1 Introduction Il existe dans la cellule 2 grands types de réactions biochimiques : - les réactions de dégradation de la matière organique (catabolisme); - les réactions de synthèse de la matière organique (anabolisme). Ces réactions métaboliques se déroulent dans la cellule en présence d’un catalyseur biologique (biocatalyseur) encore appelé enzyme. Les enzymes sont donc des composés biologiques de nature protéique, doués d’activité catalytique et produites par la cellule vivante. Leurs anciennes appellations sont les ferments ou les diastases. On écrira une réaction enzymatique de la manière suivante: Une enzyme fixe un substrat pour le transformer en produit. Ainsi, l'enzyme possède un site actif formé de l'ensemble des acides aminés qui entrent en contact avec le substrat. Ce site actif est formé de deux sites: le site de fixation du substrat et le site catalytique qui va agir sur le substrat et lui faire subir la réaction chimique. Les acides aminés qui constituent le site catalytique sont en général la sérine, la cystéine, l'histidine, la tyrosine et la lysine. Le site de fixation du substrat et le site catalytique peuvent être confondus ou distincts. Certaines enzymes sont en plus capables d'assurer la régulation des chaînes métaboliques. Cette faculté est due à la présence d'un site régulateur (en plus du site actif) qui réagit avec des modulateurs qui viennent d'ailleurs (allostérie). C'est le cas des enzymes allostériques. Le rôle des enzymes est d’accélérer les vitesses des réactions biochimiques dans la cellule. Un catalyseur est une substance qui, sans éprouver de transformation visible, et à faible dose, modifie la cinétique d’une réaction chimique. Ainsi, la catalase catalyse la réaction de transformation de l’eau oxygénée en une eau simple et en oxygène moléculaire: H2O2 →H2O + ½ O2 Avec une concentration de H2O2 = 1 MOL/L, la vitesse de réaction est de 2,2.10 –13 mol/L/s sans catalyseur, de 5,4.10 –9 mol/L/s avec un catalyseur chimique (le platine colloïdal) et de 4,5.10 –2 mol/L/s en présence de catalase. Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, c’est-à-dire qu’elle catalyse toujours la même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques initiaux. Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est déterminée génétiquement 2 : sa conservation dans le génome est favorisée par le besoin qu’éprouve cet être vivant de faire cette réaction. Toutes les molécules qui entrent dans une réaction enzymatique et sont définitivement modifiées sont appelées substrats. Le substrat est donc une molécule de nature organique ou inorganique reconnue par le centre actif de l’enzyme et transformé par celuici. La nouvelle molécule qui résulte de cette transformation est appelée produit. Toutes les molécules ayant une liaison spécifique avec une protéine sont appelées ligands. Pour chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protéine qui le reçoit. D’autres molécules non protéiques peuvent aussi avoir une activité catalytique : les abzymes (Ac) et les ribozymes (ARN). L’enzymologie est la science qui étudie les enzymes. Le spécialiste de cette science est appelé enzymologiste. Le substantif « enzyme » est du genre féminin et masculin. 3 Caractéristiques générales des enzymes I- Propriétés caractéristiques des enzymes -Les enzymes respectent les lois générales de la catalyse: •le catalyseur agit en quantité très faible et se retrouve intact à la fin de la réaction; •le catalyseur ne modifie ni la nature de la réaction, ni son équilibre thermodynamique; •il accélère la vitesse de la réaction. -Les enzymes abaissent davantage l’énergie d’activation des réactions chimiques en augmentant la probabilité des chocs efficaces. L’énergie d’activation ou l’énergie libre d’activation (ΔGA) est l’énergie qui doit être absorbée par les réactifs pour que leurs liaisons soient brisées. Les réactifs doivent atteindre un état de transition instable dans lequel les liaisons sont plus fragiles et plus faciles à briser. Même une réaction exergonique où le ΔG est négatif, requiert l’absorption d’énergie pour atteindre l’état de transition. Les enzymes ont la capacité d’abaisser l’énergie d’activation pour des réactions spécifiques pour que ces réactions puissent se faire à la température normale de la cellule. -Les enzymes présentent une grande spécificité compte tenu de leur nature protéique ; -Leur activité peut-être modulable en fonction de l’environnement : pH, T°, Substrat, composés activateurs ou inhibiteurs. II- Spécificité de l’action enzymatique La spécificité est l’une des caractéristiques principales des enzymes. Elle peut être circonscrite à 4 niveaux. 4 1- Stéréospécificité ou spécificité stéréochimique Beaucoup d’enzymes sont capables de distinguer deux isomères optiques (séries L et D) l’un de l’autre. Elles peuvent agir sur le composé de la série L et demeurer inactives sur le composé de la série D ou vice versa. On dit que les enzymes sont adaptées stéréochimiquement à leurs substrats. C’est le cas de la: -D-aminoacide déshydrogénase du foie des mammifères qui catalyse la déshydrogénation d’un grand nombre de D-aminoacides et est inactive sur les L-aminoacides: -lactico-déshydrogénase du muscle qui peut catalyser la déshydrogénation de l’acide L(+)lactique en acide pyruvique mais non celle de l’acide D(-)lactique; -l’arginase qui n’hydrolyse par contre que la L(+)arginine en ornithine et urée; -d’un certain nombre d’enzymes font la distinction entre les conformations alpha et beta. C’est le cas par exemple des alpha et beta-glucosidases, galactosidases, fructosidases etc ; D’autres enzymes ont une stéréospécificité vis à vis de l’isomérie cis-trans. 2- Spécificité liée à la nature de la liaison La nature de la liaison est la condition nécessaire pour que la substance puisse être dégradée. Ainsi, dans le cas des hydrolases, on distingue selon le type de liaison, des osidases, des estérases, des amidases, etc. Les estérases hydrolysent seulement les liaisons esters et non les liaisons osidiques ou peptidiques. Parmi les estérases, on peut faire la distinction entre les carboxy-estérases, spécifiques des liaisons esters où sont engagés des acides organiques, et les phospho-estérases qui hydrolysent les esters phosphoriques. Parmi les enzymes protéolytiques encore appelées protéases (enzymes hydrolysant les liaisons peptidiques) on distingue les exopeptidases qui exercent leur action à l’extrémité des chaînes et détachent l’amino-acide N- ou Cterminal et les endopeptidases qui hydrolysent les liaisons peptidiques à l’intérieur des chaînes. 3- Spécificité de groupe L’enzyme exigera que son substrat possède une liaison donnée et au moins une partie de la molécule conforme à une structure définie (A ou B). C’est le cas de la trypsine, enzyme protéolytique contenu dans le suc pancréatique qui hydrolyse les liaisons peptidiques des protéines mais seulement celles auxquelles participent les groupements carboxyles de résidus de lysine ou d’arginine. C’est le cas des a-glucosidases qui hydrolysent les liaisons osidiques entre l'a-glucose et un alcool ou un ose. La nature de ces liaisons influencera la vitesse de la réaction . 5 4- Spécificité absolue pour un seul substrat Un certain nombre d’enzymes possèdent une spécificité tellement grande qu’elles ne peuvent agir que sur un seul substrat, c’est le cas par exemple de: -l’arginase qui n’agit que sur la L-arginine. Toute modification de la structure de l’arginine même minime en un point éloigné de la liaison rompue la rend inapte à être dégradée ; -l’uréase a comme seul substrat l’urée qu’elle hydrolyse en CO2 et NH3. -la fructose-1,6-diphosphatase qui hydrolyse le fructose-1,6-diphosphate pour donner le fructose-6-phosphate et le phosphate inorganique. -l’anhydrase carbonique n’agit que sur le CO2 sur lequel elle ajoute une molécule d’eau pour donner l’acide carbonique. III- Nomenclature et classification 1- Nomenclature 1-1- Conception ancienne Pendant longtemps, on a attribué un nom à une enzyme en utilisant la dénomination du substrat et en lui ajoutant le suffixe «ase». Par exemple, l’enzyme dont le substrat est l’urée a été appelée uréase. On utilisait parfois le nom de la réaction catalysée auquel on ajoutait le suffixe « ase ». Exemple: Oxydation → Oxydase. Certaines enzymes sont mêmes connues sous des noms communs ne donnant aucune information sur la nature de leur substrat et de leur réaction catalysée. C’est le cas de la trypsine, de la pepsine, de la papaïne, de l’invertase etc. Compte tenu du nombre de plus en plus élevé des enzymes, une classification et une nomenclature systématique rigoureuses ont été proposées par la commission des enzymes de l’Union Internationale de Biochimie (UIB, 1961). 1-2- Conception actuelle Depuis 1961, l’Union Internationale de Biochimie a codifié la nomenclature et la classification des enzymes sous une nomenclature dite officielle. Toutes les enzymes actuellement connues sont désignées sous le nom chimique de leur substrat et de la réaction catalysée suivi du suffixe «ase» le tout accompagné d’un numéro portant 4 nombres séparés par des points 6 et précédés de EC soit E.C.x.y.z.t. Il s’agit du nom systématique de l’enzyme. Nom systématique de l’enzyme = substrat + réaction + ase E.C.x.y.z.t. E.C. = Enzyme Commission 1er chiffre (x): classe de l’enzyme (type de réaction catalysée). Il en existe 6. 2ème chiffre (y) : sous-classe (mécanisme de réaction) 3ème chiffre (z): sous sous-classe (nature des molécules impliquées) 4ème chiffre (t): numéro d’ordre de l’enzyme (une indication de la sous sous-classe) Exemple: la -D-glucosidase s’appelle en réalité D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21 Substrat : -D-glucoside Réaction : hydrolyse EC : Enzyme commission 3 : Classe des hydrolases 2 : Scindant les liaisons osidiques 1 : Il s’agit d’une liaison o-osidique 21 : indique le résidu anomérique -glucosyle 20 : indique le résidu anomérique -glucosyle 23 : indique le résidu anomérique galactosyle Lorsque l'enzyme utilise 2 substrats, on les désigne tous les deux, en indiquant : -le substrat donneur de radicaux ; -puis le substrat accepteur du radical libéré ; -le radical échangé ; -le type de réaction ; -on ajoute enfin ase. Le tout accompagné d’un numéro portant 4 nombres séparés par des points et précédés de ‘EC’. Par exemple : - ATP-glucose phosphotransférase - UDPglucose-fructose glucosyltransférase - Glutamate pyruvate aminotransférase. Dans le cas d'une réaction équilibrée réversible, on peut former les noms à partir des substrats ou des produits. 7 Lorsque le numéro (portant les 4 nombres) dans la nomenclature officielle se termine par 99, cela signifie qu’elle est incomplètement caractérisée. Dans un rapport ou une publication scientifique, le nom fonctionnel continue à être utilisé mais ce dernier est toujours suivi entre parenthèses par son numéro (portant les 4 nombres) dans la nomenclature officielle. 2- Classification des enzymes On distingue deux types de classification des enzymes : -la classification traditionnelle ou fonctionnelle; -la classification structurale de Henrissat. 2-1- Classification fonctionnelle La classification traditionnelle ou fonctionnelle ou internationale repose essentiellement sur la spécificité de substrats. Elle est la plus ancienne et a été réalisée sur la base des recommandations de l’Union Internationale de Biochimie. Le grand avantage de ce système, c’est qu’il est très simple et largement appliqué par les enzymologistes. Cette classification internationale présente cependant des limites du fait que les glycosidases sont généralement capables d’hydrolyser plusieurs substrats. En plus, elle omet non seulement les caractéristiques mécanistiques et moléculaires (séquence, structure…) mais aussi toute considération liée à l’évolution de ces enzymes. Les enzymes sont regroupées dans six classes. 2-1-1- Oxydo-réductase C’est la classe numéro 1 (EC 1). Les oxydo-réductases catalysent les réactions de transfert d’électrons, d’atomes d’hydrogène ou fixation d’oxygène. A red + B ox ↔ A ox + B red 2-1-2- Transférase C’est la classe numéro 2 (EC 2). Ces enzymes transfèrent des radicaux ou des groupes d’atomes d’une molécule (substrat donneur) à une autre molécule (substrat accepteur). Leur nom complet comporte le donneur, l’accepteur, le radical transféré suivi de transférase. Les groupes transportés sont: le méthyle (-CH3), l’hydroxyméthyle (-CH2OH), carboxyle (-COOH), groupement carboné comportant des fonctions aldéhydes ou cétones (-CHO) ou (-CO-R), groupe acyle, groupe osidyle, amine, phosphoryle, etc. A-R + B ↔ A + B-R 8 2-1-3- Hydrolase C’est la classe numéro 3 (EC3). Les hydrolases sont des enzymes de dégradation. Elles provoquent la coupure d’une molécule et fixent les radicaux H et OH de l’eau sur les valences libérées. Ce sont des enzymes sans coenzymes. Elles interviennent sur les fonctions éthers, acétals, esters phosphoriques, liaisons O-O des peroxydes, C-N des amides. Il est très difficile de les classer. Le plus simple est d’étudier leur action sur quelques groupes de molécules. C-X + H2O ↔ C-OH + X-H 2-1-4- Lyase C’est la classe numéro 4 (EC4). Les lyases sont des enzymes qui enlèvent un groupement au substrat en laissant une double-liaison, ou au contraire, fixent un groupement sur une double liaison. A-R + Coenz ↔ A + Coenz-R 2-1-5- Isomérase C’est la classe numéro 5 (EC 5). Les isomérases sont les enzymes qui catalysent les réactions d’isomérisation intramoléculaire. Elles conservent la formule brute du composé. A-B-X ↔ X-A-B 2-1-6- Ligase ou synthétases C’est la classe numéro 6 (EC 6). Les ligases sont des enzymes qui établissent une liaison avec coupure simultanée d’une molécule d’ATP. A + B↔ A-B 2-2- Classification structurale des glycosidases De nombreuses études ont montré des similarités entre les séquences en acides aminés des glycosidases de différentes sources, et ont suggéré que ces enzymes pouvaient dériver de voies d’évolution similaires. Henrissat a apporté une contribution majeure à la compréhension des glycosidases en les classant dans un système de familles avec des homologies significatives de séquences. 9 Par ailleurs, les enzymes d’une même famille ont habituellement le même arrangement du site actif et l’on peut prédire que leur superstructure doit être similaire. En conséquence, le mécanisme est conservé au sein des membres d'une famille donnée. Quelques similarités entre les familles ont mené au concept de « Superfamilles » ou « Clans ». Ainsi, de la séquence d’une enzyme l'on peut prédire les caractéristiques de spécificité de substrat ainsi que le mécanisme. L’utilité de cette approche a été démontrée par Tews et al., (1996). Une famille est alors définie quand deux séquences au moins montrent une similarité significative en acides aminés et aucune similarité avec d’autres familles. Les comparaisons structurales avec les autres familles ont amené Henrissat à suggérer la nomenclature « Clan » dans laquelle la Superfamille 4/7 est référée comme étant le « Clan GH-A » (Clan des GlycosylHydrolases A) et subséquemment les autres sont appelées B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M et N. On dénombre actuellement 14 clans notés de A à N. Les glycosidases sont regroupées dans 130 familles dont 4 ont été supprimées au cours de l'avancement des travaux de classification. Les familles supprimées sont les familles 21, 40, 41 et 60. Certaines enzymes dont les structures ont été identifiées n'ont pas été classées en familles encore moins en clans. IV- Structure et mécanisme d’action des enzymes 1- Structure enzymatique 1-1- Quelques définitions Du point de vue structure, les enzymes peuvent être divisées en deux catégories: o les enzymes entièrement protéiques; o et les enzymatiques formées de deux parties. une partie protéique appelée apoenzyme; et une partie non protéique appelée cofacteur. L’apoenzyme est l’enzyme réduite à sa partie polypeptidique après élimination du ou des cofacteurs. On appelle holoenzyme, l’enzyme fonctionnelle renfermant son ou ses cofacteurs. Holoenzyme = apoenzyme + cofacteurs Le coenzyme est une petite molécule organique, non protéique, associée faiblement à l’apoenzyme, indispensable à la catalyse enzymatique. Un groupement prosthétique est un cofacteur lié de façon covalente à l’enzyme (apoenzyme). Les cofacteurs métalliques sont des ions minéraux qui sont indispensables à l’activité enzymatique, soit : 10 parce qu’il est responsable de la stabilité de la structure tertiaire de l’apoenzyme, parce qu’il intervient dans la fixation du substrat, parce qu’il participe directement à la catalyse. Dans la partie protéique de l’enzyme, se trouve une zone particulière appelée centre actif ou site actif au niveau de laquelle se déroule l’acte catalytique. Les acides aminés constitutifs d’une enzyme sont de 3 ordres : les acides aminés collaborateurs, ils ne jouent aucun rôle apparent dans le centre actif ; les acides aminés collaborateurs et auxiliaires, ils stabilisent la conformation active de la protéine et du centre actif; et les acides aminés de contact, ils assurent la fixation et la transformation du substrat. On les trouve par conséquent au niveau du centre actif. Certaines enzymes sont constituées d’une seule chaîne polypeptidique, elles sont dites monomériques. D’autres sont formées de plusieurs chaînes polypeptidiques, ce sont des enzymes oligomériques. Lorsque les chaînes constitutives des enzymes oligomériques sont identiques, elles sont dites homo-oligomériques, dans le cas contraire, ce sont des enzymes hétérooligomériques. Il existe dans la nature des enzymes homo-hétéro-oligomériques. 1-2- Centre actif 1-2-1- Définitions Du fait de leur nature protéique, l’activité des enzymes est conditionnée par l’intégrité de leur conformation native. L’acte catalytique lui même se déroule au niveau d’une zone bien déterminée appelée centre actif ou site actif qui englobe les sites de fixation des substrats, d’éventuels cofacteurs et le site catalytique. Pour que la catalyse se fasse, il faut que : la molécule de substrat trouve exactement sa place au niveau du site de fixation; les acides aminés du site catalytique puissent modifier la constitution du substrat. Le site de fixation du substrat est responsable de la reconnaissance spécifique d’un substrat donné, c'est-à-dire, responsable de la stéréospécificité. Dans le cas des enzymes à coenzyme et ion, ils interviennent directement dans la réaction, c’est lui qui constitue le site catalytique, seul ou en association avec certains acides aminés de l’apoenzyme. Dans une classe d’enzyme donnée, 11 les acides aminés du site catalytique sont souvent les mêmes car la réaction catalysée est la même, alors que les acides aminés du site de fixation peuvent changer. 1-2-2- Etude du centre actif d’une enzyme L’étude consiste à déterminer : la nature des acides aminés du centre actif; leur place dans la séquence; leur disposition dans l’espace. Pour cela, on utilise principalement deux types de méthodes d’étude : les méthodes physiques ; et les méthodes chimiques. 1-2-2-1- Méthodes physiques Elles sont basées sur l’utilisation de la: méthode de fluorescence ; résonance magnétique nucléaire (RMN) ; radio - cristallographie ; mesure de l’activité optique et du dichroïsme circulaire. Parmi toutes ces méthodes, seule celle de la radio - cristallographie a retenu l’attention des chercheurs car elle fournit le maximum d’informations sur la structure enzymatique et un éclairage précieux sur les mécanismes d’action. Cette méthode est basée sur l’utilisation des rayons x. Lorsqu’un faisceau de rayons x est envoyé sur une préparation cristalline d’une molécule organique, il est réfléchi par les noyaux atomiques. L’observation de ces diffractions conduit aux structures. Comme nous le constatons, c’est une méthode qui requière l’utilisation de cristaux purs et de configuration bien déterminée, des appareils très chers qui ne sont pas à la portée de tous les laboratoires. C’est donc une méthode très coûteuse. 1-2-2-2- Méthodes chimiques C’est une méthode relativement peu coûteuse et qui est assez simple dans sa conception. Elle consiste en effet, de façon générale, à effectuer à l’aide de réactifs organiques des substitutions au sein de la molécule enzymatique constituée essentiellement d’aminoacides et à suivre les changements qui en découlent. 12 Après la substitution, si l’enzyme possède toujours un pouvoir catalytique, cela veut dire que, soit : La substitution ne s’est pas faite au niveau du centre actif de l’enzyme, Elle s’est faite à un endroit autre que le centre actif. La fixation de ce réactif de marquage sur l’enzyme n’a pas induit un changement de conformation sur l’enzyme qui puisse empêcher l’acte catalytique. Après la substitution, si l’enzyme perd son activité, cela veut dire que : soit la substitution s’est faite au niveau du centre actif de l’enzyme ; soit à un endroit autre que le centre actif de l’enzyme. Mais cette fixation a induit un changement conformationnel qui ne favorise pas l’acte catalytique. Pour avoir des précisions d’autres démarches sont nécessaires : -protéger le centre actif de l’enzyme avec l’utilisation d’un excès de substrat, ce qui va rendre inaccessible le résidu R-X se trouvant dans le centre actif de l’enzyme ; -Ensuite chercher à réaliser la réaction de substitution. Si le résidu R-X n’est pas substitué, cela veut dire que le résidu R-X se trouve au niveau du centre actif de l’enzyme dans le cas contraire, il ne se trouve pas dans le centre actif de l’enzyme. A partir de ces démarches, on sait maintenant que R-X se trouve dans le centre actif de l’enzyme. Pour connaître la nature de R-X, on réalise la substitution de R-X en l’absence d’un excès de substrat et on fait ensuite l’hydrolyse acide avec l’acide chlorhydrique 6N. Cette hydrolyse va nous permettre de découper l’enzyme et de connaître la nature du résidu R-X. D’une façon générale, il faut noter que les résidus amino-acides qui sont indispensables à l’activité catalytique sont des résidus polaires. Mais on trouve aussi des radicaux non polaires tels que le thioester de la méthionine et l’indol du tryptophane. 1-2-3- Activation des pro-enzymes Certaines enzymes sont fabriquées sous forme de précurseurs inactifs, molécule dans lesquelles le centre actif n’est pas fonctionnel. Le démasquage du centre actif se fait par coupure d’un petit peptide, ce qui permet un remaniement de la structure tertiaire et permet un rapprochement dans l’espace des trois acides aminés du site catalytique. 1-3- Partie de la protéine ne portant pas le centre actif Cette partie de l’enzyme est aussi importante car elle joue plusieurs rôles: 13 -Rôle dans le maintien de la structure du centre actif : La dénaturation s’accompagne de la perte d’activité enzymatique. -Rôle régulateur : Certaines enzymes fixent des effecteurs sur des sites situés en dehors du centre actif. -Le reste de la molécule est spécifique d’une espèce donnée : Deux enzymes catalysant la même réaction, sur le même substrat et provenant d’espèces différentes, ont le même site actif, mais ont des séquences différentes en ce qui concerne le reste de la molécule, ce sont donc des protéines différentes. -Le reste de la molécule est spécifique d’un tissu donné : Les isoenzymes sont des enzymes catalysant la même réaction, sur le même substrat, mais possédant des structure différentes et donc des propriétés physico-chimiques différentes. Ce sont des enzymes oligomériques. Selon l’organe qui les fabrique, les sous-unités sont différentes, et donc les isoenzymes sont différentes. Les isoenzymes sont donc spécifiques d’un organe donné. 1-4- Cofacteurs 1-4-1- Définitions et propriétés Les cofacteurs sont des petites molécules (non polypeptidiques, non protéiques), des molécules organiques ou inorganiques (des ions métalliques), liées plus ou moins fortement à la protéine et indispensables à l’activité enzymatique. Figure 1 : classification des différents cofacteurs enzymatiques Inorganiques Ions métalliques Cofacteur Coenzyme Organiques Mobiles Cosubstrats Liés Groupements prosthétiques Il intervient obligatoirement dans une réaction chimique: -pour transporter ou compléter un substrat ; 14 -pour accepter un produit; -comme participant à la structure de l’enzyme. Les cofacteurs sont donc des métabolites non protéiques, de faible masse moléculaire comparée à la masse moléculaire des enzymes. - Ils ont une structure simple; - Ils agissent à faible concentration et doivent, comme les enzymes, être régénérés à la fin d’une réaction ou d’une séquence de réactions; - Ils sont libres ou associés à l’enzyme; - ils sont thermostables. Les cofacteurs sont donc des ions métalliques et des coenzymes. Les coenzymes (Co), lorsqu’ils sont libres, s’associent faiblement (liaison hydrogène ou ionique) au moment de la catalyse à la partie protéique appelée ‘‘apoenzyme’’ (E) pour former le complexe fonctionnel apoenzymecoenzyme (E-Co) appelé Holoenzyme. Dans ce cas, ces coenzymes prennent le nom de “ coenzymes vrais ” ou coenzymes cosubstrats. D’autres enzymes comportent dans leur structure le coenzyme. Ce dernier est fortement lié à l’apoenzyme par une liaison covalente. Le coenzyme est alors appelé groupement prosthétique de l’enzyme. A cet égard, l’organisation possible d’une enzyme est la suivante: -protéine seule; -apoenzyme + coenzyme; -apoenzyme + cofacteur minéral; -apoenzyme + coenzyme + cofacteur minéral. Le cofacteur minéral n’est pas modifié au cours de la réaction, tandis que le coenzyme peut être réduit. Les coenzymes sont introduits dans l'organisme des mammifères par l'alimentation sous forme de vitamines ou de facteurs de croissance qui sont des composés indispensables au métabolisme, agissant à dose faible, et non synthétisés par l'organisme. Presque toutes les vitamines hydrosolubles et liposolubles connues sont impliquées dans la structure des coenzymes sauf la vitamine C (hydrosoluble) et la vitamine A (liposoluble). C’est sous la forme d’holoenzyme que l’enzyme acquiert une spécificité pour son substrat. Cette spécificité peut être : -étroite : l’enzyme n’agit que sur un substrat. La glucokinase ne phosphoryle que le glucose : 15 - lâche : l’enzyme intervient sur un groupe de substrats ayant une communauté de structure. L’hexokinase phosphoryle tous les hexoses. 1-4-2- Dérivés de vitamines Les coenzymes (molécules organiques) sont le plus souvent des dérivés des vitamines. Mais toutes les vitamines ne sont pas des coenzymes. Étymologiquement, une vitamine est une substance azotée nécessaire à la vie. Les vitamines sont des substances organiques indispensables au métabolisme qui doivent être fournies en petite quantité à l’organisme dans la mesure où celui-ci est incapable d’en assurer la synthèse. Mais : • nombreuses vitamines non aminées : vitamine C; • beaucoup d’avitaminoses (= carences prolongées, symptômes pathologiques) non mortelles; • une substance peut être vitamine pour une espèce animale et pas pour une autre (ex : la vitamine C n’est pas une vitamine pour le Rat mais l’est pour l’Homme). Tableau : Les types de vitamines Vitamines hydrosolubles Vitamines liposolubles C, B A, D, E, K On rencontre beaucoup de vitamines du groupe B dans la structure des coenzymes Tableau: Exemples de vitamines B à l’origine de coenzymes 1-4-3- Enzymes à cofacteurs 16 Toutes les enzymes sauf les hydrolases doivent leur activité à la présence d’un cofacteur. Les enzymes digestives sont des hydrolases et n’ont pas besoin de coenzyme : trypsine, chymotrypsine, pepsine, uréase, peptidase, lipase. Ex : la LDH (lactate déshydrogénase) isoenzyme à 4 monomères (H et M : H5, H4M, H3M2, H2M3, HM4, M5) a comme coenzyme le NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide). La succinate déshydrogénase a comme coenzyme le FAD. Les transaminases (ALAT et ASAT) ont comme coenzyme le PLP (phosphate de pyridoxal) 1-4-4- Cofacteur minéral Il existe un nombre considérable d’enzymes qui requièrent un cation métallique (Ca++; Mg++, Mn++, Zn++, etc..) pour leur activité. Ces enzymes sont appelées métalloenzymes. L’un des ions les plus fréquemment rencontrés chez les métalloenzymes est l’ion Zn2+ : il est nécessaire à l’expression de l’activité de l’anhydrase carbonique, de la carboxypeptidase, des phosphatases alcalines et d’une foule d’autres enzymes. Ce métal est fortement lié à l’enzyme. Les cofacteurs métalliques sont des ions minéraux qui sont indispensables à l’activité enzymatique : -soit parce qu’ils sont responsables de la stabilité de la structure tertiaire de l’apoenzyme ; -soit parce qu’ils interviennent dans la fixation du substrat : -soit parce qu’ils participent directement à la catalyse. 1-4-5- Groupement prosthétique Certaines enzymes comportent dans leur structure un cofacteur. Ce dernier est lié à l’apoenzyme par une liaison covalente. Ce cofacteur est alors appelé groupement prosthétique de l’enzyme. Il ne se détache pas de l'apoenzyme au cours de la réaction (exemple : FAD). Il fait partie intégrante de l’enzyme (qui est alors une hétéroenzyme). L'enzyme elle-même le remet en état initial. Les groupements prosthétiques appartiennent à plusieurs catégories moléculaires, le plus connu -l'hème- intervient dans la plupart des réactions où l'oxygène intervient (hémoglobine, hémocyanine) ou plus généralement dans les réactions d'oxydo-réduction (cytochrome, chlorophylle). Mais, il en existe bien d'autres, beaucoup appartenant à la famille des vitamines. Ex : biotine (vit B8 ou H), thiamine B1, hème des cytochromes. 1-4-6- Coenzymes vrais Les coenzymes vrais ont des fonctions d’accepteurs et de transporteurs de radicaux libérés au cours de la catalyse. Ils fixent et transportent: 17 -des hydrogènes et des électrons dans les réactions d’oxydoréduction, -des radicaux autres que l’hydrogène et les électrons dans les autres réactions. Ils transportent le radical d’un composé A à un composé B selon les étapes réactionnelles suivantes: On voit que le coenzyme a réagi de façon stœchiométrique, et qu’il est régénéré. La réaction globale catalysée est la suivante : On distingue les coenzymes des réactions d’oxydoréduction et ceux des réactions de transfert de groupement. 1-4-4-1- Coenzymes d'oxydoreduction Ils participent aux réactions d’oxydoréduction en transportant des atomes d’hydrogène sous forme d’électrons et de protons (NAD = FAD, etc.) ou uniquement des électrons (cytochromes, etc.). On les rencontre dans toutes les réactions d’oxydoréduction cellulaire et dans les séquences de transports d’électrons organisés comme la respiration cellulaire ou la photosynthèse. Les enzymes qui catalysent les réactions dans lesquelles sont impliqués ces coenzymes sont des déshydrogénases ou des réductases. On distingue : les coenzymes nicotiniques ou pyridiniques, les coenzymes flaviniques, les coenzymes quinoniques, les metalloporphyrines et les protéines fer-soufre. a- Coenzymes nicotiniques ou pyridiniques Ces coenzymes ont une répartition universelle puisque toutes les cellules en contiennent. Ils dérivent de la nicotinamide ou vitamine PP. Les deux types les plus représentés sont: -NAD+ ou Nicotinamide Adénine Dinucléotide; -NADP+ ou Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate. a1- Propriétés et structure Ce sont des petites molécules solubles. On en trouve en partie à l’état libre dans les mitochondries, dans les chloroplastes et dans le cytosol. Ils ont le même potentiel rédox (E°’ = - 18 0,32 V) et interviennent tous les deux dans les réactions d’oxydoréduction de l’alcool vers l’acide carboxylique ou vice-versa. La réaction catalysée est la suivante à partir des alcools primaires : R-CH2OH + NAD (P) + ↔ R-CHO + NAD(P)H,H+ R-CHO + NAD(P)+ + H2O↔R-COOH + NAD(P)H,H+ Tout en ayant le même potentiel d’oxydoréduction, ils sont associés à des apoenzymes qui leur sont spécifiques et déterminant les types de réactions catalysées. Le NAD+ intervient généralement sous forme oxydée et prend en charge les électrons et les protons dans les déshydrogénations cataboliques, autrement dit, NAD+ intervient dans les systèmes de dégradation ou de catabolisme conduisant à la récupération d’énergie, NADP+ intervient souvent sous forme réduite (NADPH,H+) et est associé aux déshydrogénases (réductase) dans les réactions de synthèse. Dans la cellule, il y a des déshydrogénases à NADH,H+/NAD+ des déshydrogénases à NADPH,H+/NADP+ bien que certaines acceptent les deux. Ces deux couples sont rarement interchangeables car les produits peuvent êtres très différents. Leur formule est celle de la forme naturelle de ces coenzymes, où le cycle pyridinique est attaché au ribose en configuration beta. Exemple: L-Malate + NAD+ ↔ L-Malate + NADP+ ↔ Oxaloacétate + NAD+ Pyruvate + CO2 + NADPH,H+ Ces deux réactions sont catalysées par 2 malate déshydrogénases. Figure 11 : spectre d’absorption du NAD(P)+ (forme oxydée) et du NAD(P)H,H+ (forme réduite) 19 Figure 1 – Structure des deux coenzymes nicotiniques dérivés du nicotinamide (Vit PP). Le couple NAD+/NADH,H+ est un accepteur ou donneur dans les réaction d’oxydoréduction du catabolisme. Le couple NADP+/NADPH,H+ intervient par sa forme réduite comme donneur d’électrons dans les réactions de biogenèse. a2- Mécanisme de la prise en charge des électrons et des protons Le site réactif du coenzyme se situe au niveau du noyau pyridine et les étapes de réaction sont les suivantes : le premier électron neutralise la charge positive sur l’azote quaternaire, le second neutralise un proton qu’il transforme en H qui se fixe sur le carbone 4. Il reste un proton qui accompagne la molécule réduite d’où l’écriture NADH,H+ et NADPH,H+. Sous forme oxydée, ces coenzymes n’ont qu’une seule bande d’absorption dans l’U.V. à 260 nm (sous forme réduite ou oxydée), due au noyau adénine. La réduction de NAD+ ou NADP+ s’accompagne d’une modification caractéristique de leur spectre d’absorption. Lorsqu’ils sont réduits sous la forme NADH,H+ ou NADPH,H+, il apparaît une bande supplémentaire à 340 nm (due à la réduction du noyau pyridine). L’absorption lue à cette longueur d’onde permet d’évaluer la proportion de 20 NAD(P)H,H+ présent dans la solution. Cette propriété est utilisée pour leur dosage ou pour le dosage des composés dont les réductions ou oxydations leur sont couplées. Figure 10 : réaction de réduction du NAD(P)+ en NAD(P)H + H+ a3- Equilibre des déshydrogénases à pyridine nucléotides Les couples NAD+/NADH,H+ et NADP+/NADPH,H+ ont un E°’ de -0,32 V. Les systèmes qui ont un potentiel d’oxydoréduction (E°’) plus élevé ou très proche auront tendance à accepter les électrons de leurs formes réduites NADH,H+ ou NADPH,H+. Voici quelques exemples : 3-Phosphoglycéraldéhyde + Pi ↔3-Phosphoglycéroyl-1-Phosphate + 2e- + 2H+ E°’= -0,29V NAD+ + 2e- + 2H+ ↔ NADH,H+ E°’= -0,32V 3-Phosphoglycéraldéhyde + Pi + NAD+ ↔ NADH,H+ + 3-Phosphoglycéroylphosphate NADH,H+ ↔ - + Pyruvate + 2e +2H NAD+ + 2e- + 2H+ E°’= -0,32V ↔ lactate + E°’= -0,185V + Pyruvate + NADH,H ↔ lactate + NAD a4- Mécanisme de formation du complexe enzymatique et de la catalyse + Le NAD se fixe d’abord sur l’apoenzyme pour former l’holoenzyme. Ce dernier fixe ensuite le substrat pour former un complexe ternaire au niveau duquel se font les échanges des électrons et des protons. Les étapes sont les suivantes : E + NAD+ ↔ E-NAD+ E-NAD+ + SH2 ↔ H2-S-E-NAD+ H2S-E-NAD+ ↔ S-E-NADH,H+ ↔ E-NADH,H+ ↔ (Holoenzyme) (Complexe ternaire) S-E-NADH,H+ (Echange des électrons et des protons) E-NADH,H+ + S (Libération du produit) E + NADH,H+ (Dissociation de l’holoenzyme) b- Coenzymes flaviniques 21 Ces coenzymes sont des composés hydrosolubles, de couleur jaune. Ils dérivent de la vitamine B2 ou riboflavine. Ce sont également des coenzymes de déshydrogénases. On distingue : -la flavine mononucléotide (FMN) qui est l’ester phosphorique en 5’ de la riboflavine. Elle est membranaire et intervient dans le transport d’électrons dans la chaîne respiratoire ; - la flavine adénine nucléotide (FAD), cytosolique, qui comporte un 2e nucléoside uni au premier par une liaison pyrophosphate. FMN et FAD sont des coenzymes d’une cinquantaine d’enzymes répandues dans toutes les cellules vivantes. b1- Propriétés et structure Les coenzymes flaviniques sont liés à leur apoenzyme par une liaison covalente. L’ensemble à la structure d’holoenzyme. On les appelle encore flavoprotéines. Les coenzymes constituent les groupements prosthétiques de ces enzymes. La partie réactive du FAD et du FMN qui participe à l’oxydoréduction est le noyau diméthylisoalloxazine de la riboflavine. Le potentiel redox de la flavine est variable en fonction de l’apoenzyme à laquelle elle est fixée. Les déshydrogénases flaviniques catalysent les réactions responsables de la formation ou de la réduction des doubles liaisons. Les réactions dans lesquelles elles sont impliquées sont du type : R-CH2-CH2-R1 + E-FAD ↔ R-CH=CH-R1 + E-FADH2 SH2 + E-FMN ↔ S + E-FMNH2 22 Figure 2 – Structure des deux coenzymes flaviniques dérivés de la riboflavine (Vit B2). Le couple FMN/FMNH2 ne se rencontre que dans le transport des électrons de la chaîne respiratoire. Le couple FAD/FADH2 est donneur ou accepteur d’électrons dans les réactions de catabolisme. b2- Mécanisme d’action Le noyau isoalloxazine comporte 2 doubles liaisons conjuguées capables de fixer réversiblement deux atomes d’hydrogène. La forme oxydée présente une bande d’aborption à 450 nm alors que la forme réduite n’en présente pas. Ces déshydrogénases peuvent recevoir des hydrogènes des coenzymes nicotiniques. On distingue les flavoprotéines membranaires, non autooxydables, à structure complexe, et les flavoprotéines auto-oxydables cytoplasmiques qui peuvent transférer l’hydrogène directement à l’oxygène avec formation de peroxydes d’oxygène. Pour le transport des électrons et des protons, elles ont besoin parfois des ions comme le fer et le molybdène. Les principales flavoprotéines impliquées dans le métabolisme énergétique de la cellule figurent dans le tableau ci-dessous. Tableau : Principales flavoprotéines membranaires Flavoprotéines Dénomination Coenzymes NADH,H+ -déshydrogénase (FP1) FMN Succinate déshydrogénase (FP2) FAD Dihydolipoyl déshydrogénase FAD AcylCoA déshydrogénase (FP3) FAD Glycérol 3-Phosphate (FP4) FAD déshydrogénase 23 c- Coenzyme quinoniques: ubiquinone et plastoquinone L’ubiquinone, encore appelée coenzyme Q10 est un coenzyme liposoluble transporteur d’hydrogènes à partir des substrats organiques vers l’oxygène dans la chaîne respiratoire mitochondriale. Elle n’a pas une origine vitaminique et peut être synthétisée par toutes les cellules. Elle n’est pas attachée à une protéine et peut circuler librement dans la couche phospholipidique de la membrane mitochondriale interne. Son potentiel rédox E°’= +0,1V. Actuellement plusieurs coenzymes quinoniques sont connus. Ils diffèrent par la longueur de leur chaîne latérale constituée de n radicaux isoprène polymérisés. Le nombre n est égal à 10 chez l’Ubiquinone d’où le nom de coenzyme Q10. Dans les végétaux, il y a des quinones appelées plastoquinones qui jouent un rôle équivalent dans les transports d’électrons photosynthètiques (E°’= + 0,1 V). L’ubiquinone (forme oxydée) a une bande d’absorption caractéristique entre 270 et 290 nm qui disparaît quand la quinone est réduite. Les quinones possèdent deux fonctions quinones qui, par réduction, sont transformées en di-hydroquinone par acceptation de 2 électrons et de 2 protons libérés par le substrat. Figure 3 – Ubiquinone ou Coenzyme Q10 : Interconversion des formes oxydée et réduite. Ce coenzyme intervient comme accepteur d’électrons dans la chaîne respiratoire. d- Métalloporphyrines : cytochromes et peroxydases Les métalloporphyrines sont de véritables groupements prosthétiques liés à leur apoenzyme respective par des liaisons covalentes. Les métalloporphyrines résultent de l’union, sous forme de complexe, d’un atome de fer et d’une porphyrine (dérivé par substitution du noyau tétrapyrrolique). On les rencontre dans les cytochromes et dans les peroxydases. On distingue: d1- Cytochromes 24 Ce sont des chromoprotéines présentes dans toutes les cellules, dans la membrane interne des mitochondries, dans la membrane thylakoide des chloroplastes, et dans le cytoplasme. Le groupement prosthétique ferroprotoporphyrinique est le même. Seules les apoenzymes qui leur sont solidement accrochées par liaisons covalentes sont différentes (avec des masses moléculaires allant de 13 000 à 250 000) et leur confèrent des potentiels redox différents. Ils ont un rôle de transport séquentiel des électrons grâce au changement de valence du fer. Dans les mitochondries des cellules animales et végétales et dans les chloroplastes on a isolé et identifié un grand nombre de cytochromes fonctionnant tous sur le même principe. C’est le fer du groupement prosthétique qui transporte les électrons par passage réversible du fer ferrique en fer ferreux: Cyt b-Fe3+ + e- → Cyt b-Fe2+ Lors du transport des électrons, l’ordre d’intervention des cytochromes est déterminé par leur potentiel redox. Figure 4 – Structure de l’hème des cytochromes. Les cytochromes sont présents dans toutes les cellules. Ils sont impliqués dans le transport des électrons de la chaîne respiratoire et de la photosynthèse par changement de valence du fer. Figure 6 : Un exemple de cytochrome : le cytochrome c d2- Catalases et peroxydases 25 Ce sont aussi des chromoprotéines dans lesquelles le fer reste toujours sous forme ferrique et ne change pas de valence. Elles contiennent 4 groupements hématiniques et souvent du cuivre. Les catalases catalysent la décomposition de l’eau oxygénée ou peroxyde d’hydrogène : H2O2 ↔ H2O + ½ O2 Les peroxydases oxydent certains substrats à partir d’un peroxyde comme l’eau oxygénée. d3-Oxygénases Ces métalloprotéines catalysent l’incorporation d’un atome (monooxygénases) ou d’une molécule d’oxygène (dioxygénase) sur un substrat. Certaines sont des cuproprotéines et ferroprotéines (fer non hématinique). Un exemple est donné par la tyrosine oxygénase et la dopamine β-hydroxylase qui participe à la formation de la noradrénaline dans la médullosurrénale. e-Protéines fer-soufre Ces protéines fer-soufre interviennent dans les séquences de transport des électrons aussi bien dans la chaîne respiratoire que dans la photosynthèse. Le fer est non héminique et le soufre sous forme sulfure. Le fer et le soufre sont en quantité équimoléculaire. L’apoprotéine est liée au fer par l’intermédiaire des cystéines. La figure donne un exemple de la partie non protéique de ces protéines Fer-Soufre. Ces protéines fer-soufre se comportent comme des sous-unités de complexe protéique. Le transport des électrons se fait encore par changement de valence de fer passant réversiblement du fer ferrique au fer ferreux. f-Acides lipoîque Ce coenzyme intervient comme transporteur d’hydrogène dans les réactions de décarboxylation oxydative et notamment dans celle de l’acide pyruvique. Figure 7: Forme oxydée de l'acide lipoïque. 26 1-4-4-2-Coenzymes de transport des radicaux monocarbonés Les radicaux monocarbonés susceptibles d’être transportés par leurs coenzymes spécifiques sont : CO2, -CH3, -CHO, -CH2OH, etc. Nous ne verrons que quelques coenzymes fréquemment rencontrés dans le cours du métaboisme. a-Coenzyme de transport de CO2 Le CO2 est la forme la plus oxydée du carbone. Il se forme abondamment dans la cellule suite à l’oxydation des carbones terminaux d’une molécule organique en particulier sous l’action des déshydrogénases. La dernière réaction est une réaction de décarboxylation spontanée chez les acides organiques ayant une fonction cétone en position beta (carbone 3). La décarboxylation est une réaction courante dans les cellules animales et végétales. La réaction inverse, la carboxylation, est moins fréquente et nécessite de l’énergie et un transporteur. On peut citer la carboxylation du pyruvate et de l’acétyl-CoA, nécessaire à la néoglucogenèse et la synthèse de acides gras. Une réaction de carboxylation qui occupe une place prépondérente dans le métabolisme des végétaux chorophylliens est celle du ribulose-1,5-bisphosphate qui est à l’origine de la synthèse des glucides à partir du CO2. Deux coenzymes servent de transporteurs, la biotine pour les petites molécules et la vitamine K pour les protéines. a1-Biotine ou vitamine H La biotine est un coenzyme qui est réuni à l’apoenzyme par une liaison covalente amide (entre -COOH de la chaîne latérale de la biotine et –NH2 d’une lysine de l’apoenzyme) à un résidu lysine. Elle est formée de 2 hétérocycles accolés dont l’un contient 2 atomes d’azote et l’autre un atome de soufre. Elle sert de coenzyme à la pyruvate carboxylase, une enzyme importante du métabolisme des glucides. La réaction se déroule en deux étapes : E-biotine + ATP + CO2 ↔ CH3-CO-COOH + E-biotine-CO2 E-biotine-CO2 + ADP + Pi ↔ HOOC-CH2-CO-COOH + E-Biotine 27 Elle sert aussi de transporteur à l’acétyl-CoA carboxylase, une autre enzyme capitale dans la synthèse des acides gras. E-biotine + ATP + CO2 ↔ CH3-CO-SCoA+ E-biotine-CO2 E-biotine-CO2 + ADP + Pi ↔E-Biotine + HOOC-CH2-CO-SCoA Figure 6 – Structure de la biotine. Ce coenzyme groupement prosthétique intervient dans les carboxylations notamment du pyruvate et de l’acétyl-CoA. a2-Vitamine K Les vitamines K sont synthétisées par les végétaux et par des bactéries hébergées dans le tube digestif. Elles sont liposolubles et dérivent toutes du noyau naphtoquinone. Ces vitamines entrent dans la synthèse des coenzymes des protéines carboxylases. Ces enzymes réalisent, au cours de la post-traduction, des carboxylations en formant des résidus carboxyglutamiques, utiles à l’activation des protéines et facteurs impliqués dans la coagulation du sang. Figure 9: Structure chimique de la vitamine K2 b-Coenzymes de transport de radicaux autres que le CO2 b1-S-adénosyl-méthionine Ce coenzyme, dérive de la méthionine, acide aminé indispensable, apporté dans l’alimentation. C’est la forme active de transport et de fixation du radical méthyle (-CH3). Il est donneur de 28 méthyle dans les réactions catalysées par le groupe de méthyl-transférases qui fixent des groupements méthyles aux accepteurs convenables comme : -les acides nucléiques ; -les protéines ; -les colamines pour former les cholines ; -la nicotinamide pour former le méthylnicotinamide, forme d’élimination de cette vitamine. La perte du méthyle transforme le cofacteur en S-adénosyl-homocystéine. Exemple : Ethanolamine + 3-S-adénosylméthionine ↔ Choline + 3-S-adénosylhomocystéine Figure 7 – Réaction de formation et structure de la S-Adénosylméthionine b2-Acides foliques En fait les acides foliques sont nombreux et sont rencontrés principalement dans les feuilles. Ils contiennent deux noyaux que ne peuvent synthétiser les animaux et certains microorganismes. Il s’agit des noyaux ptérine et le radical p-aminobenzoique. Associés à leur apoenzyme l’ensemble constitue les ptéroprotéines. L’acide tétrahydrofolique (THF ou FH4) est la forme activée et fonctionne comme cofacteur de nombreux systèmes enzymatiques de transfert de radicaux à un carbone autre que le CO2. C’est la forme active d’une vitamine qui est l’acide folique ou l’acide ptéroyl-glutamique. Le radical méthyle est transporté sur l’azote 5 qui peut être transféré ensuite sur la désoxyribo-uridine pour former la désoxythimidine. Le coenzyme peut transporter aussi le groupement formyl sur l’azote N10 suivant la formule ci-dessus : la synthèse du noyau purique et des acides nucléiques dépend des réactions de transfomylation (transport de-CHO). 29 Figure 8 – L’acide folique sous sa forme tétrahydrofolique est un transporteur de radicaux monocarbonés autres que le CO2. c-Coenzymes de transport des radicaux à deux ou plusieurs carbones Il s’agit des coenzymes chargés de transporter les radicaux acyle, adéhydyle, carboxyle, etc. Nous étudierons essentiellement 3 coenzymes importants compte tenu de leur implication dans le métabolisme énergétique des glucides. Leur ordre d’intervention dans la transformation du pyruvate en acétyl-CoA va permettre d’illustrer la notion de séquence de réactions et celle du complexe multi-enzymatique. c1-Thiamine pyrophosphate La thiamine pyrophosphate (TPP) ou co-carboxylase est un ester pyrophosphorique de la thiamine (vitamine B1). Elle fait partie intégrante du site actif des carboxylases (d’où son nom). Ce groupement prosthétique dérive de la thiamine. La thiamine est formée dans de très nombreuses bactéries et végétaux. Elle contient un noyau pyrimidique et un noyau imidazole. Elle sert de coenzyme à des enzymes libérant des radicaux R-CO- à partir de molécules carbonées plus complexes et les transfèrent sur d’autres coenzymes ou substrats. La thiamine pyrophosphate intervient particulièrement dans la décarboxylation oxydative des acides alpha-cétoniques en particulier le pyruvate et l’alpha-cétoglutarate. Le type des enzymes est la pyruvate déshydrogénase et l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase. Le mode d’action est le suivant: 1-l’acide alpha-cétonique est fixé sur le carbone 2 du noyau imidazole par sa fonction cétonique (prise en charge du substrat ); 2-l’enzyme effectue le départ du CO2. Le radical obtenu est transféré sur le lipoate, coenzyme groupement prosthétique de l’enzyme lipoamide. 30 Figure 9 – Structure de la thiamine pyrophosphate, coenzyme dérivé de la vitamine B1. Mécanisme d’action de la déshydrogénase au niveau de son coenzyme, groupement prosthétique. La thiamine pyrophosphate intervient comme coenzyme accepteur de radicaux dans les réactions de transcétolation (Voie des pentoses phosphates et cycle de Calvin). Dans ce cas c’est le radical-CO-CH2OH qui est transporté sur le ribose 5-phosphate. c2-Acide lipoîque et lipoamide L’acide lipoïque est un acide gras à 8 atomes de carbone qui a un pont disulfure entre les carbones 6 et 8. Il est solidement lié à son apoenzyme. L’holoenzyme formée prend alors le nom de lipoamide.. Comme annoncé précédemment il sert d’accepteur de radicaux alcyles cédés par la thiamine pyrophosphate. Dans le cas des réactions partant du pyruvate ou de l’alpha-cétoglutarate, le radical transporté est un acétyle ou un succinyle. L’enzyme responsable du transport de ces radicaux sur le lipoate est la pyruvate déshydrogénase ou l’α-cétoglutarate déshydrogenase. Le lipoate n’est pas l’accepteur final des radicaux acyles. Une deuxième enzyme intervient, une acyltransférase, (dihydrolipoyl-acyltransférase) qui transfère le radical acétyle ou succinyle sur le coenzyme A. Le lipoate est réoxydé par la dihydrolipoyl déshydrogénase à FAD qui transfère à la fin les électrons et les protons arrachés au pyruvate ou à l’ α-cétoglutarate sur NAD+. 31 Figure 10 – Structure du lipoate et réaction de transfert des radicaux issus de la thiamine pyrophosphate sur le lipoate. c3-Coenzyme A ou HSCoA Ce coenzyme existe dans toutes les cellules. Il sert d’activateur des acides gras dans les réactions de dégradations. Il joue en même temps le rôle de transformateur de radical acyle R-CO. Il est capable de les rendre solubles dans le cytoplasme. Sa structure présente une analogie avec un dinucléotide. Elle résulte de l’union de : -l’adénosine 5’diphosphate ; -de l’acide pantothénique, qui est le facteur vitaminique ( une vitamine du groupe B, non synthétisé par les animaux) ; -et de la mercaptoéthylamine. La fixation du radical sur la fonction thiol produit la formation d’un thioester à haut potentiel énergétique R-COS-CoA. C’est le groupement thiol de cette dernière qui est la partie active de la molécule : son H peut être substitué par divers radicaux acyles (notamment acétyle) pour former des acyl-coenzyme A ou acides gras activés qui chimiquement sont des thio-esters. La formation directe de l’acétyl-CoA à partir de l’acétate n’est pas courante chez les animaux. Par contre, elle se produit chez les bactéries et les végétaux avec consommation d’une molécule d’ATP (avec consommation de deux liaisons phosphates riche en énergie). Sous l’action de l’acétylthiokinase ou de l’acéyl-CoA synthètase (qui n’existe pas chez les animaux). On a : CH3 –COOH + ATP → CH3-CO-AMP + HSCoA → CH3-CO-AMP CH3-CO-SCoA + Pi + AMP La réaction globale est donc, en additionnant les deux réactions précédentes: CH3-COOH + ATP + HSCoA → CH3-CO-SCoA + AMP + PPi (pyrophosphate inorganique) 32 Ches les animaux, les acétyl-CoA sont formés au cours de la β-oxydation des acides gras, ou à l’issue de la déshydrogénation du pyruvate. Les cellules animales forment des acyl-CoA (réaction d’activation) suivant le même mécanisme et la réaction est catalysée par l’acyl-CoA synthètase. Acide gras + ATP → Acyl-AMP + HSCoA → Acyl-AMP + PPi Acyl – CoA + AMP La réaction globale est: Acide gras + ATP + HSCoA → Acyl-CoA + AMP + PPi Certaines réactions de carboxylation ne sont possibles que si le composé est lié au coenzyme A. Sous forme d’acyl-CoA. Les deux carboxylations importantes impliquant le coenzyme A sont celles de l’acétyl-CoA pour former du malonyl-CoA et du propionyl-CoA en vue de former du succinyl-CoA. Le CO2 est apporté par la carboxybiotine. CH3-CO-SCoA + ATP + CO2 → HOOC-CH2-CO-SCoA + ADP + Pi CH3-CH2-CO-SCoA + ATP + CO2 → HOOC-CH2-CH2-CO-SCoA + ADP + Pi Rôles du coenzyme • Activation des groupements carboxyliques • Activation du H en ! des groupements carboxyliques • Acylation (transfert de CH3-(CH2)n-(CO)-) Réactions à CoASH • Allongement des chaînes d’acides gras • beta6oxydation des acides gras • biosynthèse des acides aminés • formation de l’acétylcholine • formation du squalène (biosynthèse des stéroïdes). 33 Figure 11 – Structure du coenzyme A (1) – Réaction de transfert des radicaux acyles de l’acyllipoate sur le Coenzyme A (2). d-Coenzyme des aminotransférases: le pyridoxal phosphate Le pyridoxal phosphate (PLP) est un coenzyme d’une importance capitale. Il est commun à toutes les aminotransférases. Il intervient dans les réactions de transamination aussi bien de dégradation que de synthèse des acides aminés. C’est un groupement prosthétique qui est relié à son apoenzyme par liaison covalente avec laquelle elle forme une base de Schiff, aromatique. Lors de la catalyse, il forme aussi une base de Schiff avec l’acide aminé. Sa structure dérive de la vitamine B6 comprenant la pyridoxine et le phosphate. La spécificité de l’activité enzymatique est déterminée par l’apoenzyme et peut conduire aux résultats différents. Nous ne citons que 2 exemples : -Transamination : échange du radical amine entre un acide aminé et un α-cétoacide par l’intermédiaire de la pyridoxamine phosphate. Aspartate + α-cétoglutarate → oxaloacétate + glutamate. -Elimination des fonctions thiol et amine sur la cystéine HS-CH2-CH(NH2)-COOH + H2O → H2S + NH3 + CH3 –CO-COOH 34 Figure 13 – Structure du pyridoxal phosphate (PLP), coenzyme groupement prosthétique des aminotransférases 35 Réaction enzymatique Introduction La fonction d’une enzyme E est de catalyser une réaction chimique conduisant d’un substrat S à un produit P. L’activité enzymatique se manifeste donc par une accélération des vitesses de réaction en présence de l’enzyme, par rapport à la réaction, non-catalysée. Une décomposition des étapes réactionnelles, intégrant la formation du complexe enzyme-substrat peut être : Certaines étapes sont si rapides qu’on les néglige pour ne considérer que la ou les étapes cinétiquement déterminantes, qui peuvent changer d’un cas à un autre. I-Complexe enzyme-substrat 1-Théorie Victor Henry Victor Henry en 1902 a émis une hypothèse selon laquelle, le premier stade de la réaction enzymatique consisterait en une fixation des substrats sur l’enzyme pour former un complexe enzyme-substrat lequel serait ensuite dégradé en régénérant l’enzyme et en libérant les produits de la réaction. S, E et ES représentent respectivement le substrat, l’enzyme et le complexe transitoire formé lorsque le substrat biologique est fixé sur l’enzyme. 2-Mise en évidence du complexe ES. L’hypothèse de la formation de ES a été admise par la plupart des enzymologistes avant qu’il n’y ait eu de preuves chimiques directes de son existence. Keilin et Mann (1937) apportèrent pour la 36 première fois une preuve en montrant que la peroxydase de raifort forme un composé chimique défini avec son substrat, l’eau oxygénée. Comme de nombreuses autres chromoprotéines hématiniques (cytochromes, catalase, méthémoglobine), la peroxydase en solution est brun-rouge et présente un spectre d’absorption caractéristique en lumière visible. Quand H2O2 est ajoutée à l’enzyme, on observe un déplacement immédiat des bandes d’absorption indiquant la formation d’un composé chimique nouveau. Peroxydase + H2O2 ↔ Peroxydase- H2O2 En présence d’un donneur d’hydrogène convenable (cosubstrat) tel que l’acide ascorbique ou un colorant oxydable (AH2), une autre réaction a lieu: Peroxydase- H2O2 + AH2 ↔ Peroxydase + 2H2O + A qui se manifeste par le retour au spectre initial de la peroxydase libre. Le fait que ces réactions puissent être observées directement dans un spectroscope constitue une preuve convaincante de l’hypothèse formulée par Michael Menten. D’autres exemples ont été donnés par la suite de l’existence de ES. 3-Rôle de l’enzyme au niveau du complexe ES Dans les réactions enzymatiques, les processus d’affaiblissement des liaisons fortes des substrats se font à la suite d’établissement transitoire d’un complexe entre les substrats et une zone particulière de l’enzyme appelée centre actif. C’est ce complexe qui est appelé complexe enzyme substrat (ES). Au niveau de ce complexe, l’affaiblissement des liaisons fortes se fait grâce à une nouvelle répartition électronique entre l’enzyme et le ou les substrat (s). Ce qui va conduire à la formation d’autres liaisons au niveau des produits. Le complexe ES est une étape absolument indispensable pour toutes les réactions catalysées par les enzymes. 4-Nature des interactions substrat-enzyme Les substrats sont liés aux enzymes par des interactions faibles: constantes d’association de 10-2 à 10-8 M et ∆G d’interaction entre -3 et -12 kcal/mol (vs. -50 à -110 kcal/mol pour des liens covalents). La liaison du substrat au site actif implique souvent de nombreuses liaisons noncovalentes de types : 37 - van der Waals - électrostatiques - ponts hydrogènes Ces 3 types de liaisons non-covalentes diffèrent dans leurs contraintes géométrique, force et spécificité. De plus, elles sont profondément affectées (de manière différente) par la présence d’eau. 4-1- Interactions électrostatiques Un substrat chargé négativement peut former un lien électrostatique avec la chaîne latérale des résidus Lys, Arg et His, ainsi qu’avec l’amine terminale d’une chaîne polypeptidique si, dûs à leurs pKa’s, ces groupements sont chargés positivement au pH du milieu. Un substrat chargé positivement peut interagir avec les résidus Asp et Glu, ainsi qu’avec un carboxylate terminal. Figure 15: Interactions électrostatiques 4-2- Ponts hydrogènes Les ponts hydrogène dans des systèmes biologiques sont entre des hydrogènes liés à des oxygènes ou azotes et des atomes d’oxygène ou d’azote. Distances des ponts hydrogène: 2.63 à 3.10 Å Energies de liaison: 3 à 7 kcal/mol. Les acides aminés peuvent formés une variété de ponts hydrogène; 11 des 20 acides aminés peuvent former des ponts hydrogène à travers leurs chaînes latérales (donneurs ou accepteurs d’hydrogène). Une caractéristique importante d’un pont hydrogène est son sens directionnel. La spécificité des interactions enzyme substrat résulte des ponts hydrogène qui sont hautement directionnels et de la forme du site actif qui exclut les molécules n’ayant pas une forme complémentaire. 38 Figure 16: Ponts hydrogènes 4-3- Interactions van der Waals L’interaction de van der Waals est due à une force attractive non-spécifique entre deux atomes qui sont séparés par 3 à 4 Å. L’énergie de liaison pour une paire d’atomes est de l’ordre de 1 kcal/mol (interaction faible). Une interaction efficace de type van der Waals entre un substrat et une enzyme peut seulement avoir lieu si leurs formes sont complémentaires du point de vue stérique. Une spécificité résulte d’une possibilité de former simultanément un grand nombre de liaisons van der Waals entre le substrat et l’enzyme. Les répulsions entre les atomes qui sont plus proches de la distance de contact de van der Waals sont aussi importants que les forces attractives pour la spécificité d’interaction. De plus, des molécules non-polaires s’agrègent (interactions hydrophobes) dans l’eau due à une augmentation d’entropie associée aux molécules d’eau libérées. Une partie importante de l’énergie de liaison d’un substrat à une enzyme provient de l’association des régions non-polaires du substrat avec ceux du site actif. II-Activité enzymatique 1-Théorie de l’activité enzymatique 1-1-Clé-serrure (Emil Fisher, 1894) En 1902, Emil Fisher est récompensé par le prix Nobel de chimie pour son travail sur les glucides et la synthèse des purines. Il est également à l’origine du concept clé-serrure pour expliquer la spécificité des réactions enzymatiques. Dans ce modèle, la formation du complexe enzymesubstrat ES nécessite une interaction entre un ou plusieurs groupes fonctionnels ou domaines du substrat avec des motifs de la cavité enzymatique. La rigidité de ce concept et la 39 tolérance de certaines enzymes envers différents substrats constituent cependant une limite à ce modèle. Il conserve cependant un grand intérêt pédagogique. 1-2-Forme induite (Daniel E. Koshland, 1958) Dans ce modèle, qui dérive du modèle clé-serrure, il est postulé que l’association enzyme-substrat est permise après une modification de la conformation de l’enzyme induite par l’entrée partielle du substrat. La structure tridimensionnelle fonctionnelle de l’enzyme, c’est-à-dire sa forme active, n’existe donc qu’en présence de son substrat. Ce modèle, moins populaire que le précédent, a le mérite d’introduire la notion de réorganisation moléculaire et de dynamique lors de la reconnaissance enzyme - substrat. 1-3-Effet Circe (William P. Jencks 1975) / déstabilisation de l’état fondamental Ces deux théories sont basées sur les interactions noncovalentes qui existent entre enzyme et substrat. Dans l’effet Circe, on considère que c’est la liaison des parties non réactives du substrat avec la cavité enzymatique qui poussent les parties réactives dans une conformation déstabilisée. La réaction devient alors une sorte de « libération » énergétique qui est favorisée. L’idée plus globale de déstabilisation de l’état fondamental est basée sur le fait qu’une fois dans la cavité enzymatique, le substrat va subir des interactions avec les acides aminés de l’enzyme qui vont entrainer une déformation et une déstabilisation globale de l’énergie libre du substrat (ΔG). L’énergie d’activation d’une réaction étant la différence entre l’énergie libre du substrat et celle de l’état de transition, une déstabilisation de l’état initial a pour conséquence une réduction de cette différence et se traduit donc par une vitesse accrue. La réaction enzymatique est donc accélérée par rapport à la réaction noncatalysée 1-4-Stabilisation électrostatique de l’état de transition 40 De façon complémentaire à la déstabilisation de l’état fondamental, la stabilisation de l’état de transition conduit à un abaissement du niveau d’énergie de celui-ci et donc une diminution de l’énergie d’activation. Dans cette théorie, ce sont les liaisons électrostatiques qui jouent un rôle prépondérant pour la stabilisation, en raison des charges partielles importantes souvent développées au niveau des états de transition. 1-5-Effet covalent (actuel) Certains scientifiques comme Kendall N. Houk sont convaincus que les stabilisations de faible énergie (liaisons hydrogène, van der Waals, hydrophobes, …) ne permettent pas à elles seules d’expliquer les grandes différences de vitesse de réactions entre une réaction noncatalysée et la même réaction catalysée par une enzyme. Dans la théorie de l’effet covalent, il est postulé la formation d’intermédiaires au sein desquels l’enzyme est liée temporairement de façon covalente au substrat ou à un cofacteur. De tels intermédiaires impliquent une différence de mécanisme entre la réaction non-catalysée et la réaction catalysée, contrairement aux autres théories. 1-6-Near Attack Conformers(NACs) (actuel) Pour Thomas C. Bruice, ainsi que pour d’autres spécialistes, l’accélération des réactions enzymatiques est due en grande partie à la réactivité de conformères plus favorables. Cette théorie des « Near Attack Conformers » considère la réaction chimique réellement comme un processus dynamique, au cours duquel les molécules vibrent et passent par de nombreux conformères par de petits mouvements d’atomes, élongation ou contraction de liaisons, variations d’angles de liaisons ou d’angles dièdres. Certains conformères sont plus favorables que d’autres dans une réaction donnée. Cette théorie considère que l’enzyme, qui elle aussi est un assemblage dynamique d’atomes, favorise la formation de ces NACs, et que la réaction est globalement accélérée pour cette raison. Lors de la réaction non-catalysée, la formation de ces NACs est plus longue et la réaction impliquant d’autres conformères demande plus d’énergie. 41 1-7-Effet entropique (actuel) Richard Wolfenden utilise la thermodynamique des réactions chimiques pour expliquer l’accélération des réactions par les enzymes. En particulier, alors que beaucoup se focalisent sur l’énergie d’activation, il a proposé une théorie où le terme entropique joue un rôle important. On peut considérer l’entropie comme une expression du désordre. Au niveau moléculaire, c’est l’agitation moléculaire et le nombre de degré de liberté qui sont exploités. Le terme entropique intervient dans l’équation : ΔG=ΔH – TΔS Plus le terme ΔS augmente, plus la réaction est facilitée puisque cela abaisse ΔG. Au niveau moléculaire, cela signifie que plus le désordre augmente, plus la réaction est facilitée. En plus des paramètres entropiques intrinsèques de la réaction considérée, le rôle de l’eau et l’énergie de désolvatation du substrat lorsqu’il pénètre dans l’enzyme est très important dans cette théorie. 2-Techniques de mesure de l’activité enzymatique Pour mesurer l’activité enzymatique, on utilise les méthodes suivantes : 2-1-Méthodes spectrophotomètres L’enzyme agit sur le substrat pour libérer un ou plusieurs produits. Le substrat subit donc une transformation. On peut mesurer l’apparition du ou d’un produit libéré ou du substrat transformé du milieu réactionnel par des méthodes simples sensibles de dosage continu. On peut utiliser si le produit libéré ou le substrat transformé absorbe la lumière dans le visible ou l’ultraviolet les méthodes spectrophotométriques. Elles permettent de suivre la progression de la réaction grâce au changement plus ou moins considérable de l’absorbance qui accompagne la conversion de substrat. 2--2-Méthode manométrique Si l’un des produits de la réaction est un gaz, on pourra mesurer la vitesse de la réaction par une méthode manométrique qui consistera à mesurer le volume du gaz libéré ou consommé. Ce qui permet de suivre le développement de la réaction. 2-3- Technique du pH-stat 42 Si la réaction aboutit à la libération ou à la captation d’ions hydrogènes, il est souvent possible de la suivre par la technique de pH-stat. En effet, le pH est maintenu constant par addition continuelle d’un acide ou d’une base. Le nombre de mole d’acide ou de base consommée sera une mesure directe du développement de la réaction. 2-4-Méthodes chromatographiques, polarimétriques Les méthodes chromatographiques, polarimétriques ou l’estimation de la quantité de substrat ou de produits par des méthodes chimiques sont nécessaires. Elles imposent des prélèvements de parties aliquotes du milieu de réaction à des temps successifs après le début de la réaction. 3- Expression de l’activité enzymatique Les unités utilisées pour mesurer l’activité enzymatiques sont très variables : 3-1- Unité d’activité enzymatique ou unité internationale ( UI ) L’unité d’activité enzymatique d’une enzyme quelconque est la quantité de cette enzyme catalysant la transformation de 1 micro-mole de substrat par minute à 25°C ( si possible) et dans les conditions de pH et de concentrations en substrat optimales. Ici, il s’agit d’une vitesse parce que la quantité de substrat transformée est ramenée en unité de temps ( minute ). 3-2-Activité spécifique L’activité spécifique est le nombre d’unité d’activité enzymatique ou unité internationale ( UI ) par unité de poids de la préparation enzymatique (en général 1 mg). Elle permet de suivre la purification de l’enzyme. Elle augmente au fur et à mesure que l’enzyme devient pure. 3-3- Activité molaire C’est le nombre de moles de substrat transformé (ou de produit formé) par mole d’enzyme par minute dans les conditions déterminées. Dans cette situation, on doit avoir une enzyme pure et de poids moléculaire connu. 3-4-Katal C’est la quantité d’enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde sous des conditions expérimentales standard. On utilise de préférence : 43 - le microkatal ( 1 µkat = 10-6 kat ) - le nanokatal ( 1 nkat = 10-9 kat ) - le picokatal ( 1 pkat = 10-12 kat ). L’activité spécifique se définit dans ces conditions comme étant le nombre de katals par kg de protéine. 44 Cinétique enzymatique I-Rappels de cinétique chimique 1-Vitesse et ordre de réaction 1-1-Vitesse d’une réaction 1-1-1-Définition Soit la réaction A + B → C + D La vitesse de cette réaction se définit par rapport à un des éléments de la réaction. Si c’est par rapport à un réactif, on l’appelle vitesse de disparition (vitesse négative) ; si c’est par rapport à un produit, c’est une vitesse d’apparition (positive). La vitesse de la réaction (V) est définie comme étant la disparition de A ou de B ou l’apparition de C ou de D, par unité de temps. On peut écrire : V = - dA/dt = -dB/dt = dC/dt = dD/dt De façon générale, en tenant compte du nombre de molécules réagissantes ou produites, on peut écrire : A + B → C + D Dans cette situation, on a : V = - dA/dt = -dB/dt = dC/dt = dD/dt 1-1-2-Détermination graphique de la vitesse d’une réaction 45 Une méthode pratique de détermination de la vitesse d’une réaction consiste à représenter les variations de la concentration d’un des réactifs en fonction du temps et à déterminer la tangente en un point de la courbe. 1-2-Ordre d’une réaction et molécularité 1-2-1-Définition et exemples L’ordre d’une réaction est le nombre de molécules de réactants effectivement nécessaire pour l’acte chimique. Il est en rapport avec le nombre de substance dont la concentration influe sur la vitesse de la réaction. A + B → C + D V = k [A] [B] k est la constante de vitesse. Elle est indépendante des concentrations, et dépend uniquement de la température. et sont appelés ordres partiels de la réaction ; est l’ordre partiel du constituant A ; est l’ordre partiel du constituant B ; est l’ordre total de la réaction. L’ordre globale de la réaction sera : -si , alors la réaction est d'ordre 0 -si , alors la réaction est d'ordre 1 -si , alors la réaction est d'ordre 2 Ce sont les réactions d’ordre 0 qui vont nous intéresser au niveau de la cinétique enzymatique. Pour certaines réactions, il y a une relation entre l’ordre partiel par rapport aux réactifs et les coefficients stoechiométriques de la réaction. L’ordre n'est pas forcément un entier. Il peut être fractionnaire. Exemple : 2NO + Cl2 → 2NOCl 46 V = k [NO]2 [Cl]1 L’ordre global de la réaction est 3. NB : L ‘ordre de la réaction est différent du coefficient stochiométrique et de la molécularité (nombre de molécules réagissantes ou produites). - Décomposition du pentoxyde d’azote : N2O5 → NO2 + O2 Après équilibre stochiométrique 2N2O5 → 4NO2 + O2 Dans ce cas, l’ordre de la réaction par rapport à N2O5 est égal à 1 (cela a été prouvé expérimentalement) donc différent de la molécularité qui est égale à 2, ce qui veut dire qu’une seule molécule suffit pour générer NO2 + O2 -Oxydation du monoxyde d’azote Dans ce cas, l’ordre est trouvé égal à la molécularité. -Oxydation du dioxyde de soufre L’ordre est différent de la molécularité. 47 -Hydrolyse du saccharose Saccharose + eau → Fructose + glucose. C’est une réaction bimoléculaire (Fructose + Glucose). Généralement les réactions d’hydrolyse bien qu’étant bimoléculaires sont d’ordre 1. Ceci est dû au fait que l’eau est en quantité importante, et que sa variation au cours de la réaction est pratiquement imperceptible. La réaction se fait avec [H2O] = cte. V = k [ Saccharose ]1 [ eau ]0 1-3-Expressions cinétiques des vitesses de réaction suivant les différents ordres possibles 1-3-1-Cas des réactions d’ordre 0 A →Px V = kA ou V = dPx / dt dPx / dt = k A = V Si on maintient la concentration de A constante, alors V = k . cte = dPx / dt la vitesse devient constante, l’apparition du produit P va se faire de façon linéaire dans le temps. Px = Kt dPx / dt = K dPx = dt K Avec K = k .cte La représentation graphique de la concentration du produit ( Px ) en fonction du temps de réaction ( t ) donne une courbe linéaire dont la pente est K. 1-3-2-Cas des réactions d’ordre 1 Dans ce cas, la vitesse est proportionnelle à la concentration d’une seule des substances réagissantes. On peut avoir le cas : A → B V = k [ A ]1 48 V = - d [ A ] / dt = d [ B ] / dt - d [ A ] / dt = k [ A ] - d [ A ] = k [ A ] dt - d [ A ] / [ A ]= k dt Soient [A0] et [A] les concentrations respectives de A aux temps t0 et t. L’intégration de cette équation différentielle dans les intervalles [ A0 , A ] et [ t0 , t ] donne la réaction : ln [ A ] / [ A0 ] = - kt Log [ A ] = - kt / 2,303 + log [ A0 ] On peut représenter : -soit log [ A ] = f ( t ) -soit log [ A0 ] / [ A ] = f ( t ) Dans le premier cas, on obtient une courbe affine de pente négative dont la valeur est de - k / 2,303, dans le second cas, on a une courbe affine de pente k. Particularité des réactions du premier ordre : Temps de demi réaction : t1/2 tel que [A]= [A0] /2 Ln 2 = k t1/2 , d’où t1/2 = 0,693 / k On remarque que le temps de demi réaction ne dépend pas de [A0]. 1-3-3-Cas des réactions d’ordre 2 A + B →Px V = k [ A ]1 [ B ]1 Premier cas: si on considère que [ A ] = [ B ] V = - d [ A ] / dt alors: V =k [ A ]2 k = constance de vitesse. V = k[ A ]2 - d [ A ] / dt = k [ A ]2 49 - d [ A ] = k [ A ]2 dt -d [ A ] / [ A ]2 = k dt dans les intervalles [ A0 , A ] et [ t0 , t ] après intégration on a: 1 / [ A ] – 1 / [ A0 ] = kt, une droite affine ou [ A0 ] – [ A ] = Kt , une droite linéaire [ A ] [ A0 ] Deuxième cas: si [ A ] ≠ [ B], II-Cinétique enzymatique 1-Vitesse initiale de la réaction 1-1-Mode opératoire Pour réaliser cette étude : -nous devons fixer : ●la concentration du substrat. Elle doit être optimale dans le milieu réactionnel ; 50 ●la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à celle du substrat ; ●la température d’incubation ; ●le pH du tampon. -nous devons faire varier, le temps d’incubation et déterminer la quantité de produit formé à chaque intervalle de temps. 1-2-Représentation quantité de produit libéré ou formé en fonction du temps d’incubation Figure 19: Evolution de la concentration du produit en fonction du temps La vitesse initiale est la tangente d[P]/dt à la courbe [P] = f(t) au point t=0. 1-2-1-Analyse Si l’on trace la courbe quantité de produit formé en fonction du temps d’incubation, on a le résultat suivant : Cette courbe comporte deux parties : -la partie1, une courbe rectiligne ; -la partie2, une courbe qui s ‘infléchit. 1-2-2-Interprétation Dans la partie1, la réaction s’effectue à un rythme régulier. La pente est donc constante et indépendante de la concentration au substrat. Il s‘agit d’une vitesse initiale ici, nous nous trouvons dans le cas d’une cinétique d’ordre 0 par rapport au substrat. La partie 2 peut résulter de plusieurs facteurs ; -de l’inactivation de l’enzyme ; 51 -d’une inhibition par un produit de la réaction ; -de la compétition avec la réaction inverse ; -et de l’épuisement d’un substrat. En effet, compte tenu de l’état d’avancement de la réaction, la concentration du substrat n’est plus optimale. La réaction évolue en fonction de la concentration du substrat présent. Sa vitesse va donc baisser. La réaction est d’ordre 1 par rapport au substrat. 1-2-3-Conclusion Lorsque le temps de réaction est trop long, c’est le cas de la partie 2, Il introduit des irrégularités et on ne sait plus très bien ce que l’on mesure. Il est donc indispensable de travailler en vitesse initiale. 1-3-Facteurs pouvant influencer la vitesse initiale De nombreux facteurs sont capables d’influencer la vitesse initiale d’une réaction enzymatique particulière. Ce sont ; -la concentration en enzyme ; -la concentration en substrat ; -le pH ; -la température ; -la nature du substrat ; -et la présence d’activations ou d’inhibiteur. 2-Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction 2-1-Mode opératoire Pour réaliser cette étude : -nous devons fixer : ●la concentration du substrat. Elle doit être optimale dans le milieu réactionnel ; ●la température d’incubation ; ●le temps d ‘incubation, il ne doit pas être long; 52 ●le pH du tampon ; -nous devons faire varier, la concentration d’enzyme dans le milieu réactionnel et déterminer à chaque fois, la vitesse de la réaction. 2-2-Représentations graphiques On distingue deux situations : -une situation normale ; -une situation anormale. 2-2-1-Situation normale a-Analyse Figure 20: Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction : Situation normale On a une courbe hyperbolique qu’on peut scinder en deux parties : la partie1 et la partie 2. La partie 1 est une courbe rectiligne tandis que la partie 2 est une courbe qui s’infléchit. b-Interprétation La partie 1 est la zone de faibles concentrations d’enzymes. Elle permet d’obtenir dans les conditions de l’expérience les vitesses initiales. La vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration d’enzyme. L’enzyme est donc le facteur limitant du phénomène. Dans la partie 2, la concentration d’enzyme dans le milieu réactionnel est forte par rapport à la concentration de substrat, il y a une sous-estimation de l’activité enzymatique. c-Conclusion 53 Il est donc indispensable d’opérer en faibles concentrations d’enzyme et en forte concentration de substrat avec un temps d’incubation relativement court. Ces dispositions permettront de travailler facilement en vitesse initiale. 2-2-2-Situation anormale Dans cette situation, il n’existe pratiquement pas de partie rectiligne. Cette anomalie peut s’expliquer par plusieurs facteurs : -une impureté du tampon se combine avec l’enzyme, qui l’élimine totalement à dose plus forte; -l’enzyme n’est active qu’associée à un activateur sous forme d’un complexe EA selon EA → A + E . Le complexe est dissocié par dilution; -l’enzyme a une structure quaternaire qui se dissocie en monomères inactifs par dilution. -la préparation d’enzyme contient un inhibiteur formant avec l’enzyme un complexe EI inactif. L’équilibre E + I ↔ EI est déplacé à droite en augmentant la concentration de l’enzyme ; -les conditions du dosage sont incorrectes. Par exemple, le dosage utilise un système enzymatique auxiliaire et on en met pas assez. En accélérant la réaction, on s rend ce système auxiliaire limitant et la réaction s’essouffle, donnant des valeurs inférieures à la réalité. Figure 21: Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de la réaction : Situation anormale 3-Influence de la concentration du substrat sur la vitesse la réaction 3-1-Mode opératoire 54 Pour réaliser cette étude : -nous devons maintenir constants les paramètres suivants : ●la concentration de l’enzyme. Elle ne doit pas être forte. Bien au contraire, elle doit être faible ; ●la température d’incubation ; ●le temps d’incubation. Il ne doit pas être long ; ●le pH du tampon. -nous devons faire varier la concentration du substrat dans le milieu réactionnel et déterminer la vitesse de la réaction pour chaque concentration de substrat. 3-2-Représentation graphique vitesse de la réaction en fonction de la concentration du substrat dans le milieu réactionnel. Si on trace la courbe vitesse de la réaction en fonction de la concentration du substrat dans le milieu réactionnel. On obtient le résultat suivant : Figure 22 : Influence de la concentration du substrat sur la vitesse la réaction 3-2-1-Analyse On obtient une courbe hyperbolique comportant naturellement deux parties rectiligne et une partie qui s’inflexion pour donner par la suite un plateau au niveau du quel l’augmentation de la concentration du substrat ne produit plus que d’infirmes augmentations de la vitesse initiale. 3-2-2-Interprétation Partie 1 Pour une réaction enzymatique, l’enzyme existe sous deux formes; soit elle est libre (E) soit elle est combinée au substrat (ES). La concentration du substrat étant faible dans le milieu réactionnel, la plus grande partie de l’enzyme se trouve sous sa forme libre (E). Au fur et à mesure que la concentration du substrat augmente, l’équilibre de l’équation E+S ↔ ES est déplacé dans le sens de la formation de ES. La vitesse de la réaction est alors proportionnelle à la concentration 55 du substrat. V=K( E) (S) la concentration de l’enzyme étant constante dans le milieu réactionnel, on a V=K (S). Partie 2 La concentration du substrat étant forte, toute l’enzyme se trouve sous la forme ES. Par conséquent, la vitesse maximale ( Vmax) est atteinte. Dans ces conditions, l’enzyme est saturée. Chaque complexe ES va se dissocier pour libérer le produit P et l’enzyme. Nous sommes ici en concentration saturante de substrat. 3-2-3-Conclusion Il est bien dans les tests enzymatiques d’opérer en concentration saturante de substrat pour ne pas sous estimer la performance de son enzyme. 3-3-Détermination de l’équation de Michaelis et Menten Soit l’équation suivante : k1, V1 E+ S k2, V2 ES E + P k-1 , V-1 E ES = enzyme libre = enzyme liée au substrat. C’est le complexe enzyme substrat encore appelé complexe Michaelis P = produit du milieu réactionnel S = substrat du milieu réactionnel k1, k2 , k1 sont les constantes de vitesse V1 , V2 , V-1 sont des vitesses de la réaction La constante de vitesse k2 désigne l’étape limitante d’un processus complexe. Elle est généralement faible devant k-1 qui est la constance de vitesse du premier ordre correspondant à la dissociation du complexe de Michaelis. Comme k-1 k2, le complexe ES peut se former et se défaire rapidement sans altération du substrat, la transformation du substrat fait figure d’accident de parcours. C’est l’hypothèse de Michaelis et Menten. 3-3-1-Détermination de la constante de Michaelis et Menten 56 Selon l’équation de la réaction, on peut écrire que : V1 = k1 E S V-1 = k-1 ES V2 = k2 ES V = - d S / dt = V1 – V-1 = V2 k1 E S – k-1 ES = k2 ES k1 E S = k2 ES + k –1 [ES] E = concentration d’enzyme libre S = concentration de substrat ES = concentration du complexe enzyme substrat encore appelé complexe de Michaelis [P] = concentration du produit de la réaction k1 E S = ES ( k2 + k-1 ) Le système est à l’ état stationnaire, c’est à dire qu’il se forme à chaque intervalle de temps autant de ES qu’il en défait. k2 + k-1 k1 = ES = KM ( constante de Michaelis et Menten ) ES Comme la constante k2 est faible devant k-1, KM sera proche de k-1 / k1, c’est à dire de la constante de dissociation du complexe enzyme substrat. 3-3-2-Détermination de l’équation de Michaelis-Menten Soit [ ET ] la concentration d’enzyme totale dans le milieu réactionnel. En se plaçant dans les conditions de la vitesse initiale, on va se permettre de négliger le processus catalytique inverse. On a alors : [ ET ] = [ E ] + [ ES ] (équation de conservation de l’enzyme) or [ E ] [ S ] = KM [ E ] [ S ] = [ ES ] KM [ ES ] [ E ] = [ ES ] KM / [ S ] L’équation de conservation de l’enzyme donne : [ ET ] = [ ES ] KM + [ ES ] [ ET ] = [ ES ] ( KM / [ S ] + 1 ) [S] [ ET ] KM = [ ES ] 57 + 1 [S] On sait que: V2 = V = k2[ ES ] et Vmax = k2 [ ET ] On peut écrire que : Vmax / V = k2 [ ET ] / k2 [ ES ] = [ ET ] / [ ES ] donc Vmax / V= ( KM / [ S ] ) +1 = ( KM + [ S ] ) / [ S ] Vmax.[ S ] = V ( KM + [ S ] ) Vmax [ S ] V= KM + [ S ] Equation de Michaelis et Menten 3-3-3-Signification et intérêt de KM et Vmax - Lorsque toute l’enzyme du milieu réactionnel se trouve sous la forme complexée ES, la vitesse de la réaction est égale à la vitesse maximale. -Lorsque la vitesse de la réaction atteint la moitié de la vitesse maximale, autrement dit lorsque la moitié de l’enzyme du milieu réactionnel se trouve sous la forme complexée ES, la constante de Michaelis et Menten est égale à la concentration du substrat. V = Vmax.[ S ] / ( KM + [ S ] ) si V = 1 /2 Vmax alors : 1/ 2 Vmax = Vmax [ S ] / ( KM + [ S ] ) 1 / 2 = [ S ] / ( KM + [ S ] 2 [ S ] = KM + [ S ] [ S ] = KM La constante de Michaelis et Menten à la dimensions d’une concentration et s’exprime comme [ S ]. -Si k-1 k2 , alors KM = K-1 /K1 c’est l’hypothèse de Michaelis – Menten. [ E ] et [ ES ] sont à l’équilibre. Il s’agit d’un état stationnaire. La formation du produit représente une légère fuite. Dans ce cas, KM est l’inverse de l’affinité de l’enzyme pour son substrat. K aff = 1 / KM KM permet : d’évaluer l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Une constante de Michaelis et Menten élevée signifie généralement qu’une concentration élevée en substrat est nécessaire 58 pour obtenir la demi saturation de l’enzyme. L’enzyme a une faible affinité pour ce substrat. Elle pourra s’unir préférentiellement à un autre substrat dont la constante de Michaelis et Menten sera plus petit. La constante de Michaelis et Menten est caractéristique d’une enzyme donnée et qu’elle ne fait pas intervenir la concentration en enzyme pour son calcul. d’établir une comparaison au niveau des activités des enzymes agissant sur un même substrat. - si k-1 << k2 , l’hypothèse de Michaelis et Menten n’est plus valable et KM n’a plus de relation avec l’affinité de l’enzyme pour le substrat. -La constante k2 est donc le coefficient cinétique essentiel. Elle représente le pouvoir catalytique intrinsèque d’une protéine quelle que soit sa concentration dans le milieu du test, c’est à dire le nombre maximum de molécules par unité de temps. k2 est encore appelée constante catalytique = kcat.. -La constante de Michaelis-Menten peut être exprimée comme Le K peut être égal à la constante de dissociation K , si et seulement si la dissociation du M S complexe ES en E et S est beaucoup plus rapide que la formation de E et P. Dans ces conditions, k >> k et K ≈ K . Ceci permet de mesurer l'affinité de l'enzyme pour le substrat; un K élevé -1 2 M S M signifie une faible association alors qu'un K faible indique une forte association. M 3-4-Mesure de la constante et de l'efficacité catalytiques de l’enzyme Les paramètres cinétiques d'une enzyme permettent de mesurer son efficacité catalytique. Nous pouvons d'abord définir la constante catalytique (k , ou le «turnover number») comme cat étant le nombre de molécules de substrat converties en produit par unité de temps par chaque site -1 actif, quand l'enzyme est saturé. La valeur de k cat (s ) = k , dans les réactions possédant un 2 mécanisme de type Michaelis-Menten. La valeur inverse 1/k cat convertir 1 molécule de substrat en produit. 59 représente le temps requis pour L'efficacité enzymatique peut être calculée lorsque l'enzyme est non-saturée, [S] << K c'est-àM dire quand beaucoup de sites sont libres. Dans les conditions physiologiques, il est très rare qu'une enzyme soit saturée, puisque la concentration du substrat est généralement inférieure au K de l'enzyme. Dans les conditions où la concentration d'enzyme libre est à peu près égale à la M concentration d'enzyme totale, [E] ≈ [E] , on a : T Le taux de catalyse dépend donc de la valeur de kcat/KM (M-1s-1), qui représente une pseudo constante bimoléculaire et il mesure l'efficacité catalytique de l'enzyme ou sa spécificité. Une enzyme peut avoir une très grande affinité mais avec une constante catalytique faible et inversement. L'un des deux paramètres ne suffit pas à caractériser le couple enzyme/substrat. C'est le rapport qui reflète la spécificité globale d'une enzyme vis à vis d'un substrat, appelé constante de spécificité ou efficacité catalytique. Est-ce qu'il y a une limite à l'efficacité catalytique ? De l'équation ci haut on a : Cette quantité est maximale si k >> k , ça veut dire que la formation des produits obtenus à 2 -1 partir de ES est très vite par rapport à la décomposition de ES en substrat et enzyme et on obtient k cat / K ≈ k . Cette constante de deuxième ordre k ne peut pas dépasser la fréquence avec M 1 1 laquelle le substrat combine avec l'enzyme. La limite de la valeur k est la vitesse de diffusion 1 avec laquelle le substrat rencontre l’enzyme. Certaines enzymes ont atteint une efficacité catalytique tellement grande qu’elles ne sont que limitées par le coefficient de diffusion des 8 9 -1 -1 molécules (10 à 10 M s ). Le tableau sur la prochaine page montre les valeurs de K , k , et M k /K cat M cat pour plusieurs enzymes et substrats. À savoir, la catalase, l’acétylcholinestérase, la 60 fumarase, et possiblement l’anhydrase carbonique remplissent cette condition et ont donc pratiquement atteint la perfection catalytique. C'est donc dire que l'enzyme combine avec le substrat aussitôt qu'il le rencontre. Vu que le site actif de l'enzyme est une surface restreinte comment le 61 substrat est-il guidé au site actif reste une question à laquelle la réponse n'est pas encore claire. On peut conclure que : La limite supérieure de rsp est la constante de vitesse d'association de l'enzyme E et du substrat S : k1. Cette constante a pour limite la vitesse de diffusion des macromolécules dans le milieu réactionnel qui est de l'ordre de (108 -109) s-1 M-1. 3-5-Représentations graphiques de l’équation de Michaelis et Menten 3-5-1-Représentation directe ou représentation de Michaelis et Menten C’est la représentation V en fonction de S. A partir des résultats expérimentaux, mesure des vitesses initiales pour chaque concentration totale de substrat [S], pour une concentration donnée d'enzyme, nous pouvons tracer V = f([S] ) qui est une hyperbole. 62 Figure 23 : Représentation directe ou représentation de Michaelis et Menten Cette représentation graphique possède malgré sa simplicité des inconvénients : -la valeur Vmax n’est déterminée que de façon approchée. Il en va par conséquent de même pour les valeurs de Vmax / 2 et KM ; -pour tracer la courbe avec une précision suffisante, il est nécessaire d’avoir un nombre assez de points expérimentaux en particulier pour les faibles concentrations en substrat. Dans cette zone de concentration de substrat les méthodes de la vitesse d’une réaction enzymatique conduisent lorsqu’on veut les réaliser avec soin à une expérimentation longue et délicate, de plus la répétition d’un grand nombre de mesure entraîne une consommation importante de préparation enzymatique obtenue fréquemment de façon laborieuse et en petite quantité ; -pour éviter ces inconvénients, Lineweaver et Burk en 1935 ont proposé une autre méthode de détermination de KM. 3-5-2-Représentation graphiques de Lineweaver et Burk. C'est la représentation la plus utilisée qui fût publiée en 1935 par Hans Lineweaver et Dean Burk Figure 24 : Représentation graphiques de Lineweaver et Burk La représentation graphique de Lineweaver et Burk est la représentation 1/V en fonction 1/S. Cette représentation est une droite qui coupe l'axe des 1/V au point 1/VM et l'axe des 1/[S] au point -1/KM. L’intérêt de cette représentation est qu’elle peut être tracée à partir d’un minimum de points expérimentaux obtenus pour les fortes concentrations en substrat pour lesquelles la détermination de la vitesse initiale est réalisée avec le plus de précision. Il peut arriver de fois que les points expérimentaux ne s’alignent pas pour obtenir une droite affine 63 comme dans le cas d’une situation normale. Cette anomalie peut être décelée si on fait varier la concentration du substrat sur une échelle plus grande ( d’un facteur 100 ou plus ). Ce qui n’est toujours pas aisé dans la pratique ( solubilité, condition pratique du test …). Cette anomalie peut être due : - à une hétérogénéité de la solution enzymatique ou de la solution de substrat ; * la préparation enzymatique contient des iso enzymes, c’est à dire plusieurs formes d’enzymes catalysant la même réaction. * plusieurs enzymes catalysant la transformation du substrat. Cette situation peut entraînée des si on détermine l’activité de l’une des enzymes en suivant la disparition du substrat dans le milieu réactionnel. *la solution de substrat peut être impure. Elle peut contenir d’autres molécules qui peuvent être transformées par l’enzyme qui n’est donc pas spécifique. - à l’enzyme elle même. Elle peut être une enzyme non michaelienne. 3-5-3-Représentation graphique de Dixon C’est la représentation la représentation [ S ] / V en fonction de [ S ]. Figure 26 : Représentation graphique de Dixon 3-5-4-Représentation d’Eadie - Hofstee Cette représentation fût publiée par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959 : Cette représentation est une droite de pente -KM et qui coupe l'axe des v au point VM. 64 Figure 27 : Représentation graphique de d’Eadie - Hofstee L'asymptote horizontale de l'hyperbole pour les grandes valeurs de [S] permet d'avoir la valeur de VM et la valeur de KM qui est la valeur de [S] pour V = VM/2 3-6-Inhibition par excès de substrat L’excès de substrat dans le milieu réactionnel exerce une inhibition sur l’activité catalytique de l’enzyme. Cette inhibition est due à une inactivation partielle et réversible du système. En effet, le complexe ES a fixé une deuxième molécule de substrat. Le nouveau complexe ESS formé est stérile dont incorrecte pour la catalyse. ES + S ESS La constante de dissociation du complexe ESS est Ki Ki = [ ES ] x [ E ] / [ ESS ] Dans cette situation l’équation de Michaelis et Menten n’est plus valable. L’équation de conservation de l’enzyme peut s’écrire de la manière suivante : [ ET ] = [ E ] + [ ES ] + [ ESS ] [ E ] = [ ES ]. KM / [ S ] [ ESS ] = [ ES ] [ S ] / Ki [ ET ] = [ ES ]. KM / [S ] + [ ES ] + ( [ ES ] [ S ] / Ki ) [ ET ] = [ ES ] ( KM / [ S ] + 1 + [ S ] / Ki ) [ ET ] / [ ES ] = ( KM / [ S ] +1+ [ S ] / Ki ) or Vmax / V = [ ET ] / [ ES ] Vmax / V = [ KM / [ S ] +1+ [ S ] / Ki ] Vmax / V = ( KM . Ki + Ki [ S ] +[ S ]2) / [ S ].Ki V = [ S ]. Ki x Vmax / ( KM Ki + Ki.[ S ] + [ S ]2 ) Vmax x [ S ] V = [ S ]2 KM + [S] + 65 Ki Cette équation est bel et bien différente de celle de Michaelis et Menten. 3-7-Réversibilité et relation de HALDANE A des degrés divers, les réactions enzymatiques sont réversibles, c’est à dire qu’elles peuvent catalyser la réaction inverse. k-2 k-1 P +E ES E + S k2 On peut donc écrire : V’max [ P ] V = k2 + k-1 avec = K’M + [ P ] K’M k-2 V’max ( la vitesse maximale de la réaction inverse ) = k-1 [ ET ] or on sait que Vmax ( la vitesse maximale de la réaction ) = k2 [ ET ] Vmax / V’max = ( k2 [ ET ] ) / (k-1 [ ET ] ) = k2 /k-1 K’M KM = ( k2 +k-1 ) / k-2 K’M / KM = [ ( k2 + k-1 ) / k-2 ]. ( [k-1 / k2 + k-1 ] ) = k1 / k-2 = ( k2 +k--1) / k1 D’où la relation d’HALDANE K’M x Vmax = k2 x k1 = Keq = constante d’équilibre de la réaction globale. KM V’max k-2 x k-1 Cette relation souligne l’interdépendance de la constante d’équilibre et des paramètres cinétiques d’une réaction enzymatique réversible et montre qu’il n’est pas possible de négliger la réaction inverse dès que les produits s’accumulent. 4-Influence de la température sur la réaction enzymatique 66 4-1- Détermination de la température optimale d’activité 4-1-1-Mode opératoire Pour réaliser cette étude : - les paramètres suivants doivent être constants dans le milieu réactionnel : * la concentration de substrat. Elle doit être forte ; * la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à la concentration du substrat ; * le temps d’incubation. Il doit être court ; * le pH du tampon. Il ne doit pas être très éloigné du pH optimum. - la température sera le seul élément à faire varier et on déterminera à chaque fois la vitesse de la réaction. 4-1-2-Représentation graphique Figure : Influence de la température sur la réaction enzymatique a-Analyse L’étude de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la température nous permet d’obtenir une courbe en cloche qui n’est rien d’autre que la résultante de deux courbes : la courbe d’activation et la courbe de dénaturation. La courbe en cloche présente bien entendu deux parties I et II. La partie correspond à la zone des températures les plus basses et la partie II correspond à la zone des températures les plus élevées. b-Interprétation 67 Dans la partie I, la vitesse de la réaction augmente quand la température augmente. Cette augmentation de vitesse avec la température s’explique par une augmentation de la concentration du complexe activé lorsqu’on fournit plus d’énergie sous forme thermique au système réactionnel. Dans la partie II la vitesse de la réaction diminue quand la température augmente. Cette diminution de vitesse avec la température est due à une dénaturation de l’enzyme compte tenu de sa nature protéique. Les courbes d’activations et de dénaturations s’équilibrent ; on a la température optimale. A cette température l’activité de l’enzyme est maximale. Elle dépend ( la température optimale ) : * du pH ; * de la force ionique du milieu ; * et du temps de réaction ( plus le temps est court plus la température optimale peut être élevée ). c-Conclusion Contrairement aux fortes élévations de températures, les basses températures ne détruisent pas l’activité des enzymes. Aux très basses températures, on observe une diminution et même une annulation de la vitesse des réactions enzymatiques. Le froid permet donc d’éviter la dénaturation des enzymes au cours de la manipulation. 4-2- Détermination de l’énergie d’activation de la réaction 4-2-1-Principe et technique de détermination L’interprétation physique de la loi d’Arrhénius est la suivante : pour les réactions bimoléculaires, la réaction entre A et B nécessite une collision entre une molécule A et une molécule B. A l’issue d’une collision, l’énergie cinétique des molécules est partiellement transformée en énergie interne du complexe formé lors de la rencontre. Seuls les complexes qui auront emmagasiné une énergie supérieure à l’énergie d’activation Ea pourront réagir. Or cette fraction est donnée, d’après la loi de Boltzmann, par exp(-Ea/RT). Si Z est le nombre de 68 collisions par unité de volumes et de temps, alors le nombre de collisions efficaces , c’est à dire conduisant aux produits, s’écrit : k = Z exp(-Ea/RT). Avec Z ou A = facteur d’ ARRHENIUS Ea = Energie d’activation R = Constante des gaz parfaits = 1.98 T = Température absolue °K ( 273 + t °C ). ln K = ln A + ln e –Ea / RT = ln A – Ea / RT EA est comprise entre 50 et 100 kJ.mol-1. Le principe de la détermination de l’énergie d’activation repose sur la loi d’ARRHENIUS , la constante de vitesse chimique et l’énergie d’activation. La loi d’ ARRHENIUS se traduit par une relation linéaire entre log K et l’inverse de la température absolue 1/ T. On obtient une droite de pente = - Ea / (2,303.R) lorsque la vitesse réactionnelle ou une grandeur proportionnelle est porté en valeur logarithmique contre l’inverse de la température absolue. En effet, il faudrait déterminer les valeurs logarithmiques de ces vitesses initiales obtenues dans la première partie de la courbe en cloche et calculer les abscisses correspondantes. log K = - Ea / 2.303. R x 1/ T + log A 4-2-2-Représentation graphique Figure : Détermination de l’énergie d’activation 69 4-2-Q10 On définit un coefficient de température ou Q10 qui est le rapport de la vitesse V2 mesurée à la température T + 10°C sur la vitesse V1 mesurée à la température T. On peut écrire : V2 Q10 = V1 Pour les réactions enzymatiques, il faut toujours opérer à des températures physiologiques. En effet, le Q10 des enzymes voisin de 2, tombe à des valeurs très basses en dehors de la zone des températures physiologiques. Il existe une relation entre le Q10 et l’énergie d’activation. 2,303 . R x T1 x T2 . log Q10 Ea = 10 5-Influence du pH sur la réaction enzymatique 5-1-Mode opératoire Pour réaliser cette étude : - les paramètres suivants doivent être constants dans le milieu réactionnel : * la concentration de substrat. Elle doit être forte ; * la concentration d’enzyme. Elle doit être faible par rapport à la concentration du substrat ; * le temps d’incubation. Il doit être court ; * la température d’incubation. Elle ne doit pas être très éloignée de la température optimale. -le pH tampon sera le seul élément à faire varier et on déterminera à chaque fois la vitesse de la réaction. 5-1-Représentation graphique 70 Figure : Effet du pH sur l’activité enzymatique 5-1-1-Analyse L’étude de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction du pH du tampon permet d’obtenir une courbe en cloche. Elle présente bien entendu deux parties I et II. La partie I correspond à la zone des pH les plus bas. La vitesse de la réaction augmente quand le pH augmente. La partie II correspond à la zone des pH les plus élevés. La vitesse de la réaction diminue quand le pH augmente. Les deux parties sont séparées par le pH optimum au niveau duquel l’enzyme a une activité maximale. 5-1-2-Interpretation Les variations de pH peuvent avoir un effet à deux niveaux : -au niveau de l’enzyme Elles provoquent des modifications du degré d’ionisation de certains groupements fonctionnels soit du centre actif de l’enzyme. Ce qui favorise la formation du complexe ES. Soit situés en dehors du centre actif, à divers endroits de la molécule. Ce qui favorise le maintien de la conformation tridimensionnelle native de la protéine enzymatique. -au niveau du substrat. Elles provoquent un changement de son degré d’ionisation. Ce qui permet ou empêche la formation du complexe ES. 71 La variation des états d’ionisation du substrat et de l’enzyme va: - se répercuter sur l’intégrité physique de la protéine dont l’exposition à des pH trop acides ou trop basiques déclenche la dénaturation. - se répercuter sur l’affinité de l’enzyme pour le substrat en particulier lorsque celui-ci est attiré dans le site catalytique par des liaisons ioniques. Les variations de pH entraîne alors des changements de KM. -entraîner un changement de Vmax. 5-1-3-Conclusion Certaines enzymes ont leur pH optimum qui est pH acide. On dit que ce sont des enzymes acides. (Ex : amylase acide, α-glucosidase acide). D’autres ont leur pH optimum qui est un pH basique ou alcalin. Ce sont des enzymes alcalines (Ex : phosphatase alcaline). On trouve aussi des enzymes qui ont un pH optimum neutre. Ce sont des enzymes neutres. 6-Influence des agents chimiques sur la réaction enzymatique Introduction Le substrat et le produit, l’enzyme, les ions, les coenzymes et l’énergie sont les facteurs indispensables à la réaction enzymatique. Les autres molécules qui entrent en liaison avec l’enzyme, les ligands, peuvent avoir un effet positif ou négatif. Ils peuvent favoriser ou au contraire contrarier le déroulement de la réaction. L’activité enzymatique peut être modifiée par la présence de composés autre que le substrat : On les appelle effecteurs. Ils jouent un rôle important dans le phénomène de régulation et sont également forts utiles dans des mécanismes d’action des enzymes. On peut les classer en deux groupes : -les activateurs qui augmentent la vitesse de la réaction ; -et les inhibiteurs qui la réduisent. Ces effecteurs peuvent intervenir en différents points de l’enzyme. Ils peuvent : * dénaturer la protéine activante ; *de fixer sur des groupements chimiques de cette molécule protéique, groupements indispensables ou non à son activité ; 72 *se fixer sur le centre actif de la molécule fonctionnelle et empêcher la formation du complexe enzyme-substrat en réalisant un complexe enzyme-inhibiteur ; *se fixer à la place du groupement prosthétique ; *inhiber la fonction de donneur ou d’accepteur du coenzyme ; *immobiliser les ions activateurs. 6-1-Effets des inhibiteurs Les inhibiteurs sont des effecteurs dont l’action aura pour résultat soit la suppression pure et simple soit le ralentissement de l’activité enzymatique. Ces effecteurs peuvent être divisés en deux groupes : -les inhibiteurs dont l’action est réversible ; -et les inhibiteurs dont l’action est irréversible. 6-1-1-Inhibiteurs irréversibles Ce sont les effecteurs qui dénaturent ou dégradent les enzymes. Dans ce groupe on peut citer : -le phénol ( qui dénature ), l’urée, le SDS ( qui dénature ) ; -le formol ( qui coagule ) ; -l’acide trichloroacétique ( qui précipite ) ; -les enzymes protéolytiques etc. 6-1-2-Inhibiteurs réversibles Dans ce groupe d’inhibiteurs réversibles, on distingue plusieurs variantes qui se différencient par leur mode d’action. On distingue : -les inhibiteurs compétitifs ; -les inhibiteurs non compétitifs ; * les inhibiteurs non compétitifs classiques ; * les inhibiteurs non compétitifs mixtes. -les inhibiteurs incompétitifs ; a-Inhibiteurs compétitifs 73 Dans cette inhibition, nous avons deux cas : -le cas où l’inhibiteur possède une analogie structurale avec le substrat du point de vue conformation. Il y a donc une compétition entre le substrat et l’inhibiteur. L’enzyme possède donc un seul site pour le substrat et l’inhibiteur. On parle d ‘inhibition compétitive classique. - Il existe un autre cas où l’enzyme possède deux sites de fixation : un site pour le substrat et un autre pour l’inhibiteur. Si le substrat se fixe en premier lieu, l’inhibiteur ne pourra donc plus se fixer et vice-versa. Il y a donc une inhibition. La fixation du substrat (ou de l’inhibiteur ) crée un encombrement stérique qui empêche la fixation de l’inhibiteur ( ou substrat ). On parle d ‘inhibition compétitive non classique. 74 L'inhibition compétitive diminue le taux de catalyse en réduisant le nombre d'enzymes accessibles au substrat. Elle peut être abolie par un excès de substrat. Le V max de la réaction est donc le même, en présence ou absence de l'inhibiteur, car à haute concentration de substrat, tous les sites sont occupés par le substrat et l'enzyme est parfaitement active. Par contre, le K va augmenter avec la force de l'inhibiteur, par un facteur M L’analyse cinétique de l’inhibition compétitive dans une représentation de Lineweaver-Burk se caractérise par le fait que toutes les droites se coupent sur l’axe 1/v à 1/V 0 commun. 75 , - intercepté MAX Figure : Représentation double réciproque d’une enzyme michaelienne simple en présence d’un inhibiteur compétitif K’M est fonction de la concentration de l’inhibiteur. Plus la concentration de l’inhibiteur est élevée plus K’M est grand. Cela veut dire que plus la concentration de l’inhibiteur est élevée plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat diminue. L’inhibiteur n’affecte pas la vitesse maximale de la réaction. Un exemple classique et historique de ce type d’inhibition est l’inhibition de lsuccinodéshydrogénase par certains analogues de l’acide succinique tels que l’acide malonique, l’acide oxalique ou l’acide glutarique qui peuvent se combiner à l’enzyme mais ne peuvent être déshydrogénés. b-Inhibition non-compétitive On distingue : -l’inhibition non compétitive classique ou simple ; -l’inhibition non compétitive mixte. Inhibitions non compétitive classique ou simple Généralement l’inhibiteur se fixe à un site différent de celui du substrat. Mais pour qu’il ait compétition, il faut que la fixation de l’inhibiteur provoque ou induise un changement conformationnel de l’enzyme qui va se répercuter sur le site catalytique sans affecter le site de fixation du substrat. Dans ces conditions, le substrat peut se fixer mais ne sera pas métabolisé du fait du changement du site. Dans ce cas, l’inhibiteur n’a aucune influence sur l’affinité de l’enzyme pour son substrat. C’est la vitesse maximale qui est affectée. Plus la concentration de l’inhibiteur augmente plus la vitesse maximale diminue. Inhibitions non compétitive mixte Dans ce cas, la fixation de l’inhibiteur va induire un changement conformationnel qui va donc se répercuter à la fois sur le site catalytique et le site de fixation du substrat. Dans ce cas, KM et Vmax sont affectés. 76 L’analyse cinétique de l’inhibition mixte dans une représentation de Lineweaver-Burk se caractérise par des courbes d’inhibition ni parallèle ni possédant un intercepté commun. Dans ce cas, l'inhibition n'est pas renversée par une augmentation de la concentration de substrat. Le K et V M MAX vont changés de façons différentes. c-Inhibition incompétitive L’inhibiteur n’a aucune affinité pour l’enzyme toute seule. Par contre, il se fixe seulement et très bien sur le complexe ES mais dès qu’il se fixe, il induit le changement conformationnel qui va se répercuter sur le site catalytique de sorte que le complexe ES ne conduise pas au produit. 77 L’analyse cinétique de l’inhibition incompétitive dans une représentation de Lineweaver-Burk se caractérise par des courbes d’inhibition qui ont des pentes identiques égale à K /V M droites parallèles. 78 MAX - EFFETS ALLOSTERIQUES I-Quelques définitions Lorsqu’une protéine est composée de plusieurs chaînes d’acides aminés, chacune de ces chaînes est une sous-unité de la protéine. L’arrangement spatial des sous-unités constitue la structure quaternaire de la protéine. Les corps chimiques dont la molécule est constituée de répétitions multiples d’un même ensemble d’atomes sont des polymères. L’unité structurale ainsi répétée est un protomère ou monomère. Lorsque le nombre de répétitions est faible le polymère est appelé oligomère. Une protéine constituée de sous-unités identiques est un oligomère. Chaque protomère d’une protéine oligomérique peut être formé de plusieurs sousunités. Les enzymes allostériques sont des enzymes régulatrices qui sont généralement oligomériques c’est à dire constituées d’un petit nombre de monomères (sous-unités) dépassant rarement 6. Elles possèdent sur chaque monomère plusieurs sites spécifiques appelés sites allostériques pour la fixation de différents ligands dont le substrat. Une enzyme allostérique est une enzyme dont l’activité est modulée par la fixation non covalente (donc réversible) d’un ou plusieurs métabolites modulateurs sur des sites différents du site catalytique ou modulée par fixation du substrat. Une enzyme régulatrice peut être modulée c’est à dire inhibée ou activée par des modulateurs encore appelés effecteurs. Ces effecteurs sont en fait des métabolites ou des cofacteurs. Ils n’ont pas d’analogie structurale avec le substrat. Ils se fixent sur un site allostérique. L’effecteur est encore appelé effecteur allostérique. Le terme allostérique vient du mot grec «allos» qui veut dire autre et «stereos» qui veut dire forme. Les enzymes allostériques sont donc des enzymes régulatrices qui prennent une autre forme ou conformation à la suite de la liaison d’un modulateur. Dans certains systèmes multienzymatiques, lorsque le produit terminal se trouve en excès, l’enzyme régulatrice est inhibée de façon spécifique par ce produit terminal de la voie métabolique. Ce type de régulation est appelé rétrocontrôle ou inhibition par feed-back. On parle de rétroinhibition lorsque le produit d’une longue séquence de réactions biosynthétiques inhibe l’activité d’une enzyme dont l’action se manifeste au début de la voie biosynthétique. 79 Le produit inhibiteur est appelé effecteur allostérique négatif ou inhibiteur rétroactif. Lorsqu’un effecteur exerce une activation sur l’activité de l’enzyme allostérique, on parle dans ce cas d’effecteur allostérique positif. II-Symétrie Le comportement des enzymes que nous avons vues jusque là, lorsque la concentration du substrat change, répond à l’équation de Michaelis : ce sont des enzymes à cinétique michaelienne. D’autres enzymes de structure plus complexe ont une affinité vis à vis du substrat qui n’est pas une constante ou bien voient leur vitesse maximum changer en fonction de la concentration des effecteurs : ce sont les enzymes à cinétique allostérique. Ces enzymes ont toujours une structure quaternaire composée de plusieurs chaînes d’acides aminés, formant des sous-unités ou protomères presque identiques entre elles. Les protomères sont arrangés dans l’espace de façon que chacun d’entre eux ait les mêmes liaisons avec les autres. Un tel arrangement est dit symétrique. C’est le cas des deux protomères d’une paire ou des quatre protomères placés aux 4 sommets d’un tétraèdre. Chaque protomère a des liaisons avec les autres protomères du système, le plus souvent de type électrostatique, sa structure secondaire et tertiaire et son énergie interne sont modifiées par ces liaisons. Les sites de liaison existent de façon identique sur chaque protomère. Lorsque l’énergie interne d’un protomère augmente par suite de la modification de ces liaisons, on dit qu’il passe à un état tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposent une structure correspondant à une énergie interne diminuée, on dit qu’il passe à un état relâché. Ces changements d’énergie interne se traduisent par des modifications de l’affinité de l’enzyme vis à vis du substrat ou encore de la vitesse initiale de la réaction. Le passage d’un protomère de l’état relâché à l’état tendu implique en général la transformation de la structure des autres protomères dans le même sens pour maintenir la symétrie de la structure d’ensemble. III-Allostérie 1-Cinétique des enzymes allostériques 1-1-Etude de Hill : la fixation du dioxygène sur l’hémoglobine et la myoglobine 1-1-1-Structure de l’hémoglobine 80 L’hémoglobine humaine possède une structure quaternaire composée de 4 chaînes polypeptidiques identiques deux à deux. Sa formule est a22. Les chaînes et se ressemblent par leur structure dans l’espace et ont une homologie de séquence très nette. Chaque chaîne porte un noyau hème. Chaque noyau hème est constitué d’une porphyrine, la protoporphyrine , portant en son centre un ion ferreux. La myoglobine est une protéine qui transporte l’oxygène dans le cytoplasme des cellules. Elle est constituée d’une seule chaîne d’acides aminés. Sa vitesse de transport de l’oxygène est fonction de la pression de ce gaz. 1-1-2-Courbes de fixation ou de saturation de l’hémoglobine et de la myoglobine La courbe de fixation ou de saturation de la myoglobine par l’oxygène en fonction de la pression partielle de ce composé est une courbe hyperbolique alors que celle obtenue avec l’hémoglobine est une courbe sigmoïde c’est à dire en forme de S. La myoglobine est saturée à 50% à des pressions partielles d’oxygène allant de 0,15 à 0,3 Kpa pour être saturées à 50%. L’hémoglobine et la myoglobine sont toutes deux saturées à plus de 95% à la pression partielle du sang artériel dans les poumons ( environ 13 Kpa ). La myoglobine est donc saturée à 80% à une pression de 1,5 Kpa. Ces résultats montrent que la myoglobine possède une affinité très élevée pour l’oxygène. Ce qui n’est pas le cas pour chacune des quatre sous-unités de l’hémoglobine. En effet l’hémoglobine qui est la substance responsable de la coloration rouge du sang est une protéine oligomérique. Elle est constituée de 4 sousunités. Chaque sous-unité est constituée d’un groupement prosthétique l’hème qui 81 contient du fer et une fraction protéique appelée globine. Chaque fraction protéique contient un site de fixation de l’oxygène. En effet, lorsque la première sous-unité hème-polypeptide fixe une molécule d’oxygène, elle communique cette information aux sous-unités restantes grâce à des interactions au niveau des interfaces des sousunités. Ce qui entraîne un changement conformationnel de l’hémoglobine. Les sousunités répondent en augmentant fortement leur affinité pour l’oxygène. Il s’agit d’un effet coopératif car lorsque la première molécule d’oxygène se fixe, elle facilite la fixation des molécules suivantes au fur et à mesure que la pression partielle augmente. Cette coopérativité est positive car elle se traduit par la courbe sigmoïde de fixation d’oxygène sur l’hémoglobine. La liaison coopérative de l’oxygène ne se produit pas avec la myoglobine car cette protéine est monomérique c’est à dire constituée d’une seule unité possédant un groupement heminique qui se trouve à l’intérieur d’une chaîne polypeptidique. Elle ne peut donc lier qu’une seule molécule d’oxygène d’où l’allure hyperbolique de la courbe de saturation.La coopérativité positive n’est pas le seul résultat possible d’interaction des sous-unités dans les protéines oligomériques. Pour certaines protéines oligomériques, la coopérativité est négative. Dans ce cas, la liaison d’une molécule de ligand diminue la probabilité de fixation d’autres ligands. 1-1-3-Coefficient de Hill Hb + nO2 → [Hb(O2)n] La fonction de saturation Y est comprise entre 0 et 1. [ Hb][O2 ]n KD [ Hb(O2 ) n ] [ Hb(O2 ) n ] Y [ Hb] [ Hb(O2 ) n [ Hb(O2 ) n ] [ Hb][O2 ]n KD [ Hb][O2 ] n KD Y [ Hb][O2 ] n [ Hb] KD 82 [O2 ] n Equation de Hill pour l’hémoglobine : Y K D [O2 ] n [O2 ] n K D [O2 ] n [O2 ] n K D [O2 ]n [O2 ] n Y Y 1 KD KD [O2 ]n K D [O2 ] n 1 n K D [O2 ] Y log n log[O2 ] log K D Y 1 Linéarisation de l’équation de Hill : Y log n log[O2 ] log K D Y 1 Y Lorsqu’on trace log f (log[O2 ]) on obtient une droite de pente n et Y 1 d’ordonnée à l’origine – log KD. n est le nombre de Hill (également appelé « indice de coopérativité »). Il est inférieur au nombre de sites. Comme dit précédemment, n est inférieur au nombre de sites. 1-2-Application aux enzymes allostériques Soit E, une enzyme considérée comme allostérique et S, un substrat susceptible d’être fixé par l’enzyme. E + nS ESn [S ]n Y K '[ S ] n 83 Vmax [ S ]n vi K '[ S ]n vi log Vmax vi n log[ S ] log K ' Si n = 1 il n’y a pas de coopérativité : l’enzyme a un comportement Michaelien. Si n > 0 la coopérativité est positive. Si n < 0 la coopérativité est négative. Remarque : n dépend de la concentration en substrat. Ainsi, n est constant dans un domaine de concentrations en substrat. Aussi, pour les faibles et pour les fortes concentrations en substrats, n = 1. Pour déterminer l’indice de coopérativité, il suffit de faire la représentation graphique : V Log en fonction de log S Vmax - V Figure : Dans le cas où n = 1, cela veut dire que l’interaction entre les sous unités ( s’il y en a plusieurs ) est nulle. Ces sous-unités fonctionnent comme si elles étaient indépendantes et leur cinétique est hyperbolique dans le cas de V = f (S). 84 2-Etude comparative des représentations graphiques michaeliennes et à coopérativité négative et positive des cinétiques Lorsque n = 1, la cinétique est de type michaelien. La coopérativité est nulle. Il n’existe donc pas d’interaction entre les différentes sous-unités de l’enzyme si elle est oligomérique. Lorsque n > 1, on a une cinétique à coopérativité positive. La fixation du ligand induit des interactions entre les sous-unités qui facilitent la fixation des autres ligands. Lorsque n < 1, on a une cinétique à coopérativité négative. La fixation d’un ligand induit des interactions entre les sous-unités de l’enzyme oligomérique qui ne facilitent pas la fixation des autres ligands. Dans la représentation de Michaelis et Menten, le phénomène de coopérativité positive se traduit par une sigmoïde et celui de coopérativité négative par une courbe de type hyperbolique difficile à différencier de fois de celle fournie par une cinétique michaelienne. Dans la représentation de Lineweaver et Burk, on n’obtient pas de droite pour les cinétiques à coopérativité négatives et positive. Pour la coopérativité positive, on obtient une courbe dont la concavité est orientée vers le haut. Quant à la coopérativité négative, on obtient une courbe dont la concavité est dirigée vers le bas. 85 Figure : III-Propriétés caractéristiques des enzymes allostériques Structure quaternaire : les enzymes allostériques sont des oligomères : ils sont composés de plusieurs sous-unités appelées « protomères ». Les effets coopératifs sont dus à cette structure quaternaire. La dénaturation par des agents doux rompt les liaisons hydrogène. Comme il y a perte de la coopérativité, l’enzyme devient Michaelienne. Dans ce cas, le terme exact à) employer est « désensibilisation ». Les enzymes allostériques natives sont sous 2 formes : - R : pour « relâchée ». Cette forme est favorable à la fixation du substrat et défavorable à la fixation de l’inhibiteur. L’enzyme a alors une très forte affinité pour le substrat. C’est la forme active de l’enzyme. - T : pour « tendue ». Cette forme est défavorable à la fixation du substrat et de l’activateur et favorable à la fixation de l’inhibiteur. Cette forme de l’enzyme est peu active ou totalement inactive. Comportement non Michaelien : → Représentation de Michaelis : Pour les faibles concentrations en substrat, la vi augmente très lentement. Il existe un seuil audelà duquel la vi augmente très rapidement. On appelle « [S]0.5 » la concentration en substrat pour laquelle l’enzyme est saturée à 50%. 86 Représentation de Lineweaver-Burk : vi = f([I]) : Les enzymes de type K : On détecte l’allostérie en traçant v = f([S]) : on obtient une sigmoïde. En l’absence de substrat, l’enzyme native est surtout sous forme T. La présence d’un modulateur positif fait augmenter K0.5 (le K0.5 est aux enzymes allostériques ce que le Km est aux enzymes Michaeliennes). Inversement, la présence d’un modulateur négatif fait baisser le K0.5. Un excès de modulateur positif fait apparaître un comportement Michaelien chez l’enzyme : c’est la « désensibilisation ». Concrètement, l’enzyme passe de la forme T à la forme R. Pour les enzymes de types K, la présence d’effecteurs fait varier K0.5 mais pas Vmax. Les enzymes de type V : Cette fois, K0.5 ne varie pas mais Vmax varie : en présence d’activateur, Vmax augmente et en présence d’inhibiteur Vmax diminue. On détecte l’allostérie en traçant v = f([I]) ou v = f([A]). Pour les enzymes de type V, les formes R et T ont la même affinité pour le substrat mais par pour l’activateur et l’inhibiteur. 87 IV-Effets homotropes et hétérotropes Lorsque l’effet de coopérativité est provoqué par le substrat lui-même ou par les produits analogues , cet effet est dit homotrope. L’enzyme est dite homotrope. On parle dans cette situation d’effet coopératif homotrope. C’est le cas de l’oxygène qui exerce un effet homotrope sur sa propre fixation à l’hémoglobine. Lorsque l’effet de coopérativité est provoqué par un effecteur ( inhibiteur ou activateur ), il est nommé hétérotrope. On parlera d’effet coopératif hétérotrope. L’enzyme est une enzyme hétérotrope. On peut aussi dire que les interactions entre protéine et ligands sont dites homotrope lorsqu’elles se font au niveau des sites catalytiques hétérotropes lorsqu’elles concernent des sites de nature différente. Dans tous les cas, le comportement de l’enzyme paraît correspondre à des changements de conformations qui affectent soit KM, soit Vmax de la réaction. les enzymes du premier type sont désignés comme enzyme des systèmes K, les secondes comme les enzymes des systèmes V. V-Modèles structuraux Deux modèles ont été proposés : - Le modèle de Monod-Wyman - Changeux ( Modèle MWC ) -Le modèle de Koshland-Nemethy-Filter ( Modèle KNF ) 1-Modèle concerté de Monod-Wyman-Changeux La base du modèle de Monod et collaborateur repose sur les faits suivants : - L’enzyme allostérique est constituée de quelques protomères. Ces protomères sont associés de façon symétrique. Chaque protomère possède un site catalytique, un site activateur et un site inhibiteur ou un site régulateur. - Avant l’addition du ligand, l’enzyme allostérique existe sous deux conformations en équilibre ; une conformation active de forte affinité pour le substrat appelée forme R ( forme Relâchée ) et une forme inactive de faible affinité pour le substrat appelée forme T ( forme Tendue ). - Le ligand peut se fixer à chacune des deux conformations, mais avec des affinités différentes. De plus l’équilibre entre les deux formes ( R et T ) est modifié par la fixation du ligand. D’une façon générale, la fixation d’un ligand sur l’une ou l’autre 88 des deux conformations déplace l’équilibre vers la conformation qui a plus d’affinité pour ce dernier. C’est ainsi que le substrat déplace lorsqu’il se fixe sur la forme R, l’équilibre vers cette conformation. Il en est de même pour les activateurs. Les inhibiteurs se fixent sur la forme T et déplace l’équilibre vers cette forme. - Un changement de conformation d’une sous-unité affecte toutes les sous-unités à la fois. Il n’existe donc pas de composés hybrides ( TR ). Ce modèle est encore appelé modèle symétrique ou modèle du tout ou rien ou modèle concerté. Selon ce modèle, les sous-unités de l’enzyme sont identiques et arrangées de façon symétrique. Il y a 1 site par ligand sur chaque sous-unité. Forme T Forme R En l’absence de ligand, il y a un équilibre en les 2 formes. Quand le ligand se fixe sur la forme pour laquelle il a de l’affinité, il déplace l’équilibre en faveur de cette forme. 89 2-Modèle séquentiel de Koshland-Nemethy-Filter Ce modèle diffère de celui de Monod et collaborateur par 4 aspects essentiels : - Une seule des deux conformations ( T ) préexiste à l’avènement du substrat - Tout changement conformationnel d’une sous-unité ne se répercute pas simultanément mais de façon séquentielle sur les autres sous-unités. - La symétrie de l’oligomère n’est pas forcement maintenue après la fixation du ligand. - Il y a formation d’hybrides ( TR ). Ce modèle explique aussi les effets coopératifs entre les molécules du substrat et l’action des effecteurs. Dans le premier cas, l’approche du substrat sur un protomère T va induire un changement conformationnel qui va parfaire sa fixation en modulant au mieux le site de fixation. Ce changement va se répercuter séquentiellement sur les autres protomères jusqu’à ce qu’ils se retrouvent tous dans une conformation optimale pour la fixation du substrat. 90 La fixation d’une molécule de substrat conduit à une affinité de plus en plus grande pour le catalytique d’où l’effet coopératif. Dans le cas des activateurs, une fixation plus accrue du substrat pour les sites catalytiques est obtenue et dans le cas des inhibiteurs, l’obtention de conformation plurielle ne pouvant se fixer ni substrat, ni activateur. A l’heure actuelle, il est difficile de trancher de façon catégorique en faveur de l’un ou de l’autre de ces deux modèles. Les cinétiques de certaines enzymes allostériques se laissent mieux interpréter par le modèle de Monod et coll. alors que pour d’autre c’est le modèle de Koschland et coll. qui est le plus adéquat. Selon cette théorie, il existerait des formes hybrides R-T et, en l’absence de ligand, il n’y aurait pas d’équilibre entre les formes R et T. En règle générale, k1 < k2 < k3 < k4. Cependant, la β-galactosidase est un tétramère non-coopératif donc la fixation du substrat sur chaque sous-unité se fait selon la même constance. VI-Exemples d’allostérie 1-La phosphofructokinase • La phosphofructokinase (en abrégé PFK) est une enzyme présente dans toutes nos cellules. • Elle comporte 4 sous-unités presque identiques, avec 4 sites actifs pour une masse moléculaire de 340000 daltons. • Elle catalyse une réaction de transfert de phosphate et d’énergie du coenzyme ATP vers le fructose 6-phosphate qu’elle active en fructose 1,6-diphosphate. Un proton est libéré. • La réaction couplée est exergonique et irréversible. • La PFK est l’enzyme la plus lente de la glycolyse cytoplasmique, voie métabolique du métabolisme énergétique. Elle catalyse l’étape d’engagement des glucides dans la production d’énergie. Elle est donc l’enzyme-clé de cette voie métabolique. 91 • La cinétique de la PFK est allostérique; elle est rétroinhibée par le produit final de la glycolyse, l’ATP. Une molécule d’ATP (effecteur allostérique), différente de celle qui apporte le phosphate et l’énergie (coenzyme), se fixe sur un site de liaison de chaque protomère et cette fixation diminue l’affinité du site actif pour le fructose 6-phosphate. Il en résulte un ralentissement de la vitesse de réaction. • Lorsque on représente sur un graphe la constante Km de la PhosphoFructoKinase pour son substrat le Fructose-6-phosphate, en fonction de la concentration de l’ATP, produit final du métabolisme énergétique, on montre que cette constante Km est d’autant plus élevée que cette concentration augmente. • L’affinité de la PFK pour le Fructose-6-phosphate diminue avec l’augmentation de la concentration du produit final : il y a donc rétroinhibition de l’enzyme par l’ATP. VII-Voie métabolique • Les réactions enzymatiques permettent à notre organisme de faire la synthèse des molécules biologiques dont il a besoin. Cette synthèse s’effectue à partir de composés simples souvent d’origine alimentaire. Un composé A par exemple peut être le substrat de réactions enzymatiques conduisant vers des synthèses variées. C’est un carrefour métabolique. Chacune de ces synthèses va se faire en plusieurs étapes (A, B, C, D,...) chacune catalysée par une enzyme spécifique (E, F, G,...). • La vitesse de synthèse du dernier produit dépend de la vitesse de la plus lente de ces enzymes. Si ce produit final est en quantité insuffisante, il faut que cette enzyme soit activée. Si au contraire il y a une concentration élevée du produit D, il faut que cet enzyme soit inhibée. • Il est souhaitable que les composés intermédiaires ne s’accumulent pas, donc que l’enzyme la plus lente, qui va être régulée, soit celle qui catalyse la première des réactions conduisant au produit final. Dans cet ensemble de réactions enzymatiques l’enzyme E, catalysant la transformation de A en B, première étape de la synthèse, est celle qui doit être régulée par des effecteurs. qui permettront de contrôler la vitesse de l’ensemble. Par exemple, un excès de produit final peut aboutir à l’inhibition de cette première étape : c’est la rétroinhibition. • Cette unité de production cellulaire d’un composé biologique s’appelle une voie métabolique. • Elle est constituée de plusieurs réactions catalysées par des enzymes diverses. Chacune de ces enzymes peut éventuellement participer à plusieurs voies métaboliques. 92 • Lorsque le métabolisme d’un composé implique un très grand nombre d’étapes, et plusieurs carrefours métaboliques, la synthèse totale constitue un ensemble de voies métaboliques successives. 93 CINETIQUE A DEUX SUBSTRATS Introduction A part les isomérases, les lyases et les hydrolases, toutes les autres enzymes c’est à dire, les oxydoréductases, les transférases et les ligases obéissent à des cinétiques à plusieurs substrats. Dans le cas de deux substrats donnant deux produits, nous allons distinguer trois mécanismes d’association des substrats. Ces mécanismes sont : - Le mécanisme d’association au hasard ou mécanisme bibi random ; - Le mécanisme bibi ordonné ; - Le mécanisme bibi ping-pong. 1 – Notion de Cleland ! Cleland (1963) proposé des formules schématiques particulièrement commodes et applicables quel que soit le nombre de substrat. Ces formules schématiques traduisent effectivement les mécanismes enzymatiques rencontrés. - On présente par un trait horizontal l’enzyme au cours d’un cycle réactionnel et par des flèches verticales les substrats venant se fixer sur l’enzyme et les produits quittant celle-ci. - On nomme : * A et B les substrats dans leur ordre de fixation, * P, Q les produits dans leur ordre de départ * E l’enzyme libre - On désigne par EA, EAB respectivement les complexes binaires et ternaires transitoires qui résultent de la fixation dissociable de A et de B à l’enzyme. On doit aussi noter que le nombre de substrat et de produits est indiqué par les préfixes uni, bi, ter, quad… C’ est ainsi que bibi indique la présence de deux substrats et de deux produits. La grande majorité des cas réels ne dépassent pas le ter ter. L’ordre de fixation des substrats et l’ordre de départ des produits doivent être précises ; 94 Il peut être séquentiel c’est à dire que tous les substrats se fixent avant qu’il ait libération du premier produit, Il peut être ordonné, c’est à dire que les divers substrats doivent se fixer dans un ordre défini, Il peut être aléatoire ( random ). Ce sont les substrats pouvant se fixer dans un ordre quelconque. 2- Les mécanismes d’association des substrats 2-1- Mécanisme d’association au hasard ou mécanisme bibi random ou mécanisme bibi aléatoire a- La formule schématique de Cleland Chacun de ces deux substrats peut se fixer l’un avant l’autre. C’est donc un mécanisme d’association au hasard. La formule schématique proposée par Cleland est la suivante : A B P EA Q EQ E E EAB EAQ composé ternaire EB B A EP Q P b- Les réactions Ka B B EA K’b A E Produits EAB K’a Kb B A EB 95 E + EAB EAB = x Kb EAB car Ka x K’b = K’a ou Ka x K’b EA constantes de Ka = système pour A et B EA des coefficients de K’a x Kb EA Ka et Kb sont les EA = dissociation Ka du et K’a et K’b sont KM du système pour A et B. EB EB Kb = EB = EB Kb Les substrats A et B sont supposés se lier à des sites distincts. Par conséquent Ka différent de Ka’ et Kb différent de Kb’ car la fixation d’un premier substrat peut très bien modifier les propriétés de l’enzyme avant la fixation du second. La loi de conservation de l’enzyme : ET = E + EA + EB + EAB La vitesse de la réaction V = Kc x EAB V KC = ET E + EA + EB + EAB EAB or EAB = , alors Ka x K’b EAB Kc x V Ka x K’b = ET E + EA + EB + EAB E A B Kc x V Ka x K’b = 96 ET B EA EB + EB + Ka EA + Kb Ka x K’b E On divise haut et bas par Ka x K’b V Kc x A x B = ET Ka x K’b + K’b A + Ka x K’b B + A B Kb K’b V ( Ka K’b + K’b A + Ka B Kb OR Vmax = Kc x ET B + A B ) = ET Kc A Alors : V ( Ka K’b + K’b A + Ka B Kb K’b B + A B ) = Vmax A Vmax A x B V = Ka x K’b + K’b A + Ka x K’b B + A B Ka x K’b + K’b A + Ka x Kb Vmax A B K’b B + A B Kb 1 = V 1 AB Ka x K’b = + V Vmax A B Vmax A B K’b A Ka x K’b Kb B + Vmax A B + Vmax A B Ka x K’b 1 Ka x K’b K’b Kb 1 = V Vmax + Vmax A B + Vmax B K’b On sait que Ka x K’b = K’a x Kb 97 + Vmax A K’a = Kb Ka K’b Ka Ka x K’a Donc = = K’a Kb 1 Ka Ka x K’b K’b K’a 1 = V Vmax + Vmax A B 1 1 + Vmax B K’a = K’b 1 + V Vmax + Vmax A Ka x K’b + + A B Ax B Supposons que caractérise la modification de l’affinité de l’enzyme pour le 2è substrat après fixation du 1ér. On peut poser que : K’a = Ka et K’b = Kb 1 1 Ka = V Kb 1 + Vmax 1 + A Ka Vmax AB 1 ( 1 + V ] B Kb = Ka Kb + 1 ) B Kb + A ( 1 + Vmax ) B - Ka et Kb sont des constantes de dissociation du système pour les substrats A et B. - Vmax = vitesse maximale. Si les deux sites ne présentent aucune interférences alors Ka = K’a et Kb = K’b 1 1 Ka = V 1 + Vmax 1 + A Ka = V Kb + ( 1 + Vmax B Kb 98 B Ka Kb ] AB 1 ) 1 + A Kb ( 1 + Vmax ) B Exemple de bibi aléatoire : la créatine phosphokinase • La créatine phosphokinase (CPK) est une enzyme des muscles des Vertébrés. Elle catalyse le transfert d’un radical phosphoryl du substrat, le phosphate de créatine, vers un coenzyme transporteur, l’ADP. • L’affinité de l’enzyme pour ces deux corps chimiques étant voisine, la liaison de l’enzyme avec chacun d’entre eux se fait dans un ordre qui dépend uniquement des concentrations. Exemple de bibi aléatoire : la citrate synthase • La citrate synthase est une enzyme des mitochondries. Elle catalyse le transfert d’un radical acétyl du premier substrat, l’acétate transporté par le coenzyme A vers l’autre substrat, l’oxaloacétate. • L’affinité de l’enzyme pour ces deux corps chimiques étant voisine, la liaison de l’enzyme avec chacun d’entre eux se fait dans un ordre qui dépend uniquement des concentrations 2-2-Le mécanisme bibi ordonné a- La formule schématique de Cleland Soient deux substrats A et B où A se fixe le premier. Dans ce cas, B ne peut se fixer que sur le complexe binaire EA pour donner un composé ternaire EAB au sien duquel à lieu la réaction catalytique. Puis il y a successivement libération de P et de Q. ici l’ordre est préétabli. A B P 99 Q E EA EAB EPQ EQ E b- Réactions A B Ka Kb E Produits Kc EA EAB A E + B L’équation de conservation de l’enzyme: ET = E + EA + EAB V = Kc EAB EA EA Ka = B = EA Ka EA B Kb = EA B B = EAB Kb EA B EAB ] = EA or EA = Kb EAB Ka BEA = Kb Ka BEA V = Kc EAB = Kc x Kb x Ka L’expression de la vitesse redevient : BEA V Kb x Ka = ET E + EA + EAB BEA Kc V x Kb x Ka = 100 ET B + EA + Ka EAB Ka x Kb On divise le dénominateur et le numérateur par B / Ka Kb On arrive à la formule suivante : BEA Kb Ka Kc x x V Kb x Ka E = ET B E x Ka Kb E A x Ka Kb EA Ka Kb + + x E Ka x Kb E Ka E V Kc x B A = ET Ka Kb + A x Kb + AB V x [ Ka Kb + A x Kb + A B ] = ET x Kc B A ET x Kc B A V = Ka Kb + A x Kb + A B 1 Ka Kb = A x Kb AB + ET Kc B A + ET Kc B A V Kc B A Or Vmax = ET x Kc 1 Ka Kb x BA = V 1 1 = V Vmax 1 + Vmax Kb [ 1 + B 101 Kb + Vmax B 1 Ka Kb + ] AB Vmax B 1 ou Ka Kb V Kb + Vmax 1 = V 1 x BA 1 ou 1 = Vmax Ka ] A ) B Kb [ 1 + Vmax ( 1 + 1 + B Vmax 2-Représentations graphiques Mécanisme bibi ordonné • Lorsqu’une réaction enzymatique implique deux substrats ou un substrat et un coenzyme libre, les phases de la réaction enzymatique au niveau moléculaire se compliquent : on parle de cinétique à deux substrats. • Pour certaines enzymes, il se forme d’abord un premier complexe entre le premier substrat et l’enzyme. Ce complexe Enzyme-Substrat A forme ensuite un complexe avec le second substrat : Enzyme-Substrat A-Substrat B. Ce complexe ternaire est alors transformé par l’action de l’enzyme en un complexe Enzyme-Produit Y-Produit Z qui se dissocie en libérant dans l’ordre le produit Y et le produit Z. • L’enzyme libre n’ayant pas d’affinité pour le substrat B, le complexe ne peut pas se former dans un ordre différent : c’est ce qui justifie l’appellation bibi ordonné qu’on donne à ce mécanisme. Exemple de bibi ordonné : l’alcool déshydrogénase • L’alcool déshydrogénase est une enzyme qu’on trouve dans le cytoplasme de la plupart de nos cellules. Elle catalyse l’oxydation de l’éthanol en acétaldéhyde en réduisant simultanément un coenzyme NAD+ en NADH. • Cette réaction se déroule selon un mécanisme de type bibi ordonné : l’enzyme n’a pas d’affinité pour l’alcool si elle n’est pas préalablement associée au coenzyme NAD+ en un 102 premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Ethanol se transforme en un complexe Enzyme-NADH-Acétaldéhyde ; ce dernier complexe se dissocie en libérant l’acétaldéhyde puis le NAD réduit. • De nombreuses autres déshydrogénases utilisant le NAD comme coenzyme suivent un mécanisme de type bibi ordonné. Exemple de bibi ordonné : la malate déshydrogénase • La malate déshydrogénase est une enzyme qu’on trouve dans toutes les cellules. Elle catalyse l’oxydation du malate en oxaloacétate en réduisant simultanément un coenzyme NAD+ en NADH. • Cette réaction se déroule selon un mécanisme de type bibi ordonné : l’enzyme n’a pas d’affinité pour le malate si elle n’est pas préalablement associée au coenzyme NAD+ en un premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Malate se transforme en un complexe Enzyme-NADH-Oxaloacétate ; ce dernier complexe se dissocie en libérant l’oxaloacétate puis le NAD réduit. • De nombreuses autres déshydrogénases utilisant le NAD comme coenzyme suivent un mécanisme de type bibi ordonné. . 2-3- Le mécanisme bibi ping-pong a- Formule schématique de Cleland C’est un mécanisme ordonné. Les deux substrats A et B ne peuvent jamais se trouver en même temps sur l’enzyme. Le substrat A se fixe le premier sur l’enzyme pour donner le produit P. A laisse sur l’enzyme un groupement qui sera renvoyé ultérieurement sur B ou vice versa. Ensuite le second substrat c’est à dire B se fixe sur l’enzyme modifiée E’ et fourni le second produit Q pour être libéré et retourné à sa formule initiale (E). Il n’y a donc pas de formation de composé ternaire. A P 103 B Q E EA E’p E’ E’B EQ - Comme exemple on peut prendre celui de la réaction catalysée par la nucléoside diphosphate kinase ou NDkinase ( où N désigne une base de nucléotide c’est à dire Adénine (A), Guanine (G), Uracile (U) ou Cytosine (C) ). XTP Enzyme + Enzyme XDP + P Enzyme P + YDP YTP + Enzyme Réaction globale : X T P + Y D P Y T P + Enzyme La NDP kinase a des comportements ping-pong car elle présente un stade intermédiaire phosphorylé. - Comme exemple on peut citer encore les transaminases fonctionnant à l’aide de phosphate de pyridoxal (PLP) comme coenzyme. L-Aspartate + Enzyme-PLP oxaloacétate + L-glutamate + Enzyme , PMP 2- oxoglutarate + Enzyme , PMP Enzyme-PLP Réaction globale : L-Aspartate + 2-oxoglutarate glutamate 104 oxaloacétate + L- - Comme exemple on peut citer les déshydrogénases b- Les réactions A + E AE E’ + B BE’ PE’ QE E’ + P E + Q Ou simplement: A ( EA E’P ) E E’ Q Q A B ( EQ E’B ) B On se contente dans ce cas à donner directement la formule : 1 1 = V Ka [ 1 + Kb + Vmax A ] B • Pour d’autres enzymes, la réaction sera catalysée en deux temps. • Le complexe formé entre l’enzyme et le substrat A est transformé d’abord en enzyme + produit Y, mais l’enzyme E a été chimiquement modifiée en enzyme E’ au cours de cette première partie de la réaction. 105 • L’enzyme E’ ayant une affinité pour le deuxième substrat, va former un deuxième complexe Enzyme E’-Substrat B qui va être transformé en complexe Enzyme-Produit Z dans une seconde partie de la réaction où l’enzyme va retrouver sa forme chimique initiale. • Il n’y a jamais de complexe ternaire dans un tel mécanisme, mais l’enzyme (ou un coenzyme lié à sa structure) subit une transformation réversible et provisoire qui permet le lien entre les deux substrats. • C’est ce qui justifie l’appellation de ping-pong qu’on donne à ce mécanisme. Exemple de ping-pong : l’alanine aminotransférase = ALAT • L’ALAT catalyse le transfert de la fonction amine de l’alanine vers l’α-cétoglutarate qu’elle transforme en glutamate. • Dans un premier temps, l’ALAT se lie à l’alanine puis transfère la fonction amine sur un coenzyme lié : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesser d’être lié à l’enzyme. L’enzyme se dissocie alors du pyruvate. • Dans le second temps, l’enzyme liée au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe avec l’α-cétoglutarate, puis transfère la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate de pyridoxal, vers le second substrat qui est transformé en glutamate. Enfin, le complexe ALATglutamate se dissocie : l’enzyme et son coenzyme lié ont recouvré leurs structures initiales. Exemple de ping-pong : l’aspartate aminotransférase = ASAT • L’ASAT catalyse le transfert de la fonction amine de l’aspartate vers l’α-cétoglutarate qu’elle transforme en glutamate. • Dans un premier temps, l’ASAT se lie à l’aspartate puis transfère la fonction amine sur un coenzyme lié : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesser d’être lié à l’enzyme. L’enzyme se dissocie alors de l’oxaloacétate. • Dans le second temps, l’enzyme liée au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe avec l’α-cétoglutarate, puis transfère la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate depyridoxal, vers le second substrat qui est transformé en glutamate. Enfin, le complexe ASATglutamate se dissocie : l’enzyme et son coenzyme lié ont recouvré leurs structures initiales. 106 3-Représentations graphiques 3-1- Cas du mécanisme bibi random On sait que caractérise la modification de l’affinité de l’enzyme pour le deuxième substrat après modification du premier. - Dans le cas où l’association d’un substrat augmente l’affinité de l’enzyme pour l’autre substrat alors 1. - Dans le cas où l’association d’un substrat diminue l’affinité de l’enzyme pour l’autre substrat alors 1. 107 Travaux Dirigés P au temps t0 [A0] = 10-3 M ; au temps 1-Soit la réaction de premier ordre : A t = 5 sec [A] = 1,2.10-4 M. a-Calculer la constante de vitesse de la réaction. b-Calculer [A] au temps t = 12 sec. 2-Quelle relation existe t-il entre KM et [S] lorsque la vitesse d’une réaction enzymatique est égale à 90% de la vitesse maximum ? 3-Une enzyme E hautement spécifique hydrolyse un -D-glucoside pour donner du glucose. Proposer un nom systématique de cette enzyme. 4-La classification générale des enzymes (Ec) a permis de nommer l’enzyme E1 : 1,4--Dglucane cellobiohydrolase Ec 3.2.1.91. Donner : a- Le nom du substrat de l’enzyme ; b- Le nom et la structure du produit libéré ; c- La classe de cette enzyme ; d- La sous-classe ; e- La sous-sous classe ; f- Comment peut-on appeler l’enzyme qui hydrolyse le produit libéré par l’enzyme E ? g- Proposer un nom systématique ; h- Une -glycosidase peut elle hydrolyser ce substrat ? Pourquoi ? 5-L’histidine est désaminée par une enzyme l’histidinase. On note la quantité d’histidine désaminée par min et ceci pour différentes concentrations d’histidine. Histidine Urocanate + NH3 [Histidine] x 10-5 M Quantité desaminée (moles) x10-9 0,1 0,11 108 0,3 0,25 0,5 0,34 1,0 0,46 3,0 0,61 5,0 0,64 a- L’histidine obéit-elle à la cinétique de Michaelis-Menten ? Si oui, quelle est la valeur de KM ? b- Quelle est la valeur de Vmax ? 6-Une lactase sert de matériel expérimental. Aux concentrations données de lactose, les vitesses initiales de la réaction sont les suivantes : Concentration molaire de lactose 10-4 M 50 V (moles de lactose hydrolysé / min / mg) d’enzyme x 10-6 155 20 103 10 68,5 7 53 5 40,6 a-Déterminer graphiquement les constantes de l’équation de Michaelis (KM et Vmax ) relative à ce système. b-Faites deux représentations graphiques de ce système (Michaelis et L.B ) c- Comparer ces constantes. 7-On étudie l’influence du pH sur la constante de Michaelis Menten de la 6-phosphogluconate déshydrogénase. Cette enzyme catalyse la réaction : 6-phosphogluconate + NADP acide 6-phosphogluconique + NADPH2 Le NADPH2 absorbe à 340 nm. L’activité de la déshydrogénase a été mesurée spectrophotométriquement en mesurant la densité optique à 340 nm qui est proportionnelle à la concentration de NADPH2 [ substrat ] x 10-4 M 0,174 0,267 Accroissement de l’extinction pendant les 5 premières min pH 7,6 0,074 0,085 109 pH 9,0 0,034 0,047 0,526 1,666 4,000 0,098 0,114 - 0,075 0,128 0,167 A quel pH l’enzyme a t-il le plus d’affinité pour le substrat. 8-A partir des résultats expérimentaux suivant ; a-Montrer si l’inhibiteur est compétitif, non compétitif ou incompétitif, b-Déterminer le KM c-Déterminer le Ki d-Quelle est la valeur de Vmax [ substrat ] mM 2,0 3,0 4,0 10,0 15 µg de produit formé / heure Sans inhibiteur Avec inhibiteur 141 89 177 119 211 151 309 260 373 310 9-Un biochimiste veut caractériser une amylase fongique. Le milieu réactionnel est composé de : - 100 µl d’amidon 2% ( poids / volume ) préparé dans le tampon acétate 20 mM pH 5,4 ; - 100 µl de solution enzymatique contenant 15 µg de protéine. Le milieu réactionnel est incubé à 37°C pendant 30 min. Le dosage de maltose libéré par l’enzyme nous a donné 8,5 mg. Une étude cinétique plus approfondie a revelé au biochimiste qu’il a travaillé en condition saturante de substrat. Déterminer : a- La vitesse initiale de la réaction en Unité Internationale ( UI ). b- L’activité spécifique en UI / mg de protéine. c- La concentration d’enzyme libre dans le milieu réactionnel. d- La vitesse initiale si on double la concentration d’enzyme du milieu réactionnel. e- Quelle serait la vitesse observée en présence de substrat 25 mg / ml ? 10-Une enzyme catalyse une réaction entre deux substrats A et B. Afin de déterminer le schéma de la réaction, on a effectué différentes mesures de vitesses initiales en présence de concentrations variables de substrats. On a obtenu les résultats suivants: Concentration Concentration Concentration Concentration 110 Concentration Concentration de A (10-4 M) de B : 1x 10-3 M 0,5 0,57 0,62 0,65 0,66 1 2 5 10 20 de B : 2 x 10-3 M 0,7 0,9 1 1,1 1,15 de B : 5 x 10-3 M 1 1,37 1,73 1,9 2 de B : 10 x 10-3 de B : 20 x 10-3 M M) 1,1 1,25 1,65 1,8 2,2 2,6 2,5 2,9 2,7 3,2 Les vitesses exprimées en mM de produit apparu par min. 1- Déterminer le mécanisme de la réaction. 2- Déterminer les constantes de Michaelis pour chacun des deux substrats, la vitesse maximale de la réaction. 11-On étudie la cinétique de deux enzymes A et B. A partir des données suivantes, distingues le type d’enzyme (c’est à dire si c’est un enzyme ordinaire ou allostérique) et expliquez l’allure des courbes représentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat. [Substrat] Vitesse avec l’enzyme A Vitesse avec l’enzyme B 0 0,5 1 2 3 4 5 6 8,0 0 8,8 14,0 19,0 21,5 22,8 23,3 23,5 23,6 0 3 1,0 4,7 12,4 19,0 21,8 22,8 23,3 12-Soit la chaîne de biosynthèse d’un composé F : x y z A B C t D u E F A est un substrat initial x, y, z, t et u sont des enzymes. Les composés A et F ont des structures très différentes, alors que E et F ont des structures très proches. 1- On étudie isolement la réaction E F on obtient la courbe suivante : 1/V 1 111 Quel type de courbe obtient-on quand on ajoute une grande quantité de F au milieu réactionnel ? 2- On étudie isolement la réaction A B on obtient la courbe 2 a- Après avoir soumis l’enzyme à un traitement spécial, on obtient la courbe 3 V V 2 3 Que peut-on dire de x ? Donnez le type de traitement. b- Si on ajoute F au milieu réactionnel on note une diminution. Quels sont les caractères généraux de l’action de F ? Travaux Pratiques I-QUELQUES CONSEILS A- CONSEILS D’ORDRE GENERAL 112 Les séances de travaux pratiques d’enzymologie sont obligatoires pour les étudiants de SN II. Ils ne doivent par conséquent pas manquer de séances. Ils doivent être à l’heure et vêtus de leur blouse blanche de manipulation. Une séance de TP dure 3 heures. Les étudiants doivent bien préparer leur TP avant de venir en salle pour la manipulation. Pour avoir des explications sur la compréhension des TP, ils doivent s’adresser soit à l’enseignant soit au moniteur. Pour l’obtention des produits chimiques et des solutions, les étudiants doivent s’adresser au technicien du jour. Les étudiants ne doivent pas avoir honte ou peur de demander des explications sur ce qu’ils n’ont pas compris car le travail dans une salle de TP est dangereux. Il est dangereux pour l’étudiant, le technicien, l’enseignant, ses voisins, la salle de TP, car parmi les produits chimiques utilisés certains sont inflammables, corrosifs et d’autres toxiques. L’intoxication peut se faire par voie buccale, par inhalation et par absorption cutanée. Pour éviter ces problèmes, les étudiants doivent ; -s’informer des dangers présentés par les produits chimiques manipulés ; -éviter de manipuler toute substance à mains nues ; -transvaser tous les produits chimiques sous la hotte ; -évaporer les solvants volatils au bain marie ou sous vide en s’assurant de condensation ; -ne rien jeter dans le levier ; -ne jamais disperser, ni abandonner les produits chimiques ; -ne jamais distiller à sec ; -ne jamais manger, ni fumer en salle de TP; -éviter de boire en salle de TP. A la fin de chaque séance, les étudiants sont tenus de remettre leur compte rendu à l’enseignant après avoir lavée et bien rincée la verrerie utilisée. Les paillasses doivent être propres. Les étudiants qui vont passer outre ces recommandations se verront sévèrement sanctionnés par l’enseignant. Un examen est prévu à la fin de toutes les séances de TP. B-NETTOYAGE DU MATERIEL Pour la bonne marche des expériences, comme pour la validité des résultats, il est nécessaire que la verrerie utilisée soit très propre. Avant, après chaque usage, il convient donc de laver le matériel d’abord à l’eau courante, puis de le rincer trois fois à l’eau distillée, à l’aide d’une pissette. Trois lavages successifs utilisant chaque fois un peu d’eau, sont plus efficaces qu’un seul lavage qui en consomme beaucoup. 113 L’utilisation de verrerie mouillée est sans inconvénient pour beaucoup de manipulations. Il n’en est évidemment plus de même pour des opérations à effectuer en milieu anhydre ou mettant en jeu des solutions titrées dont il est important de ne pas modifier la concentration. Dans ce cas, il est nécessaire d’éliminer au départ toute l’eau de lavage. Pour cela, la verrerie courante est séchée à l’étuve à 100°C. Les récipients en matière plastique sont simplement essuyée avec un papier filtre ou séchée à l’air, à l’abri des poussières. La verrerie graduée ou jaugée ne doit pas être soumise à l’action de la chaleur, sous peine de fausser les volumes marqués par suite des résidus de dilatation. Il ne faut donc jamais la porter à l’étuve. C’est d’ailleurs pour la même raison que l’on ne doit jamais y verser de liquides chauds. Pour éliminer l’eau, on effectue simplement trois rinçages avec la solution à utiliser. 1- Pipette Avec un papier filtre, essuyer soigneusement l’extrémité de la pipette, en particulier la pointe, afin d’enlever au maximum l’eau retenue par capillarité dans le conduit effilé. Aspirer rapidement un peu de liquide à mesurer. Obturer aussitôt avec l’index le tube de la pipette afin que le liquide ne descende pas. Maintenir ensuite la pipette horizontalement de façon à pouvoir cesser l’obturation sans que le contenu ne s’écoule. Tout en roulant la pipette entre les doigts, imprimer alors au liquide un mouvement de va-et-vient afin qu’il mouille toute la partie inférieure utile de l’instrument. Laisser s’écouler dans l’évier, le liquide employé. Essuyer à nouveau la pointe de la pipette et recommencer l’opération encore deux fois. 2- Verrerie jaugée et graduée Elle est destinée à permettre une mesure volumétrique directe, la lecture de ces volumes reposant sur la position d’un interface liquide-air par rapport à des traits de repère ou à une échelle graduée fixe. Par suite de la tension superficielle du liquide, cette interface, surtout dans le cas de récipients de faible section, affecte la forme d’un ménisque. L’appréciation de sa position par rapport aux traits de repère demande quelques précautions. Par convention, on considère que la position de l’interface est déterminée par celle de la tangente horizontale au ménisque. Il en résulte : 114 -que pour apprécier correctement la position de l’interface, l’œil doit se trouver exactement à la hauteur de la tangente horizontale au ménisque, sous peine d’erreurs de parallaxe. -que le récipient de mesure (burette, pipette etc..) doit être tenu bien verticalement au moment de la lecture, de façon à permettre l’estimation précise de la coïncidence du trait de repère avec la tangente horizontale au ménisque. 3- Ballons ou fioles jaugées Leur col allongé porte un trait circulaire, dit trait de jauge. Leur remplissage doit se faire de façon que le plan déterminé par le trait de jauge coïncide avec la tangente au ménisque formé par le liquide utilisé. Le volume ainsi délimité est indiqué sur le verre du ballon ou de la fiole. C- LE MATERIEL DE LABORATOIRE ET LEUR UTILISATION 1-Pipettes Il en existe trois types principaux: -graduée; -jaugées un trait; -jaugées à deux traits. Les pipettes graduées et jaugées à un trait sont appelées pipettes à bout. Le troisième type constitue les pipettes à traits. 1-1- Description des pipettes 1-1-1- Pipettes jaugées à un trait Le trait jaugé est gravé sur le tube étroit surmontant le réservoir cylindrique. Le volume de liquide s’écoule à partir du trait jusqu’à vidange spontané complète de la pipette. Il tient compte, par conséquent, de la quantité de liquide retenue par capillarité dans la pointe de la pipette. Il ne faut donc pas souffler dans la pipette pour essayer de recueillir ce liquide. 115 1-1-2- Pipettes graduées Leur réservoir est généralement gradué en cm3 (CC) ou en ml avec des subdivisions intermédiaires dont l’intervalle correspond à un volume de 1/10 de cm3. Il existe cependant des pipettes dites capillaires, de faible capacité, où l’intervalle entre petites divisions correspond à un volume de 1/100 voire 1/1000 de cm3. Les volumes indiqués sur le réservoir de la pipette ont une valeur croissante du haut vers la pointe. Le volume lu, correspondant à une division donnée, représente le volume de liquide écoulé depuis la graduation 0. 1-1-3- Pipettes jaugées à deux traits Les traits de jauge sont gravés de part et d’autre du réservoir, sur la partie tubulaire étroite de la pipette. Le volume noté sur le réservoir correspond au volume de liquide écoulé entre ces deux traits de jauge. 1-1-4- Remarques importantes Dans le cas des pipettes à bout, la quantité de liquide retenue par capillarité après vidange est fonction de la viscosité du liquide utilisé. Comme l’étalonnage de ce type de pipette est effectué à l’eau distillée, l’utilisation d’un autre liquide peut être source d’erreur. Avec des solutions diluées, l’erreur est très faible. Chaque fois que l’on aura à effectuer une mesure précise, on devra donc utiliser une pipette à traits, où la mesure de volume est indépendante de la tension superficielle du liquide utilisé. Les pipettes graduées peuvent être également utilisées comme des pipettes à traits. Ainsi pour mesurer 1,2 cm3 à l’aide d’une pipette graduée on a intérêt à considérer le volume écoulé entre 0 CC et 1,2 CC ou entre deux graduations séparées par 1,2 cm3. La quantité de liquide retenue est fonction du diamètre du tube. Dans le cas des pipettes à bout, il importe, pour la validité des mesures, que la section de la pointe de la pipette ne soit pas modifiée. Il est, par conséquent, nécessaire de ne pas briser ni même ébrécher l’effilure de ces pipettes. Pour cela, parmi les précautions à prendre, deux sont essentielles. 116 -lorsque l’on place des pipettes propres sur leur support, toujours le mettre pointe en l’air, ce qui a aussi pour avantage de minimiser le dépôt de poussière à l’intérieur des instruments et de faciliter leur égouttage. -lorsqu’on prélève un liquide dans un récipient, ou lors de la vidange de la pipette, ne jamais toucher le bout du récipient avec la pointe. 1-2- Utilisations des pipettes 1-2-1- Remplissage des pipettes La pipette, rincée et éventuellement débarrassée de son eau résiduelle, est saisie en dessous du renflement de sécurité entre le pouce et le médius. Plonger l’effilure le plus possible dans le liquide à prélever sans toucher le fond du récipient de façon à ne pas léser la pointe de la pipette. Si l’on plonge trop peu, il arrivera, lors de l’aspiration que des bulles d’air montent dans le liquide et ce qui est plus grave, on risque d’avaler la solution. Aspirer avec précaution, de façon à ce que le liquide monte au-dessus du trait de jauge supérieur. Obturer alors rapidement l’orifice d’aspiration de la pipette avec la pulpe de l’index. Pour cette opération, il faut avoir soin de ne pas mouiller l’orifice de la pipette avec les lèvres, et d’autre part la peau de l’index doit être sèche. Sortir l’extrémité de la pipette du liquide et sécher la pointe avec du papier filtre. Appuyer la pointe contre la paroi du récipient de prélèvement. Soulever le récipient de façon à placer la pipette verticalement et le trait supérieur de jauge, à hauteur de l’œil. L’extrémité de la pipette touchant toujours la paroi du récipient, par des changements de pression de l’index sur l’orifice, laisser écouler le liquide jusqu’à ce que le ménisque devienne tangent au trait de jauge ou la graduation choisie. Par une pression plus forte, on arrête l’écoulement. Le niveau du liquide doit demeurer invariable. 1-2-2- Vidange de la pipette 117 On transporte la pipette au-dessus du récipient d’utilisation. La pointe de l’instrument est alors appliquée contre la paroi du vase et on laisse écouler le liquide en soulevant l’index. Selon le type de pipette utilisée, l’écoulement est poursuivi jusqu’à vidange spontanée complète de la pipette ou arrêté au trait de jauge inférieur ou à la graduation désirée par simple pression de l’index. Dans ces deux derniers cas le trait de jauge ou la graduation doit être à la hauteur de l’œil. 2- Burette (burette de MOHR à robinet) 2-1- Description de la burette Elle est formée d’un tube gradué cylindrique, légèrement évasé à la partie supérieure pour aider au remplissage, effilé à la partie inférieure pour limiter l’écoulement du liquide mesuré. Un robinet permet de régler ou d’arrêter l’écoulement. Comme toute la verrerie graduée, la burette doit être utilisée bien verticale sur son support, afin que les volumes versés soient lus dans de bonnes conditions, selon le protocole défini plus haut. Les burettes employés aux T.P ont une capacité de 25 ou 50 CC. Elles sont graduées en cm3, avec des subdivisions non chiffrées dont l’intervalle correspond au 1/10 de cm3. Lorsque l’instrument est en position d’utilisation, le zéro de la graduation est au sommet de l’échelle. Cette disposition permet une lecture directe des volumes versés à partir du niveau zéro. Notons que l’on peut prendre pour zéro un point quelconque de la graduation, le volume liquide utilisé correspond alors à la différence entre le volume exprimé par la graduation de départ, et celui correspondant à la graduation finale. Ainsi, entre la graduation 7,2 et la graduation 11,8 on aura versé 4,6 cm3. 2-2- Utilisation de la burette 2-2-1- Remplissage La burette propre, débarrassée de son de rinçage, robinet fermé et bien verticale sur son support, est remplie directement en versant dans l’évasement supérieur la solution à utiliser. Ce remplissage doit être assez lent afin de na pas faire mousser le liquide, de ne pas 118 introduire des bulles d’air qui adhéreraient aux parois du tube gradué. Arrêter le remplissage dès que l’on a dépassé (la graduation 0) de 2 cm. 2-2-2- Mise à zéro Placer sous la burette un récipient convenable. Ouvrir le robinet de façon à obtenir un écoulement très lent du liquide à mesurer. Cet écoulement permet de remplir la pointe effilée de l’instrument avec la liqueur de titrage. Arrêter l’écoulement lorsque le ménisque du liquide est tangent à la graduation zéro. Pendant cette opération, il faut regarder uniquement la graduation et le niveau liquide, sans se soucier de l’écoulement. Dès que le ménisque est arrivé au niveau voulu, fermer le robinet. Toucher la pointe de la burette avec la paroi du vase où a été recueilli le liquide écoulé, afin d’éliminer tout liquide extérieur qui risquerait de fausser le dosage. 2-2-3- Ecoulement de la solution Ouvrir le robinet de façon à obtenir un écoulement suffisamment lent, goutte à goutte. Tandis que le liquide s’écoule, de la main droite, et à l’aide d’un agitateur, le contenu du vase à réaction, surveiller uniquement ce dernier, sans se préoccuper du niveau dans la burette. TRAVAUX PRATIQUES I ETUDE COMPARATIVE DES ACTIVITES AMYLASIQUE ET INVERTASIQUE DES SUCS DIGESTIFS DES ESCARGOTS Archachatina ventricosa et Achatina achatina Introduction L’hydrolyse des glucides permet la libération de sucres réducteurs qui peuvent être dosés selon la méthode de Bernfeld (1955) utilisant le DNS. Les sucs digestifs des escargots géants Archachatina ventricosa et Achatina achatina contiennt toutes les enzymes responsables de ces activités hydrolytiques. Dans cette partie des travaux pratiques, nous allons comparer ces activités entre elles. 119 1- Détermination de la courbe d’étalonnage 1-1-Mode opératoire La droite d’étalonnage doit nous permettre de déterminer la quantité de sucres réducteurs présente dans le milieu réactionnel. Pour l’obtenir, nous devons réaliser 5 dilutions, dans 5 tubes à essai selon le tableau suivant : Tubes à essai T 1 2 3 4 Volume en ml de glucose ( 0,002 g/ml ) 0 0,1 0,2 0,4 0,5 Volume d’eau distillée en ml 1 0,9 0,8 0,6 0,5 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Volume de DNS en ml Bien mélanger le contenu de chaque tube Apres toutes ces dilutions, chauffer tous les tubes au bain marie bouillant pendant 5 minutes et les laisser refroidir sur la paillasse pendant 10 min. Ensuite, ajouter dans chaque tube 4 ml d’eau distillée. Bien mélanger et lire les densités optiques à 540 nm au spectrophotomètre contre le témoin (tube T).(Se faire aider par le Technicien ou moniteur du jour). 1-2- Questionnaire pour le compte rendu a- Déterminer la quantité de sucres réducteurs présente dans chaque tube à essai. Cette quantité doit être exprimée en µg. b- Tracer la courbe : densités optiques en fonction de la quantité de sucres réducteurs exprimée en µg. 2-Détermination des activités enzymatiques 120 2-1-Mode Opératoire Diluer au 250è les sucs digestifs des escargots géants Archachatina ventricosa et Achatina achatina avec le tampon acétate 20 mM pH 5,0 pour obtenir un volume final de 50 ml. La concentration protéique de la solution enzymatique préparée est de 0,7 ml/mg. Réaliser les milieux réactionnels suivants : Essai -0,4 ml de tampon acétate 20 mM pH 5,0 ; -0,2 ml de solution enzymatique (suc digestif dilué au 250ème) ; -0,4 ml de substrat (amidon ou saccharose). Témoin (T) -0,6 m l de tampon acétate 20 mM pH 5,0 ; -0,4 ml de substrat (amidon ou saccharose). NB : Deux substrats (saccharose et de l’amidon ) et deux sucs digestifs (Archachatina ventricosa et Achatina achatina ) seront à votre disposition. Vous aurez au total 8 essais et 8 témoins car chaque essai a son témoin. Incuber tous les tubes (essais et témoins) au bain marie à 37 °C pendant 15 minutes. Ajouter ensuite 0,3 ml de DNS dans chacun d’eux, agiter et chauffer au bain marie bouillant (100 °C) pendant 5 minutes et laisser refroidir pendant 10 minutes sur la paillasse. Ajouter 5 ml d’eau distillée dans tous les tubes. Bien mélanger et lire les densités optiques (D.O) à 540 nm au spectrophotomètre contre le témoin (T). 2-2-Questionnaire pour le compte rendu a-Convertir toutes les densités optiques en micromole de sucres réducteurs b-Déterminer les vitesses des réactions et les activités spécifiques. c-Représenter sous forme d’histogramme ces différentes activités spécifiques. 121 d-Interprêter ces résultats TRAVAUX PRATIQUES II DETERMINATION DU pH OPTIMUM D’HYDROLYSE DE L’ ACTIVITE AMYLASIQUE DU SUC DIGESTIF DE L’ESCARGOT GEANT Archachatina ventricosa 1- Mode opératoire Diluer au 250è le suc digestif de l’escargot donné avec le tampon acétate 20 mM (pH ;4,0 ; 4,4 ; 5,0 ; 5,4 ) et le tampon phosphate 20 mM (pH 6,0; 6,4; 7,0 ; 7,4 ; 8 ) pour obtenir dans chaque cas un volume final de 50 ml. Ces différentes solutions enzymatiques doivent être bien conservées au frais pour la suite de la manipulation. Préparer aussi différentes solutions de cellulose 1 % (p/v) (250 ml) dans chaque tampon de pH sus-cités. Faire ensuite les 9 dilutions (dans chaque cas) dans 9 tubes à essai, selon le tableau suivant : pH 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4 7,0 7,4 8 Tubes T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Volume de A (ml) 0,6 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Volume de B (ml) 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Bien mélanger le contenu de chaque tube Préincuber ces milieux réactionnels en mettant tous ces tubes au bain marie à 37°C pendant 5 min puis ajouter dans chaque tube 0,4 ml de substrat préparé dans les tampons correspondants. 122 Le substrat à utiliser est l’amidon 1% Solution A : tampon acétate ou phosphate, Solution B : solution enzymatique (suc digestif dilué au 250è dans les tampons acétate et phosphate 20 mM). Incuber tous les tubes (essais et témoin) au bain marie à 37 °C pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 0,3 ml de DNS dans chacun d’eux, agiter et chauffer au bain marie bouillant (100 °C) pendant 5 minutes et laisser refroidir pendant 10 minutes sur la paillasse. Ajouter 4 ml d’eau distillée dans tous les tubes. Bien mélanger et lire les densités optiques (D.O) à 540 nm au spectrophotomètre contre le tube témoin (T). N.B : vous connaissez maintenant le pH optimum d’hydrolyse pour l’invertase du suc digestif d’escargot, pour la suite du travail, vous aller utiliser la solution enzymatique préparée à partir de ce pH comme solution enzymatique afin d’obtenir des activités enzymatiques intéressantes. Il en est de même pour le substrat. 2- Questionnaire pour le compte rendu a-Quel est la densité optique la plus élevée. Si on considère que cette valeur représente 100 % d’activité, quels seront les pourcentages d’activité des autres densités optiques ? b- Tracer la courbe ; % d’activité en fonction du pH. c- Quelle est la zone de pH optimum d’hydrolyse pour l’activité amylasique du suc digestif de l’escargot ? d- Déterminer le pH optimum d’hydrolyse de l’activité amylasique du suc digestif de l’escargot. e-Quelles conclusions pouvez vous tirer ? TRAVAUX PRATIQUES III ETUDE DE LA DIGESTIBILITE in vitro DE QUELQUES AMIDONS DE TUBERCULES ET RACINES 1- Mode opératoire Préparer deux séries de 10 tubes : les tubes de la première série doivent contenir chacun 0,4 ml de tampon et 0,2 ml de solution enzymatique (suc digestif de l’escargot géant 123 Archachatina ventricosa). Ceux de la deuxième série, doivent contenir seulement 0,6 ml de tampon. Ils serviront de témoin. Tous ces tubes sont pré-incubés pendant 5 min et 0,4 ml d’amidon (1%, p/v) sont ajoutés dans tous les tubes. Incuber ces tubes à nouveau (1ère et 2è séries) au bain marie à 37°C pendant 15 min. Ajouter dans chaque essai et témoin (ne contenant pas de solution enzymatique) 0,3 ml de DNS. Agiter et chauffer au bain marie bouillant pendant 5 minutes ces tubes et les laisser refroidir sur la paillasse pendant 5 minutes. Ajouter 4 ml d’eau distillée dans ces tubes. Bien mélanger et lire la densité optique (D.O) de l’essai à 540 nm au spectrophotomètre contre le tube témoin. 2- Questionnaire pour le compte rendu a- Déterminer la quantité de sucres réducteurs en µg présente dans chaque tube à essai. b-Représenter ces résultats sous forme d’histogramme. c-Interpréter ces résultats. TRAVAUX PRATIQUES IV ACTION DU TRIS SUR L’ACTIVITE CELLULASIQUE DU SUC DIGESTIF D’ESCARGOT Introduction L’activité d’une enzyme peut être modifiée par la présence de composés autre que le substrat : on les appelle effecteurs. Ils jouent un rôle important dans les 124 phénomènes de régulation et sont également fort utiles dans l’étude des mécanismes d’action des enzymes. On peut les classer en deux catégories : - les activateurs qui augmentent la vitesse de la réaction enzymatique, - les inhibiteurs qui la réduisent. 1- Action du TRIS sur l’activité catalytique de la cellulase du suc digestif d’escargot 1-1- Mode opératoire Faire 3 dilutions de la solution de TRIS 40 mM pour obtenir les concentrations de 10 mM et 5 mM pour un volume final dans chaque cas de 10 ml dans le tampon de pH optimum. Préparer 14 tubes selon le tableau suivant : Tubes Volume de Tris En ml E1 0,4 T1 0,4 E2 0,4 T2 0,4 E3 0,4 T3 0,4 E4 0,4 T4 0,4 E5 0,4 T5 0,4 E6 0,4 T6 0,4 Volume du tampon 0 (ml) 0,2 0 0,2 0 0,2 0 0,2 0 0,2 0 0,2 Volume de la solution 0,2 enzymatique (ml) 0 0,2 0 0,2 0 0,2 0 0,2 0 0,2 0 Préincuber tous les tubes au bain marie à 37°C pendant 10 min et ajouter le substrat selon le protocole suivant Pourcentage Cellulose Volume cellulose (ml) de 0,1 0,1 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1 1 de 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Laisser incuber tous les milieux réactionnels pendant 15 minutes à 37 °C et ajouter dans chaque tube 0,3 ml de DNS. Mettre les tubes au bain marie bouillant pendant 5 minutes, les laisser reposer sur la paillasse pendant 5 minutes. Ajouter dans chaque tube 4 ml d’eau distillée et lire les densités optiques contre le tube témoin correspondant à 540 nm. 125 N.B : Faites les expériences avec toutes les concentrations de Tris préparées. 1-2- Questionnaire pour le compte rendu 1-2-1- Déterminer la quantité de sucre réducteur présente dans chaque tube à essai. Cette quantité doit être exprimée en µg . 1-2-2- En considérant que la concentration protéique de la solution enzymatique est de 0,25 mg/ml, déterminer l’activité spécifique exprimée en µg de sucre réducteur par minute par mg de protéine dans chaque tube à essai. 1-2-3- Tracer la courbe activité spécifique exprimée en µg de sucre réducteur par min par mg de protéine en fonction de la concentration en substrat 1-2-4-Déterminer le type d’inhibition, Ki, Vmax et KM TRAVAUX PRATIQUES V ACTION DE QUELQUES CATIONS SUR L’ACTIVITE INVERTASIQUE DU SUC DIGESTIF D’ESCARGOT 1-Mode opératoire Faire 5 dilutions de la solution de cation 40 mM pour obtenir les concentrations de 30 mM, 20 mM, 10 mM, 1 mM pour un volume final dans chaque cas de 10 ml dans le tampon de pH optimum. Préparer 14 tubes selon le tableau suivant : Tubes Concentration de cation en mM Volume de tampon en ml Volume de la solution de cation en ml E1 1 T1 1 E2 5 T2 5 E3 10 T3 10 E4 20 T4 20 E5 30 T5 30 E6 40 T6 40 E7 0 T7 0 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0,4 0,7 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0 0 126 Volume de la 0,3 solution enzymatique en ml 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0 0,3 0,3 0 0,3 Préincuber tous les tubes au bain marie à 37 °C pendant 10 min et y ajouter ensuite 0,4 ml de solution de saccharose 1 %. Laisser incuber pendant 15 min au même endroit et ajouter dans chaque tube 0,3 ml de DNS. Mettre les tubes au bain marie bouillant pendant 5 min, les laisser reposer sur la paillasse pendant 5 min. Ajouter dans chaque tube 4 ml d’eau distillée et lire la densité optique contre le tube témoin correspondant à 540 nm. 2-Questionnaire pour le compte rendu b1- Déterminer le pourcentage d’activité dans chaque tube à assai. b2- Tracer la courbe : pourcentage d’activité en fonction de la concentration de l’effecteur . b3-Commenter les courbes obtenues 127 0 128