Département de pharmacie Laboratoire de Pharmacie Galénique LA STERILISATION … PROCÈDES ET VALIDATION Plan du cours: I- Définitions II- Les produits à stériliser III- Les méthodes de stérilisation: A- Stérilisation par la chaleur: B- Stérilisation par les gaz antiseptiques C- Stérilisation par les rayonnements D- Stérilisation par la filtration IV- Contrôle de la stérilité V- validation d’un procédé de stérilisation Introduction Qu’est-ce que la stérilisation? « Un procédé qui permet d’obtenir la stérilité » et… « La stérilité est l’absence de microorganismes viables et non viables» Qu’est-ce qu’un stérilisateur? « Un équipement dans lequel les items à stériliser sont introduit » Introduction IMPORTANT! La stérilité est un ABSOLU! Les choses ne sont pas « un peu stérile! » Elles sont soit « stérile » ou « non-stérile. » Introduction Pourquoi et quand stériliser? Pour éliminer la contamination dû aux microorganismes. Avant la production du produit Contenants, outils, pièces de machines, etc. Après la production du produit Stérilisation terminale; stérilisation du produit dans son récipient final. 1. DEFINITIONS Stérilisation Opération ayant pour but d’éliminer ou de détruire tous les microorganismes vivants, portés par un objet parfaitement nettoyé. Stérilité • Absence de microorganisme vivant • La probabilité d’avoir une unité non stérile soit < 10-6 atteindre un niveau d’assurance de stérilité. (NAS) 10-6 : probabilité de rencontrer une unité non stérile inférieure à 1 par million. 1. DEFINITIONS La stérilité n’est possible que dans le cadre de la protection de cet état. La stérilité est un état éphémère. « il convient chaque fois que possible, de choisir un procédé permettant la stérilisation du produit dans son récipient final (stérilisation terminale) ». Travailler en zone d’atmosphère contrôlée. 2. NECESSITE DE STERILISER Éviter l’introduction de microorganismes pathogènes ou pas dans l’organisme : Matériel médicochirurgical Préparations médicamenteuses par voie oculaire ou parentérale ou appliquées sur peau lésée Alimentation des personnes sensibles (immunodéprimés), alimentation entérale Air ambiant des blocs opératoires Ces microorganismes peuvent être dangereux : Pour l’homme : si pathogène infection voire septicémie Pour le médicament : déstabilisation 3. Méthodes de stérilisation Pour les produits qui peuvent être stérilisés dans leur conditionnement définitif La vapeur d’eau. La chaleur sèche. L’ irradiation. Les antiseptiques gazeux. Pour les produits qui ne peuvent pas être stérilisés dans leur conditionnement définitif : La filtration stérilisante. La préparation dans des conditions aseptiques. 3.1- Stérilisation par la chaleur 1.PRINCIPE Détruire les microorganismes / chaleur sèche ou humide. Appliquée à des préparations ou matériels conditionnés dans son conditionnement définitif ou dans des protecteurs de stérilité Pour les médicaments. 2.Sensibilité des Micro-organismes à la chaleur Dépend de : Espèce microbienne et de la forme sous laquelle elle se trouve; Durée du traitement ; Le nombre de germes au départ; Température; Nature du milieu dans lequel se trouve les germes. 1- Espèce microbienne 1- Espèce microbienne Tous les micro-organismes n’ont pas la même sensibilité à la chaleur. Pour une espèce donnée, les spores sont plus résistantes que les formes végétatives. 2- Durée et le nombre de germe Le nombre de survie des germes après un traitement thermique varie en sens inverse avec la duré du traitement selon une relation logarithmique Évolution d’une population en fonction du temps En théorie la stérilité totale ne peut être atteinte. Le risque de survie après un traitement thermique est d’autant plus faible qu’il y’avait moins de germes au départ. Évolution d’une population en fonction du temps Avec des coordonnées semi logarithmique Log N/N0 = - kt N0 : nombre de germes initial N : nombre de germes au temps t 2.1 Temps de réduction décimale : DT À une température donnée, le temps de réduction décimale DT correspond au temps nécessaire à réduire la population de microorganismes d’un facteur 10. Spores de Clostridium botulinum 12 secondes 2 minutes 2.2-Z, la valeur d’inactivation thermique « C’est l ’élévation de température nécessaire pour réduire la valeur DT d’un facteur 10 » DT À chaque fois qu’on élève la température de 10 °C, le temps nécessaire pour atteindre la stérilité est divisé par 10. On note alors que la valeurs d’inactivation thermique Z = 10 °C. Chaque germe est caractérisé par ses deux paramètres d’action. Un germe est d’autant plus résistant que ses valeurs D et Z sont plus élevées. Micro-organismes D115°C (en min) D121°C (en min) Z (en°C) B.stearothermophilus 15 1.5 9.5 B.subtilis 2.2 0.6 10 0.0025 0.04 7 B.megaterium Diminution du nombre de germes initiaux employer du matériel propre et stérile utiliser de l'eau fraîchement distillée utiliser des matières premières les plus pures possibles travailler la plus proprement possible travailler dans une atmosphère la plus propre possible. 3- Température Temps nécessaire à la destruction des spores d’une espèce microbienne en fonction de la température :relation logarithmique Exemple : spores de clostridium botulinium 9 min à 115°C 30 min à 110°C 4h à 100°C la pente varie avec l’espèce microbienne 4- Nature du milieu Humidité: La destruction des micro-organismes est beaucoup plus rapide en milieu liquide qu’en milieu solide pH: Un pH bas augmente la sensibilité des microorganismes. Autres constituants: Substances qui présentes un pouvoir bactéricide a chaud. Chaleur sèche (Dry Heat) Procédé ancien (19e siècle) Surtout associée à la dépyrogénisation (250 à 350 °C) peut aussi être utilisée pour la stérilisation (180 °C). Les fours ou étuves à air chaud, fours Pasteur ou stérilisateurs Poupinel, chauffés habituellement à l’électricité et convenablement calorifugés permettant la circulation d’air chaud filtré (HEPA) à l’intérieur d’un four à convection. L’agent stérilisant : O2 de l’air porté à une température élevée oxydation des protéines bactériennes Chaleur sèche (Dry Heat) Paramètres à contrôler: température . La Pharmacopée Européenne préconise un barème minimal de 160°C pendant au moins 2h lorsque cette stérilisation est utilisée comme stérilisation finale D’autres barèmes : 170°C pendant 1h ou 180°C /30 min Pour matériau résistant à des très hautes températures. Surtout utilisée pour les contenants en verre. Il est à noter que la chaleur sèche est inactive sur les Agent Transmissible Non Conventionnel, et par conséquent les fours Poupinel son proscrits à l’hôpital. Phase d’un cycle de stérilisation: chauffage, stérilisation et refroidissement. Stérilisation par la chaleur humide Mode de stérilisation le plus répandu Production de vapeur d’eau par chauffage sous pression : vapeur saturante = gaz stérilisant. Dénaturation des macromolécules bactériennes (noyau et parois) sous l’action de la chaleur hydrolyse partielle des chaînes peptidiques Pour les récipients contenant des solutions à stériliser, l’effet stérilisant est réalisé par l’eau de la solution Pour la stérilisation terminale : le conditionnement doit être perméable à la vapeur d’eau Stérilisation par la chaleur humide Autoclave de laboratoire Enceinte cylindrique étanche en acier inoxydable ou en cuivre + couvercle . Panier grillagé : recevoir les produits à stériliser. Elle peut contenir de l’eau portée à une haute température pour dégager de la vapeur ou recevoir la vapeur par le biais de canalisation. Couvercle : manomètre, thermomètre, robinet d’évacuation et soupape de sûreté. Autoclave de laboratoire Stérilisation par la chaleur humide Autoclave de laboratoire Fonctionnement Il faut veiller à ce que la température soit homogène dans l’ensemble de l’enceinte tout au long de la stérilisation . Garantir que toutes les unités soumises à la stérilisation seront stérile Stérilisation par la chaleur humide Autoclave industriel C’est une enceinte à une ou deux portes étanches par un joint dans laquelle on admettra de la vapeur ou de l’eau surchauffée. Autoclave industriel discontinu Les autoclaves industriels sont en général horizontaux et à ouverture latérale pour permettre un chargement et un déchargement par chariots à plateaux, Ils sont généralement équipés d’un enregistreur de pression et de température. stérilisateur industriel en continu Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Les différentes phases d’un cycle de stérilisation sont : purge de l’air pré-traitement ou chauffage de la charge stérilisation refroidissement - séchage Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Purge de l’air : Bonne diffusion de la vapeur en tout point de l’enceinte efficacité de la stérilisation Autoclave de laboratoire laisser le robinet d’évacuation en position ouverte, déclencher le chauffage jusqu’à ébullition de l’eau la vapeur se propage dans l’ensemble de l’autoclave Autoclave industriel l’élimination de l’air est assurée au moyen d’une pompe à vide. Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Chauffage de la charge A l’échelle de laboratoire fermer le robinet de purge augmenter la température de 100 à 120°C progressivement pendant 20 min. A l’échelle industrielle mouiller la charge par la vapeur condenser cette vapeur sur les éléments à stériliser Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Étape de stérilisation Le palier de stérilisation: Conditions de référence applicables aux préparations aqueuses : 121°C pendant 15 min: plateau de stérilisation. Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Refroidissement A l’échelle de laboratoire Diminuer progressivement la température de 121 à 100°C, Tout en maintenant le robinet de purge fermé A l’échelle industrielle évacuer la vapeur la condenser Doit être maîtrisé en terme de vitesse de refroidissement et de maintien de la pression dans l’enceinte : risque d’explosion des contenants de solutions Stérilisation par la chaleur humide Cycle de stérilisation Séchage Le séchage par le vide qui permet d'évacuer la vapeur d'eau, à l’aide de la pompe a vide. Le retour à la pression atmosphérique grâce à une entrée d'air filtré afin de pouvoir effectuer une ouverture de porte. Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation Indicateurs chimiques 1.Test de pénétration de vapeur Bowie Dick doit être réalisé tous les matins à chaque démarrage du stérilisateur avant son utilisation afin de vérifier le bon fonctionnement des autoclaves. Après cycle, ouverture du pack et vérification du virage uniforme de l’indicateur. Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation Indicateurs chimiques Les témoins de passage ils sont ajoutés aux charges et ont comme objectif de garantir les bons paramètres de stérilisation. Exemple :Le ruban indicateur utilisé pour fixer les emballages ou les sachets comportent des zones de virage. Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation Indicateurs chimiques Tubes de verre contenant des substances chimiques pures à point de fusion caractéristique et un indicateur coloré indication sur la température atteinte dans l’enceinte Ex: Acide benzoïque TF = 121°C Indicateur coloré = éosine qui passe du rose pale au rose orangé Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation Indicateurs biologiques sont des préparations normalisées de microorganismes (spores) sélectionnés et utilisés pour évaluer l'efficacité d'un procédé de stérilisation, ils servent à démontrer que le procédé de stérilisation utilisé a la capacité d'inactiver les microorganismes ayant une résistance connue par rapport à un procédé de référence. Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation Indicateurs biologiques Le germe utilisé pour la préparation de ces indicateurs correspondant au germe de référence. stérilisation par la chaleur sèche : Bacillus subtilis; stérilisation par la chaleur humide : Bacillus Stearothermophilus. Stérilisation par la chaleur humide Contrôle de stérilisation 2.Des indications permettent de suivre le cycle en cours : L’autoclave indique la phase du cycle en cours, la température et la pression Validation de la stérilisation par la chaleur consiste à démontrer que celui-ci permet d’atteindre l’état stérile désiré sans altérer le produit. Après avoir choisi un cycle de stérilisation, la validation consiste alors à étudier avec des sondes convenablement réparties: la distribution de la chaleur dans l’appareil à vide et à pleine charge. la pénétration de la chaleur dans les unités constituant la charge et en particulier dans la partie la plusdéfavorable mise en évidence par l’étude de distribution. la reproductibilité du procédé en répétant plusieurs fois les études de distribution et pénétration ainsi que la bonne conservation des produits. 3.2- Stérilisation par les gaz antiseptiques Les gaz permettent de stériliser a des températures plus basses qu’avec la stérilisation par la vapeur d’eau ou la chaleur sèche. Trois gaz sont actuellement utilisés mais leur emploi est limité par leur toxicité. Formaldéhyde Para-formaldéhyde solide est transformé en formol gaz par chauffage Réalisée dans des caissons, utilisé en quantité suffisante pour dégager 3g/m3, le contact dure une nuit et une ventilation par l’air stérile permet de chasser le formol. Efficace en milieu humide Gaz peu pénétrant →stérilisation en surface →Stérilisation du matériel et des locaux Irritant et toxique pour le personnel : manipulation avec précaution Oxyde d’éthylène Bactéricide : alkylation de molécules nécessaires au métabolisme des bactéries L’eau est nécessaire à la réaction d’alkylation, l’humidité résiduelle 20 à 40 % Utilisé pour le matériel médico-chirurgical qui ne supporte pas l’autoclavage (PVC, polyéthylène…) Les produits à stériliser sont conditionnés dans des protecteurs individuels de stérilité Dossier de stérilisation : pression, température, humidité et concentration en gaz Étape de désorption lente nécessaire après stérilisation (taux d’OE ne doit pas dépasser 2% à la fin) Gaz très inflammable, irritant et manque d’inertie : manipulation avec précaution par un personnel expérimenté Acide peracétique Libère de l’O2 atomique qui est un agent très puissant d’oxydation : action au niveau de la paroi cellulaire et des constituants cytoplasmiques Activité maximale en présence d’un taux élevé d’humidité, 80 % Stérilisation des enceintes stériles +++ Très peu pénétrant (comme le formol) mais action stérilisante plus puissante Commercialisé sous forme de solution concentrée à 35 %. Utilisé sous forme diluée au 1/10ème, porté à T° 40 à 47°C Grande toxicité et provoque la corrosion des métaux Peroxyde d’hydrogène en phase plasma C’est le procédé Sterrad Le gaz plasma est du peroxyde d’hydrogène activé en milieu humide par un champ électrique Peroxyde d’hydrogène en phase plasma Phase plasma : renferme des radicaux libres O+HO. → Propriétés bactéricides et sporicides du plasma du peroxyde d ’hydrogène Remplace l’oxyde d’éthylène pour les DM Utilisé en stérilisation hospitalière, pour les DM thermofragiles Ne peut être utilisé pour les objets creux et longs 3.3- Stérilisation par les rayonnements stérilisants Rayonnements inonisants β et γ Radio-stérilisation obtenue par -des radioéléments, type Cobalt 60 qui émet des photons gamma, très bactéricide et très pénétrant ( ou le Césium 137), -soit par des accélérateur d’électrons qui émettent un rayonnement béta Stérilisation très efficace du matériel médicochirurgical (seringue, aiguille , nécessaire pour perfusion, articles de pansement, sutures...) à usage unique, dans un emballage étanche définitif Rayonnements inonisants β et γ Méthode coûteuse et à risque pour l’être humain Réalisée dans des centres spécialisés soumis à des dispositions législatives et réglementaires particulières L’effet stérilisant nécessite une dose minimale de rayonnement ionisant, de l’ordre de 25 kGy dépend→ de l’état de contamination initial et de la sensibilité des germes aux rayonnements Contrôle régulier par des procèdes dosimétriques régulier pour mesurer la dose réellement reçue par le produit. La radiostérilisation UV Ils sont très bactéricide mais peu pénétrants et sont utilisés pour une stérilisation superficielle. Ils sont très efficaces mais ils sont arrêtés par le moindre obstacle. Rayonnements utilisés en pharmacie uniquement pour stériliser l’air et pour maintenir la stérilité de l’eau : Lampes UV équipant les cuves de stockage de l’EPPI Lampes UV équipant les SAS d’entrée des enceintes stériles. 3.4- Stérilisation par filtration La filtration stérilisante S’applique aux monophasiques fluides : gaz et liquides Solution renfermant PA thermolabile pour ne pas le dégrader. La préparation une fois filtrée est répartie puis conditionnée dans des conditions aseptiques Filtration de l’air qui alimente les enceintes stériles Choisir le média filtrant adapté : compatibilité avec PA, faible taux de rétention, diamètre des pores adéquat pour la filtration stérilisante (≤0,22 μm) Opération réalisée avec un matériel stérile et dans des zones à atmosphère contrôlée. La filtration stérilisante et test de routine La filtration doit être réalisée le plus tôt possible après la préparation de la solution et doit être réduite au minimum de temps. Stérilisation du circuit de répartition par la vapeur propre (121°C-20 min) S’assurer ensuite de l’intégrité du filtre avant de débuter la filtration et en fin de filtration (point de bulle, test de diffusion et test de tenue de pression) Vérifier que le filtre permet d’obtenir un filtrat stérile à partir d’une solution 107 UFC Brevundimonas diminuta par cm2 de surface 40 4. Conditionnement aseptique et enceintes stériles Substances sensibles à la chaleur devant être stériles (suspension injectable, émulsion, forme polymérique, implants, inserts ophtalmiques…) Toutes les étapes de fabrication et de conditionnement se font dans des enceintes où règne une asepsie aussi rigoureuse que possible → le degré de contamination doit être connu et maîtrisé →alimentation en air stérile Simple vitrine, hotte ou une salle entière 4. Conditionnement enceintes stériles aseptique et 4.1. Filtration stérilisante de l’air Une filtration efficace passe par au moins 3 étages de filtration 99 % des particules de l’air atmosphérique ont un diamètre < au micromètre → agir sur ce diamètre dès le 1er étage de filtration 4. Conditionnement aseptique et enceintes stériles 4.1. Filtration stérilisante de l’air Les filtres stérilisants peuvent être en papier, cellulose, membrane de cellulose, laine de verre… Dans les canalisations d’arrivée d’air, ils sont toujours placés en aval des appareils de conditionnement de l’air, c’est-à-dire des appareils de dépoussiérage et de réglage de l’humidité et de la température indispensables dans les enceintes stériles. Par mesure de sécurité supplémentaire, des tubes à UV germicides peuvent être placés dans les gaines d’entrée d’air après les filtres stérilisants. 4. Conditionnement enceintes stériles aseptique et 4.1. Filtration stérilisante de l’air Avec les enceintes à flux d’air laminaire, l’emploi des filtres dits « absolus » ou« HEPA » (haute efficacité pour les particules de l’air) s’est répandu . Ce sont généralement des filtres de fibres de verre en plaques pliées en accordéon pour augmenter leur surface et maintenues dans des cadres de bois ou de métal. 4. Conditionnement aseptique et enceintes stériles 4.2. Les enceintes stériles Enceintes de petit volume : hotte à flux d’air laminaire, isolateur Salles stériles = salle blanche Les isolateurs +++ en Zone à Atmosphère Contrôlé (ZAC) Les isolateurs sont utilisés pour : La protection du personnel (produit toxique) La protection du produit La protection de l’environnement Isolateur •Un volume avec des parois rigides ou souples (microbiologiquement étanche) qui protège le process de l’opérateur et de l’environnement Le volume est étanche à l’air ou ventilé à travers des filtres HEPA Hotte à flux d’air laminaire •Possibilité de contact du personnel et du matériel avec l’environnement extérieur La barrière n’est pas étanche (nécessité d’un habillage spécifique) Installée dans une ZAC à conditions très strictes Utilisation de pression différentielle entre les pièces Hotte à flux d’air laminaire 4. Conditionnement enceintes stériles Isolateurs aseptique et 4. Conditionnement aseptique et enceintes stériles 4.2. Les enceintes stériles Enceintes stériles à flux d’air laminaire Enceintes à flux vertical : l’air arrive du plafond (filtres HEPA)→ sol (grillage constitué d’une paroi poreuse = préfiltre) → meilleure installation pour le dépoussiérage Enceintes à flux horizontal : l’air de mur à mur → installation moins satisfaisante mais moinschère Enceintes mixtes : de mur à sol ou de plafond à mur (les plus courantes) 4.2. Les enceintes stériles Classification des zones d’atmosphère contrôlée Aux fins de la fabrication de médicaments stériles, quatre classes de zones d’atmosphère contrôlée sont définies par les BPF et les BPP : 4.2. Les enceintes stériles Classification des zones d’atmosphère contrôlée 5.Contrôle de la stérilité L’essai de stérilité L’essai est défini par la Pharmacopée Européenne. L’échantillonnage prévu pour un lot de taille supérieure à 500 unités est de 20 unités à prélever. La probabilité de trouver une unité non stérile sur un échantillon est relativement faible.
