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Manuel de laboratoire_LSV
v1.0_09
2007
1
33
Dosage des composés phénoliques
Attention
: cette manip a été utilisée et mise au point pour un diplôme (Kayumba A.,
2001) et n’a plus été
utilisée depuis
au sein du labo
.
I. Principes
Les composés phénoliques solubles dans du méthanol (CPFS) sont
extraits par un mélange méthanol
–
eau.
Ils sont ensuite mélangés avec le réactif de Folin
Ciocalteus en milieu basique. Les oxydes de tungstène et de
molybdène contenus dans le réactif de Folin réagissent avec les phénols
extraits et donnent une colo
ratio
n
bleue dont on mesure l’intensité au spectrophotomètre.
Le résidu récalcitrant à l’extraction de la solution méthanolique, contient
le groupe des composés
phénoliques insolubles dans le méthanol (CPFI). Pour extraire ces composés
insolubles, le résidu es
t mélangé
à une solution d’hydroxyde de sodium, et le tout est agité pendant vingt
heures à l’obscurité. Après
extraction, les composés insolubles sont traités de la même façon que les
composés solubles.
Les composés phénoliques solubles dans le méthanol
et les composés phénoliques insolubles dans ce solvant
sont donc dosés distinctement. Les premiers regroupent la plupart des
composés phénoliques simples,
ainsi
que les tanins hydrolysables. Les composés phénoliques insolubles ne
contiennent que les acides
phénoliques
des parois cellulaires et constituent des noyaux d’humification qui servent à
la formation des acide
s
humiques (Kayumba, 2001).
II. Méthode
1)
Matériel

Balance analytique, précision 0.0001 g.

Bain chauffant à sec avec ses colonnes réfrigéra
ntes et ses allonges de 500 ml à col rodé avec leurs
bouchons.

Cylindre gradué de 100 et 50 ml.

Bain de glace.

Chronomètre.

Erlenmeyers de 250 ml.

Entonnoirs.

Filtres plissés 14 1/2 ø 150 mm.

Pisettes de 250 ml et 500 ml.

Ballons jaugés de 100 ml.

Pipette
s automatiques et embouts.

Flacons PE de 250 ml.

Agitateur rotatif (sous
sol).

Spectrophotomètre et cuves 10 mm.
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2)
Réactifs
a)
Extraction

Solution
mère d’acide gallique p.a.
: dissoudre 1 gramme d’acide gallique dans H2O désionisée et
jauger à 1 litre.

S
olution de carbonate de sodium à 20 %
(p/v)
: dissoudre 20 g de Na2CO3 dans 100 ml d’H2O
désionisée.

Réactif de Folin
–
Ciocalteus
.

Solution d’extraction
: méthanol/H2O 2
: 1 acidifié avec HCl
: dans un ballon de 1 litre, mettre 648.7
ml de méthanol p.a. p
uis 300 ml d’eau. Ajouter avec précaution 27 ml d’HCL conc. 37 % et ajuster à
la jauge lorsque le mélange est revenu à température ambiante.

NaOH 1M (Titrisol).

Méthanol technique

Acétone technique
b)
Gamme etalon
Pour la courbe
–
étalon, préparer à partir
de la solution
mère une gamme de solutions d’acide gallique allant
de 0 à 1 g/l.
T
able de correspondance pour la fabrication de la gamme étalon d’acide
gallique, à partir d’une solut
ion
mère concentrée à 1 g/l.
Concentration en g/l
Volume de la solution
mère en ml
Volume d’eau (ml)
0
0
100
0.2
20
80
0.4
40
60
0.6
60
40
0.8
80
20
1
100
0
3)
Mode opératoire
a) Echantillon de départ
On utilise de la litière broyée à la pulvérisette (env. 50

m).
Peser exactement une quantité de litière broyée vo
isine de 1 g.
b) Blancs
Remplacer la prise d’essai par de l’eau désionisée et suivre la procédure.
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c
)
Procédure
Composés phénoliques
-
fraction soluble dans le méthanol (CPFS)
1.
Peser
une prise d’essai
2.
Noter la masse
m, en g.
3.
Introduire
l’échantillon d
ans une allonge (tube à fond plat).
4.
Ajouter 50 ml de solution d’extraction
petit à petit en essayant de mouiller toute la matière et en
lavant les parois de l’allonge.
5.
Faire bouillir sous reflux
au bain à sec (thermochem, type CHL, préchauffé à 150 °C) pen
dant
exactement
une heure
. Eviter une forte ébullition en baissant la température de consigne à 120 °C dès
que l’ébullition est atteinte.
6.
Après une heure, fermer les allonges et laisser
refroidir dans la glace pendant 3 minutes
environ.
7.
Séparer l’extrait d
u résidu en
filtrant à travers un filtre plissé rapide LS 14 1/2 sur erlenmeyers de
250 ml.
8.
Récupérer suffisamment d’extrait pour l’analyse des CPFS (10 ml) et les
mettre de côté. Remettre un
erlenmeyer de 250 ml propre sous l’entonnoir.
9.
Le résidu quantita
tivement collecté dans le filtre est alors lavé 4 fois au méthanol technique et 2
fois à l’acétone technique.
Au cours de cette opération, utiliser des pissettes remplies des différents
solvants et rincer les résidus qui seraient restés dans l’allonge avan
t de verser dans le filtre. Petit à petit,
le filtrat se décolore.
10.
Ainsi dépigmenté (c’est le filtrat et non le résidu dans le filtre qui se
dépigmente), le résidu est
séché
dans son filtre à l’étuve à 60 0 C pendant quelques heures à une nuit. Ce résidu s
era ensuite utilisé pour
l’analyse de la fraction insoluble des phénols.
D
osage de la fraction soluble dans le méthanol (CPFS)
1.
Réaliser une courbe étalon en parallèle
2.
Verser 70 ml de H2O
distillée dans un ballon jaugé de 100 ml.
3.
Pipeter 1 ml de l’extrait
de CPFS, ajouter dans le ballon.
4.
Ajouter
3 ml de réactif de Folin
–
Ciocalteus
,
laisser
réagir
3 minutes
et
ajouter 10 ml de Na2CO3
20
%. La solution se colore en bleu foncé.
5.
Laisser réagir exactement une heure et mesurer la densité optique (cuve 10 mm)
à
675 nm
.
Attention, pour le dosage, commencer toujours par la courbe étalon. Lorsque
l’absorbance se rapproch
e de
la valeur de 1 (> 0.9) il est indispensable de diluer l’échantillon afin de le doser
correctement. E
n effet, une
distorsion trop grande affec
te les valeurs proches de l’unité. Pour les dilutions, procéder au demi (5
ml
d’échantillon + 5 ml d’eau désionisée) ou au cinquième (2 ml d’échantillon + 8
ml d’eau désionisée)
et ne
pas oublier de tenir compte des facteurs de dilution dans le calcul des
résultats.
Le dosage au spectrophotomètre se fait en utilisant la concentration 0 g/l
comme référence. Commence
r
donc toujours par celle
ci lors des dosages (y compris pour les CPFI, refaire un échantillon à 0 g/l).
D
osage de la fraction insoluble dans l
e méthanol (CPFI)
1.
Introduire le résidu séché
avec son filtre dans un flacon P.E. de 250 ml et
ajouter 100 ml de
NaOH
1M
. Fermer le flacon.
2.
Agiter
à l’agitateur rotatif, à l’obscurité et à température ambiante, pendant
20 heures.
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3.
Filtrer
l’extrait à trave
rs un filtre plissé rapide (LS 14 1/2).
4.
Pour la suite,
procéder de la même façon que pour les CPFS
mais avec une quantité d’hydrolysat de
2 ml.
Ne pas oublier de refaire un ballon correspondant à la valeur de 0 g/l de
la gamme
étalon pour faire le
blanc.
Lorsque l’absorbance se rapproche de la valeur de 1 (> 0.9) il est
indispensable de diluer
l’échantillon afin de le doser correctement. En effet, une distorsion trop grande
affecte les valeur
s proches
de l’unité. Pour les dilutions, procéder au demi (5 ml
d’échantillon + 5 ml d’eau désionisée) ou au
cinquième (2 ml d’échantillon + 8 ml d’eau désionisée) et ne pas oublier
de tenir compte des facteur
s de
dilution dans le calcul des résultats.
4) Récupération
Récupérer le reste des CPFS (mélange méthanol et
eau) ainsi que les solutions de lavage des CPFI (mélange
méthanol et acétone) dans les solvants organiques.
Les solutions contenant du réactif de Folin
Ciocalteus quand à elle sont à récupérer dans les solvants
organiques hallogénés.
5)
Calculs
C
alcul g
lobal
Soient
:
a [g/l] = concentration de l’échantillon obtenue grâce à la courbe étalon
P [g] = poids exact de l’échantillon
(corrigée par l’humiditérésiduelle)
.
Alors
:
CPFS
en g par g de matière sèche

a
*
50
*
1
1000
*
P
CPFI en g par g de matière
sèche

a
*
100
*
1
2
*
1000
*
P
Calculs détaillés pour les CPFS
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solution mère
d'acide gallique
ballon jaugé 1
à une concentration
connue en mg/l
(100 ml)
densité optique
1 ml
ballon jaugé 2
(100 ml)
échantillon
de poids P
allonge
avec 50 ml
de solution
d'extraction
densité optique
1 ml
ballon jaugé 3
(100 ml)
Figure 33.1
:D
étail des étapes du dosage des CPFS et des étalons d’acide gallique.
Pour trouver a quantité de phénols présents dans les 5
0 ml de l’allonge (voir fig.33.1
)
:
1000 ml

ag
rammes
50 ml

a
*
50
1000
grammes
Cette valeur est la quantité de tous les phénols de l’échantillon de poids P.
Si dans P en g

a
*
50
1000
grammes de phénols
Alors dans 1 g

a
*
50
*
1
1000
*
P
Cette valeur représente
la quantité en g de phénols solubles par g d’échantillon.
Calculs détaillés pour les CPFI
La densité optique correspond à 2 ml d’hydrolysat, alors que pour la gamme
–
étalon l’hydrolysat est de 1 ml.
La densité optique lue correspond donc à
a
2
avec a en g/l. Ceci représente la concentration des phénols dans
le ballon 4 (fig. F. 3).
Si
:
1000 ml

a
2
grammes
Alors
:
100 ml

a
*
100
2
*
1000
grammes
Cette masse représente la quantité des phénols insolubl
es présent
s dans le ballon 4 (voir fig. 33.2
), et qui est
la quantité de phénols insolubles dans l’échantillon de poids P.
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Si dans
P en g

a
*
100
2
*
1000
grammes de phénols insolubles
Alors dans1 g

a
*
100
*
1
2
*
1000
*
P
grammes
Cette q
uantité correspond à la quantité de phénols insolubles en grammes par gramme
d’échantillon.
solution mère
d'acide gallique
ballon jaugé 1
à une concentration
connue en mg/l
(100 ml)
densité optique
1 ml
ballon jaugé 2
(100 ml)
échantillon
de poids P
allonge
avec 50 ml
de solution
d'extraction
densité optique
Flacon P.E.
(100 ml)
2 ml
tous les
CPFI
ballon jaugé 4
(100 ml)
Figure 33
.
2
: détail des étapes du dosage des CPFI et des étalons d’acide gallique.
6)
Références
Allen S. E. (ed.)., 1974
–
"Chemical analysis of ecological m
aterials", Blackwell , Oxford.
Gobat J.
M., Aragno M. & Matthey W., 1998
Le sol vivant. PPUR, Lausanne.
Kayumba A., 2001
–
Suivi de la décomposition des litières des zones alluviales de la Sarine.
Travail de
diplôme, laboratoire d’Ecologie végétale, Univ
ersité de Neuchâtel.
Lunt H. A., 1931
–
"The carbon
organic matter factor in forest soil humus", Soil Sc., 32 : 27
33.
Scehovic J., 1994
–
Dosage des composés phénoliques dans les fourrages. Station fédérale de
recherches en
production végétale de Changins
, Suisse.
Steubing L., 1965
–
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Pflanzenökologisches praktikum
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Pour les autres références, voir les parties concernées du chapitre B du manuel
des méthodes