartiennent à plusieurs catégories moléculaires, le
plus connu -l'hème- intervient dans la plupart des réactions où l'oxygène intervient (hémoglobine,
hémocyanine) ou plus généralement dans les réactions d'oxydo-réduction (cytochrome,
chlorophylle). Mais, il en existe bien d'autres, beaucoup appartenant à la famille des vitamines.
Ex : biotine (vit B8 ou H), thiamine B1, hème des cytochromes.
1-4-6- Coenzymes vrais
Les coenzymes vrais ont des fonctions d’accepteurs et de transporteurs de radicaux libérés
au cours de la catalyse. Ils fixent et transportent:
17
-des hydrogènes et des électrons dans les réactions d’oxydoréduction,
-des radicaux autres que l’hydrogène et les électrons dans les autres réactions.
Ils transportent le radical d’un composé A à un composé B selon les étapes réactionnelles
suivantes:
On voit que le coenzyme a réagi de façon stœchiométrique, et qu’il est régénéré. La réaction
globale catalysée est la suivante :
On distingue les coenzymes des réactions d’oxydoréduction et ceux des réactions de transfert de
groupement.
1-4-4-1- Coenzymes d'oxydoreduction
Ils participent aux réactions d’oxydoréduction en transportant des atomes d’hydrogène
sous forme d’électrons et de protons (NAD = FAD, etc.) ou uniquement des électrons
(cytochromes, etc.). On les rencontre dans toutes les réactions d’oxydoréduction cellulaire et dans
les séquences de transports d’électrons organisés comme la respiration cellulaire ou
la
photosynthèse. Les enzymes qui catalysent les réactions dans lesquelles sont impliqués ces
coenzymes sont des déshydrogénases ou des réductases. On distingue : les coenzymes
nicotiniques ou pyridiniques, les coenzymes flaviniques, les coenzymes quinoniques, les
metalloporphyrines et les protéines fer-soufre.
a- Coenzymes nicotiniques ou pyridiniques
Ces coenzymes ont une répartition universelle puisque toutes les cellules en contiennent.
Ils dérivent de la nicotinamide ou vitamine PP. Les deux types les plus représentés sont:
-NAD+ ou Nicotinamide Adénine Dinucléotide;
-NADP+ ou Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate.
a1- Propriétés et structure
Ce sont des petites molécules solubles. On en trouve en partie à l’état libre dans les
mitochondries, dans les chloroplastes et dans le cytosol. Ils ont le même potentiel rédox (E°’ = -
18
0,32 V) et interviennent tous les deux dans les réactions d’oxydoréduction de l’alcool vers l’acide
carboxylique ou vice-versa. La réaction catalysée est la suivante à partir des alcools primaires :
R-CH2OH + NAD (P) + ↔ R-CHO + NAD(P)H,H+
R-CHO + NAD(P)+ + H2O↔R-COOH + NAD(P)H,H+
Tout en ayant le même potentiel d’oxydoréduction, ils sont associés à des apoenzymes qui
leur sont spécifiques et déterminant les types de réactions catalysées. Le NAD+ intervient
généralement sous forme oxydée et prend en charge les électrons et les protons dans les
déshydrogénations cataboliques, autrement dit, NAD+ intervient dans les systèmes de dégradation
ou de catabolisme conduisant à la récupération d’énergie, NADP+ intervient souvent sous forme
réduite (NADPH,H+) et est associé aux déshydrogénases (réductase) dans les réactions de
synthèse. Dans la cellule, il y a des déshydrogénases à NADH,H+/NAD+ des déshydrogénases à
NADPH,H+/NADP+ bien que certaines acceptent les deux. Ces deux couples sont rarement
interchangeables car les produits peuvent êtres très différents. Leur formule est celle de la forme
naturelle de ces coenzymes, où le cycle pyridinique est attaché au ribose en configuration beta.
Exemple:
L-Malate + NAD+
↔
L-Malate + NADP+ ↔
Oxaloacétate + NAD+
Pyruvate + CO2 + NADPH,H+
Ces deux réactions sont catalysées par 2 malate déshydrogénases.
Figure 11 : spectre d’absorption du NAD(P)+ (forme oxydée) et du NAD(P)H,H+
(forme réduite)
19
Figure 1 – Structure des deux coenzymes nicotiniques dérivés du nicotinamide (Vit PP). Le couple
NAD+/NADH,H+ est un accepteur ou donneur dans les réaction d’oxydoréduction du
catabolisme. Le couple NADP+/NADPH,H+ intervient par sa forme réduite comme donneur
d’électrons dans les réactions de biogenèse.
a2- Mécanisme de la prise en charge des électrons et des protons
Le site réactif du coenzyme se situe au niveau du noyau pyridine et les étapes de réaction
sont les suivantes : le premier électron neutralise la charge positive sur l’azote quaternaire, le
second neutralise un proton qu’il transforme en H qui se fixe sur le carbone 4. Il reste un proton
qui accompagne la molécule réduite d’où l’écriture NADH,H+ et NADPH,H+. Sous forme oxydée,
ces coenzymes n’ont qu’une seule bande d’absorption dans l’U.V. à 260 nm (sous forme réduite
ou oxydée), due au noyau adénine. La réduction de NAD+ ou NADP+ s’accompagne d’une
modification caractéristique de leur spectre d’absorption. Lorsqu’ils sont réduits sous la forme
NADH,H+ ou NADPH,H+, il apparaît une bande supplémentaire à 340 nm (due à la réduction du
noyau pyridine). L’absorption lue à cette longueur d’onde permet d’évaluer la proportion de
20
NAD(P)H,H+ présent dans la solution. Cette propriété est utilisée pour leur dosage ou pour le
dosage des composés dont les réductions ou oxydations leur sont couplées.
Figure 10 : réaction de réduction du NAD(P)+ en NAD(P)H + H+
a3- Equilibre des déshydrogénases à pyridine nucléotides
Les couples NAD+/NADH,H+ et NADP+/NADPH,H+ ont un E°’ de -0,32 V. Les systèmes
qui ont un potentiel d’oxydoréduction (E°’) plus élevé ou très proche auront tendance à accepter
les électrons de leurs formes réduites NADH,H+ ou NADPH,H+. Voici quelques exemples :
3-Phosphoglycéraldéhyde + Pi ↔3-Phosphoglycéroyl-1-Phosphate + 2e- + 2H+ E°’= -0,29V
NAD+ + 2e- + 2H+ ↔ NADH,H+
E°’= -0,32V
3-Phosphoglycéraldéhyde + Pi + NAD+ ↔ NADH,H+ + 3-Phosphoglycéroylphosphate
NADH,H+
↔
-
+
Pyruvate + 2e +2H
NAD+ + 2e- + 2H+
E°’= -0,32V
↔ lactate
+
E°’= -0,185V
+
Pyruvate + NADH,H
↔ lactate + NAD
a4- Mécanisme de formation du complexe enzymatique et de la
catalyse
+
Le NAD se fixe d’abord sur l’apoenzyme pour former l’holoenzyme. Ce dernier fixe ensuite
le substrat pour former un complexe ternaire au niveau duquel se font les échanges des électrons et
des protons. Les étapes sont les suivantes :
E
+
NAD+
↔
E-NAD+
E-NAD+ + SH2
↔ H2-S-E-NAD+
H2S-E-NAD+
↔
S-E-NADH,H+
↔
E-NADH,H+
↔
(Holoenzyme)
(Complexe ternaire)
S-E-NADH,H+
(Echange des électrons et des protons)
E-NADH,H+ + S (Libération du produit)
E + NADH,H+
(Dissociation de l’holoenzyme)
b- Coenzymes flaviniques
21
Ces coenzymes sont des composés hydrosolubles, de couleur jaune. Ils dérivent de la
vitamine B2 ou riboflavine. Ce sont également des coenzymes de déshydrogénases. On distingue :
-la flavine mononucléotide (FMN) qui est l’ester phosphorique en 5’ de la riboflavine.
Elle est membranaire et intervient dans le transport d’électrons dans la chaîne respiratoire ;
- la flavine adénine nucléotide (FAD), cytosolique, qui comporte un 2e nucléoside uni au
premier par une liaison pyrophosphate.
FMN et FAD sont des coenzymes d’une cinquantaine d’enzymes répandues dans toutes les
cellules vivantes.
b1- Propriétés et structure
Les coenzymes flaviniques sont liés à leur apoenzyme par une liaison covalente.
L’ensemble à la structure d’holoenzyme. On les appelle encore flavoprotéines. Les coenzymes
constituent les groupements prosthétiques de ces enzymes. La partie réactive du FAD et du FMN
qui participe à l’oxydoréduction est le noyau diméthylisoalloxazine de la riboflavine. Le potentiel
redox de la flavine est variable en fonction de l’apoenzyme à laquelle elle est fixée. Les
déshydrogénases flaviniques catalysent les réactions responsables de la formation ou de la
réduction des doubles liaisons. Les réactions dans lesquelles elles sont impliquées sont du type :
R-CH2-CH2-R1 + E-FAD ↔ R-CH=CH-R1 + E-FADH2
SH2 + E-FMN ↔ S + E-FMNH2
22
Figure 2 – Structure des deux coenzymes flaviniques dérivés de la riboflavine (Vit B2). Le
couple FMN/FMNH2 ne se rencontre que dans le transport des électrons de la chaîne
respiratoire. Le couple FAD/FADH2 est donneur ou accepteur d’électrons dans les réactions
de catabolisme.
b2- Mécanisme d’action
Le noyau isoalloxazine comporte 2 doubles liaisons conjuguées capables de fixer
réversiblement deux atomes d’hydrogène. La forme oxydée présente une bande d’aborption à 450
nm alors que la forme réduite n’en présente pas. Ces déshydrogénases peuvent recevoir des
hydrogènes des coenzymes nicotiniques. On distingue les flavoprotéines membranaires, non autooxydables, à structure complexe, et les flavoprotéines auto-oxydables cytoplasmiques qui peuvent
transférer l’hydrogène directement à l’oxygène avec formation de peroxydes d’oxygène. Pour le
transport des électrons et des protons, elles ont besoin parfois des ions comme le fer et le
molybdène. Les principales flavoprotéines impliquées dans le métabolisme énergétique de la
cellule figurent dans le tableau ci-dessous.
Tableau : Principales flavoprotéines membranaires
Flavoprotéines
Dénomination
Coenzymes
NADH,H+ -déshydrogénase
(FP1)
FMN
Succinate déshydrogénase
(FP2)
FAD
Dihydolipoyl déshydrogénase
FAD
AcylCoA déshydrogénase
(FP3)
FAD
Glycérol 3-Phosphate
(FP4)
FAD
déshydrogénase
23
c- Coenzyme quinoniques: ubiquinone et plastoquinone
L’ubiquinone, encore appelée coenzyme Q10 est un coenzyme liposoluble transporteur
d’hydrogènes à partir des substrats organiques vers l’oxygène dans la chaîne respiratoire
mitochondriale. Elle n’a pas une origine vitaminique et peut être synthétisée par toutes les
cellules. Elle n’est pas attachée à une protéine et peut circuler librement dans la
couche
phospholipidique de la membrane mitochondriale interne. Son potentiel rédox E°’= +0,1V.
Actuellement plusieurs coenzymes quinoniques sont connus. Ils diffèrent par la longueur
de leur chaîne latérale constituée de n radicaux isoprène polymérisés. Le nombre n est égal à 10
chez l’Ubiquinone d’où le nom de coenzyme Q10. Dans les végétaux, il y a des quinones appelées
plastoquinones qui jouent un rôle équivalent dans les transports d’électrons photosynthètiques
(E°’= + 0,1 V). L’ubiquinone (forme oxydée) a une bande d’absorption caractéristique entre 270
et 290 nm qui disparaît quand la quinone est réduite. Les quinones possèdent deux fonctions
quinones qui, par réduction, sont transformées en di-hydroquinone par acceptation de 2 électrons
et de 2 protons libérés par le substrat.
Figure 3 – Ubiquinone ou Coenzyme Q10 : Interconversion des formes oxydée et réduite. Ce
coenzyme intervient comme accepteur d’électrons dans la chaîne respiratoire.
d- Métalloporphyrines : cytochromes et peroxydases
Les métalloporphyrines sont de véritables groupements prosthétiques liés à leur
apoenzyme respective par des liaisons covalentes. Les métalloporphyrines résultent de l’union,
sous forme de complexe, d’un atome de fer et d’une porphyrine (dérivé par substitution du
noyau tétrapyrrolique). On les rencontre dans les cytochromes et dans les peroxydases. On
distingue:
d1- Cytochromes
24
Ce sont des chromoprotéines présentes dans toutes les cellules, dans la membrane interne
des mitochondries, dans la membrane thylakoide des chloroplastes, et dans le cytoplasme. Le
groupement prosthétique ferroprotoporphyrinique est le même. Seules les apoenzymes qui leur
sont solidement accrochées par liaisons covalentes sont différentes (avec des masses moléculaires
allant de 13 000 à 250 000) et leur confèrent des potentiels redox différents. Ils ont un rôle de
transport séquentiel des électrons grâce au
changement de valence du fer. Dans les
mitochondries des cellules animales et végétales et dans les chloroplastes on a isolé et identifié un
grand nombre de cytochromes fonctionnant tous sur le même principe. C’est le fer du groupement
prosthétique qui transporte les électrons par passage réversible du fer ferrique en fer ferreux:
Cyt b-Fe3+ + e- → Cyt b-Fe2+
Lors du transport des électrons, l’ordre d’intervention des cytochromes est déterminé par leur
potentiel redox.
Figure 4 – Structure de l’hème des cytochromes. Les cytochromes sont présents dans toutes
les cellules. Ils sont impliqués dans le transport des électrons de la chaîne respiratoire et de
la photosynthèse par changement de valence du fer.
Figure 6 : Un exemple de cytochrome : le cytochrome c
d2- Catalases et peroxydases
25
Ce sont aussi des chromoprotéines dans lesquelles le fer reste toujours sous forme ferrique
et ne change pas de valence. Elles contiennent 4 groupements hématiniques et souvent du cuivre.
Les catalases catalysent la décomposition de l’eau oxygénée ou peroxyde d’hydrogène :
H2O2 ↔ H2O + ½ O2
Les peroxydases oxydent certains substrats à partir d’un peroxyde comme l’eau oxygénée.
d3-Oxygénases
Ces métalloprotéines catalysent l’incorporation d’un atome (monooxygénases) ou d’une molécule
d’oxygène (dioxygénase) sur un substrat. Certaines sont des cuproprotéines et ferroprotéines (fer
non hématinique). Un exemple est donné par la tyrosine oxygénase et la dopamine β-hydroxylase
qui participe à la formation de la noradrénaline dans la médullosurrénale.
e-Protéines fer-soufre
Ces protéines fer-soufre interviennent dans les séquences de transport des électrons aussi
bien dans la chaîne respiratoire que dans la photosynthèse. Le fer est non héminique et le soufre
sous forme sulfure. Le fer et le soufre sont en quantité équimoléculaire. L’apoprotéine est liée au
fer par l’intermédiaire des cystéines. La figure donne un exemple de la partie non protéique de ces
protéines Fer-Soufre. Ces protéines fer-soufre se comportent comme des sous-unités de complexe
protéique. Le transport des électrons se fait encore par changement de valence de fer passant
réversiblement du fer ferrique au fer ferreux.
f-Acides lipoîque
Ce coenzyme intervient comme transporteur d’hydrogène dans les réactions de
décarboxylation oxydative et notamment dans celle de l’acide pyruvique.
Figure 7: Forme oxydée de l'acide lipoïque.
26
1-4-4-2-Coenzymes de transport des radicaux monocarbonés
Les radicaux monocarbonés susceptibles d’être transportés par leurs coenzymes
spécifiques sont : CO2, -CH3, -CHO, -CH2OH, etc. Nous ne verrons que quelques coenzymes
fréquemment rencontrés dans le cours du métaboisme.
a-Coenzyme de transport de CO2
Le CO2 est la forme la plus oxydée du carbone. Il se forme abondamment dans la cellule
suite à l’oxydation des carbones terminaux d’une molécule organique en particulier sous l’action
des déshydrogénases. La dernière réaction est une réaction de décarboxylation spontanée chez les
acides organiques ayant une fonction cétone en position beta (carbone 3). La décarboxylation est
une réaction courante dans les cellules animales et végétales. La
réaction inverse, la
carboxylation, est moins fréquente et nécessite de l’énergie et un transporteur. On peut citer la
carboxylation du pyruvate et de l’acétyl-CoA, nécessaire à la néoglucogenèse et la synthèse de
acides gras. Une réaction de carboxylation qui occupe une place prépondérente dans le
métabolisme des végétaux chorophylliens est celle du
ribulose-1,5-bisphosphate qui est à
l’origine de la synthèse des glucides à partir du CO2. Deux coenzymes servent de transporteurs, la
biotine pour les petites molécules et la vitamine K pour les protéines.
a1-Biotine ou vitamine H
La biotine est un coenzyme qui est réuni à l’apoenzyme par une liaison covalente amide
(entre -COOH de la chaîne latérale de la biotine et –NH2 d’une lysine de l’apoenzyme) à un
résidu lysine. Elle est formée de 2 hétérocycles accolés dont l’un contient 2 atomes d’azote et
l’autre un atome de soufre. Elle sert de coenzyme à la pyruvate carboxylase, une enzyme
importante du métabolisme des glucides. La réaction se déroule en deux étapes :
E-biotine + ATP +
CO2
↔
CH3-CO-COOH + E-biotine-CO2
E-biotine-CO2 + ADP + Pi
↔
HOOC-CH2-CO-COOH + E-Biotine
27
Elle sert aussi de transporteur à l’acétyl-CoA carboxylase, une autre enzyme capitale dans la
synthèse des acides gras.
E-biotine + ATP + CO2
↔
CH3-CO-SCoA+ E-biotine-CO2
E-biotine-CO2 + ADP + Pi
↔E-Biotine + HOOC-CH2-CO-SCoA
Figure 6 – Structure de la biotine. Ce coenzyme groupement prosthétique intervient dans les
carboxylations notamment du pyruvate et de l’acétyl-CoA.
a2-Vitamine K
Les vitamines K sont synthétisées par les végétaux et par des bactéries hébergées dans le
tube digestif. Elles sont liposolubles et dérivent toutes du noyau naphtoquinone. Ces vitamines
entrent dans la synthèse des coenzymes des protéines carboxylases. Ces enzymes réalisent, au
cours de la post-traduction, des carboxylations en formant des résidus carboxyglutamiques, utiles
à l’activation des protéines et facteurs impliqués dans la coagulation du sang.
Figure 9: Structure chimique de la vitamine K2
b-Coenzymes de transport de radicaux autres que le CO2
b1-S-adénosyl-méthionine
Ce coenzyme, dérive de la méthionine, acide aminé indispensable, apporté dans l’alimentation.
C’est la forme active de transport et de fixation du radical méthyle (-CH3). Il est donneur de
28
méthyle dans les réactions catalysées par le groupe de méthyl-transférases qui fixent des
groupements méthyles aux accepteurs convenables comme :
-les acides nucléiques ;
-les protéines ;
-les colamines pour former les cholines ;
-la nicotinamide pour former le méthylnicotinamide, forme d’élimination de cette
vitamine. La perte du méthyle transforme le cofacteur en S-adénosyl-homocystéine.
Exemple :
Ethanolamine + 3-S-adénosylméthionine
↔
Choline + 3-S-adénosylhomocystéine
Figure 7 – Réaction de formation et structure de la S-Adénosylméthionine
b2-Acides foliques
En fait les acides foliques sont nombreux et sont rencontrés principalement dans les feuilles. Ils
contiennent deux noyaux que ne peuvent synthétiser les animaux et certains microorganismes. Il
s’agit des noyaux ptérine et le radical p-aminobenzoique. Associés à leur apoenzyme l’ensemble
constitue les ptéroprotéines. L’acide tétrahydrofolique (THF ou FH4) est la forme activée et
fonctionne comme cofacteur de nombreux systèmes enzymatiques de transfert de radicaux à un
carbone autre que le CO2. C’est la forme active d’une vitamine qui est l’acide folique ou l’acide
ptéroyl-glutamique. Le radical méthyle est transporté sur l’azote 5 qui peut être transféré ensuite
sur la désoxyribo-uridine pour former la désoxythimidine. Le coenzyme peut transporter aussi le
groupement formyl sur l’azote N10 suivant la formule ci-dessus : la synthèse du noyau purique et
des acides nucléiques dépend des réactions de transfomylation (transport de-CHO).
29
Figure 8 – L’acide folique sous sa forme tétrahydrofolique est un transporteur de radicaux
monocarbonés autres que le CO2.
c-Coenzymes de transport des radicaux à deux ou plusieurs
carbones
Il s’agit des coenzymes chargés de transporter les radicaux acyle, adéhydyle, carboxyle,
etc. Nous étudierons essentiellement 3 coenzymes importants compte tenu de leur implication
dans le métabolisme énergétique des glucides. Leur ordre d’intervention dans la transformation
du pyruvate en acétyl-CoA va permettre d’illustrer la notion de séquence de réactions et celle du
complexe multi-enzymatique.
c1-Thiamine pyrophosphate
La thiamine pyrophosphate (TPP) ou co-carboxylase est un ester pyrophosphorique de la thiamine
(vitamine B1). Elle fait partie intégrante du site actif des carboxylases (d’où son nom). Ce
groupement prosthétique dérive de la thiamine. La thiamine est formée dans de très nombreuses
bactéries et végétaux. Elle contient un noyau pyrimidique et un noyau imidazole. Elle sert de
coenzyme à des enzymes libérant des radicaux R-CO- à partir de molécules carbonées plus
complexes et les transfèrent sur d’autres coenzymes ou substrats. La thiamine pyrophosphate
intervient particulièrement dans la décarboxylation oxydative des acides alpha-cétoniques en
particulier le pyruvate et l’alpha-cétoglutarate. Le type des enzymes est la pyruvate
déshydrogénase et l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase. Le mode d’action est le suivant:
1-l’acide alpha-cétonique est fixé sur le carbone 2 du noyau imidazole par sa fonction
cétonique (prise en charge du substrat );
2-l’enzyme effectue le départ du CO2. Le radical obtenu est transféré sur le lipoate,
coenzyme groupement prosthétique de l’enzyme lipoamide.
30
Figure 9 – Structure de la thiamine pyrophosphate, coenzyme dérivé de la vitamine B1.
Mécanisme d’action de la déshydrogénase au niveau de son coenzyme, groupement
prosthétique.
La thiamine pyrophosphate intervient comme coenzyme accepteur de radicaux dans les
réactions de transcétolation (Voie des pentoses phosphates et cycle de Calvin). Dans ce cas c’est le
radical-CO-CH2OH qui est transporté sur le ribose 5-phosphate.
c2-Acide lipoîque et lipoamide
L’acide lipoïque est un acide gras à 8 atomes de carbone qui a un pont disulfure entre les
carbones 6 et 8. Il est solidement lié à son apoenzyme. L’holoenzyme formée prend alors le nom
de lipoamide..
Comme annoncé précédemment il sert d’accepteur de radicaux alcyles cédés par la
thiamine pyrophosphate. Dans le cas des réactions partant du pyruvate ou de l’alpha-cétoglutarate,
le radical transporté est un acétyle ou un succinyle. L’enzyme responsable du transport de ces
radicaux sur le lipoate est la pyruvate déshydrogénase ou l’α-cétoglutarate déshydrogenase. Le
lipoate n’est pas l’accepteur final des radicaux acyles. Une deuxième enzyme intervient, une
acyltransférase, (dihydrolipoyl-acyltransférase) qui transfère le radical acétyle ou succinyle sur le
coenzyme A. Le lipoate est réoxydé par la dihydrolipoyl déshydrogénase à FAD qui transfère à la
fin les électrons et les protons arrachés au pyruvate ou à l’ α-cétoglutarate sur NAD+.
31
Figure 10 – Structure du lipoate et réaction de transfert des radicaux issus de la thiamine
pyrophosphate sur le lipoate.
c3-Coenzyme A ou HSCoA
Ce coenzyme existe dans toutes les cellules. Il sert d’activateur des acides gras dans les
réactions de dégradations. Il joue en même temps le rôle de transformateur de radical acyle R-CO. Il est capable de les rendre solubles dans le cytoplasme. Sa structure présente une analogie avec
un dinucléotide. Elle résulte de l’union de :
-l’adénosine 5’diphosphate ;
-de l’acide pantothénique, qui est le facteur vitaminique ( une vitamine du groupe B, non
synthétisé par les animaux) ;
-et de la mercaptoéthylamine.
La fixation du radical sur la fonction thiol produit la formation d’un thioester à haut
potentiel énergétique R-COS-CoA. C’est le groupement thiol de cette dernière qui est la partie
active de la molécule : son H peut être substitué par divers radicaux acyles (notamment acétyle)
pour former des acyl-coenzyme A ou acides gras activés qui chimiquement sont des thio-esters.
La formation directe de l’acétyl-CoA à partir de l’acétate n’est pas courante chez les
animaux. Par contre, elle se produit chez les bactéries et les végétaux avec consommation d’une
molécule d’ATP (avec consommation de deux liaisons phosphates riche en énergie). Sous l’action
de l’acétylthiokinase ou de l’acéyl-CoA synthètase (qui n’existe pas chez les animaux). On a :
CH3 –COOH
+
ATP
→
CH3-CO-AMP
+
HSCoA
→
CH3-CO-AMP
CH3-CO-SCoA
+
Pi
+
AMP
La réaction globale est donc, en additionnant les deux réactions précédentes:
CH3-COOH + ATP + HSCoA
→
CH3-CO-SCoA + AMP + PPi (pyrophosphate
inorganique)
32
Ches les animaux, les acétyl-CoA sont formés au cours de la β-oxydation des acides gras, ou à
l’issue de la déshydrogénation du pyruvate. Les cellules animales forment des acyl-CoA (réaction
d’activation) suivant le même mécanisme et la réaction est catalysée par l’acyl-CoA synthètase.
Acide gras + ATP
→
Acyl-AMP + HSCoA →
Acyl-AMP + PPi
Acyl – CoA + AMP
La réaction globale est:
Acide gras + ATP + HSCoA → Acyl-CoA + AMP + PPi
Certaines réactions de carboxylation ne sont possibles que si le composé est lié au coenzyme A.
Sous forme d’acyl-CoA. Les deux carboxylations importantes impliquant le coenzyme A sont
celles de l’acétyl-CoA pour former du malonyl-CoA et du propionyl-CoA en vue de former du
succinyl-CoA. Le CO2 est apporté par la carboxybiotine.
CH3-CO-SCoA + ATP + CO2
→
HOOC-CH2-CO-SCoA + ADP + Pi
CH3-CH2-CO-SCoA + ATP + CO2
→
HOOC-CH2-CH2-CO-SCoA + ADP + Pi
Rôles du coenzyme
• Activation des groupements carboxyliques
• Activation du H en ! des groupements carboxyliques
• Acylation (transfert de CH3-(CH2)n-(CO)-)
Réactions à CoASH
• Allongement des chaînes d’acides gras
• beta6oxydation des acides gras
• biosynthèse des acides aminés
• formation de l’acétylcholine
• formation du squalène (biosynthèse des stéroïdes).
33
Figure 11 – Structure du coenzyme A (1) – Réaction de transfert des radicaux acyles de
l’acyllipoate sur le Coenzyme A (2).
d-Coenzyme des aminotransférases: le pyridoxal phosphate
Le pyridoxal phosphate (PLP) est un coenzyme d’une importance capitale. Il est commun à
toutes les aminotransférases. Il intervient dans les réactions de transamination aussi bien de
dégradation que de synthèse des acides aminés. C’est un groupement prosthétique qui est relié à
son apoenzyme par liaison covalente avec laquelle elle forme une base de Schiff, aromatique. Lors
de la catalyse, il forme aussi une base de Schiff avec l’acide aminé. Sa structure dérive de la
vitamine B6 comprenant la pyridoxine et le phosphate.
La spécificité de l’activité enzymatique est déterminée par l’apoenzyme et peut conduire aux
résultats différents. Nous ne citons que 2 exemples :
-Transamination : échange du radical amine entre un acide aminé et un α-cétoacide par
l’intermédiaire de la pyridoxamine phosphate.
Aspartate + α-cétoglutarate
→
oxaloacétate + glutamate.
-Elimination des fonctions thiol et amine sur la cystéine
HS-CH2-CH(NH2)-COOH + H2O
→
H2S + NH3 + CH3 –CO-COOH
34
Figure 13 – Structure du pyridoxal phosphate (PLP), coenzyme groupement prosthétique
des aminotransférases
35
Réaction enzymatique
Introduction
La fonction d’une enzyme E est de catalyser une réaction chimique conduisant d’un
substrat S à un produit P. L’activité enzymatique se manifeste donc par une accélération des
vitesses de réaction en présence de l’enzyme, par rapport à la réaction, non-catalysée. Une
décomposition des étapes réactionnelles, intégrant la formation du complexe enzyme-substrat peut
être :
Certaines étapes sont si rapides qu’on les néglige pour ne considérer que la ou les étapes
cinétiquement déterminantes, qui peuvent changer d’un cas à un autre.
I-Complexe enzyme-substrat
1-Théorie Victor Henry
Victor Henry en 1902 a émis une hypothèse selon laquelle, le premier stade de la réaction
enzymatique consisterait en une fixation des substrats sur l’enzyme pour former un complexe
enzyme-substrat lequel serait ensuite dégradé en régénérant l’enzyme et en libérant les produits de
la réaction.
S, E et ES représentent respectivement le substrat, l’enzyme et le complexe transitoire formé
lorsque le substrat biologique est fixé sur l’enzyme.
2-Mise en évidence du complexe ES.
L’hypothèse de la formation de ES a été admise par la plupart des enzymologistes avant qu’il n’y
ait eu de preuves chimiques directes de son existence. Keilin et Mann (1937) apportèrent pour la
36
première fois une preuve en montrant que la peroxydase de raifort forme un composé chimique
défini avec son substrat, l’eau oxygénée. Comme de nombreuses autres chromoprotéines
hématiniques (cytochromes, catalase, méthémoglobine), la peroxydase en solution est brun-rouge
et présente un spectre d’absorption caractéristique en lumière visible. Quand H2O2 est ajoutée à
l’enzyme, on observe un déplacement immédiat des bandes d’absorption indiquant la formation
d’un composé chimique nouveau.
Peroxydase + H2O2 ↔ Peroxydase- H2O2
En présence d’un donneur d’hydrogène convenable (cosubstrat) tel que l’acide ascorbique ou un
colorant oxydable (AH2), une autre réaction a lieu:
Peroxydase- H2O2 + AH2 ↔ Peroxydase + 2H2O + A
qui se manifeste par le retour au spectre initial de la peroxydase libre. Le fait que ces réactions
puissent être observées directement dans un spectroscope constitue une preuve convaincante de
l’hypothèse formulée par Michael Menten. D’autres exemples ont été donnés par la suite de
l’existence de ES.
3-Rôle de l’enzyme au niveau du complexe ES
Dans les réactions enzymatiques, les processus d’affaiblissement des liaisons fortes des
substrats se font à la suite d’établissement transitoire d’un complexe entre les substrats et une zone
particulière de l’enzyme appelée centre actif. C’est ce complexe qui est appelé complexe enzyme
substrat (ES). Au niveau de ce complexe, l’affaiblissement des liaisons fortes se fait grâce à une
nouvelle répartition électronique entre l’enzyme et le ou les substrat (s). Ce qui va conduire à la
formation d’autres liaisons au niveau des produits. Le complexe ES est une étape absolument
indispensable pour toutes les réactions catalysées par les enzymes.
4-Nature des interactions substrat-enzyme
Les substrats sont liés aux enzymes par des interactions faibles: constantes d’association de 10-2 à
10-8 M et ∆G d’interaction entre -3 et -12 kcal/mol (vs. -50 à -110 kcal/mol pour des liens
covalents). La liaison du substrat au site actif implique souvent de nombreuses liaisons noncovalentes de types :
37
- van der Waals
- électrostatiques
- ponts hydrogènes
Ces 3 types de liaisons non-covalentes diffèrent dans leurs contraintes géométrique, force et
spécificité. De plus, elles sont profondément affectées (de manière différente) par la présence
d’eau.
4-1- Interactions électrostatiques
Un substrat chargé négativement peut former un lien électrostatique avec la chaîne latérale des
résidus Lys, Arg et His, ainsi qu’avec l’amine terminale d’une chaîne polypeptidique si, dûs à
leurs pKa’s, ces groupements sont chargés positivement au pH du milieu. Un substrat chargé
positivement peut interagir avec les résidus Asp et Glu, ainsi qu’avec un carboxylate terminal.
Figure 15: Interactions électrostatiques
4-2- Ponts hydrogènes
Les ponts hydrogène dans des systèmes biologiques sont entre des hydrogènes liés à des
oxygènes ou azotes et des atomes d’oxygène ou d’azote. Distances des ponts hydrogène: 2.63 à
3.10 Å Energies de liaison: 3 à 7 kcal/mol. Les acides aminés peuvent formés une variété de ponts
hydrogène; 11 des 20 acides aminés peuvent former des ponts hydrogène à travers leurs chaînes
latérales (donneurs ou accepteurs d’hydrogène). Une caractéristique importante d’un pont
hydrogène est son sens directionnel. La spécificité des interactions enzyme substrat résulte des
ponts hydrogène qui sont hautement directionnels et de la forme du site actif qui exclut les
molécules n’ayant pas une forme complémentaire.
38
Figure 16: Ponts hydrogènes
4-3- Interactions van der Waals
L’interaction de van der Waals est due à une force attractive non-spécifique entre deux
atomes qui sont séparés par 3 à 4 Å. L’énergie de liaison pour une paire d’atomes est de l’ordre de
1 kcal/mol (interaction faible). Une interaction efficace de type van der Waals entre un substrat et
une enzyme peut seulement avoir lieu si leurs formes sont complémentaires du point de vue
stérique. Une spécificité résulte d’une possibilité de former simultanément un grand nombre de
liaisons van der Waals entre le substrat et l’enzyme. Les répulsions entre les atomes qui sont plus
proches de la distance de contact de van der Waals sont aussi importants que les forces attractives
pour la spécificité d’interaction. De plus, des molécules non-polaires s’agrègent (interactions
hydrophobes) dans l’eau due à une augmentation d’entropie associée aux molécules d’eau
libérées. Une partie importante de l’énergie de liaison d’un substrat à une enzyme provient de
l’association des régions non-polaires du substrat avec ceux du site actif.
II-Activité enzymatique
1-Théorie de l’activité enzymatique
1-1-Clé-serrure (Emil Fisher, 1894)
En 1902, Emil Fisher est récompensé par le prix Nobel de chimie pour son travail sur les
glucides et la synthèse des purines. Il est également à l’origine du concept clé-serrure pour
expliquer la spécificité des réactions enzymatiques. Dans ce modèle, la formation du complexe
enzymesubstrat ES nécessite une interaction entre un ou plusieurs groupes fonctionnels ou
domaines du substrat avec des motifs de la cavité enzymatique. La rigidité de ce concept et la
39
tolérance de certaines enzymes envers différents substrats constituent cependant une limite à ce
modèle. Il conserve cependant un grand intérêt pédagogique.
1-2-Forme induite (Daniel E. Koshland, 1958)
Dans ce modèle, qui dérive du modèle clé-serrure, il est postulé que l’association enzyme-substrat
est permise après une modification de la conformation de l’enzyme induite par l’entrée partielle du
substrat. La structure tridimensionnelle fonctionnelle de l’enzyme, c’est-à-dire sa forme active,
n’existe donc qu’en présence de son substrat.
Ce modèle, moins populaire que le précédent, a le mérite d’introduire la notion de réorganisation
moléculaire et de dynamique lors de la reconnaissance enzyme - substrat.
1-3-Effet Circe (William P. Jencks 1975) / déstabilisation de l’état fondamental
Ces deux théories sont basées sur les interactions noncovalentes qui existent entre enzyme
et substrat. Dans l’effet Circe, on considère que c’est la liaison des parties non réactives du
substrat avec la cavité enzymatique qui poussent les parties réactives dans une conformation
déstabilisée. La réaction devient alors une sorte de « libération » énergétique qui est favorisée.
L’idée plus globale de déstabilisation de l’état fondamental est basée sur le fait qu’une fois dans la
cavité enzymatique, le substrat va subir des interactions avec les acides aminés de l’enzyme qui
vont entrainer une déformation et une déstabilisation globale de l’énergie libre du substrat (ΔG).
L’énergie d’activation d’une réaction étant la différence entre l’énergie libre du substrat et celle de
l’état de transition, une déstabilisation de l’état initial a pour conséquence une réduction de cette
différence et se traduit donc par une vitesse accrue. La réaction enzymatique est donc accélérée
par rapport à la réaction noncatalysée
1-4-Stabilisation électrostatique de l’état de transition
40
De façon complémentaire à la déstabilisation de l’état fondamental, la stabilisation de l’état
de transition conduit à un abaissement du niveau d’énergie de celui-ci et donc une diminution de
l’énergie d’activation. Dans cette théorie, ce sont les liaisons électrostatiques qui jouent un rôle
prépondérant pour la stabilisation, en raison des charges partielles importantes souvent
développées au niveau des états de transition.
1-5-Effet covalent (actuel)
Certains scientifiques comme Kendall N. Houk sont convaincus que les stabilisations de
faible énergie (liaisons hydrogène, van der Waals, hydrophobes, …) ne permettent pas à elles
seules d’expliquer les grandes différences de vitesse de réactions entre une réaction noncatalysée
et la même réaction catalysée par une enzyme. Dans la théorie de l’effet covalent, il est postulé la
formation d’intermédiaires au sein desquels l’enzyme est liée temporairement de façon covalente
au substrat ou à un cofacteur. De tels intermédiaires impliquent une différence de mécanisme
entre la réaction non-catalysée et la réaction catalysée, contrairement aux autres théories.
1-6-Near Attack Conformers(NACs) (actuel)
Pour Thomas C. Bruice, ainsi que pour d’autres spécialistes, l’accélération des réactions
enzymatiques est due en grande partie à la réactivité de conformères plus favorables. Cette théorie
des « Near Attack Conformers » considère la réaction chimique réellement comme un processus
dynamique, au cours duquel les molécules vibrent et passent par de nombreux conformères par de
petits mouvements d’atomes, élongation ou contraction de liaisons, variations d’angles de liaisons
ou d’angles dièdres. Certains conformères sont plus favorables que d’autres dans une réaction
donnée. Cette théorie considère que l’enzyme, qui elle aussi est un assemblage dynamique
d’atomes, favorise la formation de ces NACs, et que la réaction est globalement accélérée pour
cette raison. Lors de la réaction non-catalysée, la formation de ces NACs est plus longue et la
réaction impliquant d’autres conformères demande plus d’énergie.
41
1-7-Effet entropique (actuel)
Richard Wolfenden utilise la thermodynamique des réactions chimiques pour expliquer
l’accélération des réactions par les enzymes. En particulier, alors que beaucoup se focalisent sur
l’énergie d’activation, il a proposé une théorie où le terme entropique joue un rôle important. On
peut considérer l’entropie comme une expression du désordre. Au niveau moléculaire, c’est
l’agitation moléculaire et le nombre de degré de liberté qui sont exploités. Le terme entropique
intervient dans l’équation :
ΔG=ΔH – TΔS
Plus le terme ΔS augmente, plus la réaction est facilitée puisque cela abaisse ΔG. Au niveau
moléculaire, cela signifie que plus le désordre augmente, plus la réaction est facilitée. En plus des
paramètres entropiques intrinsèques de la réaction considérée, le rôle de l’eau et l’énergie de
désolvatation du substrat lorsqu’il pénètre dans l’enzyme est très important dans cette théorie.
2-Techniques de mesure de l’activité enzymatique
Pour mesurer l’activité enzymatique, on utilise les méthodes suivantes :
2-1-Méthodes spectrophotomètres
L’enzyme agit sur le substrat pour libérer un ou plusieurs produits. Le substrat subit donc
une transformation. On peut mesurer l’apparition du ou d’un produit libéré ou du substrat
transformé du milieu réactionnel par des méthodes simples sensibles de dosage continu. On peut
utiliser si le produit libéré ou le substrat transformé absorbe la lumière dans le visible ou
l’ultraviolet les méthodes spectrophotométriques. Elles permettent de suivre la progression de la
réaction grâce au changement plus ou moins considérable de l’absorbance qui accompagne la
conversion de substrat.
2--2-Méthode manométrique
Si l’un des produits de la réaction est un gaz, on pourra mesurer la vitesse de la réaction par
une méthode manométrique qui consistera à mesurer le volume du gaz libéré ou consommé. Ce
qui permet de suivre le développement de la réaction.
2-3- Technique du pH-stat
42
Si la réaction aboutit à la libération ou à la captation d’ions hydrogènes, il est souvent
possible de la suivre par la technique de pH-stat. En effet, le pH est maintenu constant par addition
continuelle d’un acide ou d’une base. Le nombre de mole d’acide ou de base consommée sera une
mesure directe du développement de la réaction.
2-4-Méthodes chromatographiques, polarimétriques
Les méthodes chromatographiques, polarimétriques ou l’estimation de la quantité de
substrat ou de produits par des méthodes chimiques sont nécessaires. Elles imposent des
prélèvements de parties aliquotes du milieu de réaction à des temps successifs après le début de la
réaction.
3- Expression de l’activité enzymatique
Les unités utilisées pour mesurer l’activité enzymatiques sont très variables :
3-1- Unité d’activité enzymatique ou unité internationale ( UI )
L’unité d’activité enzymatique d’une enzyme quelconque est la quantité de cette enzyme
catalysant la transformation de 1 micro-mole de substrat par minute à 25°C ( si possible) et dans
les conditions de pH et de concentrations en substrat optimales. Ici, il s’agit d’une vitesse parce
que la quantité de substrat transformée est ramenée en unité de temps ( minute ).
3-2-Activité spécifique
L’activité spécifique est le nombre d’unité d’activité enzymatique ou unité internationale (
UI ) par unité de poids de la préparation enzymatique (en général 1 mg). Elle permet de suivre la
purification de l’enzyme. Elle augmente au fur et à mesure que l’enzyme devient pure.
3-3- Activité molaire
C’est le nombre de moles de substrat transformé (ou de produit formé) par mole d’enzyme
par minute dans les conditions déterminées. Dans cette situation, on doit avoir une enzyme pure et
de poids moléculaire connu.
3-4-Katal
C’est la quantité d’enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde sous des
conditions expérimentales standard. On utilise de préférence :
43
- le microkatal ( 1 µkat = 10-6 kat )
- le nanokatal ( 1 nkat = 10-9 kat )
- le picokatal ( 1 pkat = 10-12 kat ).
L’activité spécifique se définit dans ces conditions comme étant le nombre de katals par kg de
protéine.
44
Cinétique enzymatique
I-Rappels de cinétique chimique
1-Vitesse et ordre de réaction
1-1-Vitesse d’une réaction
1-1-1-Définition
Soit la réaction A + B → C + D
La vitesse de cette réaction se définit par rapport à un des éléments de la réaction. Si c’est par
rapport à un réactif, on l’appelle vitesse de disparition (vitesse négative) ; si c’est par rapport à un
produit, c’est une vitesse d’apparition (positive). La vitesse de la réaction (V) est définie comme
étant la disparition de A ou de B ou l’apparition de C ou de D, par unité de temps. On peut écrire :
V = - dA/dt = -dB/dt = dC/dt = dD/dt
De façon générale, en tenant compte du nombre de molécules réagissantes ou produites, on peut
écrire :
A + B → C + D
Dans cette situation, on a :
V = - dA/dt = -dB/dt = dC/dt = dD/dt
1-1-2-Détermination graphique de la vitesse d’une réaction
45
Une méthode pratique de détermination de la vitesse d’une réaction consiste à représenter les
variations de la concentration d’un des réactifs en fonction du temps et à déterminer la tangente
en un point de la courbe.
1-2-Ordre d’une réaction et molécularité
1-2-1-Définition et exemples
L’ordre d’une réaction est le nombre de molécules de réactants effectivement nécessaire
pour l’acte chimique. Il est en rapport avec le nombre de substance dont la concentration influe sur
la vitesse de la réaction.
A + B → C + D
V = k [A] [B]
k est la constante de vitesse. Elle est indépendante des concentrations, et dépend uniquement de la
température.
 et  sont appelés ordres partiels de la réaction ;
 est l’ordre partiel du constituant A ;
 est l’ordre partiel du constituant B ;
 est l’ordre total de la réaction.
L’ordre globale de la réaction sera : 
-si , alors la réaction est d'ordre 0
-si , alors la réaction est d'ordre 1
-si , alors la réaction est d'ordre 2
Ce sont les réactions d’ordre 0 qui vont nous intéresser au niveau de la cinétique enzymatique.
Pour certaines réactions, il y a une relation entre l’ordre partiel par rapport aux réactifs et les
coefficients stoechiométriques de la réaction. L’ordre n'est pas forcément un entier. Il peut être
fractionnaire.
Exemple :
2NO + Cl2
→ 2NOCl
46
V = k [NO]2 [Cl]1
L’ordre global de la réaction est 3.
NB : L ‘ordre de la réaction est différent du coefficient stochiométrique et de la molécularité
(nombre de molécules réagissantes ou produites).
- Décomposition du pentoxyde d’azote :
N2O5
→ NO2 + O2
Après équilibre stochiométrique
2N2O5
→ 4NO2 + O2
Dans ce cas, l’ordre de la réaction par rapport à N2O5 est égal à 1 (cela a été prouvé
expérimentalement) donc différent de la molécularité qui est égale à 2, ce qui veut dire qu’une
seule molécule suffit pour générer NO2 + O2
-Oxydation du monoxyde d’azote
Dans ce cas, l’ordre est trouvé égal à la molécularité.
-Oxydation du dioxyde de soufre
L’ordre est différent de la molécularité.
47
-Hydrolyse du saccharose
Saccharose + eau → Fructose + glucose.
C’est une réaction bimoléculaire (Fructose + Glucose). Généralement les réactions d’hydrolyse
bien qu’étant bimoléculaires sont d’ordre 1. Ceci est dû au fait que l’eau est en quantité
importante, et que sa variation au cours de la réaction est pratiquement imperceptible. La réaction
se fait avec [H2O] = cte.
V = k [ Saccharose ]1 [ eau ]0
1-3-Expressions cinétiques des vitesses de réaction suivant les différents ordres
possibles
1-3-1-Cas des réactions d’ordre 0
A →Px
V = kA
ou
V = dPx / dt
dPx / dt = k  A  = V
Si on maintient la concentration de A constante, alors V = k . cte = dPx / dt la vitesse devient
constante, l’apparition du produit P va se faire de façon linéaire dans le temps.
Px = Kt
dPx / dt = K

dPx = dt K

Avec K = k .cte
La représentation graphique de la concentration du produit ( Px ) en fonction du temps de réaction
( t ) donne une courbe linéaire dont la pente est K.
1-3-2-Cas des réactions d’ordre 1
Dans ce cas, la vitesse est proportionnelle à la concentration d’une seule des substances
réagissantes. On peut avoir le cas :
A
→ B
V = k [ A ]1
48
V = - d [ A ] / dt = d [ B ] / dt
- d [ A ] / dt = k [ A ]

- d [ A ] = k [ A ] dt
- d [ A ] / [ A ]= k dt
Soient [A0] et [A] les concentrations respectives de A aux temps t0 et t.
L’intégration de cette équation différentielle dans les intervalles [ A0 , A ] et [ t0 , t ] donne la
réaction :
ln [ A ] / [ A0 ] = - kt
Log [ A ] = - kt / 2,303 + log [ A0 ]
On peut représenter : -soit log [ A ] = f ( t )
-soit log [ A0 ] / [ A ] = f ( t )
Dans le premier cas, on obtient une courbe affine de pente négative dont la valeur est de - k
/ 2,303, dans le second cas, on a une courbe affine de pente k.
Particularité des réactions du premier ordre :
Temps de demi réaction : t1/2 tel que [A]= [A0] /2
Ln 2 = k t1/2 , d’où t1/2 = 0,693 / k
On remarque que le temps de demi réaction ne dépend pas de [A0].
1-3-3-Cas des réactions d’ordre 2
A + B →Px
V = k [ A ]1 [ B ]1
Premier cas: si on considère que [ A ] = [ B ]
V = - d [ A ] / dt
alors: V =k [ A ]2
k = constance de vitesse.
V = k[ A ]2
- d [ A ] / dt = k [ A ]2

49
- d [ A ] = k [ A ]2 dt
-d [ A ] / [ A ]2 = k dt
dans les intervalles [ A0 , A ] et [ t0 , t ] après intégration on a:
1 / [ A ] – 1 / [ A0 ] = kt,
une droite affine
ou
[ A0 ] – [ A ]
= Kt ,
une droite linéaire
[ A ] [ A0 ]
Deuxième cas: si [ A ] ≠ [ B],
II-Cinétique enzymatique
1-Vitesse initiale de la réaction
1-1-Mode opératoire
Pour réaliser cette étude :
-nous devons fixer :
●la concentration du substrat. Elle doit être optimale dans le milieu réactionnel ;
50
●la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à celle du substrat ;
●la température d’incubation ;
●le pH du tampon.
-nous devons faire varier, le temps d’incubation et déterminer la quantité de produit formé à
chaque intervalle de temps.
1-2-Représentation quantité de produit libéré ou formé en fonction du temps
d’incubation
Figure 19: Evolution de la concentration du produit en fonction du temps
La vitesse initiale est la tangente d[P]/dt à la courbe [P] = f(t) au point t=0.
1-2-1-Analyse
Si l’on trace la courbe quantité de produit formé en fonction du temps d’incubation, on a le
résultat suivant :
Cette courbe comporte deux parties :
-la partie1, une courbe rectiligne ;
-la partie2, une courbe qui s ‘infléchit.
1-2-2-Interprétation
Dans la partie1, la réaction s’effectue à un rythme régulier. La pente est donc constante et
indépendante de la concentration au
substrat. Il s‘agit d’une vitesse initiale ici, nous nous
trouvons dans le cas d’une cinétique d’ordre 0 par rapport au substrat.
La partie 2 peut résulter de plusieurs facteurs ;
-de l’inactivation de l’enzyme ;
51
-d’une inhibition par un produit de la réaction ;
-de la compétition avec la réaction inverse ;
-et de l’épuisement d’un substrat.
En effet, compte tenu de l’état d’avancement de la réaction, la concentration du substrat n’est plus
optimale. La réaction évolue en fonction de la concentration du substrat présent. Sa vitesse va
donc baisser. La réaction est d’ordre 1 par rapport au substrat.
1-2-3-Conclusion
Lorsque le temps de réaction est trop long, c’est le cas de la partie 2, Il introduit des
irrégularités et on ne sait plus très bien ce que l’on mesure. Il est donc indispensable de travailler
en vitesse initiale.
1-3-Facteurs pouvant influencer la vitesse initiale
De nombreux facteurs sont capables d’influencer la vitesse initiale d’une réaction enzymatique
particulière. Ce sont ;
-la concentration en enzyme ;
-la concentration en substrat ;
-le pH ;
-la température ;
-la nature du substrat ;
-et la présence d’activations ou d’inhibiteur.
2-Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction
2-1-Mode opératoire
Pour réaliser cette étude :
-nous devons fixer :
●la concentration du substrat. Elle doit être optimale dans le milieu réactionnel ;
●la température d’incubation ;
●le temps d ‘incubation, il ne doit pas être long;
52
●le pH du tampon ;
-nous devons faire varier, la concentration d’enzyme dans le milieu réactionnel et déterminer à
chaque fois, la vitesse de la réaction.
2-2-Représentations graphiques
On distingue deux situations :
-une situation normale ;
-une situation anormale.
2-2-1-Situation normale
a-Analyse
Figure 20: Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction : Situation
normale
On a une courbe hyperbolique qu’on peut scinder en deux parties : la partie1 et la partie 2. La
partie 1 est une courbe rectiligne tandis que la partie 2 est une courbe qui s’infléchit.
b-Interprétation
La partie 1 est la zone de faibles concentrations d’enzymes. Elle permet d’obtenir dans les
conditions de l’expérience les vitesses initiales. La vitesse de la réaction est proportionnelle à la
concentration d’enzyme. L’enzyme est donc le facteur limitant du phénomène. Dans la partie 2, la
concentration d’enzyme dans le milieu réactionnel est forte par rapport à la concentration de
substrat, il y a une sous-estimation de l’activité enzymatique.
c-Conclusion
53
Il est donc indispensable d’opérer en faibles concentrations d’enzyme et en forte concentration de
substrat avec un temps d’incubation relativement court. Ces dispositions permettront de travailler
facilement en vitesse initiale.
2-2-2-Situation anormale
Dans cette situation, il n’existe pratiquement pas de partie rectiligne. Cette anomalie peut
s’expliquer par plusieurs facteurs :
-une impureté du tampon se combine avec l’enzyme, qui l’élimine totalement à dose plus
forte;
-l’enzyme n’est active qu’associée à un activateur sous forme d’un complexe EA selon EA
→ A + E . Le complexe est dissocié par dilution;
-l’enzyme a une structure quaternaire qui se dissocie en monomères inactifs par dilution.
-la préparation d’enzyme contient un inhibiteur formant avec l’enzyme un complexe EI
inactif. L’équilibre E + I
↔ EI est déplacé à droite en augmentant la concentration de
l’enzyme ;
-les conditions du dosage sont incorrectes. Par exemple, le dosage utilise un système
enzymatique auxiliaire et on en met pas assez. En accélérant la réaction, on s rend ce système
auxiliaire limitant et la réaction s’essouffle, donnant des valeurs inférieures à la réalité.
Figure 21: Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction : Situation
anormale
3-Influence de la concentration du substrat sur la vitesse la réaction
3-1-Mode opératoire
54
Pour réaliser cette étude :
-nous devons maintenir constants les paramètres suivants :
●la concentration de l’enzyme. Elle ne doit pas être forte. Bien au contraire, elle doit être
faible ;
●la température d’incubation ;
●le temps d’incubation. Il ne doit pas être long ;
●le pH du tampon.
-nous devons faire varier la concentration du substrat dans le milieu réactionnel et déterminer la
vitesse de la réaction pour chaque concentration de substrat.
3-2-Représentation graphique vitesse de la réaction en fonction de la
concentration du substrat dans le milieu réactionnel.
Si on trace la courbe vitesse de la réaction en fonction de la concentration du substrat dans le
milieu réactionnel. On obtient le résultat suivant :
Figure 22 : Influence de la concentration du substrat sur la vitesse la réaction
3-2-1-Analyse
On obtient une courbe hyperbolique comportant naturellement deux parties rectiligne et
une partie qui s’inflexion pour donner par la suite un plateau au niveau du quel l’augmentation de
la concentration du substrat ne produit plus que d’infirmes augmentations de la vitesse initiale.
3-2-2-Interprétation
Partie 1
Pour une réaction enzymatique, l’enzyme existe sous deux formes; soit elle est libre (E) soit elle
est combinée au substrat (ES). La concentration du substrat étant faible dans le milieu réactionnel,
la plus grande partie de l’enzyme se trouve sous sa forme libre (E). Au fur et à mesure que la
concentration du substrat augmente, l’équilibre de l’équation E+S ↔
ES est déplacé dans le
sens de la formation de ES. La vitesse de la réaction est alors proportionnelle à la concentration
55
du substrat. V=K( E) (S) la concentration de l’enzyme étant constante dans le milieu réactionnel,
on a V=K (S).
Partie 2
La concentration
du substrat étant forte, toute l’enzyme se trouve sous la forme ES. Par
conséquent, la vitesse maximale ( Vmax) est atteinte. Dans ces conditions, l’enzyme est saturée.
Chaque complexe ES va se dissocier pour libérer le produit P et l’enzyme. Nous sommes ici en
concentration saturante de substrat.
3-2-3-Conclusion
Il est bien dans les tests enzymatiques d’opérer en concentration saturante de substrat pour ne pas
sous estimer la performance de son enzyme.
3-3-Détermination de l’équation de Michaelis et Menten
Soit l’équation suivante :
k1, V1
E+ S
k2, V2
ES
E + P
k-1 , V-1
E
ES
= enzyme libre
= enzyme liée au substrat. C’est le complexe enzyme substrat encore appelé
complexe Michaelis
P
= produit du milieu réactionnel
S
= substrat du milieu réactionnel
k1, k2 , k1 sont les constantes de vitesse
V1 , V2 , V-1 sont des vitesses de la réaction
La constante de vitesse k2 désigne l’étape limitante d’un processus complexe. Elle est
généralement faible devant k-1 qui est la constance de vitesse du premier ordre correspondant à la
dissociation du complexe de Michaelis. Comme k-1   k2, le complexe ES peut se former et se
défaire rapidement sans altération du substrat, la transformation du substrat fait figure d’accident
de parcours. C’est l’hypothèse de Michaelis et Menten.
3-3-1-Détermination de la constante de Michaelis et Menten
56
Selon l’équation de la réaction, on peut écrire que :
V1 = k1 E S
V-1 = k-1  ES
V2 = k2  ES 
V = - d  S  / dt = V1 – V-1 = V2

k1  E   S  – k-1 ES  = k2 
ES 
k1  E   S  = k2  ES  + k –1 [ES]
 E = concentration d’enzyme libre
 S  = concentration de substrat
 ES  = concentration du complexe enzyme substrat encore appelé complexe de Michaelis
[P] = concentration du produit de la réaction
k1  E   S  =  ES  ( k2 + k-1 )
Le système est à l’ état stationnaire, c’est à dire qu’il se forme à chaque intervalle de temps autant
de ES qu’il en défait.
k2 + k-1
k1
=
ES =
KM ( constante de Michaelis et Menten )
 ES 
Comme la constante k2 est faible devant k-1, KM sera proche de k-1 / k1, c’est à dire de la constante
de dissociation du complexe enzyme substrat.
3-3-2-Détermination de l’équation de Michaelis-Menten
Soit [ ET ] la concentration d’enzyme totale dans le milieu réactionnel. En se plaçant dans les
conditions de la vitesse initiale, on va se permettre de négliger le processus catalytique inverse.
On a alors :
[ ET ] = [ E ] + [ ES ] (équation de conservation de l’enzyme)
or [ E ] [ S ]
=
KM

[ E ] [ S ] = [ ES ] KM
[ ES ]
[ E ] = [ ES ] KM / [ S ]
L’équation de conservation de l’enzyme donne :
[ ET ] =
[ ES ] KM
+ [ ES ]

[ ET ] = [ ES ] ( KM / [ S ] + 1 )
[S]
[ ET ]
KM
=
[ ES ]
57
+ 1
[S]
On sait que: V2 = V =
k2[ ES ] et Vmax = k2 [ ET ]
On peut écrire que : Vmax / V = k2 [ ET ] / k2 [ ES ] = [ ET ] / [ ES ] donc
Vmax / V= ( KM / [ S ] ) +1 = ( KM + [ S ] ) / [ S ]
Vmax.[ S ]
=
V ( KM + [ S ] )

Vmax [ S ]
V=
KM + [ S ]
Equation de Michaelis et Menten
3-3-3-Signification et intérêt de KM et Vmax
- Lorsque toute l’enzyme du milieu réactionnel se trouve sous la forme complexée ES, la vitesse
de la réaction est égale à la vitesse maximale.
-Lorsque la vitesse de la réaction atteint la moitié de la vitesse maximale, autrement dit lorsque la
moitié de l’enzyme du milieu réactionnel se trouve sous la forme complexée ES, la constante de
Michaelis et Menten est égale à la concentration du substrat.
V = Vmax.[ S ] / ( KM + [ S ] ) si V = 1 /2 Vmax alors :
1/ 2 Vmax = Vmax [ S ] / ( KM + [ S ] )  1 / 2 = [ S ] / ( KM + [ S ]  2 [ S ] = KM + [ S ]
 [ S ] = KM
La constante de Michaelis et Menten à la dimensions d’une concentration et s’exprime comme [ S
].
-Si k-1  k2 , alors KM = K-1 /K1 c’est l’hypothèse de Michaelis – Menten. [ E ] et [ ES ]
sont à l’équilibre. Il s’agit d’un état stationnaire. La formation du produit représente une
légère fuite. Dans ce cas, KM est l’inverse de l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
K aff = 1 / KM
KM permet :
 d’évaluer l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Une constante de Michaelis et
Menten élevée signifie généralement qu’une concentration élevée en substrat est nécessaire
58
pour obtenir la demi saturation de l’enzyme. L’enzyme a une faible affinité pour ce
substrat. Elle pourra s’unir préférentiellement à un autre substrat dont la constante de
Michaelis et Menten sera plus petit. La constante de Michaelis et Menten est
caractéristique d’une enzyme donnée et qu’elle ne fait pas intervenir la concentration en
enzyme pour son calcul.
 d’établir une comparaison au niveau des activités des enzymes agissant sur un même
substrat.
- si k-1 << k2 , l’hypothèse de Michaelis et Menten n’est plus valable et KM n’a plus de
relation avec l’affinité de l’enzyme pour le substrat.
-La constante k2 est donc le coefficient cinétique essentiel. Elle représente le pouvoir
catalytique intrinsèque d’une protéine quelle que soit sa concentration dans le milieu du
test, c’est à dire le nombre maximum de molécules par unité de temps. k2 est encore
appelée constante catalytique = kcat..
-La constante de Michaelis-Menten peut être exprimée comme
Le K peut être égal à la constante de dissociation K , si et seulement si la dissociation du
M
S
complexe ES en E et S est beaucoup plus rapide que la formation de E et P. Dans ces conditions,
k >> k et K ≈ K . Ceci permet de mesurer l'affinité de l'enzyme pour le substrat; un K élevé
-1
2
M
S
M
signifie une faible association alors qu'un K faible indique une forte association.
M
3-4-Mesure de la constante et de l'efficacité catalytiques de l’enzyme
Les paramètres cinétiques d'une enzyme permettent de mesurer son efficacité catalytique.
Nous pouvons d'abord définir la constante catalytique (k , ou le «turnover number») comme
cat
étant le nombre de molécules de substrat converties en produit par unité de temps par chaque site
-1
actif, quand l'enzyme est saturé. La valeur de k
cat
(s ) = k , dans les réactions possédant un
2
mécanisme de type Michaelis-Menten. La valeur inverse 1/k
cat
convertir 1 molécule de substrat en produit.
59
représente le temps requis pour
L'efficacité enzymatique peut être calculée lorsque l'enzyme est non-saturée, [S] << K c'est-àM
dire quand beaucoup de sites sont libres. Dans les conditions physiologiques, il est très rare
qu'une enzyme soit saturée, puisque la concentration du substrat est généralement inférieure au
K de l'enzyme. Dans les conditions où la concentration d'enzyme libre est à peu près égale à la
M
concentration d'enzyme totale, [E] ≈ [E] , on a :
T
Le taux de catalyse dépend donc de la valeur de kcat/KM (M-1s-1), qui représente une pseudo
constante bimoléculaire et il mesure l'efficacité catalytique de l'enzyme ou sa spécificité. Une
enzyme peut avoir une très grande affinité mais avec une constante catalytique faible et
inversement. L'un des deux paramètres ne suffit pas à caractériser le couple enzyme/substrat.
C'est le rapport
qui reflète la spécificité globale d'une enzyme vis à vis d'un substrat, appelé constante de
spécificité ou efficacité catalytique.
Est-ce qu'il y a une limite à l'efficacité catalytique ? De l'équation ci haut on a :
Cette quantité est maximale si k >> k , ça veut dire que la formation des produits obtenus à
2
-1
partir de ES est très vite par rapport à la décomposition de ES en substrat et enzyme et on obtient
k
cat
/ K ≈ k . Cette constante de deuxième ordre k ne peut pas dépasser la fréquence avec
M
1
1
laquelle le substrat combine avec l'enzyme. La limite de la valeur k est la vitesse de diffusion
1
avec laquelle le substrat rencontre l’enzyme. Certaines enzymes ont atteint une efficacité
catalytique tellement grande qu’elles ne sont que limitées par le coefficient de diffusion des
8
9
-1 -1
molécules (10 à 10 M s ). Le tableau sur la prochaine page montre les valeurs de K , k , et
M
k /K
cat
M
cat
pour plusieurs enzymes et substrats. À savoir, la catalase, l’acétylcholinestérase, la
60
fumarase, et possiblement l’anhydrase carbonique remplissent cette condition et ont donc
pratiquement atteint la perfection catalytique. C'est donc dire que l'enzyme combine avec le
substrat aussitôt qu'il le rencontre. Vu que le site actif de l'enzyme est une surface restreinte
comment le
61
substrat est-il guidé au site actif reste une question à laquelle la réponse n'est pas encore
claire.
On peut conclure que :
La limite supérieure de rsp est la constante de vitesse d'association de l'enzyme E et du
substrat S : k1. Cette constante a pour limite la vitesse de diffusion des macromolécules dans
le milieu réactionnel qui est de l'ordre de (108 -109) s-1 M-1.
3-5-Représentations graphiques de l’équation de Michaelis et Menten
3-5-1-Représentation directe ou représentation de Michaelis et Menten
C’est la représentation V en fonction de S. A partir des résultats expérimentaux, mesure des
vitesses initiales pour chaque concentration totale de substrat [S], pour une concentration
donnée d'enzyme, nous pouvons tracer V = f([S] ) qui est une hyperbole.
62
Figure 23 : Représentation directe ou représentation de Michaelis et Menten
Cette représentation graphique possède malgré sa simplicité des inconvénients :
-la valeur Vmax n’est déterminée que de façon approchée. Il en va par conséquent de même
pour les valeurs de Vmax / 2 et KM ;
-pour tracer la courbe avec une précision suffisante, il est nécessaire d’avoir un nombre assez
de points expérimentaux en particulier pour les faibles concentrations en substrat. Dans cette
zone de concentration de substrat les méthodes de la vitesse d’une réaction enzymatique
conduisent lorsqu’on veut les réaliser avec soin à une expérimentation longue et délicate, de
plus la répétition d’un grand nombre de mesure entraîne une consommation importante de
préparation enzymatique obtenue fréquemment de façon laborieuse et en petite quantité ;
-pour éviter ces inconvénients, Lineweaver et Burk en 1935 ont proposé une autre méthode
de détermination de KM.
3-5-2-Représentation graphiques de Lineweaver et Burk.
C'est la représentation la plus utilisée qui fût publiée en 1935 par Hans Lineweaver et Dean
Burk
Figure 24 : Représentation graphiques de Lineweaver et Burk
La représentation graphique de Lineweaver et Burk est la représentation 1/V en fonction 1/S.
Cette représentation est une droite qui coupe l'axe des 1/V au point 1/VM et l'axe des 1/[S] au
point -1/KM. L’intérêt de cette représentation est qu’elle peut être tracée à partir d’un
minimum de points expérimentaux obtenus pour les fortes concentrations en substrat pour
lesquelles la détermination de la vitesse initiale est réalisée avec le plus de précision. Il peut
arriver de fois que les points expérimentaux ne s’alignent pas pour obtenir une droite affine
63
comme dans le cas d’une situation normale. Cette anomalie peut être décelée si on fait varier
la concentration du substrat sur une échelle plus grande ( d’un facteur 100 ou plus ). Ce qui
n’est toujours pas aisé dans la pratique ( solubilité, condition pratique du test …). Cette
anomalie peut être due :
- à une hétérogénéité de la solution enzymatique ou de la solution de substrat ;
* la préparation enzymatique contient des iso enzymes, c’est à dire
plusieurs formes d’enzymes catalysant la même réaction.
* plusieurs enzymes catalysant la transformation du substrat. Cette
situation peut entraînée des si on détermine l’activité de l’une des enzymes en suivant
la disparition du substrat dans le milieu réactionnel.
*la solution de substrat peut être impure. Elle peut contenir d’autres
molécules qui peuvent être transformées par l’enzyme qui n’est donc pas spécifique.
- à l’enzyme elle même. Elle peut être une enzyme non michaelienne.
3-5-3-Représentation graphique de Dixon
C’est la représentation la représentation [ S ] / V en fonction de [ S ].
Figure 26 : Représentation graphique de Dixon
3-5-4-Représentation d’Eadie - Hofstee
Cette représentation fût publiée par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959 :
Cette représentation est une droite de pente -KM et qui coupe l'axe des v au point VM.
64
Figure 27 : Représentation graphique de d’Eadie - Hofstee
L'asymptote horizontale de l'hyperbole pour les grandes valeurs de [S] permet d'avoir la
valeur de VM et la valeur de KM qui est la valeur de [S] pour
V = VM/2
3-6-Inhibition par excès de substrat
L’excès de substrat dans le milieu réactionnel exerce une inhibition sur l’activité catalytique
de l’enzyme. Cette inhibition est due à une inactivation partielle et réversible du système. En
effet, le complexe ES a fixé une deuxième molécule de substrat. Le nouveau complexe ESS
formé est stérile dont incorrecte pour la catalyse.
ES + S
ESS
La constante de dissociation du complexe ESS est Ki
Ki = [ ES ] x [ E ] / [ ESS ]
Dans cette situation l’équation de Michaelis et Menten n’est plus valable. L’équation de
conservation de l’enzyme peut s’écrire de la manière suivante :
[ ET ] = [ E ] + [ ES ] + [ ESS ]
[ E ] = [ ES ]. KM / [ S ]
[ ESS ] = [ ES ] [ S ] / Ki
[ ET ] = [ ES ]. KM / [S ] + [ ES ] + ( [ ES ] [ S ] / Ki )
[ ET ] = [ ES ] ( KM / [ S ] + 1 + [ S ] / Ki )
[ ET ] / [ ES ] = ( KM / [ S ] +1+ [ S ] / Ki )
or Vmax / V = [ ET ] / [ ES ]  Vmax / V = [ KM / [ S ] +1+ [ S ] / Ki ]
Vmax / V = ( KM . Ki + Ki [ S ] +[ S ]2) / [ S ].Ki
V = [ S ]. Ki x Vmax / ( KM Ki + Ki.[ S ] + [ S ]2 )

Vmax x [ S ]
V
=
[ S ]2
KM
+ [S] +
65
Ki
Cette équation est bel et bien différente de celle de Michaelis et Menten.
3-7-Réversibilité et relation de HALDANE
A des degrés divers, les réactions enzymatiques sont réversibles, c’est à dire qu’elles peuvent
catalyser la réaction inverse.
k-2
k-1
P +E
ES
E + S
k2
On peut donc écrire :
V’max [ P ]
V =
k2 + k-1
avec
=
K’M + [ P ]
K’M
k-2
V’max ( la vitesse maximale de la réaction inverse ) = k-1 [ ET ]
or on sait que Vmax ( la vitesse maximale de la réaction ) = k2 [ ET ]
Vmax / V’max = ( k2 [ ET ] ) / (k-1 [ ET ] ) = k2 /k-1
K’M

KM
= ( k2 +k-1 ) / k-2
K’M / KM = [ ( k2 + k-1 ) / k-2 ]. ( [k-1 / k2 + k-1 ] ) = k1 / k-2
= ( k2 +k--1) / k1
D’où la relation d’HALDANE
K’M
x
Vmax
=
k2 x k1
= Keq =
constante d’équilibre de la
réaction globale.
KM
V’max
k-2 x k-1
Cette relation souligne l’interdépendance de la constante d’équilibre et des paramètres
cinétiques d’une réaction enzymatique réversible et montre qu’il n’est pas possible de
négliger la réaction inverse dès que les produits s’accumulent.
4-Influence de la température sur la réaction enzymatique
66
4-1- Détermination de la température optimale d’activité
4-1-1-Mode opératoire
Pour réaliser cette étude :
- les paramètres suivants doivent être constants dans le milieu réactionnel :
* la concentration de substrat. Elle doit être forte ;
* la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à la
concentration du substrat ;
* le temps d’incubation. Il doit être court ;
* le pH du tampon. Il ne doit pas être très éloigné du pH optimum.
- la température sera le seul élément à faire varier et on déterminera à
chaque fois la vitesse de la réaction.
4-1-2-Représentation graphique
Figure : Influence de la température sur la réaction enzymatique
a-Analyse
L’étude de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la température
nous permet d’obtenir une courbe en cloche qui n’est rien d’autre que la résultante de
deux courbes : la courbe d’activation et la courbe de dénaturation. La courbe en cloche
présente bien entendu deux parties I et II. La partie correspond à la zone des
températures les plus basses et la partie II correspond à la zone des températures les
plus élevées.
b-Interprétation
67
Dans la partie I, la vitesse de la réaction augmente quand la température augmente.
Cette augmentation de vitesse avec la température s’explique par une augmentation de
la concentration du complexe activé lorsqu’on fournit plus d’énergie sous forme
thermique au système réactionnel.
Dans la partie II la vitesse de la réaction diminue quand la température augmente.
Cette diminution de vitesse avec la température est due à une dénaturation de
l’enzyme compte tenu de sa nature protéique.
Les courbes d’activations et de dénaturations s’équilibrent ; on a la température
optimale. A cette température l’activité de l’enzyme est maximale. Elle dépend ( la
température optimale ) :
* du pH ;
* de la force ionique du milieu ;
* et du temps de réaction ( plus le temps est court plus la température
optimale peut être élevée ).
c-Conclusion
Contrairement aux fortes élévations de températures, les basses températures ne
détruisent pas l’activité des enzymes. Aux très basses températures, on observe une
diminution et même une annulation de la vitesse des réactions enzymatiques. Le froid
permet donc d’éviter la dénaturation des enzymes au cours de la manipulation.
4-2- Détermination de l’énergie d’activation de la réaction
4-2-1-Principe et technique de détermination
L’interprétation physique de la loi d’Arrhénius est la suivante : pour les réactions
bimoléculaires, la réaction entre A et B nécessite une collision entre une molécule A et une
molécule B. A l’issue d’une collision, l’énergie cinétique des molécules est partiellement
transformée en énergie interne du complexe formé lors de la rencontre. Seuls les complexes
qui auront emmagasiné une énergie supérieure à l’énergie d’activation Ea pourront réagir. Or
cette fraction est donnée, d’après la loi de Boltzmann, par exp(-Ea/RT). Si Z est le nombre de
68
collisions par unité de volumes et de temps, alors le nombre de collisions efficaces , c’est à
dire conduisant aux produits, s’écrit :
k = Z exp(-Ea/RT).
Avec Z ou A = facteur d’ ARRHENIUS
Ea = Energie d’activation
R = Constante des gaz parfaits = 1.98
T = Température absolue °K ( 273 + t °C ).
ln K = ln A + ln e –Ea / RT = ln A – Ea / RT
EA est comprise entre 50 et 100 kJ.mol-1.
Le principe de la détermination de l’énergie d’activation repose sur la loi d’ARRHENIUS , la
constante de vitesse chimique et l’énergie d’activation.
La loi d’ ARRHENIUS se traduit par une relation linéaire entre log K et l’inverse de la
température absolue
1/ T. On obtient une droite de pente = - Ea / (2,303.R) lorsque la
vitesse réactionnelle ou une grandeur proportionnelle est porté en valeur logarithmique contre
l’inverse de la température absolue. En effet, il faudrait déterminer les valeurs logarithmiques
de ces vitesses initiales obtenues dans la première partie de la courbe en cloche et calculer les
abscisses correspondantes.
log K = - Ea / 2.303. R x 1/ T + log A
4-2-2-Représentation graphique
Figure : Détermination de l’énergie d’activation
69
4-2-Q10
On définit un coefficient de température ou Q10 qui est le rapport de la vitesse V2
mesurée à la température T + 10°C sur la vitesse V1 mesurée à la température T. On
peut écrire :
V2
Q10 =
V1
Pour les réactions enzymatiques, il faut toujours opérer à des températures
physiologiques. En effet, le Q10 des enzymes voisin de 2, tombe à des valeurs très
basses en dehors de la zone des températures physiologiques. Il existe une relation
entre le Q10 et l’énergie d’activation.
2,303 . R x T1 x T2 . log Q10
Ea
=
10
5-Influence du pH sur la réaction enzymatique
5-1-Mode opératoire
Pour réaliser cette étude :
- les paramètres suivants doivent être constants dans le milieu réactionnel :
* la concentration de substrat. Elle doit être forte ;
* la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à la
concentration du substrat ;
* le temps d’incubation. Il doit être court ;
* la température d’incubation. Elle ne doit pas être très éloignée de la
température optimale.
-le pH tampon sera le seul élément à faire varier et on déterminera à chaque
fois la vitesse de la réaction.
5-1-Représentation graphique
70
Figure : Effet du pH sur l’activité enzymatique
5-1-1-Analyse
L’étude de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction du pH du tampon
permet d’obtenir une courbe en cloche. Elle présente bien entendu deux parties I et II.
La partie I correspond à la zone des pH les plus bas. La vitesse de la réaction
augmente quand le pH augmente. La partie II correspond à la zone des pH les plus
élevés. La vitesse de la réaction diminue quand le pH augmente. Les deux parties sont
séparées par le pH optimum au niveau duquel l’enzyme a une activité maximale.
5-1-2-Interpretation
Les variations de pH peuvent avoir un effet à deux niveaux :
-au niveau de l’enzyme
Elles provoquent des modifications du degré d’ionisation de certains groupements
fonctionnels soit du centre actif de l’enzyme. Ce qui favorise la formation du
complexe ES. Soit situés en dehors du centre actif, à divers endroits de la molécule.
Ce qui favorise le maintien de la conformation tridimensionnelle native de la protéine
enzymatique.
-au niveau du substrat.
Elles provoquent un changement de son degré d’ionisation. Ce qui permet ou
empêche la formation du complexe ES.
71
La variation des états d’ionisation du substrat et de l’enzyme va:
- se répercuter sur l’intégrité physique de la protéine dont l’exposition à
des pH trop acides ou trop basiques déclenche la dénaturation.
- se répercuter sur l’affinité de l’enzyme pour le substrat en particulier
lorsque celui-ci est attiré dans le site catalytique par des liaisons ioniques. Les
variations de pH entraîne alors des changements de KM.
-entraîner un changement de Vmax.
5-1-3-Conclusion
Certaines enzymes ont leur pH optimum qui est pH acide. On dit que ce sont des
enzymes acides.
(Ex : amylase acide, α-glucosidase acide). D’autres ont leur pH optimum qui est un
pH basique ou alcalin. Ce sont des enzymes alcalines (Ex : phosphatase alcaline). On
trouve aussi des enzymes qui ont un pH optimum neutre. Ce sont des enzymes neutres.
6-Influence des agents chimiques sur la réaction enzymatique
Introduction
Le substrat et le produit, l’enzyme, les ions, les coenzymes et l’énergie sont les facteurs
indispensables à la réaction enzymatique. Les autres molécules qui entrent en liaison avec
l’enzyme, les ligands, peuvent avoir un effet positif ou négatif. Ils peuvent favoriser ou au
contraire contrarier le déroulement de la réaction. L’activité enzymatique peut être modifiée
par la présence de composés autre que le substrat : On les appelle effecteurs. Ils jouent un rôle
important dans le phénomène de régulation et sont également forts utiles dans des
mécanismes d’action des enzymes. On peut les classer en deux groupes :
-les activateurs qui augmentent la vitesse de la réaction ;
-et les inhibiteurs qui la réduisent.
Ces effecteurs peuvent intervenir en différents points de l’enzyme. Ils peuvent :
* dénaturer la protéine activante ;
*de fixer sur des groupements chimiques de cette molécule protéique,
groupements indispensables ou non à son activité ;
72
*se fixer sur le centre actif de la molécule fonctionnelle et empêcher la formation
du complexe enzyme-substrat en réalisant un complexe enzyme-inhibiteur ;
*se fixer à la place du groupement prosthétique ;
*inhiber la fonction de donneur ou d’accepteur du coenzyme ;
*immobiliser les ions activateurs.
6-1-Effets des inhibiteurs
Les inhibiteurs sont des effecteurs dont l’action aura pour résultat soit la suppression
pure et simple soit le ralentissement de l’activité enzymatique. Ces effecteurs peuvent
être divisés en deux groupes :
-les inhibiteurs dont l’action est réversible ;
-et les inhibiteurs dont l’action est irréversible.
6-1-1-Inhibiteurs irréversibles
Ce sont les effecteurs qui dénaturent ou dégradent les enzymes. Dans ce groupe on
peut citer :
-le phénol ( qui dénature ), l’urée, le SDS ( qui dénature ) ;
-le formol ( qui coagule ) ;
-l’acide trichloroacétique ( qui précipite ) ;
-les enzymes protéolytiques etc.
6-1-2-Inhibiteurs réversibles
Dans ce groupe d’inhibiteurs réversibles, on distingue plusieurs variantes qui se
différencient par leur mode d’action. On distingue :
-les inhibiteurs compétitifs ;
-les inhibiteurs non compétitifs ;
* les inhibiteurs non compétitifs classiques ;
* les inhibiteurs non compétitifs mixtes.
-les inhibiteurs incompétitifs ;
a-Inhibiteurs compétitifs
73
Dans cette inhibition, nous avons deux cas :
-le cas où l’inhibiteur possède une analogie structurale avec le substrat du
point de vue conformation. Il y a donc une compétition entre le substrat et l’inhibiteur.
L’enzyme possède donc un seul site pour le substrat et l’inhibiteur. On parle
d ‘inhibition compétitive classique.
- Il existe un autre cas où l’enzyme possède deux sites de fixation : un site
pour le substrat et un autre pour l’inhibiteur. Si le substrat se fixe en premier lieu,
l’inhibiteur ne pourra donc plus se fixer et vice-versa. Il y a donc une inhibition. La
fixation du substrat (ou de l’inhibiteur ) crée un encombrement stérique qui empêche
la fixation de l’inhibiteur ( ou substrat ). On parle d ‘inhibition compétitive non
classique.
74
L'inhibition compétitive diminue le taux de catalyse en réduisant le nombre d'enzymes
accessibles au substrat. Elle peut être abolie par un excès de substrat. Le V
max
de la réaction
est donc le même, en présence ou absence de l'inhibiteur, car à haute concentration de
substrat, tous les sites sont occupés par le substrat et l'enzyme est parfaitement active. Par
contre, le K va augmenter avec la force de l'inhibiteur, par un facteur
M
L’analyse cinétique de l’inhibition compétitive dans une représentation de Lineweaver-Burk
se caractérise par le fait que toutes les droites se coupent sur l’axe 1/v à 1/V
0
commun.
75
, - intercepté
MAX
Figure : Représentation double réciproque d’une enzyme michaelienne simple en
présence d’un inhibiteur compétitif
K’M est fonction de la concentration de l’inhibiteur. Plus la concentration de
l’inhibiteur est élevée plus K’M est grand. Cela veut dire que plus la concentration de
l’inhibiteur est élevée plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat diminue.
L’inhibiteur n’affecte pas la vitesse maximale de la réaction.
Un exemple classique et historique de ce type d’inhibition est l’inhibition de
lsuccinodéshydrogénase par certains analogues de l’acide succinique tels que l’acide
malonique, l’acide oxalique ou l’acide glutarique qui peuvent se combiner à l’enzyme
mais ne peuvent être déshydrogénés.
b-Inhibition non-compétitive
On distingue :
-l’inhibition non compétitive classique ou simple ;
-l’inhibition non compétitive mixte.
Inhibitions non compétitive classique ou simple
Généralement l’inhibiteur se fixe à un site différent de celui du substrat. Mais
pour qu’il ait compétition, il faut que la fixation de l’inhibiteur provoque ou induise un
changement conformationnel de l’enzyme qui va se répercuter sur le site catalytique
sans affecter le site de fixation du substrat. Dans ces conditions, le substrat peut se
fixer mais ne sera pas métabolisé du fait du changement du site. Dans ce cas,
l’inhibiteur n’a aucune influence sur l’affinité de l’enzyme pour son substrat. C’est la
vitesse maximale qui est affectée. Plus la concentration de l’inhibiteur augmente plus
la vitesse maximale diminue.
Inhibitions non compétitive mixte
Dans ce cas, la fixation de l’inhibiteur va induire un changement conformationnel qui va donc
se répercuter à la fois sur le site catalytique et le site de fixation du substrat. Dans ce cas, KM
et Vmax sont affectés.
76
L’analyse cinétique de l’inhibition mixte dans une représentation de Lineweaver-Burk se
caractérise par des courbes d’inhibition ni parallèle ni possédant un intercepté commun. Dans
ce cas, l'inhibition n'est pas renversée par une augmentation de la concentration de substrat.
Le K et V
M
MAX
vont changés de façons différentes.
c-Inhibition incompétitive
L’inhibiteur n’a aucune affinité pour l’enzyme toute seule. Par contre, il se fixe seulement et
très bien sur le complexe ES mais dès qu’il se fixe, il induit le changement conformationnel
qui va se répercuter sur le site catalytique de sorte que le complexe ES ne conduise pas au
produit.
77
L’analyse cinétique de l’inhibition incompétitive dans une représentation de Lineweaver-Burk
se caractérise par des courbes d’inhibition qui ont des pentes identiques égale à K /V
M
droites parallèles.
78
MAX
-
EFFETS ALLOSTERIQUES
I-Quelques définitions
Lorsqu’une protéine est composée de plusieurs chaînes d’acides aminés, chacune de ces
chaînes est une sous-unité de la protéine. L’arrangement spatial des sous-unités constitue la
structure quaternaire de la protéine. Les corps chimiques dont la molécule est constituée de
répétitions multiples d’un même ensemble d’atomes sont des polymères. L’unité structurale
ainsi répétée est un protomère ou monomère. Lorsque le nombre de répétitions est faible le
polymère est appelé oligomère. Une protéine constituée de sous-unités identiques est un
oligomère. Chaque protomère d’une protéine oligomérique peut être formé de plusieurs sousunités.
Les enzymes allostériques sont des enzymes régulatrices qui sont généralement oligomériques
c’est à dire constituées d’un petit nombre de monomères (sous-unités) dépassant rarement 6.
Elles possèdent sur chaque monomère plusieurs sites spécifiques appelés sites allostériques
pour la fixation de différents ligands dont le substrat.
Une enzyme allostérique est une enzyme dont l’activité est modulée par la fixation non
covalente (donc réversible) d’un ou plusieurs métabolites modulateurs sur des sites différents
du site catalytique ou modulée par fixation du substrat. Une enzyme régulatrice peut être
modulée c’est à dire inhibée ou activée par des modulateurs encore appelés effecteurs. Ces
effecteurs sont en fait des métabolites ou des cofacteurs. Ils n’ont pas d’analogie structurale
avec le substrat. Ils se fixent sur un site allostérique. L’effecteur est encore appelé effecteur
allostérique.
Le terme allostérique vient du mot grec «allos» qui veut dire autre et «stereos» qui
veut dire forme. Les enzymes allostériques sont donc des enzymes régulatrices qui prennent
une autre forme ou conformation à la suite de la liaison d’un modulateur.
Dans certains systèmes multienzymatiques, lorsque le produit terminal se trouve en excès,
l’enzyme régulatrice est inhibée de façon spécifique par ce produit terminal de la voie
métabolique. Ce type de régulation est appelé rétrocontrôle ou inhibition par feed-back. On
parle de rétroinhibition lorsque le produit d’une longue séquence de réactions biosynthétiques
inhibe l’activité d’une enzyme dont l’action se manifeste au début de la voie biosynthétique.
79
Le produit inhibiteur est appelé effecteur allostérique négatif ou inhibiteur rétroactif.
Lorsqu’un effecteur exerce une activation sur l’activité de l’enzyme allostérique, on parle
dans ce cas d’effecteur allostérique positif.
II-Symétrie
Le comportement des enzymes que nous avons vues jusque là, lorsque la concentration du
substrat change, répond à l’équation de Michaelis : ce sont des enzymes à cinétique
michaelienne. D’autres enzymes de structure plus complexe ont une affinité vis à vis du
substrat qui n’est pas une constante ou bien voient leur vitesse maximum changer en fonction
de la concentration des effecteurs : ce sont les enzymes à cinétique allostérique. Ces
enzymes ont toujours une structure quaternaire composée de plusieurs chaînes d’acides
aminés, formant des sous-unités ou protomères presque identiques entre elles. Les protomères
sont arrangés dans l’espace de façon que chacun d’entre eux ait les mêmes liaisons avec les
autres. Un tel arrangement est dit symétrique. C’est le cas des deux protomères d’une paire ou
des quatre protomères placés aux 4 sommets d’un tétraèdre.
Chaque protomère a des liaisons avec les autres protomères du système, le plus souvent de
type électrostatique, sa structure secondaire et tertiaire et son énergie interne sont modifiées
par ces liaisons. Les sites de liaison existent de façon identique sur chaque protomère.
Lorsque l’énergie interne d’un protomère augmente par suite de la modification de ces
liaisons, on dit qu’il passe à un état tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposent
une structure correspondant à une énergie interne diminuée, on dit qu’il passe à un état
relâché. Ces changements d’énergie interne se traduisent par des modifications de l’affinité de
l’enzyme
vis à vis du substrat ou encore de la vitesse initiale de la réaction. Le passage d’un protomère
de l’état relâché à l’état tendu implique en général la transformation de la structure des autres
protomères dans le même sens pour maintenir la symétrie de la
structure d’ensemble.
III-Allostérie
1-Cinétique des enzymes allostériques
1-1-Etude de Hill : la fixation du dioxygène sur l’hémoglobine et la myoglobine
1-1-1-Structure de l’hémoglobine
80
L’hémoglobine humaine possède une structure quaternaire composée de 4
chaînes polypeptidiques identiques deux à deux. Sa formule est a22. Les chaînes  et
 se ressemblent par leur structure dans l’espace et ont une homologie de séquence
très nette. Chaque chaîne porte un noyau hème. Chaque noyau hème est constitué
d’une porphyrine, la protoporphyrine , portant en son centre un ion ferreux.
La myoglobine est une protéine qui transporte l’oxygène dans le cytoplasme des
cellules. Elle est constituée d’une seule chaîne d’acides aminés. Sa vitesse de transport
de l’oxygène est fonction de la pression de ce gaz.
1-1-2-Courbes de fixation ou de saturation de l’hémoglobine et de la myoglobine
La courbe de fixation ou de saturation de la myoglobine par l’oxygène en fonction de
la pression partielle de ce composé est une courbe hyperbolique alors que celle
obtenue avec l’hémoglobine est une courbe sigmoïde c’est à dire en forme de S.
La myoglobine est saturée à 50% à des pressions partielles d’oxygène allant de 0,15 à
0,3 Kpa pour être saturées à 50%. L’hémoglobine et la myoglobine sont toutes deux
saturées à plus de 95% à la pression partielle du sang artériel dans les poumons (
environ 13 Kpa ). La myoglobine est donc saturée à 80% à une pression de 1,5 Kpa.
Ces résultats montrent que la myoglobine possède une affinité très élevée pour
l’oxygène. Ce qui n’est pas le cas pour chacune des quatre sous-unités de
l’hémoglobine. En effet l’hémoglobine qui est la substance responsable de la
coloration rouge du sang est une protéine oligomérique. Elle est constituée de 4 sousunités. Chaque sous-unité est constituée d’un groupement prosthétique l’hème qui
81
contient du fer et une fraction protéique appelée globine. Chaque fraction protéique
contient un site de fixation de l’oxygène. En effet, lorsque la première sous-unité
hème-polypeptide fixe une molécule d’oxygène, elle communique cette information
aux sous-unités restantes grâce à des interactions au niveau des interfaces des sousunités. Ce qui entraîne un changement conformationnel de l’hémoglobine. Les sousunités répondent en augmentant fortement leur affinité pour l’oxygène. Il s’agit d’un
effet coopératif car lorsque la première molécule d’oxygène se fixe, elle facilite la
fixation des molécules suivantes au fur et à mesure que la pression partielle augmente.
Cette coopérativité est positive car elle se traduit par la courbe sigmoïde de fixation
d’oxygène sur l’hémoglobine. La liaison coopérative de l’oxygène ne se produit pas
avec la myoglobine car cette protéine est monomérique c’est à dire constituée d’une
seule unité possédant un groupement heminique qui se trouve à l’intérieur d’une
chaîne polypeptidique. Elle ne peut donc lier qu’une seule molécule d’oxygène d’où
l’allure hyperbolique de la courbe de saturation.La coopérativité positive n’est pas le
seul résultat possible d’interaction des sous-unités dans les protéines oligomériques.
Pour certaines protéines oligomériques, la coopérativité est négative. Dans ce cas, la
liaison d’une molécule de ligand diminue la probabilité de fixation d’autres ligands.
1-1-3-Coefficient de Hill
Hb + nO2 → [Hb(O2)n]
La fonction de saturation Y est comprise entre 0 et 1.
[ Hb][O2 ]n
KD 
[ Hb(O2 ) n ]
[ Hb(O2 ) n ]
Y
[ Hb]  [ Hb(O2 ) n
[ Hb(O2 ) n ] 
[ Hb][O2 ]n
KD
[ Hb][O2 ] n
KD
Y
[ Hb][O2 ] n
[ Hb] 
KD
82
[O2 ] n
Equation de Hill pour l’hémoglobine : Y 
K D  [O2 ] n
[O2 ] n
K D  [O2 ] n
[O2 ] n
K D  [O2 ]n [O2 ] n
Y




Y 1
KD
KD
[O2 ]n
K D  [O2 ] n
1
n
K D  [O2 ]
 Y 
log
  n log[O2 ]  log K D
 Y 1
Linéarisation de l’équation de Hill :
 Y 
log
  n log[O2 ]  log K D
 Y 1
 Y 
Lorsqu’on trace log
  f (log[O2 ]) on obtient une droite de pente n et
 Y 1
d’ordonnée à l’origine – log KD.
n est le nombre de Hill (également appelé « indice de coopérativité »). Il est inférieur
au nombre de sites.
Comme dit précédemment, n est inférieur au nombre de sites.
1-2-Application aux enzymes allostériques
Soit E, une enzyme considérée comme allostérique et S, un substrat susceptible
d’être fixé par l’enzyme.
E + nS
ESn
[S ]n
Y
K '[ S ] n
83
Vmax  [ S ]n
vi 
K '[ S ]n

vi
log
 Vmax  vi

  n log[ S ]  log K '

Si n = 1 il n’y a pas de coopérativité : l’enzyme a un comportement Michaelien.
Si n > 0 la coopérativité est positive.
Si n < 0 la coopérativité est négative.
Remarque : n dépend de la concentration en substrat. Ainsi, n est constant dans un
domaine de concentrations en substrat. Aussi, pour les faibles et pour les fortes
concentrations en substrats, n = 1.
Pour déterminer l’indice de coopérativité, il suffit de faire la représentation graphique :
V
Log
en fonction de log  S 
Vmax - V
Figure :
Dans le cas où n = 1, cela veut dire que l’interaction entre les sous unités ( s’il y en a
plusieurs ) est nulle. Ces sous-unités fonctionnent comme si elles étaient
indépendantes et leur cinétique est hyperbolique dans le cas de V = f (S).
84
2-Etude comparative des représentations graphiques
michaeliennes et à coopérativité négative et positive
des
cinétiques
Lorsque n = 1, la cinétique est de type michaelien. La coopérativité est nulle. Il
n’existe donc pas d’interaction entre les différentes sous-unités de l’enzyme si elle est
oligomérique.
Lorsque n > 1, on a une cinétique à coopérativité positive. La fixation du ligand induit
des interactions entre les sous-unités qui facilitent la fixation des autres ligands.
Lorsque n < 1, on a une cinétique à coopérativité négative. La fixation d’un ligand
induit des interactions entre les sous-unités de l’enzyme oligomérique qui ne facilitent
pas la fixation des autres ligands.
Dans la représentation de Michaelis et Menten, le phénomène de coopérativité positive
se traduit par une sigmoïde et celui de coopérativité négative par une courbe de type
hyperbolique difficile à différencier de fois de celle fournie par une cinétique
michaelienne. Dans la représentation de Lineweaver et Burk, on n’obtient pas de
droite pour les cinétiques à coopérativité négatives et positive. Pour la coopérativité
positive, on obtient une courbe dont la concavité est orientée vers le haut. Quant à la
coopérativité négative, on obtient une courbe dont la concavité est dirigée vers le bas.
85
Figure :
III-Propriétés caractéristiques des enzymes allostériques
Structure quaternaire : les enzymes allostériques sont des oligomères : ils sont composés
de plusieurs sous-unités appelées « protomères ». Les effets coopératifs sont dus à cette
structure quaternaire.
La dénaturation par des agents doux rompt les liaisons hydrogène. Comme il y a perte de la
coopérativité, l’enzyme devient Michaelienne. Dans ce cas, le terme exact à) employer est
« désensibilisation ».
Les enzymes allostériques natives sont sous 2 formes :
-
R : pour « relâchée ». Cette forme est favorable à la fixation du substrat et
défavorable à la fixation de l’inhibiteur. L’enzyme a alors une très forte affinité
pour le substrat. C’est la forme active de l’enzyme.
-
T : pour « tendue ». Cette forme est défavorable à la fixation du substrat et de
l’activateur et favorable à la fixation de l’inhibiteur. Cette forme de l’enzyme est
peu active ou totalement inactive.
Comportement non Michaelien :
→ Représentation de Michaelis :
Pour les faibles concentrations en substrat, la vi augmente très lentement. Il existe un seuil audelà duquel la vi augmente très rapidement. On appelle « [S]0.5 » la concentration en substrat
pour laquelle l’enzyme est saturée à 50%.
86
Représentation de Lineweaver-Burk :
vi = f([I]) :
Les enzymes de type K :
On détecte l’allostérie en traçant v = f([S]) : on obtient une sigmoïde. En l’absence de
substrat, l’enzyme native est surtout sous forme T. La présence d’un modulateur positif fait
augmenter K0.5 (le K0.5 est aux enzymes allostériques ce que le Km est aux enzymes
Michaeliennes). Inversement, la présence d’un modulateur négatif fait baisser le K0.5. Un
excès de modulateur positif fait apparaître un comportement Michaelien chez l’enzyme : c’est
la « désensibilisation ». Concrètement, l’enzyme passe de la forme T à la forme R. Pour les
enzymes de types K, la présence d’effecteurs fait varier K0.5 mais pas Vmax.
Les enzymes de type V :
Cette fois, K0.5 ne varie pas mais Vmax varie : en présence d’activateur, Vmax augmente et en
présence d’inhibiteur Vmax diminue. On détecte l’allostérie en traçant v = f([I]) ou v = f([A]).
Pour les enzymes de type V, les formes R et T ont la même affinité pour le substrat mais par
pour l’activateur et l’inhibiteur.
87
IV-Effets homotropes et hétérotropes
Lorsque l’effet de coopérativité est provoqué par le substrat lui-même ou par les
produits analogues , cet effet est dit homotrope. L’enzyme est dite homotrope. On
parle dans cette situation d’effet coopératif homotrope. C’est le cas de l’oxygène qui
exerce un effet homotrope sur sa propre fixation à l’hémoglobine.
Lorsque l’effet de coopérativité est provoqué par un effecteur ( inhibiteur ou activateur
), il est nommé hétérotrope. On parlera d’effet coopératif hétérotrope. L’enzyme est
une enzyme hétérotrope.
On peut aussi dire que les interactions entre protéine et ligands sont dites homotrope
lorsqu’elles se font au niveau des sites catalytiques hétérotropes lorsqu’elles
concernent des sites de nature différente. Dans tous les cas, le comportement de
l’enzyme paraît correspondre à des changements de conformations qui affectent soit
KM, soit Vmax de la réaction. les enzymes du premier type sont désignés comme
enzyme des systèmes K, les secondes comme les enzymes des systèmes V.
V-Modèles structuraux
Deux modèles ont été proposés :
- Le modèle de Monod-Wyman - Changeux ( Modèle MWC )
-Le modèle de Koshland-Nemethy-Filter ( Modèle KNF )
1-Modèle concerté de Monod-Wyman-Changeux
La base du modèle de Monod et collaborateur repose sur les faits suivants :
- L’enzyme allostérique est constituée de quelques protomères. Ces protomères sont
associés de façon symétrique. Chaque protomère possède un site catalytique, un site
activateur et un site inhibiteur ou un site régulateur.
- Avant l’addition du ligand, l’enzyme allostérique existe sous deux conformations en
équilibre ; une conformation active de forte affinité pour le substrat appelée forme R (
forme Relâchée ) et une forme inactive de faible affinité pour le substrat appelée
forme T ( forme Tendue ).
- Le ligand peut se fixer à chacune des deux conformations, mais avec des affinités
différentes. De plus l’équilibre entre les deux formes ( R et T ) est modifié par la
fixation du ligand. D’une façon générale, la fixation d’un ligand sur l’une ou l’autre
88
des deux conformations déplace l’équilibre vers la conformation qui a plus d’affinité
pour ce dernier. C’est ainsi que le substrat déplace lorsqu’il se fixe sur la forme R,
l’équilibre vers cette conformation. Il en est de même pour les activateurs. Les
inhibiteurs se fixent sur la forme T et déplace l’équilibre vers cette forme.
- Un changement de conformation d’une sous-unité affecte toutes les sous-unités à la
fois. Il n’existe donc pas de composés hybrides ( TR ). Ce modèle est encore appelé
modèle symétrique ou modèle du tout ou rien ou modèle concerté.
Selon ce modèle, les sous-unités de l’enzyme sont identiques et arrangées de façon
symétrique. Il y a 1 site par ligand sur chaque sous-unité.
Forme T
Forme R
En l’absence de ligand, il y a un équilibre en les 2 formes. Quand le ligand se fixe sur la
forme pour laquelle il a de l’affinité, il déplace l’équilibre en faveur de cette forme.
89
2-Modèle séquentiel de Koshland-Nemethy-Filter
Ce modèle diffère de celui de Monod et collaborateur par 4 aspects essentiels :
- Une seule des deux conformations ( T ) préexiste à l’avènement du substrat
- Tout changement conformationnel d’une sous-unité ne se répercute pas
simultanément mais de façon séquentielle sur les autres sous-unités.
- La symétrie de l’oligomère n’est pas forcement maintenue après la fixation du
ligand.
- Il y a formation d’hybrides ( TR ).
Ce modèle explique aussi les effets coopératifs entre les molécules du substrat et
l’action des effecteurs. Dans le premier cas, l’approche du substrat sur un protomère T
va induire un changement conformationnel qui va parfaire sa fixation en modulant au
mieux le site de fixation. Ce changement va se répercuter séquentiellement sur les
autres protomères jusqu’à ce qu’ils se retrouvent tous dans une conformation optimale
pour la fixation du substrat.
90
La fixation d’une molécule de substrat conduit à une affinité de plus en plus grande
pour le catalytique d’où l’effet coopératif.
Dans le cas des activateurs, une fixation plus accrue du substrat pour les sites
catalytiques est obtenue et dans le cas des inhibiteurs, l’obtention de conformation
plurielle ne pouvant se fixer ni substrat, ni activateur.
A l’heure actuelle, il est difficile de trancher de façon catégorique en faveur de l’un
ou de l’autre de ces deux modèles. Les cinétiques de certaines enzymes allostériques
se laissent mieux interpréter par le modèle de Monod et coll. alors que pour d’autre
c’est le modèle de Koschland et coll. qui est le plus adéquat.
Selon cette théorie, il existerait des formes hybrides R-T et, en l’absence de ligand, il n’y
aurait pas d’équilibre entre les formes R et T.
En règle générale, k1 < k2 < k3 < k4.
Cependant, la β-galactosidase est un tétramère non-coopératif donc la fixation du substrat sur
chaque sous-unité se fait selon la même constance.
VI-Exemples d’allostérie
1-La phosphofructokinase
• La phosphofructokinase (en abrégé PFK) est une enzyme présente dans toutes nos cellules.
• Elle comporte 4 sous-unités presque identiques, avec 4 sites actifs pour une masse
moléculaire
de 340000 daltons.
• Elle catalyse une réaction de transfert de phosphate et d’énergie du coenzyme ATP vers le
fructose 6-phosphate qu’elle active en fructose 1,6-diphosphate. Un proton est libéré.
• La réaction couplée est exergonique et irréversible.
• La PFK est l’enzyme la plus lente de la glycolyse cytoplasmique, voie métabolique du
métabolisme énergétique. Elle catalyse l’étape d’engagement des glucides dans la production
d’énergie. Elle est donc l’enzyme-clé de cette voie métabolique.
91
• La cinétique de la PFK est allostérique; elle est rétroinhibée par le produit final de la
glycolyse, l’ATP. Une molécule d’ATP (effecteur allostérique), différente de celle qui apporte
le phosphate et l’énergie (coenzyme), se fixe sur un site de liaison de chaque protomère et
cette fixation diminue l’affinité du site actif pour le fructose 6-phosphate. Il en résulte un
ralentissement de la vitesse de réaction.
• Lorsque on représente sur un graphe la constante Km de la PhosphoFructoKinase pour son
substrat le Fructose-6-phosphate, en fonction de la concentration de l’ATP, produit final du
métabolisme énergétique, on montre que cette constante Km est d’autant plus élevée que cette
concentration augmente.
• L’affinité de la PFK pour le Fructose-6-phosphate diminue avec l’augmentation de la
concentration du produit final : il y a donc rétroinhibition de l’enzyme par l’ATP.
VII-Voie métabolique
• Les réactions enzymatiques permettent à notre organisme de faire la synthèse des molécules
biologiques dont il a besoin. Cette synthèse s’effectue à partir de composés simples souvent
d’origine alimentaire. Un composé A par exemple peut être le substrat de réactions
enzymatiques conduisant vers des synthèses variées. C’est un carrefour métabolique. Chacune
de ces synthèses va se faire en plusieurs étapes (A, B, C, D,...) chacune catalysée par une
enzyme spécifique (E, F, G,...).
• La vitesse de synthèse du dernier produit dépend de la vitesse de la plus lente de ces
enzymes. Si ce produit final est en quantité insuffisante, il faut que cette enzyme soit activée.
Si au contraire il y a une concentration élevée du produit D, il faut que cet enzyme soit
inhibée.
• Il est souhaitable que les composés intermédiaires ne s’accumulent pas, donc que l’enzyme
la plus lente, qui va être régulée, soit celle qui catalyse la première des réactions conduisant
au produit final. Dans cet ensemble de réactions enzymatiques l’enzyme E, catalysant la
transformation de A en B, première étape de la synthèse, est celle qui doit être régulée par des
effecteurs.
qui permettront de contrôler la vitesse de l’ensemble. Par exemple, un excès de produit final
peut aboutir à l’inhibition de cette première étape : c’est la rétroinhibition.
• Cette unité de production cellulaire d’un composé biologique s’appelle une voie
métabolique.
• Elle est constituée de plusieurs réactions catalysées par des enzymes diverses. Chacune de
ces enzymes peut éventuellement participer à plusieurs voies métaboliques.
92
• Lorsque le métabolisme d’un composé implique un très grand nombre d’étapes, et plusieurs
carrefours métaboliques, la synthèse totale constitue un ensemble de voies métaboliques
successives.
93
CINETIQUE A DEUX SUBSTRATS
Introduction
A part les isomérases, les lyases et les hydrolases, toutes les autres enzymes c’est à
dire, les oxydoréductases, les transférases et les ligases obéissent à des cinétiques à
plusieurs substrats.
Dans le cas de deux substrats donnant deux produits, nous allons distinguer trois
mécanismes d’association des substrats. Ces mécanismes sont :
- Le mécanisme d’association au hasard ou mécanisme bibi random ;
- Le mécanisme bibi ordonné ;
- Le mécanisme bibi ping-pong.
1 – Notion de Cleland
!
Cleland (1963) proposé des formules schématiques particulièrement commodes et
applicables quel que soit le nombre de substrat. Ces formules schématiques traduisent
effectivement les mécanismes enzymatiques rencontrés.
- On présente par un trait horizontal l’enzyme au cours d’un cycle réactionnel et par
des flèches verticales les substrats venant se fixer sur l’enzyme et les produits quittant
celle-ci.
- On nomme : * A et B les substrats dans leur ordre de fixation,
* P, Q les produits dans leur ordre de départ
* E l’enzyme libre
- On désigne par EA, EAB respectivement les complexes binaires et ternaires
transitoires qui résultent de la fixation dissociable de A et de B à l’enzyme.
On doit aussi noter que le nombre de substrat et de produits est indiqué par les préfixes
uni, bi, ter, quad… C’ est ainsi que bibi indique la présence de deux substrats et de
deux produits. La grande majorité des cas réels ne dépassent pas le ter ter.
L’ordre de fixation des substrats et l’ordre de départ des produits doivent être
précises ;
94
 Il peut être séquentiel c’est à dire que tous les substrats se fixent avant qu’il ait
libération du premier produit,
 Il peut être ordonné, c’est à dire que les divers substrats doivent se fixer dans un
ordre défini,
 Il peut être aléatoire ( random ). Ce sont les substrats pouvant se fixer dans un ordre
quelconque.
2- Les mécanismes d’association des substrats
2-1- Mécanisme d’association au hasard ou mécanisme bibi random ou
mécanisme bibi aléatoire
a- La formule schématique de Cleland
Chacun de ces deux substrats peut se fixer l’un avant l’autre. C’est donc un
mécanisme d’association au hasard. La formule schématique proposée par Cleland est
la suivante :
A
B
P
EA
Q
EQ
E
E
EAB  EAQ
composé
ternaire
EB
B
A
EP
Q
P
b- Les réactions
Ka
B
B
EA
K’b
A
E
Produits
EAB
K’a
Kb
B
A
EB
95
E
+
EAB
 EAB  =
x Kb
EAB
car Ka x K’b = K’a
ou
Ka x K’b
EA
constantes de
Ka =
système pour A et B
 EA 
des coefficients de
K’a x Kb
EA

Ka et Kb sont les
 EA  =
dissociation
Ka
du
et K’a et K’b sont
KM du système pour
A et B.
EB
EB
Kb =

 EB 
=
 EB 
Kb
Les substrats A et B sont supposés se lier à des sites distincts. Par conséquent Ka
différent de Ka’ et Kb différent de Kb’ car la fixation d’un premier substrat peut très
bien modifier les propriétés de l’enzyme avant la fixation du second.
La loi de conservation de l’enzyme :  ET  =  E  +  EA  +  EB  +  EAB 
La vitesse de la réaction V = Kc x  EAB 
V
KC
=
 ET
 E  +  EA  +  EB  +  EAB 
EAB
or  EAB  =
, alors
Ka x K’b
EAB
Kc x
V
Ka x K’b
=
 ET 
 E  +  EA  +  EB  +  EAB 
E A B
Kc x
V
Ka x K’b
=
96
 ET 
B
EA
 EB  +
EB
+
Ka
EA
+
Kb
Ka x K’b
E
On divise haut et bas par
Ka x K’b
V
Kc x  A  x  B 
=
 ET 
Ka x K’b + K’b  A  + Ka x
K’b  B  +  A   B 
Kb
K’b
 V ( Ka K’b + K’b  A  + Ka
B
Kb
OR Vmax = Kc x  ET 
 B  +  A   B  ) =  ET  Kc  A  
Alors : V ( Ka K’b + K’b  A  + Ka
B
Kb
K’b
 B  +  A   B  ) = Vmax  A  
Vmax  A  x  B 
V
=
Ka x K’b + K’b  A  + Ka x
K’b  B  +  A   B 
Ka x K’b + K’b  A  + Ka x
Kb
Vmax  A   B 
K’b  B  +  A   B 
Kb
1
=
V
1
AB
Ka x K’b
=
+
V
Vmax  A   B 
Vmax  A  B 
K’b  A 
Ka x K’b
Kb  B 
+
Vmax  A  B 
+
Vmax  A  B 
Ka x K’b
1
Ka x K’b
K’b
Kb
1
=
V
Vmax
+
Vmax  A   B 
+
Vmax  B 
K’b
On sait que
Ka x K’b = K’a x Kb 
97
+
Vmax  A 
K’a
=
Kb
Ka K’b
Ka
Ka x K’a
Donc
=
= K’a
Kb
1
Ka
Ka x K’b
K’b
K’a
1
=
V
Vmax
+
Vmax  A   B 
1
1
+
Vmax  B 
K’a
=
K’b
1 +
V
Vmax
+
Vmax  A 
Ka x K’b
+
+
A

B
Ax B
Supposons que  caractérise la modification de l’affinité de l’enzyme pour le
2è substrat après fixation du 1ér. On peut poser que : K’a = Ka et K’b = Kb
1
1
Ka
=
V
 Kb
 1 +
Vmax
1
+
A
 Ka
Vmax
AB
1
( 1 +
V
]
B
Kb
=
Ka Kb
+
1
)
B
 Kb
+
A
( 1 +
Vmax
)
B
- Ka et Kb sont des constantes de dissociation du système pour les substrats A et B.
- Vmax = vitesse maximale.
Si les deux sites ne présentent aucune interférences alors Ka = K’a et Kb = K’b
1
1
Ka
=
V
 1 +
Vmax
1
+
A
Ka
=
V
Kb
+
( 1 +
Vmax
B
Kb
98
B
Ka Kb
]
AB
1
)
1
+
A
Kb
( 1 +
Vmax
)
B
Exemple de bibi aléatoire : la créatine phosphokinase
• La créatine phosphokinase (CPK) est une enzyme des muscles des Vertébrés. Elle catalyse
le transfert d’un radical phosphoryl du substrat, le phosphate de créatine, vers un coenzyme
transporteur, l’ADP.
• L’affinité de l’enzyme pour ces deux corps chimiques étant voisine, la liaison de l’enzyme
avec chacun d’entre eux se fait dans un ordre qui dépend uniquement des concentrations.
Exemple de bibi aléatoire : la citrate synthase
• La citrate synthase est une enzyme des mitochondries. Elle catalyse le transfert d’un radical
acétyl du premier substrat, l’acétate transporté par le coenzyme A vers l’autre substrat,
l’oxaloacétate.
• L’affinité de l’enzyme pour ces deux corps chimiques étant voisine, la liaison de l’enzyme
avec chacun d’entre eux se fait dans un ordre qui dépend uniquement des concentrations
2-2-Le mécanisme bibi ordonné
a- La formule schématique de Cleland
Soient deux substrats A et B où A se fixe le premier. Dans ce cas, B ne peut se fixer
que sur le complexe binaire EA pour donner un composé ternaire EAB au sien duquel
à lieu la réaction catalytique. Puis il y a successivement libération de P et de Q. ici
l’ordre est préétabli.
A
B
P
99
Q
E
EA
EAB

EPQ
EQ
E
b- Réactions
A
B
Ka
Kb
E
Produits
Kc
EA
EAB
A
E
+
B
L’équation de conservation de l’enzyme:
 ET  =  E  +  EA  +  EAB 
V = Kc  EAB 
EA
EA
Ka =

B
=
 EA 
Ka
 EA   B 
Kb =
 EA   B 
 B =
 EAB 
Kb
 EA  B 
 EAB ] =
EA
or
 EA  =
Kb
 EAB 
Ka
BEA
=
Kb Ka
BEA
V = Kc  EAB  = Kc x
Kb x Ka
L’expression de la vitesse redevient :
BEA
V
Kb x Ka
=
 ET 
 E  +  EA  +  EAB 
BEA
Kc
V
x
Kb x Ka
=
100
 ET 
B +
EA
+
Ka
EAB
Ka x Kb
On divise le dénominateur et le numérateur par  B  / Ka Kb
On arrive à la formule suivante :
BEA
Kb
Ka
Kc
x
x
V
Kb x Ka
 E

=
 ET 
B
 E  x Ka Kb
 E   A  x Ka Kb
EA
Ka Kb
+
+
x
E
Ka x Kb
 E  Ka
E
V
Kc x  B   A 
=
 ET 
Ka Kb +  A  x Kb
+
AB
V x [ Ka Kb +  A  x Kb +  A   B  ] =  ET  x Kc  B   A 
 ET  x Kc  B   A 
V =
Ka Kb +  A  x Kb +  A   B 
1
Ka Kb
=
 A  x Kb
AB
+
 ET  Kc  B   A 
+
 ET  Kc  B   A 
V
Kc  B   A 
Or Vmax =  ET  x Kc
1
Ka Kb
x
BA
=
V
1
1
=
V
Vmax
1
+
Vmax
Kb
[ 1 +
B
101
Kb
+
Vmax  B 
1
Ka Kb
+
]
AB
Vmax
 B 
1
ou
Ka Kb
V
Kb
+
Vmax
1
=
V
1
x
BA
1
ou
1
=
Vmax
Ka
]
A
)
B
Kb
[ 1 +
Vmax
( 1 +
1
+
B
Vmax
2-Représentations graphiques
Mécanisme bibi ordonné
• Lorsqu’une réaction enzymatique implique deux substrats ou un substrat et un coenzyme
libre, les phases de la réaction enzymatique au niveau moléculaire se compliquent : on parle
de cinétique à deux substrats.
• Pour certaines enzymes, il se forme d’abord un premier complexe entre le premier substrat
et l’enzyme. Ce complexe Enzyme-Substrat A forme ensuite un complexe avec le second
substrat : Enzyme-Substrat A-Substrat B. Ce complexe ternaire est alors transformé par
l’action de l’enzyme en un complexe Enzyme-Produit Y-Produit Z qui se dissocie en libérant
dans l’ordre le produit Y et le produit Z.
• L’enzyme libre n’ayant pas d’affinité pour le substrat B, le complexe ne peut pas se former
dans un ordre différent : c’est ce qui justifie l’appellation bibi ordonné qu’on donne à ce
mécanisme.
Exemple de bibi ordonné : l’alcool déshydrogénase
• L’alcool déshydrogénase est une enzyme qu’on trouve dans le cytoplasme de la plupart de
nos cellules. Elle catalyse l’oxydation de l’éthanol en acétaldéhyde en réduisant
simultanément un coenzyme NAD+ en NADH.
• Cette réaction se déroule selon un mécanisme de type bibi ordonné : l’enzyme n’a pas
d’affinité pour l’alcool si elle n’est pas préalablement associée au coenzyme NAD+ en un
102
premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Ethanol se transforme en un
complexe Enzyme-NADH-Acétaldéhyde ; ce dernier complexe se dissocie en libérant
l’acétaldéhyde puis le NAD réduit.
• De nombreuses autres déshydrogénases utilisant le NAD comme coenzyme suivent un
mécanisme de type bibi ordonné.
Exemple de bibi ordonné : la malate déshydrogénase
• La malate déshydrogénase est une enzyme qu’on trouve dans toutes les cellules. Elle
catalyse l’oxydation du malate en oxaloacétate en réduisant simultanément un coenzyme
NAD+ en NADH.
• Cette réaction se déroule selon un mécanisme de type bibi ordonné : l’enzyme n’a pas
d’affinité pour le malate si elle n’est pas préalablement associée au coenzyme NAD+ en un
premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Malate se transforme en un
complexe Enzyme-NADH-Oxaloacétate ; ce dernier complexe se dissocie en libérant
l’oxaloacétate puis le NAD réduit.
• De nombreuses autres déshydrogénases utilisant le NAD comme coenzyme suivent un
mécanisme
de type bibi ordonné.
.
2-3- Le mécanisme bibi ping-pong
a- Formule schématique de Cleland
C’est un mécanisme ordonné. Les deux substrats A et B ne peuvent jamais se trouver
en même temps sur l’enzyme. Le substrat A se fixe le premier sur l’enzyme pour
donner le produit P. A laisse sur l’enzyme un groupement qui sera renvoyé
ultérieurement sur B ou vice versa. Ensuite le second substrat c’est à dire B se fixe sur
l’enzyme modifiée E’ et fourni le second produit Q pour être libéré et retourné à sa
formule initiale (E). Il n’y a donc pas de formation de composé ternaire.
A
P
103
B
Q
E
EA

E’p
E’
E’B  EQ
- Comme exemple on peut prendre celui de la réaction catalysée par la nucléoside
diphosphate kinase ou NDkinase ( où N désigne une base de nucléotide c’est à dire
Adénine (A), Guanine (G), Uracile (U) ou Cytosine (C) ).
XTP
Enzyme
+
Enzyme
XDP +
P
Enzyme
P + YDP
YTP
+
Enzyme
Réaction globale :
X T P
+
Y D P
Y T P + Enzyme
La NDP kinase a des comportements ping-pong car elle présente un stade
intermédiaire phosphorylé.
- Comme exemple on peut citer encore les transaminases fonctionnant à l’aide de
phosphate de pyridoxal (PLP) comme coenzyme.
L-Aspartate + Enzyme-PLP
oxaloacétate
+
L-glutamate
+
Enzyme , PMP
2- oxoglutarate + Enzyme , PMP
Enzyme-PLP
Réaction globale :
L-Aspartate + 2-oxoglutarate
glutamate
104
oxaloacétate
+
L-
- Comme exemple on peut citer les déshydrogénases
b- Les réactions
A + E
AE
E’ + B
BE’
PE’
QE
E’ + P
E + Q
Ou simplement:
A
( EA
E’P )
E
E’
Q
Q
A
B
( EQ
E’B )
B
On se contente dans ce cas à donner directement la formule :
1
1
=
V
Ka
[ 1 +
Kb
+
Vmax
A
]
B
• Pour d’autres enzymes, la réaction sera catalysée en deux temps.
• Le complexe formé entre l’enzyme et le substrat A est transformé d’abord en enzyme +
produit Y, mais l’enzyme E a été chimiquement modifiée en enzyme E’ au cours de cette
première partie de la réaction.
105
• L’enzyme E’ ayant une affinité pour le deuxième substrat, va former un deuxième complexe
Enzyme E’-Substrat B qui va être transformé en complexe Enzyme-Produit Z dans une
seconde partie de la réaction où l’enzyme va retrouver sa forme chimique initiale.
• Il n’y a jamais de complexe ternaire dans un tel mécanisme, mais l’enzyme (ou un
coenzyme
lié à sa structure) subit une transformation réversible et provisoire qui permet le lien entre les
deux substrats.
• C’est ce qui justifie l’appellation de ping-pong qu’on donne à ce mécanisme.
Exemple de ping-pong : l’alanine aminotransférase = ALAT
• L’ALAT catalyse le transfert de la fonction amine de l’alanine vers l’α-cétoglutarate qu’elle
transforme en glutamate.
• Dans un premier temps, l’ALAT se lie à l’alanine puis transfère la fonction amine sur un
coenzyme lié : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesser
d’être lié à l’enzyme. L’enzyme se dissocie alors du pyruvate.
• Dans le second temps, l’enzyme liée au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe
avec l’α-cétoglutarate, puis transfère la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate
de pyridoxal, vers le second substrat qui est transformé en glutamate. Enfin, le complexe
ALATglutamate se dissocie : l’enzyme et son coenzyme lié ont recouvré leurs structures
initiales.
Exemple de ping-pong : l’aspartate aminotransférase = ASAT
• L’ASAT catalyse le transfert de la fonction amine de l’aspartate vers l’α-cétoglutarate
qu’elle transforme en glutamate.
• Dans un premier temps, l’ASAT se lie à l’aspartate puis transfère la fonction amine sur un
coenzyme lié : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesser
d’être lié à l’enzyme. L’enzyme se dissocie alors de l’oxaloacétate.
• Dans le second temps, l’enzyme liée au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe
avec l’α-cétoglutarate, puis transfère la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate
depyridoxal, vers le second substrat qui est transformé en glutamate. Enfin, le complexe
ASATglutamate se dissocie : l’enzyme et son coenzyme lié ont recouvré leurs structures
initiales.
106
3-Représentations graphiques
3-1- Cas du mécanisme bibi random
On sait que  caractérise la modification de l’affinité de l’enzyme pour le deuxième
substrat après modification du premier.
- Dans le cas où l’association d’un substrat augmente l’affinité de l’enzyme pour
l’autre substrat alors   1.
- Dans le cas où l’association d’un substrat diminue l’affinité de l’enzyme pour
l’autre substrat alors  1.
107
Travaux Dirigés
P au temps t0 [A0] = 10-3 M ; au temps
1-Soit la réaction de premier ordre : A
t = 5 sec [A] = 1,2.10-4 M.
a-Calculer la constante de vitesse de la réaction.
b-Calculer [A] au temps t = 12 sec.
2-Quelle relation existe t-il entre KM et [S] lorsque la vitesse d’une réaction enzymatique est
égale à 90% de la vitesse maximum ?
3-Une enzyme E hautement spécifique hydrolyse un -D-glucoside pour donner du glucose.
Proposer un nom systématique de cette enzyme.
4-La classification générale des enzymes (Ec) a permis de nommer l’enzyme E1 : 1,4--Dglucane cellobiohydrolase Ec 3.2.1.91.
Donner :
a- Le nom du substrat de l’enzyme ;
b- Le nom et la structure du produit libéré ;
c- La classe de cette enzyme ;
d- La sous-classe ;
e- La sous-sous classe ;
f- Comment peut-on appeler l’enzyme qui hydrolyse le produit libéré par l’enzyme E ?
g- Proposer un nom systématique ;
h- Une -glycosidase peut elle hydrolyser ce substrat ? Pourquoi ?
5-L’histidine est désaminée par une enzyme l’histidinase. On note la quantité d’histidine
désaminée par min et ceci pour différentes concentrations d’histidine.
Histidine
Urocanate + NH3
[Histidine] x 10-5 M
Quantité desaminée (moles) x10-9
0,1
0,11
108
0,3
0,25
0,5
0,34
1,0
0,46
3,0
0,61
5,0
0,64
a- L’histidine obéit-elle à la cinétique de Michaelis-Menten ? Si oui, quelle est la valeur
de KM ?
b- Quelle est la valeur de Vmax ?
6-Une lactase sert de matériel expérimental. Aux concentrations données de lactose, les
vitesses initiales de la réaction sont les suivantes :
Concentration molaire de lactose 10-4 M
50
V (moles de lactose hydrolysé / min / mg)
d’enzyme x 10-6
155
20
103
10
68,5
7
53
5
40,6
a-Déterminer graphiquement les constantes de l’équation de Michaelis (KM et Vmax )
relative à ce système.
b-Faites deux représentations graphiques de ce système (Michaelis et L.B )
c- Comparer ces constantes.
7-On étudie l’influence du pH sur la constante de Michaelis Menten de la 6-phosphogluconate
déshydrogénase.
Cette enzyme catalyse la réaction :
6-phosphogluconate + NADP
acide 6-phosphogluconique + NADPH2
Le NADPH2 absorbe à 340 nm. L’activité de la déshydrogénase a été mesurée
spectrophotométriquement en mesurant la densité optique à 340 nm qui est proportionnelle à
la concentration de NADPH2
[ substrat ] x 10-4 M
0,174
0,267
Accroissement de l’extinction pendant les 5 premières min
pH 7,6
0,074
0,085
109
pH 9,0
0,034
0,047
0,526
1,666
4,000
0,098
0,114
-
0,075
0,128
0,167
A quel pH l’enzyme a t-il le plus d’affinité pour le substrat.
8-A partir des résultats expérimentaux suivant ;
a-Montrer si l’inhibiteur est compétitif, non compétitif ou incompétitif,
b-Déterminer le KM
c-Déterminer le Ki
d-Quelle est la valeur de Vmax
[ substrat ] mM
2,0
3,0
4,0
10,0
15
µg de produit formé / heure
Sans inhibiteur
Avec inhibiteur
141
89
177
119
211
151
309
260
373
310
9-Un biochimiste veut caractériser une amylase fongique. Le milieu réactionnel est composé
de :
-
100 µl d’amidon 2% ( poids / volume ) préparé dans le tampon acétate 20 mM pH
5,4 ;
-
100 µl de solution enzymatique contenant 15 µg de protéine.
Le milieu réactionnel est incubé à 37°C pendant 30 min. Le dosage de maltose libéré par
l’enzyme nous a donné 8,5 mg. Une étude cinétique plus approfondie a revelé au biochimiste
qu’il a travaillé en condition saturante de substrat. Déterminer :
a- La vitesse initiale de la réaction en Unité Internationale ( UI ).
b- L’activité spécifique en UI / mg de protéine.
c- La concentration d’enzyme libre dans le milieu réactionnel.
d- La vitesse initiale si on double la concentration d’enzyme du milieu réactionnel.
e- Quelle serait la vitesse observée en présence de substrat 25 mg / ml ?
10-Une enzyme catalyse une réaction entre deux substrats A et B. Afin de déterminer le
schéma de la réaction, on a effectué différentes mesures de vitesses initiales en présence de
concentrations variables de substrats. On a obtenu les résultats suivants:
Concentration
Concentration
Concentration
Concentration
110
Concentration
Concentration
de A (10-4 M)
de B : 1x 10-3
M
0,5
0,57
0,62
0,65
0,66
1
2
5
10
20
de B : 2 x 10-3
M
0,7
0,9
1
1,1
1,15
de B : 5 x 10-3
M
1
1,37
1,73
1,9
2
de B : 10 x 10-3 de B : 20 x 10-3
M
M)
1,1
1,25
1,65
1,8
2,2
2,6
2,5
2,9
2,7
3,2
Les vitesses exprimées en mM de produit apparu par min.
1- Déterminer le mécanisme de la réaction.
2- Déterminer les constantes de Michaelis pour chacun des deux substrats, la vitesse
maximale de la réaction.
11-On étudie la cinétique de deux enzymes A et B. A partir des données suivantes, distingues
le type d’enzyme (c’est à dire si c’est un enzyme ordinaire ou allostérique) et expliquez
l’allure des courbes représentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat.
[Substrat]
Vitesse avec l’enzyme A
Vitesse avec l’enzyme B
0
0,5
1
2
3
4
5
6
8,0
0
8,8
14,0
19,0
21,5
22,8
23,3
23,5
23,6
0
3
1,0
4,7
12,4
19,0
21,8
22,8
23,3
12-Soit la chaîne de biosynthèse d’un composé F :
x
y
z
A
B
C
t
D
u
E
F
A est un substrat initial x, y, z, t et u sont des enzymes.
Les composés A et F ont des structures très différentes, alors que E et F ont des structures très
proches.
1- On étudie isolement la réaction E
F on obtient la courbe suivante :
1/V
1
111
Quel type de courbe obtient-on quand on ajoute une grande quantité de F au milieu
réactionnel ?
2- On étudie isolement la réaction A
B on obtient la courbe 2
a- Après avoir soumis l’enzyme à un traitement spécial, on obtient la courbe 3
V
V
2
3
Que peut-on dire de x ? Donnez le type de traitement.
b- Si on ajoute F au milieu réactionnel on note une diminution.
Quels sont les caractères généraux de l’action de F ?
Travaux Pratiques
I-QUELQUES CONSEILS
A- CONSEILS D’ORDRE GENERAL
112
Les séances de travaux pratiques d’enzymologie sont obligatoires pour les étudiants de
SN II.
Ils ne doivent par conséquent pas manquer de séances. Ils doivent être à l’heure et vêtus
de leur blouse blanche de manipulation. Une séance de TP dure 3 heures. Les étudiants
doivent bien préparer leur TP avant de venir en salle pour la manipulation. Pour avoir des
explications sur la compréhension des TP, ils doivent s’adresser soit à l’enseignant soit au
moniteur. Pour l’obtention des produits chimiques et des solutions, les étudiants doivent
s’adresser au technicien du jour. Les étudiants ne doivent pas avoir honte ou peur de
demander des explications sur ce qu’ils n’ont pas compris car le travail dans une salle de TP
est dangereux. Il est dangereux pour l’étudiant, le technicien, l’enseignant, ses voisins, la salle
de TP, car parmi les produits chimiques utilisés certains sont inflammables, corrosifs et
d’autres toxiques. L’intoxication peut se faire par voie buccale, par inhalation et par
absorption cutanée. Pour éviter ces problèmes, les étudiants doivent ;
-s’informer des dangers présentés par les produits chimiques manipulés ;
-éviter de manipuler toute substance à mains nues ;
-transvaser tous les produits chimiques sous la hotte ;
-évaporer les solvants volatils au bain marie ou sous vide en s’assurant
de
condensation ;
-ne rien jeter dans le levier ;
-ne jamais disperser, ni abandonner les produits chimiques ;
-ne jamais distiller à sec ;
-ne jamais manger, ni fumer en salle de TP;
-éviter de boire en salle de TP.
A la fin de chaque séance, les étudiants sont tenus de remettre leur compte rendu à
l’enseignant après avoir lavée et bien rincée la verrerie utilisée. Les paillasses doivent être
propres. Les étudiants qui vont passer outre ces recommandations se verront sévèrement
sanctionnés par l’enseignant. Un examen est prévu à la fin de toutes les séances de TP.
B-NETTOYAGE DU MATERIEL
Pour la bonne marche des expériences, comme pour la validité des résultats, il est
nécessaire que la verrerie utilisée soit très propre. Avant, après chaque usage, il convient donc
de laver le matériel d’abord à l’eau courante, puis de le rincer trois fois à l’eau distillée, à
l’aide d’une pissette. Trois lavages successifs utilisant chaque fois un peu d’eau, sont plus
efficaces qu’un seul lavage qui en consomme beaucoup.
113
L’utilisation de verrerie mouillée est sans inconvénient pour beaucoup de
manipulations. Il n’en est évidemment plus de même pour des opérations à effectuer en milieu
anhydre ou mettant en jeu des solutions titrées dont il est important de ne pas modifier la
concentration. Dans ce cas, il est nécessaire d’éliminer au départ toute l’eau de lavage. Pour
cela, la verrerie courante est séchée à l’étuve à 100°C. Les récipients en matière plastique sont
simplement essuyée avec un papier filtre ou séchée à l’air, à l’abri des poussières. La verrerie
graduée ou jaugée ne doit pas être soumise à l’action de la chaleur, sous peine de fausser les
volumes marqués par suite des résidus de dilatation. Il ne faut donc jamais la porter à l’étuve.
C’est d’ailleurs pour la même raison que l’on ne doit jamais y verser de liquides chauds.
Pour éliminer l’eau, on effectue simplement trois rinçages avec la solution à utiliser.
1- Pipette
Avec un papier filtre, essuyer soigneusement l’extrémité de la pipette, en particulier la
pointe, afin d’enlever au maximum l’eau retenue par capillarité dans le conduit effilé. Aspirer
rapidement un peu de liquide à mesurer. Obturer aussitôt avec l’index le tube de la pipette afin
que le liquide ne descende pas. Maintenir ensuite la pipette horizontalement de façon à
pouvoir cesser l’obturation sans que le contenu ne s’écoule. Tout en roulant la pipette entre
les doigts, imprimer alors au liquide un mouvement de va-et-vient afin qu’il mouille toute la
partie inférieure utile de l’instrument. Laisser s’écouler dans l’évier, le liquide employé.
Essuyer à nouveau la pointe de la pipette et recommencer l’opération encore deux fois.
2- Verrerie jaugée et graduée
Elle est destinée à permettre une mesure volumétrique directe, la lecture de ces
volumes reposant sur la position d’un interface liquide-air par rapport à des traits de repère ou
à une échelle graduée fixe. Par suite de la tension superficielle du liquide, cette interface,
surtout dans le cas de récipients de faible section, affecte la forme d’un ménisque.
L’appréciation de sa position par rapport aux traits de repère demande quelques précautions.
Par convention, on considère que la position de l’interface est déterminée par celle de la
tangente horizontale au ménisque.
Il en résulte :
114
-que pour apprécier correctement la position de l’interface, l’œil doit se trouver
exactement à la hauteur de la tangente horizontale au ménisque, sous peine d’erreurs de
parallaxe.
-que le récipient de mesure (burette, pipette etc..) doit être tenu bien verticalement au
moment de la lecture, de façon à permettre l’estimation précise de la coïncidence du trait
de repère avec la tangente horizontale au ménisque.
3- Ballons ou fioles jaugées
Leur col allongé porte un trait circulaire, dit trait de jauge. Leur remplissage doit se faire
de façon que le plan déterminé par le trait de jauge coïncide avec la tangente au ménisque
formé par le liquide utilisé. Le volume ainsi délimité est indiqué sur le verre du ballon ou de
la fiole.
C- LE MATERIEL DE LABORATOIRE ET LEUR UTILISATION
1-Pipettes
Il en existe trois types principaux:
-graduée;
-jaugées un trait;
-jaugées à deux traits.
Les pipettes graduées et jaugées à un trait sont appelées pipettes à bout. Le troisième type
constitue les pipettes à traits.
1-1- Description des pipettes
1-1-1- Pipettes jaugées à un trait
Le trait jaugé est gravé sur le tube étroit surmontant le réservoir cylindrique. Le
volume de liquide s’écoule à partir du trait jusqu’à vidange spontané complète de la
pipette. Il tient compte, par conséquent, de la quantité de liquide retenue par capillarité
dans la pointe de la pipette. Il ne faut donc pas souffler dans la pipette pour essayer de
recueillir ce liquide.
115
1-1-2- Pipettes graduées
Leur réservoir est généralement gradué en cm3 (CC) ou en ml avec des subdivisions
intermédiaires dont l’intervalle correspond à un volume de 1/10 de cm3. Il existe cependant
des pipettes dites capillaires, de faible capacité, où l’intervalle entre petites divisions
correspond à un volume de 1/100 voire 1/1000 de cm3. Les volumes indiqués sur le réservoir
de la pipette ont une valeur croissante du haut vers la pointe. Le volume lu, correspondant à
une division donnée, représente le volume de liquide écoulé depuis la graduation 0.
1-1-3- Pipettes jaugées à deux traits
Les traits de jauge sont gravés de part et d’autre du réservoir, sur la partie tubulaire
étroite de la pipette. Le volume noté sur le réservoir correspond au volume de liquide écoulé
entre ces deux traits de jauge.
1-1-4- Remarques importantes
Dans le cas des pipettes à bout, la quantité de liquide retenue par capillarité après
vidange est fonction de la viscosité du liquide utilisé. Comme l’étalonnage de ce type de
pipette est effectué à l’eau distillée, l’utilisation d’un autre liquide peut être source d’erreur.
Avec des solutions diluées, l’erreur est très faible.
Chaque fois que l’on aura à effectuer une mesure précise, on devra donc utiliser une
pipette à traits, où la mesure de volume est indépendante de la tension superficielle du liquide
utilisé.
Les pipettes graduées peuvent être également utilisées comme des pipettes à traits.
Ainsi pour mesurer 1,2 cm3 à l’aide d’une pipette graduée on a intérêt à considérer le volume
écoulé entre 0 CC et 1,2 CC ou entre deux graduations séparées par 1,2 cm3.
La quantité de liquide retenue est fonction du diamètre du tube. Dans le cas des
pipettes à bout, il importe, pour la validité des mesures, que la section de la pointe de la
pipette ne soit pas modifiée. Il est, par conséquent, nécessaire de ne pas briser ni même
ébrécher l’effilure de ces pipettes.
Pour cela, parmi les précautions à prendre, deux sont essentielles.
116
-lorsque l’on place des pipettes propres sur leur support, toujours le mettre pointe en l’air, ce
qui a aussi pour avantage de minimiser le dépôt de poussière à l’intérieur des instruments et
de faciliter leur égouttage.
-lorsqu’on prélève un liquide dans un récipient, ou lors de la vidange de la pipette, ne jamais
toucher le bout du récipient avec la pointe.
1-2- Utilisations des pipettes
1-2-1- Remplissage des pipettes
La pipette, rincée et éventuellement débarrassée de son eau résiduelle, est saisie en
dessous du renflement de sécurité entre le pouce et le médius.
Plonger l’effilure le plus possible dans le liquide à prélever sans toucher le fond du
récipient de façon à ne pas léser la pointe de la pipette. Si l’on plonge trop peu, il arrivera, lors
de l’aspiration que des bulles d’air montent dans le liquide et ce qui est plus grave, on risque
d’avaler la solution.
Aspirer avec précaution, de façon à ce que le liquide monte au-dessus du trait de jauge
supérieur. Obturer alors rapidement l’orifice d’aspiration de la pipette avec la pulpe de
l’index.
Pour cette opération, il faut avoir soin de ne pas mouiller l’orifice de la pipette avec les lèvres,
et d’autre part la peau de l’index doit être sèche.
Sortir l’extrémité de la pipette du liquide et sécher la pointe avec du papier filtre.
Appuyer la pointe contre la paroi du récipient de prélèvement. Soulever le récipient de façon à
placer la pipette verticalement et le trait supérieur de jauge, à hauteur de l’œil.
L’extrémité de la pipette touchant toujours la paroi du récipient, par des changements de
pression de l’index sur l’orifice, laisser écouler le liquide jusqu’à ce que le ménisque devienne
tangent au trait de jauge ou la graduation choisie. Par une pression plus forte, on arrête
l’écoulement. Le niveau du liquide doit demeurer invariable.
1-2-2- Vidange de la pipette
117
On transporte la pipette au-dessus du récipient d’utilisation. La pointe de l’instrument
est alors appliquée contre la paroi du vase et on laisse écouler le liquide en soulevant l’index.
Selon le type de pipette utilisée, l’écoulement est poursuivi jusqu’à vidange spontanée
complète de la pipette ou arrêté au trait de jauge inférieur ou à la graduation désirée par
simple pression de l’index.
Dans ces deux derniers cas le trait de jauge ou la graduation doit être à la hauteur de l’œil.
2- Burette (burette de MOHR à robinet)
2-1- Description de la burette
Elle est formée d’un tube gradué cylindrique, légèrement évasé à la partie supérieure pour
aider au remplissage, effilé à la partie inférieure pour limiter l’écoulement du liquide mesuré.
Un robinet permet de régler ou d’arrêter l’écoulement.
Comme toute la verrerie graduée, la burette doit être utilisée bien verticale sur son
support, afin que les volumes versés soient lus dans de bonnes conditions, selon le protocole
défini plus haut.
Les burettes employés aux T.P ont une capacité de 25 ou 50 CC. Elles sont graduées en
cm3, avec des subdivisions non chiffrées dont l’intervalle correspond au 1/10 de cm3.
Lorsque l’instrument est en position d’utilisation, le zéro de la graduation est au sommet
de l’échelle. Cette disposition permet une lecture directe des volumes versés à partir du niveau
zéro. Notons que l’on peut prendre pour zéro un point quelconque de la graduation, le volume
liquide utilisé correspond alors à la différence entre le volume exprimé par la graduation de
départ, et celui correspondant à la graduation finale. Ainsi, entre la graduation 7,2 et la
graduation 11,8 on aura versé 4,6 cm3.
2-2- Utilisation de la burette
2-2-1- Remplissage
La burette propre, débarrassée de son de rinçage, robinet fermé et bien verticale sur
son support, est remplie directement en versant dans l’évasement supérieur la solution à
utiliser. Ce remplissage doit être assez lent afin de na pas faire mousser le liquide, de ne pas
118
introduire des bulles d’air qui adhéreraient aux parois du tube gradué. Arrêter le remplissage
dès que l’on a dépassé (la graduation 0) de 2 cm.
2-2-2- Mise à zéro
Placer sous la burette un récipient convenable. Ouvrir le robinet de façon à obtenir un
écoulement très lent du liquide à mesurer. Cet écoulement permet de remplir la pointe effilée
de l’instrument avec la liqueur de titrage. Arrêter l’écoulement lorsque le ménisque du liquide
est tangent à la graduation zéro. Pendant cette opération, il faut regarder uniquement la
graduation et le niveau liquide, sans se soucier de l’écoulement. Dès que le ménisque est
arrivé au niveau voulu, fermer le robinet.
Toucher la pointe de la burette avec la paroi du vase où a été recueilli le liquide écoulé,
afin d’éliminer tout liquide extérieur qui risquerait de fausser le dosage.
2-2-3- Ecoulement de la solution
Ouvrir le robinet de façon à obtenir un écoulement suffisamment lent, goutte à goutte.
Tandis que le liquide s’écoule, de la main droite, et à l’aide d’un agitateur, le contenu du vase
à réaction, surveiller uniquement ce dernier, sans se préoccuper du niveau dans la burette.
TRAVAUX PRATIQUES I
ETUDE COMPARATIVE DES ACTIVITES AMYLASIQUE ET INVERTASIQUE
DES SUCS DIGESTIFS DES ESCARGOTS Archachatina ventricosa et Achatina
achatina
Introduction
L’hydrolyse des glucides permet la libération de sucres réducteurs qui peuvent être
dosés selon la méthode de Bernfeld (1955) utilisant le DNS. Les sucs digestifs des escargots
géants Archachatina ventricosa et Achatina achatina contiennt toutes les enzymes
responsables de ces activités hydrolytiques. Dans cette partie des travaux pratiques, nous
allons comparer ces activités entre elles.
119
1- Détermination de la courbe d’étalonnage
1-1-Mode opératoire
La droite d’étalonnage doit nous permettre de déterminer la quantité de sucres
réducteurs présente dans le milieu réactionnel. Pour l’obtenir, nous devons réaliser 5 dilutions,
dans 5 tubes à essai selon le tableau suivant :
Tubes à essai
T
1
2
3
4
Volume en ml de glucose ( 0,002 g/ml )
0
0,1
0,2
0,4
0,5
Volume d’eau distillée en ml
1
0,9
0,8
0,6
0,5
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
Volume de DNS en ml
Bien mélanger le contenu de chaque tube
Apres toutes ces dilutions, chauffer tous les tubes au bain marie bouillant pendant 5
minutes et les laisser refroidir sur la paillasse pendant 10 min. Ensuite, ajouter dans chaque
tube 4 ml d’eau distillée. Bien mélanger et lire les densités optiques à 540 nm au
spectrophotomètre contre le témoin (tube T).(Se faire aider par le Technicien ou moniteur du
jour).
1-2- Questionnaire pour le compte rendu
a- Déterminer la quantité de sucres réducteurs présente dans chaque tube à essai. Cette
quantité doit être exprimée en µg.
b- Tracer la courbe : densités optiques en fonction de la quantité de sucres réducteurs
exprimée en µg.
2-Détermination des activités enzymatiques
120
2-1-Mode Opératoire
Diluer au 250è les sucs digestifs des escargots géants Archachatina ventricosa et Achatina
achatina avec le tampon acétate 20 mM pH 5,0 pour obtenir un volume final de 50 ml. La
concentration protéique de la solution enzymatique préparée est de 0,7 ml/mg.
Réaliser les milieux réactionnels suivants :
Essai
-0,4 ml de tampon acétate 20 mM pH 5,0 ;
-0,2 ml de solution enzymatique (suc digestif dilué au 250ème) ;
-0,4 ml de substrat (amidon ou saccharose).
Témoin (T)
-0,6 m l de tampon acétate 20 mM pH 5,0 ;
-0,4 ml de substrat (amidon ou saccharose).
NB : Deux substrats (saccharose et de l’amidon ) et deux sucs digestifs (Archachatina
ventricosa et Achatina achatina ) seront à votre disposition. Vous aurez au total 8 essais et 8
témoins car chaque essai a son témoin.
Incuber tous les tubes (essais et témoins) au bain marie à 37 °C pendant 15 minutes. Ajouter
ensuite 0,3 ml de DNS dans chacun d’eux, agiter et chauffer au bain marie bouillant (100 °C)
pendant 5 minutes et laisser refroidir pendant 10 minutes sur la paillasse. Ajouter 5 ml d’eau
distillée dans tous les tubes. Bien mélanger et lire les densités optiques (D.O) à 540 nm au
spectrophotomètre contre le témoin (T).
2-2-Questionnaire pour le compte rendu
a-Convertir toutes les densités optiques en micromole de sucres réducteurs
b-Déterminer les vitesses des réactions et les activités spécifiques.
c-Représenter sous forme d’histogramme ces différentes activités spécifiques.
121
d-Interprêter ces résultats
TRAVAUX PRATIQUES II
DETERMINATION DU pH OPTIMUM D’HYDROLYSE DE L’ ACTIVITE
AMYLASIQUE DU SUC DIGESTIF DE L’ESCARGOT GEANT Archachatina
ventricosa
1- Mode opératoire
Diluer au 250è le suc digestif de l’escargot donné avec le tampon acétate 20 mM
(pH ;4,0 ; 4,4 ; 5,0 ; 5,4 ) et le tampon phosphate 20 mM (pH 6,0; 6,4; 7,0 ; 7,4 ; 8 ) pour
obtenir dans chaque cas un volume final de 50 ml. Ces différentes solutions enzymatiques
doivent être bien conservées au frais pour la suite de la manipulation. Préparer aussi
différentes solutions de cellulose 1 % (p/v) (250 ml) dans chaque tampon de pH sus-cités.
Faire ensuite les 9 dilutions (dans chaque cas) dans 9 tubes à essai, selon le tableau suivant :
pH
4,0
4,4
5,0
5,4
6,0
6,4
7,0
7,4
8
Tubes
T
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Volume de
A (ml)
0,6
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
Volume de
B (ml)
0
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Bien mélanger le contenu de chaque tube
Préincuber ces milieux réactionnels en mettant tous ces tubes au bain marie à 37°C pendant 5
min puis ajouter dans chaque tube 0,4 ml de substrat préparé dans les tampons
correspondants.
122
Le substrat à utiliser est l’amidon 1%
Solution A : tampon acétate ou phosphate,
Solution B : solution enzymatique (suc digestif dilué au 250è dans les tampons acétate et
phosphate 20 mM).
Incuber tous les tubes (essais et témoin) au bain marie à 37 °C pendant 10 minutes. Ajouter
ensuite 0,3 ml de DNS dans chacun d’eux, agiter et chauffer au bain marie bouillant (100 °C)
pendant 5 minutes et laisser refroidir pendant 10 minutes sur la paillasse. Ajouter 4 ml d’eau
distillée dans tous les tubes. Bien mélanger et lire les densités optiques (D.O) à 540 nm au
spectrophotomètre contre le tube témoin (T).
N.B : vous connaissez maintenant le pH optimum d’hydrolyse pour l’invertase du suc digestif
d’escargot, pour la suite du travail, vous aller utiliser la solution enzymatique préparée à
partir de ce pH comme solution enzymatique afin d’obtenir des activités enzymatiques
intéressantes. Il en est de même pour le substrat.
2- Questionnaire pour le compte rendu
a-Quel est la densité optique la plus élevée. Si on considère que cette valeur représente 100
% d’activité, quels seront les pourcentages d’activité des autres densités optiques ?
b- Tracer la courbe ; % d’activité en fonction du pH.
c- Quelle est la zone de pH optimum d’hydrolyse pour l’activité amylasique du suc digestif de
l’escargot ?
d- Déterminer le pH optimum d’hydrolyse de l’activité amylasique du suc digestif de
l’escargot.
e-Quelles conclusions pouvez vous tirer ?
TRAVAUX PRATIQUES III
ETUDE DE LA DIGESTIBILITE in vitro DE QUELQUES AMIDONS DE
TUBERCULES ET RACINES
1- Mode opératoire
Préparer deux séries de 10 tubes : les tubes de la première série doivent contenir
chacun 0,4 ml de tampon et 0,2 ml de solution enzymatique (suc digestif de l’escargot géant
123
Archachatina ventricosa). Ceux de la deuxième série, doivent contenir seulement 0,6 ml de
tampon. Ils serviront de témoin.
Tous ces tubes sont pré-incubés pendant 5 min et 0,4 ml d’amidon (1%, p/v) sont
ajoutés dans tous les tubes. Incuber ces tubes à nouveau (1ère et 2è séries) au bain marie à
37°C pendant 15 min. Ajouter dans chaque essai et témoin (ne contenant pas de solution
enzymatique) 0,3 ml de DNS. Agiter et chauffer au bain marie bouillant pendant 5 minutes
ces tubes et les laisser refroidir sur la paillasse pendant 5 minutes. Ajouter 4 ml d’eau distillée
dans ces tubes. Bien mélanger et lire la densité optique (D.O) de l’essai à 540 nm au
spectrophotomètre contre le tube témoin.
2- Questionnaire pour le compte rendu
a- Déterminer la quantité de sucres réducteurs en µg présente dans chaque tube à essai.
b-Représenter ces résultats sous forme d’histogramme.
c-Interpréter ces résultats.
TRAVAUX PRATIQUES IV
ACTION DU TRIS SUR L’ACTIVITE CELLULASIQUE DU SUC DIGESTIF
D’ESCARGOT
Introduction
L’activité d’une enzyme peut être modifiée par la présence de composés
autre que le substrat : on les appelle effecteurs. Ils jouent un rôle important dans les
124
phénomènes de régulation et sont également fort utiles dans l’étude des mécanismes d’action
des enzymes. On peut les classer en deux catégories :
- les activateurs qui augmentent la vitesse de la réaction enzymatique,
- les inhibiteurs qui la réduisent.
1- Action du TRIS sur l’activité catalytique de la cellulase du suc digestif d’escargot
1-1-
Mode opératoire
Faire 3 dilutions de la solution de TRIS 40 mM pour obtenir les concentrations de 10
mM et 5 mM pour un volume final dans chaque cas de 10 ml dans le tampon de pH optimum.
Préparer 14 tubes selon le tableau suivant :
Tubes
Volume de Tris
En ml
E1
0,4
T1
0,4
E2
0,4
T2
0,4
E3
0,4
T3
0,4
E4
0,4
T4
0,4
E5
0,4
T5
0,4
E6
0,4
T6
0,4
Volume du tampon 0
(ml)
0,2
0
0,2
0
0,2
0
0,2
0
0,2
0
0,2
Volume de la solution 0,2
enzymatique (ml)
0
0,2
0
0,2
0
0,2
0
0,2
0
0,2
0
Préincuber tous les tubes au bain marie à 37°C pendant 10 min
et ajouter le substrat selon le protocole suivant
Pourcentage
Cellulose
Volume
cellulose
(ml)
de 0,1
0,1
0,2
0,2
0,4
0,4
0,6
0,6
0,8
0,8
1
1
de 0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
Laisser incuber tous les milieux réactionnels pendant 15 minutes à 37 °C et ajouter
dans chaque tube 0,3 ml de DNS. Mettre les tubes au bain marie bouillant pendant 5 minutes,
les laisser reposer sur la paillasse pendant 5 minutes. Ajouter dans chaque tube 4 ml d’eau
distillée et lire les densités optiques contre le tube témoin correspondant à 540 nm.
125
N.B : Faites les expériences avec toutes les concentrations de Tris préparées.
1-2- Questionnaire pour le compte rendu
1-2-1- Déterminer la quantité de sucre réducteur présente dans chaque tube à essai. Cette
quantité doit être exprimée en µg .
1-2-2- En considérant que la concentration protéique de la solution enzymatique est de 0,25
mg/ml, déterminer l’activité spécifique exprimée en µg de sucre réducteur par minute par mg
de protéine dans chaque tube à essai.
1-2-3- Tracer la courbe activité spécifique exprimée en µg de sucre réducteur par min par mg
de protéine en fonction de la concentration en substrat
1-2-4-Déterminer le type d’inhibition, Ki, Vmax et KM
TRAVAUX PRATIQUES V
ACTION DE QUELQUES CATIONS SUR L’ACTIVITE INVERTASIQUE DU SUC
DIGESTIF D’ESCARGOT
1-Mode opératoire
Faire 5 dilutions de la solution de cation 40 mM pour obtenir les concentrations de 30
mM, 20 mM, 10 mM, 1 mM pour un volume final dans chaque cas de 10 ml dans le
tampon de pH optimum.
Préparer 14 tubes selon le tableau suivant :
Tubes
Concentration
de cation en
mM
Volume
de
tampon en ml
Volume de la
solution
de
cation en ml
E1
1
T1
1
E2
5
T2
5
E3
10
T3
10
E4
20
T4
20
E5
30
T5
30
E6
40
T6
40
E7
0
T7
0
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0,4
0,7
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0
0
126
Volume de la 0,3
solution
enzymatique
en ml
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0
0,3
0,3
0
0,3
Préincuber tous les tubes au bain marie à 37 °C pendant 10 min et y ajouter ensuite 0,4
ml de solution de saccharose 1 %. Laisser incuber pendant 15 min au même endroit et ajouter
dans chaque tube 0,3 ml de DNS. Mettre les tubes au bain marie bouillant pendant 5 min, les
laisser reposer sur la paillasse pendant 5 min. Ajouter dans chaque tube 4 ml d’eau distillée et
lire la densité optique contre le tube témoin correspondant à 540 nm.
2-Questionnaire pour le compte rendu
b1- Déterminer le pourcentage d’activité dans chaque tube à assai.
b2- Tracer la courbe : pourcentage d’activité en fonction de la concentration de l’effecteur .
b3-Commenter les courbes obtenues
127
0
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