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3- Procédes de stérilisation - etudiant

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Département de pharmacie
Laboratoire de Pharmacie Galénique
LA
STERILISATION
… PROCÈDES ET VALIDATION
Plan du cours:
I- Définitions
II- Les produits à stériliser
III- Les méthodes de stérilisation:
A- Stérilisation par la chaleur:
B- Stérilisation par les gaz antiseptiques
C- Stérilisation par les rayonnements
D- Stérilisation par la filtration
IV- Contrôle de la stérilité
V- validation d’un procédé de stérilisation
Introduction
 Qu’est-ce que la stérilisation?
« Un procédé qui permet d’obtenir la stérilité »
 et…
« La stérilité est l’absence de microorganismes
viables et non viables»
 Qu’est-ce qu’un stérilisateur?
« Un équipement dans lequel les items à
stériliser sont introduit »
Introduction
IMPORTANT!
La stérilité est un ABSOLU!
Les choses ne sont pas
« un peu stérile! »
Elles sont soit
« stérile » ou « non-stérile. »
Introduction
 Pourquoi et quand stériliser?
 Pour éliminer la contamination dû aux
microorganismes.
 Avant la production du produit
 Contenants, outils, pièces de machines, etc.
 Après la production du produit
 Stérilisation terminale; stérilisation du produit
dans son récipient final.
1. DEFINITIONS
Stérilisation
Opération ayant pour but d’éliminer ou de
détruire tous les microorganismes vivants,
portés par un objet parfaitement nettoyé.
Stérilité
• Absence de microorganisme vivant
• La probabilité d’avoir une unité non stérile soit
< 10-6 atteindre un niveau d’assurance de
stérilité.
(NAS) 10-6 : probabilité de rencontrer une unité
non stérile inférieure à 1 par million.
1. DEFINITIONS
 La stérilité n’est possible que dans le cadre de
la protection de cet état.
 La stérilité est un état éphémère.
 « il convient chaque fois que possible, de choisir
un procédé permettant la stérilisation
du produit dans son récipient final (stérilisation
terminale) ».
 Travailler en zone d’atmosphère contrôlée.
2. NECESSITE DE STERILISER
 Éviter l’introduction de microorganismes pathogènes
ou pas dans l’organisme :
 Matériel médicochirurgical
 Préparations médicamenteuses par voie oculaire ou
parentérale
 ou appliquées sur peau lésée
 Alimentation des personnes sensibles
(immunodéprimés),
 alimentation entérale
 Air ambiant des blocs opératoires
 Ces microorganismes peuvent être dangereux :
 Pour l’homme : si pathogène infection voire septicémie
 Pour le médicament : déstabilisation
3. Méthodes de stérilisation
 Pour les produits qui peuvent être stérilisés dans leur
conditionnement définitif
 La vapeur d’eau.
 La chaleur sèche.
 L’ irradiation.
 Les antiseptiques gazeux.
Pour les produits qui ne peuvent pas être stérilisés
dans leur conditionnement définitif :
La filtration stérilisante.
La préparation dans des conditions aseptiques.
3.1- Stérilisation par
la chaleur
1.PRINCIPE
 Détruire les microorganismes / chaleur
sèche ou humide.
 Appliquée à des préparations ou matériels
 conditionnés dans son conditionnement
définitif ou dans des protecteurs de
stérilité Pour les médicaments.
2.Sensibilité des Micro-organismes à la chaleur
Dépend de :
 Espèce microbienne et de la forme sous
laquelle elle se trouve;
 Durée du traitement ;
 Le nombre de germes au départ;
 Température;
 Nature du milieu dans lequel se trouve les
germes.
1- Espèce microbienne
1- Espèce microbienne
 Tous les micro-organismes
n’ont pas la même sensibilité
à la chaleur.
 Pour une espèce donnée, les
spores sont plus résistantes
que les formes végétatives.
2- Durée et le nombre de germe
 Le nombre de survie des germes après un traitement
thermique varie en sens inverse avec la duré du
traitement selon une relation logarithmique
Évolution d’une population en fonction du temps
 En théorie la stérilité totale ne peut être atteinte.
 Le risque de survie après un traitement thermique est
d’autant plus faible qu’il y’avait moins de germes au
départ.
Évolution d’une population en fonction du temps
Avec des coordonnées semi logarithmique
Log N/N0 = - kt
N0 : nombre de germes initial
N : nombre de germes au temps t
2.1 Temps de réduction décimale : DT
À une température donnée, le temps de réduction
décimale DT correspond au temps nécessaire à
réduire la population de microorganismes d’un
facteur 10.
Spores de Clostridium botulinum
12 secondes
2 minutes
2.2-Z, la valeur d’inactivation thermique
 « C’est l ’élévation de température nécessaire
pour réduire la valeur DT d’un facteur 10 »
DT
À chaque fois qu’on
élève la température de
10 °C, le temps
nécessaire
pour
atteindre la stérilité est
divisé par 10. On note
alors que la valeurs
d’inactivation thermique
Z = 10 °C.
 Chaque germe est caractérisé par ses deux
paramètres d’action. Un germe est d’autant plus
résistant que ses valeurs D et Z sont plus
élevées.
Micro-organismes
D115°C (en min) D121°C (en min)
Z (en°C)
B.stearothermophilus
15
1.5
9.5
B.subtilis
2.2
0.6
10
0.0025
0.04
7
B.megaterium
Diminution du nombre de germes initiaux
employer du matériel propre et stérile
utiliser de l'eau fraîchement distillée
utiliser des matières premières les plus pures
possibles
travailler la plus proprement possible
travailler dans une atmosphère la plus propre
possible.
 3- Température
Temps nécessaire à la destruction des spores d’une
espèce microbienne en fonction de la température
:relation logarithmique
 Exemple : spores de clostridium botulinium
9 min à 115°C
30 min à 110°C
4h à 100°C
la pente varie avec l’espèce microbienne
4- Nature du milieu
 Humidité:
La destruction des micro-organismes est
beaucoup plus rapide en milieu liquide qu’en
milieu solide
 pH:
Un pH bas augmente la sensibilité des
microorganismes.
 Autres constituants:
Substances qui présentes un pouvoir bactéricide
a chaud.
 Chaleur sèche (Dry Heat)
 Procédé ancien (19e siècle)
 Surtout associée à la dépyrogénisation (250
à 350 °C)
peut aussi être utilisée pour la stérilisation (180 °C).
 Les fours ou étuves à air chaud, fours Pasteur ou
stérilisateurs Poupinel, chauffés habituellement à
l’électricité
et
convenablement
calorifugés
permettant la circulation d’air chaud filtré (HEPA) à
l’intérieur d’un four à convection.
 L’agent stérilisant : O2 de l’air porté à une
température élevée
 oxydation des protéines bactériennes
 Chaleur sèche (Dry Heat)
 Paramètres à contrôler: température . La Pharmacopée





Européenne préconise un barème minimal de 160°C
pendant au moins 2h lorsque cette stérilisation est utilisée
comme stérilisation finale
D’autres barèmes : 170°C pendant 1h ou 180°C /30 min
Pour matériau résistant à des très hautes températures.
Surtout utilisée pour les contenants en verre.
Il est à noter que la chaleur sèche est inactive sur les Agent
Transmissible Non Conventionnel, et par conséquent les
fours Poupinel son proscrits à l’hôpital.
Phase d’un cycle de stérilisation: chauffage, stérilisation
et refroidissement.
 Stérilisation par la chaleur humide
 Mode de stérilisation le plus répandu
 Production de vapeur d’eau par chauffage sous
pression : vapeur saturante = gaz stérilisant.
 Dénaturation des macromolécules bactériennes
(noyau et parois) sous l’action de la chaleur
hydrolyse partielle des chaînes peptidiques
 Pour les récipients contenant des solutions à
stériliser, l’effet stérilisant est réalisé par l’eau de la
solution
 Pour la stérilisation terminale : le conditionnement
doit être perméable à la vapeur d’eau
 Stérilisation par la chaleur humide
Autoclave de laboratoire
Enceinte cylindrique étanche en acier inoxydable
ou en cuivre + couvercle .
Panier grillagé : recevoir les produits à stériliser.
Elle peut contenir de l’eau portée à une haute
température pour dégager de la vapeur ou
recevoir la vapeur par le biais de canalisation.
 Couvercle : manomètre, thermomètre, robinet
d’évacuation et soupape de sûreté.
 Autoclave de laboratoire
 Stérilisation par la chaleur humide
Autoclave de laboratoire
Fonctionnement
Il faut veiller à ce que la température soit
homogène dans l’ensemble de l’enceinte tout au
long de la stérilisation .
Garantir que toutes les unités soumises à la
stérilisation seront stérile
 Stérilisation par la chaleur humide
Autoclave industriel
C’est une enceinte à une ou deux portes étanches
par un joint dans laquelle on admettra de la vapeur
ou de l’eau surchauffée.
Autoclave industriel discontinu
Les autoclaves industriels sont en
général horizontaux et à ouverture
latérale
pour
permettre
un
chargement et un déchargement
par chariots à plateaux,
Ils sont généralement équipés d’un
enregistreur de pression et de
température.
stérilisateur industriel en continu
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Les différentes phases d’un cycle de stérilisation
sont :
purge de l’air
pré-traitement ou chauffage de la charge
stérilisation
refroidissement - séchage
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Purge de l’air : Bonne diffusion de la vapeur en
tout point de l’enceinte efficacité de la stérilisation
Autoclave de laboratoire
laisser le robinet d’évacuation en position ouverte,
déclencher le chauffage jusqu’à ébullition de l’eau
la vapeur se propage dans l’ensemble de
l’autoclave
Autoclave industriel
l’élimination de l’air est assurée au moyen d’une
pompe à vide.
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Chauffage de la charge
A l’échelle de laboratoire
fermer le robinet de purge
augmenter la température de 100 à 120°C
progressivement pendant 20 min.
A l’échelle industrielle
mouiller la charge par la vapeur
condenser cette vapeur sur les éléments à
stériliser
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Étape de stérilisation
Le palier de stérilisation: Conditions de
référence applicables aux préparations aqueuses
: 121°C pendant 15 min: plateau de stérilisation.
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Refroidissement
A l’échelle de laboratoire
Diminuer progressivement la température de 121 à
100°C,
Tout en maintenant le robinet de purge fermé
A l’échelle industrielle
évacuer la vapeur
la condenser
Doit être maîtrisé en terme de vitesse de
refroidissement et de maintien de la pression dans
l’enceinte : risque d’explosion des contenants de
solutions
 Stérilisation par la chaleur humide
Cycle de stérilisation
Séchage
Le séchage par le vide qui permet d'évacuer la
vapeur d'eau, à l’aide de la pompe a vide.
Le retour à la pression atmosphérique grâce à une
entrée d'air filtré afin de pouvoir effectuer une
ouverture de porte.
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
Indicateurs chimiques
1.Test de pénétration de vapeur Bowie Dick doit
être réalisé tous les matins à chaque
démarrage du stérilisateur avant son utilisation
afin de vérifier le bon fonctionnement des
autoclaves.
Après cycle, ouverture du pack et vérification du virage
uniforme de l’indicateur.
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
Indicateurs chimiques
Les témoins de passage
ils sont ajoutés aux charges et ont comme objectif de
garantir les bons paramètres de stérilisation.
Exemple :Le ruban indicateur utilisé pour fixer les
emballages ou les sachets comportent des zones de
virage.
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
 Indicateurs chimiques
Tubes de verre contenant des substances chimiques
pures à point de fusion caractéristique et un
indicateur coloré indication sur la température
atteinte dans l’enceinte
Ex: Acide benzoïque TF = 121°C
Indicateur coloré = éosine qui passe du rose pale au
rose orangé
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
 Indicateurs biologiques
 sont
des préparations normalisées de
microorganismes (spores) sélectionnés et
utilisés pour évaluer l'efficacité d'un procédé de
stérilisation, ils servent à démontrer que le
procédé de stérilisation utilisé a la capacité
d'inactiver les microorganismes ayant une
résistance connue par rapport à un procédé de
référence.
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
 Indicateurs biologiques
 Le germe utilisé pour la préparation de ces
indicateurs correspondant au germe de référence.
 stérilisation par la chaleur sèche : Bacillus subtilis;
 stérilisation par la chaleur humide : Bacillus
Stearothermophilus.
 Stérilisation par la chaleur humide
Contrôle de stérilisation
2.Des indications permettent de suivre le cycle en cours :
L’autoclave indique la phase du cycle en cours, la
température et la pression

Validation de la stérilisation par la chaleur
consiste à démontrer que celui-ci permet d’atteindre l’état
stérile désiré sans altérer le produit.
Après avoir choisi un cycle de stérilisation, la validation
consiste alors à étudier avec des sondes convenablement
réparties:
la distribution de la chaleur dans l’appareil à vide et à pleine
charge.
la pénétration de la chaleur dans les unités constituant la
charge et en particulier dans la partie la plusdéfavorable mise
en évidence par l’étude de distribution.
la reproductibilité du procédé en répétant plusieurs fois les
études de distribution et pénétration ainsi que la bonne
conservation des produits.
3.2- Stérilisation par les gaz
antiseptiques
 Les gaz permettent de stériliser a des
températures plus basses qu’avec la
stérilisation par la vapeur d’eau ou la chaleur
sèche.
 Trois gaz sont actuellement utilisés mais leur
emploi est limité par leur toxicité.
 Formaldéhyde
 Para-formaldéhyde solide est transformé en
formol gaz par chauffage
 Réalisée dans des caissons, utilisé en quantité
suffisante pour dégager 3g/m3, le contact dure
une nuit et une ventilation par l’air stérile permet
de chasser le formol.
 Efficace en milieu humide
 Gaz peu pénétrant →stérilisation en surface
→Stérilisation du matériel et des locaux
 Irritant et toxique pour le personnel :
manipulation avec précaution
 Oxyde d’éthylène
 Bactéricide : alkylation de molécules nécessaires au métabolisme
des bactéries
 L’eau est nécessaire à la réaction d’alkylation, l’humidité résiduelle
20 à 40 %
 Utilisé pour le matériel médico-chirurgical qui ne supporte pas
l’autoclavage (PVC, polyéthylène…)
 Les produits à stériliser sont conditionnés dans des protecteurs
individuels de stérilité
 Dossier de stérilisation : pression, température, humidité et
concentration en gaz
 Étape de désorption lente nécessaire après stérilisation (taux d’OE
ne doit pas dépasser 2% à la fin)
 Gaz très inflammable, irritant et manque d’inertie : manipulation
avec précaution par un personnel expérimenté
 Acide peracétique
 Libère de l’O2 atomique qui est un agent très
puissant d’oxydation : action au niveau de la paroi
cellulaire et des constituants cytoplasmiques
 Activité maximale en présence d’un taux élevé
d’humidité, 80 %
 Stérilisation des enceintes stériles +++
 Très peu pénétrant (comme le formol) mais action
stérilisante plus puissante
 Commercialisé sous forme de solution concentrée à
35 %.
 Utilisé sous forme diluée au 1/10ème, porté à T° 40 à
47°C
 Grande toxicité et provoque la corrosion des
métaux
Peroxyde d’hydrogène en phase plasma
 C’est le procédé Sterrad
 Le gaz plasma est du peroxyde
d’hydrogène activé en milieu humide
par un champ électrique
 Peroxyde d’hydrogène en phase plasma
 Phase plasma : renferme des radicaux libres O+HO.
→ Propriétés bactéricides et sporicides du plasma du
peroxyde d ’hydrogène
 Remplace l’oxyde d’éthylène pour les DM
 Utilisé en stérilisation hospitalière, pour les DM
thermofragiles
 Ne peut être utilisé pour les objets creux et longs
3.3- Stérilisation par les
rayonnements stérilisants
 Rayonnements inonisants β et γ
Radio-stérilisation obtenue par
-des radioéléments, type Cobalt 60 qui émet des
photons gamma, très bactéricide et très pénétrant (
ou le Césium 137),
-soit par des accélérateur d’électrons qui émettent un
rayonnement béta
Stérilisation
très
efficace
du
matériel
médicochirurgical (seringue, aiguille , nécessaire pour
perfusion, articles de pansement, sutures...) à usage
unique, dans un emballage étanche définitif
 Rayonnements inonisants β et γ
 Méthode coûteuse et à risque pour l’être humain
 Réalisée dans des centres spécialisés soumis à des
dispositions
législatives
et
réglementaires
particulières
 L’effet stérilisant nécessite une dose minimale de
rayonnement ionisant, de l’ordre de 25 kGy
dépend→ de l’état de contamination initial et de la
sensibilité des germes aux rayonnements
 Contrôle régulier par des procèdes dosimétriques
régulier pour mesurer la dose réellement reçue par
le produit.
 La radiostérilisation UV
 Ils sont très bactéricide mais peu pénétrants et sont
utilisés pour une stérilisation superficielle. Ils sont
très efficaces mais ils sont arrêtés par le moindre
obstacle.
 Rayonnements utilisés en pharmacie uniquement
pour stériliser l’air et pour maintenir la stérilité de
l’eau :
 Lampes UV équipant les cuves de stockage de l’EPPI
 Lampes UV équipant les SAS d’entrée des enceintes
stériles.
3.4- Stérilisation par
filtration
 La filtration stérilisante
 S’applique
aux
monophasiques
fluides
:
gaz
et
liquides
 Solution renfermant PA thermolabile pour ne pas le
dégrader. La préparation une fois filtrée est répartie puis
conditionnée dans des conditions aseptiques
 Filtration de l’air qui alimente les enceintes stériles
 Choisir le média filtrant adapté : compatibilité avec
PA, faible taux de rétention, diamètre des pores
adéquat pour la filtration stérilisante (≤0,22 μm)
 Opération réalisée avec un matériel stérile et dans
des zones à atmosphère contrôlée.
 La filtration stérilisante et test de routine
 La filtration doit être réalisée le plus tôt possible





après la préparation de la solution et doit être
réduite au minimum de temps.
Stérilisation du circuit de répartition par la vapeur
propre (121°C-20 min)
S’assurer ensuite de l’intégrité du filtre avant de
débuter la filtration et en fin de filtration (point de
bulle, test de diffusion et test de tenue de pression)
Vérifier que le filtre permet d’obtenir un filtrat
stérile à partir d’une solution 107 UFC
Brevundimonas diminuta par cm2 de surface 40
4.
Conditionnement
aseptique
et
enceintes stériles
 Substances sensibles à la chaleur devant être
stériles (suspension injectable, émulsion, forme
polymérique, implants, inserts ophtalmiques…)
 Toutes les étapes de fabrication et de
conditionnement se font dans des enceintes
où règne une asepsie aussi rigoureuse que
possible → le degré de contamination doit
être connu et maîtrisé →alimentation en air
stérile
 Simple vitrine, hotte ou une salle entière
4.
Conditionnement
enceintes stériles
aseptique
et
4.1. Filtration stérilisante de l’air
 Une filtration efficace passe par au moins 3
étages de filtration
 99 % des particules de l’air atmosphérique
ont un diamètre < au micromètre → agir sur
ce diamètre dès le 1er étage de filtration
4.
Conditionnement
aseptique
et
enceintes stériles
4.1. Filtration stérilisante de l’air
 Les filtres stérilisants peuvent être en papier,
cellulose, membrane de cellulose, laine de
verre… Dans les canalisations d’arrivée d’air, ils
sont toujours placés en aval des appareils de
conditionnement de l’air, c’est-à-dire des
appareils de dépoussiérage et de réglage de
l’humidité et de la température indispensables
dans les enceintes stériles.
 Par mesure de sécurité supplémentaire, des
tubes à UV germicides peuvent être placés dans
les gaines d’entrée d’air après les filtres
stérilisants.
4.
Conditionnement
enceintes stériles
aseptique
et
4.1. Filtration stérilisante de l’air
 Avec les enceintes à flux d’air laminaire,
l’emploi des filtres dits « absolus » ou« HEPA
» (haute efficacité pour les particules de l’air)
s’est répandu .
 Ce sont généralement des filtres de fibres de
verre en plaques pliées en accordéon pour
augmenter leur surface et maintenues dans
des cadres de bois ou de métal.
4.
Conditionnement
aseptique
et
enceintes stériles
4.2. Les enceintes stériles
 Enceintes de petit volume : hotte à flux d’air
laminaire, isolateur
 Salles stériles = salle blanche
 Les isolateurs +++ en Zone à Atmosphère
Contrôlé (ZAC)
 Les isolateurs sont utilisés pour :
 La protection du personnel (produit toxique)
 La protection du produit
 La protection de l’environnement
Isolateur
•Un volume avec des parois
rigides ou souples
(microbiologiquement
étanche) qui protège le
process de l’opérateur et de
l’environnement
Le volume est étanche à l’air
ou ventilé à travers des filtres
HEPA
Hotte à flux d’air laminaire
•Possibilité de contact du
personnel et du matériel
avec l’environnement
extérieur
La barrière n’est pas
étanche (nécessité d’un
habillage spécifique)
Installée dans une ZAC à
conditions très strictes
Utilisation de pression
différentielle entre les
pièces
Hotte à flux d’air laminaire
4.
Conditionnement
enceintes stériles
Isolateurs
aseptique
et
4.
Conditionnement
aseptique
et
enceintes stériles
 4.2. Les enceintes stériles
 Enceintes stériles à flux d’air laminaire
 Enceintes à flux vertical : l’air arrive du plafond
 (filtres HEPA)→ sol (grillage constitué d’une
 paroi poreuse = préfiltre) → meilleure
installation pour le dépoussiérage
 Enceintes à flux horizontal : l’air de mur à mur
→ installation moins satisfaisante mais moinschère
 Enceintes mixtes : de mur à sol ou de plafond à
mur (les plus courantes)
4.2. Les enceintes stériles
Classification des zones d’atmosphère
contrôlée
 Aux fins de la fabrication de médicaments
stériles,
quatre
classes
de
zones
d’atmosphère contrôlée sont définies par les
BPF et les BPP :
4.2. Les enceintes stériles
Classification des zones d’atmosphère
contrôlée
5.Contrôle de la stérilité
L’essai de stérilité
 L’essai est défini par la Pharmacopée
Européenne.
 L’échantillonnage prévu pour un lot de taille
supérieure à 500 unités est de 20 unités à
prélever. La probabilité de trouver une unité
non stérile sur un échantillon est relativement
faible.
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