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Manuel de laboratoire_LSV
v1.0_09
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Dosage des composés phénoliques
Attention
: cette manip a été utilisée et mise au point pour un diplôme (Kayumba A.,
2001) et n’a plus été
utilisée depuis
au sein du labo
.
I. Principes
Les composés phénoliques solubles dans du méthanol (CPFS) sont
extraits par un mélange méthanol
–
eau.
Ils sont ensuite mélangés avec le réactif de Folin
-
Ciocalteus en milieu basique. Les oxydes de tungstène et de
molybdène contenus dans le réactif de Folin réagissent avec les phénols
extraits et donnent une colo
ratio
n
bleue dont on mesure l’intensité au spectrophotomètre.
Le résidu récalcitrant à l’extraction de la solution méthanolique, contient
le groupe des composés
phénoliques insolubles dans le méthanol (CPFI). Pour extraire ces composés
insolubles, le résidu es
t mélangé
à une solution d’hydroxyde de sodium, et le tout est agité pendant vingt
heures à l’obscurité. Après
extraction, les composés insolubles sont traités de la même façon que les
composés solubles.
Les composés phénoliques solubles dans le méthanol
et les composés phénoliques insolubles dans ce solvant
sont donc dosés distinctement. Les premiers regroupent la plupart des
composés phénoliques simples,

ainsi
que les tanins hydrolysables. Les composés phénoliques insolubles ne
contiennent que les acides
phénoliques
des parois cellulaires et constituent des noyaux d’humification qui servent à
la formation des acide
s
humiques (Kayumba, 2001).
II. Méthode
1)
Matériel
Balance analytique, précision 0.0001 g.
Bain chauffant à sec avec ses colonnes réfrigéra
ntes et ses allonges de 500 ml à col rodé avec leurs
bouchons.
Cylindre gradué de 100 et 50 ml.
Bain de glace.
Chronomètre.
Erlenmeyers de 250 ml.
Entonnoirs.
Filtres plissés 14 1/2 ø 150 mm.
Pisettes de 250 ml et 500 ml.
Ballons jaugés de 100 ml.
Pipette
s automatiques et embouts.
Flacons PE de 250 ml.
Agitateur rotatif (sous
-
sol).
Spectrophotomètre et cuves 10 mm.
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2)
Réactifs
a)
Extraction
Solution
-
mère d’acide gallique p.a.
: dissoudre 1 gramme d’acide gallique dans H2O désionisée et
jauger à 1 litre.
S
olution de carbonate de sodium à 20 %
(p/v)
: dissoudre 20 g de Na2CO3 dans 100 ml d’H2O
désionisée.
Réactif de Folin
–
Ciocalteus
.
Solution d’extraction
: méthanol/H2O 2
: 1 acidifié avec HCl
: dans un ballon de 1 litre, mettre 648.7
ml de méthanol p.a. p
uis 300 ml d’eau. Ajouter avec précaution 27 ml d’HCL conc. 37 % et ajuster à
la jauge lorsque le mélange est revenu à température ambiante.
NaOH 1M (Titrisol).
Méthanol technique
Acétone technique
b)
Gamme etalon
Pour la courbe
–
étalon, préparer à partir
de la solution
-
mère une gamme de solutions d’acide gallique allant
de 0 à 1 g/l.
T

able de correspondance pour la fabrication de la gamme étalon d’acide
gallique, à partir d’une solut
ion
-
mère concentrée à 1 g/l.
Concentration en g/l
Volume de la solution
mère en ml
Volume d’eau (ml)
0
0
100
0.2
20
80
0.4
40
60
0.6
60
40
0.8
80
20
1
100
0
3)
Mode opératoire
a) Echantillon de départ
On utilise de la litière broyée à la pulvérisette (env. 50
m).
Peser exactement une quantité de litière broyée vo
isine de 1 g.
b) Blancs
Remplacer la prise d’essai par de l’eau désionisée et suivre la procédure.
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c
)
Procédure
Composés phénoliques
-

fraction soluble dans le méthanol (CPFS)
1.
Peser
une prise d’essai
2.
Noter la masse
m, en g.
3.
Introduire
l’échantillon d
ans une allonge (tube à fond plat).
4.
Ajouter 50 ml de solution d’extraction
petit à petit en essayant de mouiller toute la matière et en
lavant les parois de l’allonge.
5.
Faire bouillir sous reflux
au bain à sec (thermochem, type CHL, préchauffé à 150 °C) pen
dant
exactement
une heure
. Eviter une forte ébullition en baissant la température de consigne à 120 °C dès
que l’ébullition est atteinte.
6.
Après une heure, fermer les allonges et laisser
refroidir dans la glace pendant 3 minutes
environ.
7.
Séparer l’extrait d
u résidu en
filtrant à travers un filtre plissé rapide LS 14 1/2 sur erlenmeyers de
250 ml.
8.
Récupérer suffisamment d’extrait pour l’analyse des CPFS (10 ml) et les
mettre de côté. Remettre un
erlenmeyer de 250 ml propre sous l’entonnoir.
9.
Le résidu quantita
tivement collecté dans le filtre est alors lavé 4 fois au méthanol technique et 2
fois à l’acétone technique.
Au cours de cette opération, utiliser des pissettes remplies des différents
solvants et rincer les résidus qui seraient restés dans l’allonge avan
t de verser dans le filtre. Petit à petit,
le filtrat se décolore.
10.
Ainsi dépigmenté (c’est le filtrat et non le résidu dans le filtre qui se
dépigmente), le résidu est
séché