travaux diriges de l`unite d`enseignement lv 303 « biochimie

UFR DES SCIENCES DU VIVANT
DIVISION DE BIOCHIMIE
ANNEE UNIVERSITAIRE 2013-2014
TRAVAUX DIRIGES
DE L’UNITE D’ENSEIGNEMENT LV 303
« BIOCHIMIE FONDAMENTALE »
LICENCE DE SCIENCES ET TECHNOLOGIES : MENTION SCIENCES DU VIVANT
TD 1-Protéines
2
TD 1-Protéines
TD 1 : PROTEINES
A- Etude structurale et fonctionnelle de la protéine MutS :
D’après Manelyte L et al , Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34(18), 5270–5279.
La protéine MutS est un facteur essentiel du système de réparation post-réplicatif des
mésappariements de l'ADN (MMR : Mutation Mismatch Repair, voir cours de LV203). MutS est
notamment impliquée dans la reconnaissance et la fixation des mésappariements conduisant alors
au recrutement d'autres facteurs tels que MutL et MutH.
In vivo et in vitro, il a été montré que le domaine C-terminal de MutS (CTD, résidus 801 à 853) joue
un rôle essentiel dans son oligomérisation et dans sa fonction lors d’une réparation.
Première partie : Alignement de séquences
La figure 1 représente un alignement de séquences et une prédiction de structure secondaire
de la région CTD de MutS provenant de 9 espèces bactériennes différentes.
Hélice -Boucle
-Hélice
Boucle
- Hélice - Boucle
- Hélice
Figure 1 : Alignement de séquences et prédiction de structure secondaire (S. II) de MutS chez plusieurs
espèces bactériennes. Les nombres entre parenthèses correspondent au nombre d'acides aminés
présents dans la zone définie par la séquence de référence. En fin de séquence le nombre entre
parenthèse est le nombre d'acides aminés total de la protéine.
Q1 a) Qu’est-ce qui définit la structure primaire d’une protéine ?
Q1 b) Quels sont les motifs de structure secondaire des protéines ?
Q2) Commentez les données présentées figure 1. Que pouvez-vous conclure quant aux structures
primaire et secondaire de la région CTD ?
3
TD 1-Protéines
Deuxième partie : Production de mutants de MutS
Dans le but d’analyser la structure et la fonction du domaine C-terminal de la protéine MutS,
différents variants portant une étiquette 6-Histidine ont été construits et exprimés :
- MutS-CTD : domaine C-terminal de MutS (résidus 801à 853),
- MutS-CTD ∆His6 : MutS-CTD délétée de son étiquette histidine,
- MutS- CTDD835R : MutS-CTD pour lequel le résidu D835 a été remplacé par R.
D’après leur séquence, les protéines MutS-CTD et MutS-CTDD835R ont une masse moléculaire calculée
de 7,7 kDa et MutS-CTD ∆His6 une masse moléculaire de 6,4 kDa.
Les protéines exprimées ont été purifiées à homogénéité par chromatographie d’affinité sur colonne
de nickel et par chromatographie d’exclusion moléculaire sur Sephadex G200. Les protéines purifiées
ont ensuite été déposées sur un gel SDS-PAGE en présence d’un agent réducteur (figure 2). Elles ont
été détectées après coloration au bleu de Coomassie.
Q3 a) Donnez le principe général d'une chromatographie d'affinité. Expliquer l'utilisation du nickel
dans l’expérience.
Q3 b) Donnez le principe de la chromatographie d’exclusion moléculaire (ou gel filtration).
Q3 c) Quelles autres chromatographies connaissez-vous ?
Q4 a) Quel est le rôle de l’agent réducteur utilisé en SDS-PAGE ? Citez-en un.
Q4 b) Quel est le principe de la coloration au bleu de Coomassie ? Quelle autre technique, plus
sensible, est utilisée pour colorer un gel de protéines ?
Figure 2 : Analyse des variants MutSCTD purifiés. Gel de polyacrylamide
SDS-PAGE coloré au bleu de
Coomassie. Les masses des marqueurs
protéiques (M) sont indiquées à gauche
de la figure.
Q5) Commentez brièvement les résultats du gel SDS-PAGE.
Troisième partie : Etude structurale de MutS
Des spectres de dichroïsme circulaire ont été obtenus pour les 3 variants de MutS. Le spectre de
MutS-CTD est donné (figure 3). Les deux autres mutants présentent un spectre superposable.
4
TD 1-Protéines
Figure 3 : Spectre de dichroïsme
circulaire obtenu pour MutS-CTD.
Q6 a) Quelle information structurale est apportée par un spectre de dichroïsme circulaire ?
Q6 b) Quelle est la structure majoritaire des trois variants de MutS ? Est-ce en accord avec les
données de la figure 1 ?
Quatrième partie : Statut oligomérique de MutS
Les masses moléculaires des différents variants de MutS-CTD ont été estimées par sédimentation à
l’équilibre (à des concentrations de 20 µM). On obtient les valeurs suivantes :
- 29800 +/- 410 Da pour MutS-CTD,
- 25300 +/- 380 Da pour MutS-CTD ∆His 6,
- 16500+ /- 370 Da pour MutS-CTDD835R.
Q7 a) Donnez le principe de la sédimentation à l'équilibre.
Q7 b) Quel est le statut oligomérique des trois variants de MutS-CTD ?
Q8) Quel est l’intérêt d’étudier le variant MutS CTD ∆His 6 dans ces expériences ?
Une chromatographie d’exclusion moléculaire (Superdex G-200) a été réalisée avec différentes
concentrations de MutS-CTD et MutS-CTDD835R (figure 4).
MutS, µM
Figure 4 : Analyse par chromatographie d’exclusion moléculaire des variants MutS-CTD. : MutS-CTD
(O) et MutS-CTDD835R (∆). Dans le graphique, le volume d’élution (en mL) de la protéine est reporté en
fonction de la concentration protéique au moment du dépôt. Les lignes pointillées indiquent les
volumes d’élution des formes de 16500 Da et 29800 Da respectivement sur la base des analyses des
résultats de sédimentation à l’équilibre.
Q9) Pourquoi différentes concentrations des variants MutS-CTD ont-elles été testées en
chromatographie d’exclusion moléculaire ?
5
TD 1-Protéines
Q10) Quelle information supplémentaire apporte cette expérience ?
Q11 a) Quel est l’effet d’une mutation D --> R ?
Q11 b) Quelle hypothèse peut-on faire sur le rôle du résidu 835 de MutS ?
Cinquième partie : Etude fonctionnelle de MutS
On étudie la fonction de la protéine entière MutS et de son variant MutSD835R. Ces deux protéines se
comportent de la même manière que MutS-CTD et MutS-CTDD835R respectivement en
chromatographie d’exclusion moléculaire.
On étudie la liaison de ces deux protéines sur un fragment d’ADN de 42 pb comportant un
mésappariement G/T (figure 5).
Figure 5 : Liaison des protéines MutS
() et MutSD385R () à un fragment
d’ADN de 42pb comportant un
mésappariement G/T.
MutS-D835R
Q12) Que pouvez-vous conclure ?
Q13) Donnez une estimation des constantes de dissociation du complexe MutS/ADN.
On étudie in vivo l’activité de différents variants de MutS (tableau 1) en mesurant la fréquence de
mutation d’un gène dans des cellules ne possédant pas le gène mutS et transfectées par des
plasmides portant le gène indiqué dans le tableau.
La protéine MutS800 correspond à MutS amputée de sa partie C-terminale (résidus 1 à 800). Elle se
comporte comme MutSD385R en chromatographie d’exclusion.
Q14) Que pouvez-vous dire sur le statut oligomérique de la protéine MutS800 ?
Tableau 1 : Activité MMR in vivo des variants de MutS
Variant
Vecteur seul
MutS
MutSD835R
MutS800
MutS-CTD
Activité in vivo
Fréquence de mutation (*109)
172
1,1
7,0
7,5
167
Q15) Que signifie la valeur « 172 » pour le vecteur seul ? Comment évoluera cette fréquence de
mutation d’un gène pour des cellules capables de réparation ?
Q16) Analysez les résultats du tableau 1.
Q17) Que pouvez-vous conclure de l’ensemble de ces expériences sur le rôle du domaine C-terminal
de la protéine et du résidu D835 en particulier dans la formation de la structure quaternaire et dans
la fonction de MutS ?
6
TD 1-Protéines
B- QCM Protéine
Les réponses doivent être présentées en cochant la (les) case(s) qui vous semble(nt) correcte(s).
1° Dans un gel de polyacrylamide-SDS :
□A : Les grandes protéines migrent plus loin que les petites
□B : Les petites protéines migrent plus loin que les grandes
□C : Toutes les protéines migrent vers l'électrode négative
□D : Le SDS confère une charge positive à toutes les protéines
2° Quelles sont les caractéristiques que partagent les hélices-α et les feuillets-β ?
□A : Les 2 ont les mêmes angles de liaisons φ et ψ
□B : Les 2 utilisent un grand nombre de liaisons hydrogène
□C : Les 2 ont des liaisons hydrogènes parallèles à la direction de la chaîne principale
□D : Les 2 contribuent à la structure des protéines intégrales de membrane
3° Quels aminoacides trouve-t-on fréquemment dans les tournants- β (β -turns) ?
□A : Glutamate et aspartate
□B : Tryptophane et thréonine
□C : Sitrulline et homosérine
□D : Proline et glycine
4° De ces 4 propositions, laquelle rend le mieux compte de l’empaquetage étroit qui caractérise le
cœur de la plupart des protéines globulaires ?
□A : Des ponts disulfure
□B : Des liaisons hydrogène
□C : Des interactions électrostatiques
□D : Des forces de van der Waals
5° Soit le tripeptide Gly-Asp-Gly. Quelle est sa charge nette (approximative) à pH 7.0 ?
□A : 0
□B : + 1
□C : - 1
□D : + 0,5
6° Le cœur d’une protéine contient une valine sous forme sauvage. Deux formes mutées de cette
protéine sont étudiées, dans lesquelles la valine est remplacée par une leucine ou par une
thréonine. On mesure les Tm de dénaturation thermique de la protéine sauvage et des 2 formes
mutées de cette protéine. Ces Tm croissent dans l’ordre suivant : TmLeu < TmVal < TmThr. Laquelle
(ou lesquelles) de ces propositions est (sont) correcte(s) ?
□A : La leucine, plus encombrante que la valine, déstabilise la forme mutante par rapport à la forme
sauvage
□B : La leucine, moins encombrante que la valine, déstabilise la forme mutante par rapport à la
forme sauvage
□C : La thréonine stabilise la forme mutante par rapport à la forme sauvage, grâce à la formation de
liaisons hydrogène supplémentaires
□D : La thréonine stabilise la forme mutante par rapport à la forme sauvage, grâce à la formation de
ponts salins supplémentaires
7° Les chaînes latérales des aminoacides constitutifs d'une hélice- α :
□A : pointent vers l'extérieur de l'hélice
□B : pointent vers l'intérieur de l'hélice
□C : alternent entre l'intérieur et l'extérieur de l'hélice
□D : se disposent au hasard entre l'intérieur et l'extérieur de l'hélice
8° Si on connaît tous les angles φ et ψ d’une protéine, on peut alors déterminer :
□A : sa structure secondaire complète
□B : sa structure tertiaire complète
□C : sa structure quaternaire complète
□D : ses structures secondaires et tertiaires complètes
7
TD 1-Protéines
9° : Un mélange contenant de l'acide aspartique, de l'arginine et de la glutamine est déposé sur une
colonne échangeuse d'anions équilibrée à pH 13. Pour l'élution on applique un gradient de pH de 13
à 5. Parmi les affirmations suivantes laquelle (lesquelles) est (sont) correcte(s) ?
□A : Seule la glutamine est éluée
□B : Seuls l'acide aspartique et l'arginine sont élués
□C : La colonne est chargée négativement
□D : Tous ces aminoacides sont initialement fixés sur la colonne
10° Un tonneau-β est constitué par la superstructure secondaire suivante :
□A : Un motif hélice α-tour-hélice α
□B : Un motif feuillet β –hélice α-feuillet β
□C : Une succession de feuillets β uniquement □D : Aucune des structures qui précèdent
11° VRAI ou FAUX ?
A : La méthionine forme des ponts disulfure dans les protéines
B : La glycine est optiquement active
C : La tyrosine possède un caractère à la fois polaire et apolaire
D : Le tryptophane absorbe la lumière UV
□Vrai
□Vrai
□Vrai
□Vrai
□Faux
□Faux
□Faux
□Faux
12° Cocher la (les) proposition(s) correcte(s) concernant une protéine homodimèrique de 60 kDa (A)
de pHi = 8 et une protéine monomérique de 45 kDa (B) de pHi = 6
□A : sur une colonne filtration sur gel, la protéine 45 kDa sort après la protéine 60 kDa
□B : en présence de SDS on obtient 2 bandes pour la protéine 60 kDa en électrophorèse sur gel de
polyacrylamide (PAGE)
□C : les techniques SDS-PAGE et la filtration sur gel permettent de déterminer la masse moléculaire
des protéines natives
□D : Ces techniques permettent de calculer avec certitude le nombre de sous unité de chaque
complexe
□E : en électrophorèse à pH 7, A migre vers la cathode et B migre vers l'anode
13° Si le polypeptide ala-ser-val-asp-glu-leu-gly est replié en hélice-α, quel aminoacide est lié à
l'alanine par une liaison hydrogène ?
□A : Val
□B : Asp
□C : Glu
□D : Leu
14° Si l'on connaît la constante de dissociation (KD) de l'équilibre entre une protéine (P) et son
ligand (L), il est possible de calculer :
□A : La constante d'association (KA)
□B : Le ΔG0 de la réaction
□C : La concentration de ligand qui provoque l'occupation de la moitié de la protéine
□D : La valeur du rapport [P][L]/[PL]
15° La libre rotation de la liaison peptidique est restreinte en premier lieu par :
□A : Les liaisons hydrogène que forment les groupes amide
□B : Le caractère de double liaison partielle de la liaison N-Cα
□C : Le caractère de double liaison partielle de la liaison amide
□D : L'encombrement stérique des chaînes latérales
16° Le(s)quel(s) de ces aminoacides possède(nt) une chaîne latérale pouvant être la cible de
kinase(s) ?
□A : Sérine
□B : Valine
□C : Tyrosine
□D : Thréonine
17° En vous aidant du diagramme ci-contre, indiquez la(les)quelle(s) des séquences
de 7 aminoacides suivantes pourrai(en)t former 2 tours d'une hélice α
amphipathique ?
□A : Phe-Val-Lys-Asp-Leu-Trp-Arg
□B : Phe-Leu-Val-Trp-Lys-Arg-Asp
□C : Lys-Asp-Leu-Trp-Arg-Phe-Val
□D : Phe-Lys-Arg-Asp-Leu-Val-Trp
3
7
6
4
2
1
5
8
TD 2-Enzymologie I
TD 2 ENZYMOLOGIE I
A- Rappels et mise à jour des connaissances de L2 et des
premiers cours de L3
(Il s'agit de pré-requis, vous devez préparer cette partie avant de venir en TD !)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
Qu'est ce qu'un catalyseur ?
Qu'appelle-t-on vitesse initiale pour une réaction catalysée par une enzyme?
Définir l'état stationnaire
Ecrire le schéma du modèle proposé en 1913 par L. Michaelis et M.L Menten.
Définir la constante de dissociation du complexe ES.
Définir la constante d'association du complexe ES.
Etablir l'équation de Michaelis-Menten.
La valeur de la constante KM de l'enzyme dépend-elle
a. la concentration de l'enzyme?
b. la concentration en substrat?
c. du pH?
d. de la température? (cf. figure ci- dessous)
e. de la force ionique?
Plot. of log Km against 1/T for the lactate
deshydrogenase systeme, for the forward
and reverse reaction. From.U. Boramann.
T .W., Mooo and K.J Laldler Biochemistry
(1974) vol 13 p. 5152
9) De quels paramètres dépend la vitesse de la réaction lorsque l'enzyme n'est pas saturée par le
substrat ?
10) Quelles sont les conditions expérimentales qui permettent de mesurer le VMAX ?
11) Le temps pendant lequel une réaction enzymatique reste en vitesse initiale dépend des
paramètres VMAX et Km, il est donc variable pour chaque enzyme. Une hydrolase, à une concentration
donnée, a un VMAX = 2,63.10-5 M.min-l et un Km = 30 µM. En admettant que l'on mesure la vitesse
initiale tant que [S] ne diminue pas de plus de 10%, pour [So] = 30 µM pendant combien de temps la
courbe de disparition du substrat en fonction du temps restera -t-elle linéaire?
12) Comment varie la vitesse initiale d'une réaction avec la concentration d'enzyme?
On mesure expérimentalement l'activité de la kanamycine acétyl transférase qui catalyse le
transfert du groupement acétyl à partir de l'acétyl-CoA sur l'antibiotique aminoglycosidique dans les
conditions suivantes : AcCoA 30 µM, kanamycine 10 µM, milieu tamponné à pH 7, 1 µl d'un extrait
9
TD 2-Enzymologie I
cellulaire dilué au 1/10. Dans ces conditions, après 10 min, la réaction est toujours en vitesse initiale.
On étudie ensuite la variation de ΔP / 10 min en fonction de la concentration d'enzyme et on trace la
courbe ci-après.
Comment expliquer le plateau obtenu pour E > à 80 µL ? Le choix d'une incubation de 10min pour
mesurer une vitesse initiale pour cette expérience vous semble-t-il correcte ?
10
TD 2-Enzymologie I
B-Protéase du VIH
nd
(d'après examen 2 session LC363 2013)
(D'après J. Med. Chem. 2013, 56, 1074−1083)
La protéase de HIV est une enzyme homodimérique qui
clive ses substrats à l'aide de 2 aspartates situés en
position25 sur chacune des chaînes (Asp25 et Asp25'). L'un
des 2 aspartates active une molécule d'eau qui attaque la
liaison peptidique à hydrolyser, et l'autre assiste l'ouverture
de cette liaison peptidique.
Le pH affecte la catalyse de la réaction selon la courbe de la
Figure 1 (unités arbitraires en ordonnée).
Q1° Quelles données quantitatives peut‐on tirer de cette
figure ? Q2° Aidez‐vous de cette figure pour préciser le
rôle joué par chacun des aspartates dans la catalyse en
vous appuyant sur votre réponse à la Q1°. Justifiez vos
arguments à l'aide d'un schéma.
On étudie l'inhibition de cette protéase par un composé appelé Inhibiteur‐1.
La Figure 2 représente le complexe
protéase-inhibiteur-1 étudié, la position
des 2 Asp catalytiques, ainsi que celle
des Ile50 et 50'.
Lorsqu'on étudie l'activité de la
protéase sur l'un de ses substrats (S) en
absence
ou
en
présence
de
l'inhibiteur‐1, on obtient les résultats
de la Figure 3.
Q3° Que concluez‐vous de cette
figure ?
On compare l'activité de la protéase sauvage de HIV (qu'on appelle
PRwt) à celle de l'un de ses mutants (qu'on appelle PRI50V) pour
lequel les isoleucines 50et 50'ont été remplacées par des valines sur
chaque chaîne.
On obtient les résultats du tableau ci‐dessous, où différents
paramètres de l'enzyme ont été mesurés vis‐à‐vis de S, en absence
ou en présence de l'inhibiteur1.
Tableau
Protéase
PRWT
PRI50V
kcat (min -1)
190±20
68±5
Km (mM)
30±5
109±8
KI (nM)
0,5±0,06
30,9±0,6
Q4° Comparez les valeurs des constantes de spécificité (efficacité) des enzymes sauvage et mutée
vis‐à‐vis de S, ainsi que la sensibilité à l'inhibition de l'enzyme sauvage et de l'enzyme mutée. Vous
expliquerez les différences d'efficacités catalytiques des enzymes sauvage et mutée, ainsi que leurs
sensibilités respectives à l'inhibition en vous basant sur les figures 1 à 3.
11
TD 2-Enzymologie I
C- Neuraminase
nde
(D'après examen 2
session 2012/2013)
Un virus pris en grippe
(d’après Du J. et al. Drug Discov. Today, 2012, 17, 1111-1120
et Russell RJ et al. Nature, 2006, 243, 45-49)
La neuraminidase du virus de la grippe (enzyme localisée à la surface des virus) est
essentielle dans le cycle infectieux puisqu’elle permet le relargage et la pénétration des
particules virales néosynthétisées dans les cellules du tractus respiratoire. Ceci en fait
une des cibles thérapeutiques privilégiées dans le traitement curatif contre les souches
classiques du virus de la grippe et également celles récemment apparues comme H5N1
(grippe aviaire) potentiellement très virulente chez l’homme.
La neuraminidase est une enzyme Michaelienne et hydrolyse les résidus d’acide sialique
(Neu5Ac) contenus dans les glycoprotéines de surface de la cellule hôte. (fig 1)
Site d’hydrolyse par la
neuraminidase
Figure 1
Neu5Ac
1 Etude de l’activité catalytique de la neuraminidase du virus de la grippe.
Un premier substrat fluorescent nommé Ac4 et composé de 4 résidus d’acide sialique a
été testé en utilisant une neuraminidase recombinante purifiée à homogénéité à la
concentration de 0,1 µmol.L-1. Le résultat est obtenu à la figure 2.
Un second substrat nommé Ac2 et comportant 2 résidus d’acide sialique a été testé dans
les mêmes conditions que précédemment et donne les résultats reportés à la figure 3.
Figure 2
Figure 3
Q1 : Quelle est le nom de la représentation observée à la figure 2 ? Donnez, sans la
démontrer, l’équation de la droite représentée à la figure 2.
Q2 : Quelle est le nom de la représentation observée à la figure 3 ? Donnez, sans la
démontrer, l’équation de la droite représentée à la figure 3.
Q3 : A partir des figures 2 et 3, donnez la Vmax et la KM pour chacun des substrats Ac4 et
Ac2.
12
TD 2-Enzymologie I
Q4 : Donnez la constante catalytique (kcat) obtenue avec chaque substrat en détaillant
vos calculs.
Q5 : Calculez l’efficacité catalytique (kcat/KM) de l’enzyme pour chaque substrat et dites
quel est le meilleur substrat.
Q6 : Pour lequel des deux substrat est-on proche de la perfection catalytique? (Justifiez)
2 Conception d’inhibiteurs ciblant la neuraminidase.
Afin d’empêcher le cycle viral, des inhibiteurs ont été conçus et sont actuellement
utilisés dans le traitement de la grippe, notamment l’oseltamivir (ou Tamiflu®). Une
étude de l’inhibition de l’activité de la neuraminidase a été menée en utilisant le
Tamiflu® (figure 4) et un autre inhibiteur récemment conçu et nommé I1 (figure 5). Pour
cette étude, les conditions expérimentales sont les mêmes que celles évoquées au
paragraphe 1 précédent et le substrat Ac2 a été utilisé.
Avec Tamiflu
[Ac2]
croissantes
Sans Tamiflu
-5.10
5
-10-4
5
5.10
10-4
2.10-4
Figure 5
Figure 4
Q7 : Dites, en le justifiant, quel est le type d’inhibition exercée par le Tamiflu®. En
déduire les valeurs de V’max et K’M
Q8 : Ecrire la relation permettant d’exprimer K’M en fonction de KM, [I] (la concentration
de Tamiflu) et Ki (la constante d’inhibition du Tamiflu).
Q9 : Sachant que sur la figure 4, la droite notée "Avec Tamiflu" a été obtenue en utilisant
une concentration de Tamiflu® égale à 10-9 M, calculez la constante d’inhibition Ki du
Tamiflu®.
Q10 : Quelle est le nom de la représentation observée à la figure 5 ? Dites en le justifiant,
quel est le type d’inhibition exercée par I1.
Q11 : Quelle est la valeur de la constante d’inhibition Ki de l’inhibiteur I1 ?
Q12 : Quel est, entre le Tamiflu® et I1, l’inhibiteur qui a la meilleure affinité pour la
neuraminidase ? (Justifiez).
13
TD 2-Enzymologie I
3 Apparition de virus résistants
Le virus de la grippe pouvant muter rapidement, certaines souches ont émergés
naturellement et sont devenues résistantes aux molécules thérapeutiques disponibles
actuellement. Ainsi deux mutants ponctuels de la neuraminidase ont été isolés : le
mutant H274W et le mutant R292E (on rappelle que dans une telle notation, la première lettre
correspond à l’acide aminé présent dans la protéine sauvage, le nombre correspond à la position de
l’acide aminé dans la séquence et la dernière lettre correspond à l’acide aminé retrouvé dans la
protéine mutée). L’effet inhibiteur du Tamiflu a été étudié sur ces deux mutants dans les
conditions de la figure 4. Nous obtenons la même droite notée "Avec Tamiflu" (cf. fig 4)
pour ces deux mutants mais en ayant utilisé 10-5 M de Tamiflu® pour le mutant H274W
et 10-3 M de Tamiflu® pour le mutant R292E.
Q13 : Calculez les constantes d’inhibition Ki du Tamiflu® pour les mutants H274W et
R292E. Lequel des deux mutants est-il le plus résistant à l’action du Tamiflu® ?
La structure du site actif de la neuraminidase sauvage cristallisée en présence de
Tamiflu® est représentée à la figure 6 où les pointillés schématisent une interaction
électrostatique. La figure 7 représente la molécule de Tamiflu®.
152
151
119
-
371
Figure 7
274
292
Figure 6
Q14 : Identifiez les acides aminés aux positions 151 et 152 sachant que leurs chaînes
latérales possèdent toutes deux un pK acide.
Q15 : Identifiez l’acide aminé à la position 371 sachant que sa chaîne latérale possède un
pK basique et celui à la position 274 dont la chaîne latérale possède un pK proche de la
neutralité.
Q16 : En vous aidant des figures 6 et 7, expliquez pourquoi le mutant R292E est devenu
résistant au Tamiflu®.
Q17 : Même question que précédemment concernant le mutant H274W.
14
TD 3-Métabolisme I
TD 3 Métabolisme I
Problème I : Régulation du métabolisme du carbone chez les trypanosomes (sujet élaboré
à partir de l’examen de métabolisme proposé par Pierre Sarthou en licence de Biochimie en juin 2001).
Les trypanosomes sont des parasites eucaryotes dont le cycle de développement passe par des stades
impliquant des insectes vecteurs et des vertébrés hôtes. Lors de ce cycle, les parasites adaptent leur
métabolisme énergétique à la disponibilité de leurs substrats. Le glucose est la source d'énergie majeure à tous
ces stades, mais la glycolyse est compartimentée de façon particulière chez ces organismes : elle se déroule en
grande partie au sein d'organelles spécialisées, appelées glycosomes, qui échangent un nombre limité de
substrats et de produits avec le reste de la cellule (cytoplasme et mitochondries). En particulier, il n'existe pas
+
de transporteurs pour l'ATP, l'ADP, le NAD et le NADH entre les glycosomes et le reste de la cellule. Ce
problème va vous permettre de préciser le rôle des glycosomes dans les diverses conditions de développement
de ces parasites.
I.1. Stade I : Métabolisme énergétique du trypanosome au stade de développement dans le sang du
vertébré hôte.
a. A ce stade, les mitochondries du trypanosome n'ont ni cycle de Krebs, ni chaîne respiratoire classique,
ni ATP synthase fonctionnels. Leur glycérol 3-phosphate déshydrogénase (flavoprotéine membranaire qui
transforme le glycérol-3-P en dihydroxyacétone-P) est par contre fonctionnelle. Lors de la réaction catalysée
par cette enzyme, les électrons sont transférés au coenzyme Q qui est lui-même réoxydé grâce à une oxydase
qui peut être inhibée spécifiquement par un composé appelé SHAM. L’oxygène moléculaire est finalement
l’accepteur final des électrons.
Compte-tenu de toutes ces informations, proposez un schéma qui montre comment les électrons sont
transportés du glycérol-3-P à l'oxygène. Quelle est la stœchiométrie de la réaction globale ?
b. Dans des conditions aérobies, on constate (1) qu'une mole de glucose est métabolisée en deux moles
d'acide 3-phosphoglycérique (3PG) dans les glycosomes, et (2) que le 3PG est exporté dans le cytoplasme où il
est transformé en pyruvate grâce aux trois dernières étapes de la glycolyse. Le pyruvate est finalement excrété
par le trypanosome. Quel est le bilan en ADP/ATP dans les glycosomes et dans le cytoplasme ?
c. Sachant que la membrane des glycosomes contient un échangeur glycérol-3-P/dihydroxyacétone-P,
+
+
quel est le bilan NAD /NADH,H dans les glycosomes ?
d. Si on ajoute le SHAM, la consommation d'oxygène cesse, et on constate qu'une mole de glucose est
transformée dans les glycosomes en une mole de 3-PG et une mole de glycérol, grâce à l'action de la glycérol
kinase glycosomiale. Ces 2 produits sont ensuite exportés dans le cytoplasme, où le 3-PG est métabolisé en
pyruvate qui est finalement sécrété avec le glycérol par le parasite. Pourquoi l'addition de SHAM induit-elle la
formation du glycérol ?
e. Quel est alors le bilan en ADP/ATP dans les glycosomes et dans le cytosol ? Ce bilan aurait-il été
différent si le glycérol avait été produit dans les glycosomes grâce à une phosphatase au lieu d'une glycérol
kinase ?
I.2. Stade II : Métabolisme énergétique du trypanosome au stade de développement chez l'insecte
vecteur.
A ce stade, le métabolisme énergétique du parasite change considérablement :
• la pyruvate kinase cytosolique est inactive.
• l'échangeur glycérol-3-P/dihydroxyacétone-P de la membrane des glycosomes n'est pas fonctionnel.
• le cycle de Krebs, la chaîne respiratoire classique et l'ATP synthase mitochondriale sont fonctionnels.
15
TD 3-Métabolisme I
Dans ces conditions, on constate qu'une mole de glucose est métabolisée dans les glycosomes en deux
moles d'acide 1,3-bisphosphoglycérique (1,3 BPG), qui sont ensuite transformées en deux moles de pyruvate
selon le schéma suivant :
(1)
glucose
2 (1,3BPG)
2 (1,3BPG)
2 (3PG)
(2)
(4)
2 (OAA)
(5)
(3)
2 (PEP)
2 (PEP)
2 (2PG)
(6)
2 (MAL)
2 (MAL)
2 (PYR)
Glycosome
Cytoplasme
Enzymes impliquées : (1) phosphoglycérate kinase, (2) phosphoglycéromutase, (3) énolase, (4) PEP carboxykinase, (5)
malate déshydrogénase, (6) enzyme malique. - Abréviations : 3PG : 3-phosphoglycérate, 2 PG : 2-phosphoglycérate, PEP :
phosphoénolpyruvate, OAA : oxaloacétate, MAL : malate, PYR : pyruvate. - Rappel : la PEP carboxykinase (4) est associée
"classiquement" à la néoglucogenèse et l'enzyme malique (6) à la biosynthèse des acides gras.
a. Quel est le bilan en ADP/ATP dans les glycosomes et dans le cytosol ?
+
b. Comment les glycosomes équilibrent-t-ils leur bilan NAD /NADH dans ces conditions ?
c. A l'aide de ces indications, justifiez l'intérêt de ce trajet "compliqué" qui transforme le glucose en
pyruvate.
d. Le pyruvate ainsi produit dans le cytoplasme n'est pas excrété : il intègre la mitochondrie où il est
transformé en acétyl-CoA, qui est métabolisé comme suit :
• les deux tiers de l'acétyl-CoA sont transformés en acétate selon la réaction :
Acétyl-CoA + Succinate  Succinyl-CoA + Acétate
puis, l'acétate quitte ensuite la mitochondrie et est finalement excrété par le parasite.
• le tiers restant est dégradé en CO2 via le cycle de Krebs.
Sachant que la chaîne respiratoire classique et l'ATP synthase sont fonctionnelles (voir plus haut),
combien de moles d'ATP (ou de GTP) peut-on obtenir dans ces conditions à partir d'une mole de pyruvate ?
+
NB : Pour simplifier, on considérera que la réoxydation d'1 NADH,H permet la production de 3 ATP, et que
celle d'1 FADH2 permet la production de 2 ATP. On négligera la consommation d'énergie associée aux divers
échanges de métabolites entre le cytoplasme et les mitochondries.
e. Quel est le bilan en production d'ATP associée à la transformation de glucose en acétate et CO2 ? Le
bilan redox vous semble-t-il équilibré ?
f. Contrairement aux parasites au Stade I, les parasites au Stade II peuvent largement utiliser la proline
comme source énergétique. Sachant que la proline est métabolisée en trois étapes en glutamate, expliquez
cette différence.
16
TD 3-Métabolisme I
Problème II : Métabolisme des algues vertes (sujet élaboré à partir de l’examen de métabolisme
LV303 session de Janvier 2012).
On étudie les variations du métabolisme de certaines algues vertes, eucaryotes unicellulaires, en fonction
des conditions de culture.
II.1. La nuit, en présence d’oxygène exogène
Ces algues tirent l’essentiel de leur énergie de la dégradation de l’amidon en CO2. La première étape de
ce processus consiste en une phosphorolyse de l’amidon en glucose-1-phosphate.
a. Citer les voies métaboliques impliquées dans l'oxydation complète du glucose-1-phosphate.
b. Combien de moles d'ATP peut-on produire par mole de glucose-1-phosphate ainsi oxydé ? Justifiez
rigoureusement votre réponse en 3 à 5 lignes maximum.
II.2. La nuit, en absence d’oxygène exogène
Ces algues dégradent l'amidon en glucose-1-phosphate, puis en pyruvate (via la glycolyse), pour produire
essentiellement du formate (H-COO ), de l'acétate (CH3-COO ) et de l'éthanol (CH3-CH2OH), dans un rapport
molaire 2:1:1.
Elles utilisent en particulier les réactions suivantes :
Pyruvate + CoA-SH  Acétyl-CoA + formate
+
+
Acétyl-CoA + NADH, H  Acétaldéhyde + NAD + CoA-SH
Acétaldéhyde  Ethanol
Acétyl-CoA + Pi  Acétyl-phosphate + CoA-SH
Acétyl-phosphate + ADP  Acétate + ATP
a. Compléter la réaction suivante (type de réaction, coenzymes ou co-substrats impliqués)
Acétaldéhyde  Ethanol
b. Pourquoi ces algues sont-elles capables de pousser en absence d’oxygène ?
c. Combien de moles d'ATP peut-on produire à partir d'une mole de glucose-1-phosphate dans ces
conditions ? Le bilan en électrons est-il équilibré ? Justifiez rigoureusement vos réponses sous forme d'une
suite concise et précise de réactions métaboliques.
d. Comparez ce bilan énergétique à celui de la fermentation alcoolique.
17
TD 4-Enzymologie II
TD 4 Enzymologie II
QCM Enzymologie
(vous devez préparer cette partie avant de venir en TD !)
1° Indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) concernant les mécanismes de catalyse enzymatique :
□ A : des interactions électrostatiques entre enzyme et substrat peuvent intervenir
□ B : un échange de protons peut s’établir entre le substrat et certains des résidus de l’enzyme
□ C : un changement conformationnel peut favoriser la fixation du substrat ou la catalyse elle-même
□ D : ces mécanismes de catalyse entraînent une augmentation de l’énergie d’activation par baisse de l’énergie
de liaison
□ E : ils modifient à la fois la vitesse et l’équilibre de la réaction chimique
2° Quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) fausse(s) concernant les enzymes ?
□ A : elles accroissent les vitesses aller et retour des réactions équilibrées qu’elles catalysent
□ B : elles abaissent l’énergie d’activation des réactions qu’elles catalysent
□ C : elles peuvent déplacer les équilibres des substrats vers les produits
□ D : elles ne forment jamais de liaison covalente réversible avec leurs substrats
3° La vitesse initiale d'une réaction enzymatique E + S
proportionnelle à :
ES
E + P est directement
□ A : la concentration de S pour [S] >> Km
□ B : la concentration de S pour [S] << Km
□ C : la concentration de ES
4° Indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) concernant la constante de Michælis (Km) pour une enzyme
donnée :
□ A : elle est indépendante de la concentration d'enzyme
□ B : elle est directement proportionnelle à la constante de dissociation KS pour le substrat
□ C : c'est la concentration de substrat pour laquelle on est à Vmax/2
□ D : elle augmente en présence d'un inhibiteur incompétitif
5° Indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) concernant la vitesse d'une réaction enzymatique à l'équilibre:
□ A : elle est minimum
□ B : elle est nulle
□ C : elle est maximum
□ D : elle est fonction de la concentration en enzyme
□ E : elle est fonction de la concentration en substrat
6° La représentation de Woolf-Eadie-Hofstee, vi= f(vi/[S]), permet d’obtenir une droite dont les points
d’intersection avec les axes des abscisses et des ordonnées sont respectivement :
□ B : Vmax/Km et Vmax □ C : Km et Km/Vmax
□ D : -Km et 1/Vmax
□ A : -1/Km et 1/Vmax
7° Indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) concernant les inhibiteurs enzymatiques :
□ A : ils augmentent la Vmax lorsqu’ils sont non compétitifs
□ B : ils augmentent toujours la Km
□ C : ce sont des analogues structuraux du substrat lorsqu’ils sont compétitifs
□ D : ils peuvent participer au rétrocontrôle négatif des voies métaboliques
5
8° Pour une concentration de substrat égale à son Km, une enzyme de masse moléculaire 10 Da transforme
1 millimole de substrat par litre et par seconde. Sachant que sa constante catalytique kcat est de 200 sec-1,
quelle est la concentration de E ?
□ A : 1 mg. mL
-1
□ B : 10 mg mL
9° Soit la réaction :
devient k-1 ?
□ A : il ne change pas
A
k1
k-1
-1
-1
□ C : 0,1 mg mL □ D : 0,01 mg mL
B
-1
9
, on ajoute une enzyme qui augmente k1 par un facteur 10 . Que
□ B : il est multiplié par 10
9
18
□ C : il est divisé par 10
9
TD 4-Enzymologie II
10° Soient 3 inhibiteurs, compétitif (IC), non competitif (INC) et incompétitif (IIC), ayant le même KI pour une
enzyme E qui transforme un substrat en un produit. Si on travaille à saturation en substrat, comment
classerez-vous les 3 inhibiteurs par ordre d'efficacité décroissante ?
□ A : IC > INC et IIC
□ B : INC > IC et IIC
□ C : IIC > IC et INC
□ D : INC = IIC > IC
11° Une enzyme E utilise une lysine active sous forme protonée au site actif. Son pKA est de 10. Lorsque le pH
passe de 7 à 6, on constate un net ralentissement de l'activité enzymatique. Quelle(s) en est (sont) la (les)
explication(s) possible(s) :
□ A : la lysine se déprotone plus facilement, ce qui inactive E
□ B : E change de conformation
□ C : le substrat de E se déprotone et n'est plus reconnu par E
□ D : le substrat de E se protone et n'est plus reconnu par E
k1
E + S
12° Selon le modèle ci-contre,
la vitesse de disparition du complexe ES s'exprime comme suit :
k
ES
k2
E + P
-1
□ B : k-1 [ES] + k2 [ES]
□ D : k-1 [ES]
□ A : k1 ([Et] - [ES])[S]
□ C : k2 [ES]
13° En 5 minutes, une enzyme E a transformé en produit 10% de son substrat S dont la concentration initiale
était égale à 1000 fois son Km. Combien de temps lui faudra-il pour transformer la même quantité de
substrat, si on utilise 5 fois moins de E et 5 fois plus de S ?
□ A : 5 min
□ C : 15 min
□ B : 10 min
□ D : 25 min
14° Un substrat S se fixe avec la même affinité sur une enzyme libre ou liée à un inhibiteur I réversible. La
fixation de I entraîne une diminution du kcat. Ces observations indiquent que :
□ A : I augmente le Km de E pour S
□ C : I est un inhibiteur non compétitif
□ B : I est un inhibiteur compétitif
□ D : I est un analogue structural de S
15° Selon le modèle de l'état stationnaire :
□ A : Km est toujours égal à KS (ou KD)
□ C : d[S]/dt = d[ES]/dt
□ B : d[P]/dt = d[ES]/dt
□ D : d[ES]/dt = 0 à l'état stationnaire
16° Une enzyme E est protégée contre la dénaturation thermique par une substance X. Ceci pourrait suggérer
que :
□ A : X est un substrat de E
□ C : X est un activateur de E
□ B : X est un produit de E
□ D : X est un inhibiteur de E
17° Soit une cinétique michaelienne représentée sur le
graphe ci-contre
.
Si A correspond à une expérience réalisée en absence
d'inhibiteur, alors :
□ A : B pourrait refléter une inhibition compétitive
□ B : C pourrait refléter une inhibition incompétitive
□ C : D pourrait refléter une inhibition incompétitive
□ D : B pourrait refléter une inhibition non-compétitive
□ E : C pourrait refléter une inhibition non compétitive
vi
B
C
A
D
19
vi/[S]
TD 4-Enzymologie II
B- Etude de l'Alcool déshydrogénase
L'alcool déshydrogénase (ADH) catalyse la réaction suivante :
1) Une étude cinétique de la réaction
d'oxydation de l'éthanol par l'ADH
donne les résultats de la Figure 1.
Q1° Quel est le mécanisme
possible (ordonné ou non, Ping-Pong)
de cette réaction ? Justifiez votre
réponse.
D'autres expériences montrent que l'ADH peut fixer le NAD+ ou le NADH seuls, mais pas l'éthanol ou
l'acétaldéhyde seuls.
Q2° Quelles précisions ces informations vous apportent-elles par rapport à la question
précédente ? Illustrez votre réponse par un schéma de Cleland.
2) L'ADH oxyde également le méthanol en formaldéhyde :
Lorsqu'on incube l'ADH avec du méthanol, du NAD+ en excès, et des
concentrations variées d'éthanol, on obtient les résultats de la Figure 2.
Q3° Que pouvez-vous conclure de cette figure ?
Le formaldéhyde est extrêmement toxique pour l'organisme. L'un des
traitements possibles de l'intoxication aiguë au méthanol consiste en
l'ingestion d'une grande quantité d'éthanol.
Q4° Quelle est l'explication probable de ce traitement d'urgence
? Quelle est la limite d'un tel traitement (hormis la toxicité de l'éthanol) ?
3) Un tel traitement n'est évidemment pas sans risque, et l'on tend à développer d'autres approches
basées sur la recherche d'inhibiteurs pharmacologiques de l'ADH. Ces inhibiteurs devraient non
seulement empêcher la production de formaldéhyde à partir du méthanol, mais ils pourraient également
permettre de diminuer les effets toxiques dus à l'importante production d'acétaldéhyde observée chez les
alcooliques chroniques.
…/…
Un inhibiteur de l'ADH a été synthétisé. Cette molécule est un formamide
(H-CONH-R) qui se fixe sur l'enzyme en tant qu'analogue structural de
l'acétaldéhyde. Lorsqu'on incube l'ADH avec du NADH, de l'acétaldéhyde
en excès, et des concentrations variées du formamide (FA), on obtient les
résultats de la Figure 3.
Q5° Quel type d'inhibition FA exerce-t-il, et quelle est l'équation
de Michaelis vi=f(S) associée à ce type d'inhibition ?
Q6° En vous référant au schéma de Cleland proposé à la Q2°,
identifiez l'espèce enzymatique sur laquelle se fixe le FA (enzyme libre,
complexe(s) binaire(s), complexe(s) ternaire(s)…?). Justifiez votre
réponse à l'aide d'un nouveau schéma de Cléland.
L'ADH est généralement saturée par le méthanol en cas d'intoxication aiguë.
Q7° Si l'on tient compte de cette précision (essentielle) et des modes d'action comparés du FA et
de l'éthanol sur l'ADH, quel avantage y aurait-t-il à utiliser le FA plutôt que l'éthanol en cas
d'intoxication aigue par le méthanol ?
20
TD 4-Enzymologie II
C- Inhibition par excès de substrat
Une enzyme E catalyse la formation d’un substrat S en un produit P selon le schéma :
E + S  ES  E + P, KM = [E][S]/[ES]
La cinétique de transformation de S en P est décrite par le graphique ci-dessous (représentation de
Lineweaver et Burk).
1. Analyse du graphique.
a. Quelle vitesse initiale correspond à 0,1 sur l’axe des ordonnées et quelle concentration
de [S0] correspond à 1 sur l’axe des abscisses ?
b. Indiquer sans calculs, jusqu’à quelle valeur de [S0] la cinétique de cette enzyme peut
être assimilée à une cinétique michaëlienne classique. Justifier votre réponse.
c. Que peut-on dire de l’effet du substrat sur la vitesse initiale de la réaction ?
2. Le comportement anormal de l’enzyme peut être expliqué par le fait que le complexe ES fixe une
seconde molécule de substrat S pour former un complexe inactif ES2 selon le schéma :
ES + S ES2,
KD = [ES][S]/[ES2]
a. Retrouver l’équation de Michaelis, vi = f([S0]), modifiée pour cette enzyme (conseil
:exprimer le rapport vi/Vmax et faire le bilan des différentes formes de l’enzyme présentes
dans le mélange réactionnel). En quoi l’équation trouvée explique-t-elle le comportement
de l’enzyme ?
b. Montrer que, quelles que soient les valeurs de KM et KD (différentes l’une de l’autre), la
vitesse initiale vi est la même lorsque [S0] = KD ou lorsque [S0] = KM.
c. Déterminer graphiquement KM, KD et VMAX en justifiant à chaque fois la réponse.
Eléments de réponse
Question 1
b. Une représentation en double inverse, si l’enzyme a un comportement michaelien, doit donner une droite.
c. On est dans un schéma d’inhibition
Questions 2
a. Tenir compte de toutes les formes possibles de l’enzyme.
b.et c. Chercher les points de la courbe ayant la même ordonnée.
21
TD 5-Métabolisme II
TD 5 METABOLISME II
Problème I : La biosynthèse du ribose (sujet élaboré à partir de l’examen de métabolisme proposé
par le Professeur C HOUNTONDJI en licence de Biologie, session de juin 1998).
I.1. Un chercheur veut réaliser, dans une souche d'Escherichia coli K12, la biosynthèse d'ARN radiomarqué
sur un ou plusieurs atomes de carbone du ribose.
La biosynthèse du ribose emprunte une voie particulière dans le métabolisme intermédiaire. Laquelle ?
I.2. La souche d'E. coli K12 est mise à pousser sur un milieu approprié contenant du glucose.
Indiquez, dans la structure du ribose, l'origine de chacun des atomes de carbone, en les étiquetant avec
les numéros des atomes de carbone du glucose de départ.
I.3. On veut réaliser la biosynthèse de ribose radiomarqué spécifiquement et uniquement sur le carbone
14
n°1. La souche d'E.coli K12 est mise à pousser sur un milieu approprié contenant du glucose marqué au [ C] sur
14
le carbone n°2 ([ C]C2-glucose), et le ribose présent dans les cellules a été analysé.
Le ribose peut-il être radiomarqué uniquement sur le carbone n°1 ?
-
I.4. On veut maintenant tester une souche d'E.coli dépourvue de l'enzyme transcétolase (souche TC dont
les deux gènes codant pour les transcétolases ont été délétés). La souche d'E. coli TC est mise à pousser en
14
14
présence de glucose marqué au [ C] sur le carbone n°2 ([ C]C2-glucose).
14
Quelle est la distribution du marquage [ C] sur les carbones du ribose ? Qu’apporte cette expérience, par
rapport aux conclusions de la question I.2. ?
Problème II : Catabolisme du glycogène (sujet élaboré à partir de l’examen de métabolisme proposé
par le Professeur P SARTHOU en licence de Biochimie, session de septembre 2001).
On étudie le catabolisme du glycogène chez des cyanobactéries. On rappelle que la glycogène
phosphorylase transforme le glycogène en glucose-1-phosphate.
II.1. Catabolisme du glycogène en conditions aérobies.
La phosphofructokinase (PFK) est inactive dans ces conditions, et le glycogène est oxydé en pyruvate par
la voie des pentoses-phosphates.
Combien de moles de CO2, d’ATP, de NADH et de NADPH peut-on produire lors de la transformation
d’une mole de Glucose-1-phosphate en une mole de pyruvate ? Justifiez votre réponse à l’aide d’un schéma.
NB : Certaines données utiles vous sont rappelées dans la figure ci-dessous.
Ribose-5-P
Sédoheptulose-7-P
Fructose-6-P
Xylulose-5-P
Glyceraldéhyde-3-P
Erythrose-4-P
Xylulose-5-P
22
Fructose-6-P
Glyceraldéhyde-3-P
TD 5-Métabolisme II
II.2. Catabolisme du glycogène en conditions anaérobies.
La PFK est active et la glycolyse fonctionnelle. Les bactéries n’utilisent pas la voie oxydative des
pentoses-phosphates, la pyruvate déshydrogénase (Pyruvate  Acétyl-CoA) et la pyruvate décarboxylase
(Pyruvate  CO2 + acétaldéhyde) sont inactives. On étudie le catabolisme anaérobie du glycogène en absence
0
ou en présence de soufre-élément (S ) :
0
• Expérience A (en absence de S ) : on constate qu’à partir d’une mole de glucose-1-phosphate, ces
bactéries produisent 1 mole d’éthanol, 1 mole d’acétate, 2 moles de CO2 et 2 moles de H2.
0
• Expérience B (en présence de S ) : on constate qu’à partir d’une mole glucose-1-phosphate, ces
bactéries produisent 0,3 mole d’éthanol, 1,7 moles d’acétate, 2 moles de CO2 et 3,4 moles de H2S.
NB : vous pourrez vous aider des données du Tableau 1 afin de répondre aux questions posées.
a. Justifiez précisément ces bilans à l’aide de schémas. Combien de moles d’ATP ces bactéries
produisent-elles dans chaque cas ?
+
+
b. Les bilans en NAD /NADH,H vous semblent-ils “logiques” et pourquoi ?
0
c. Quelle est la fonction (et l’utilité) du S pour ces bactéries ?
Tableau 1 : quelques réactions métaboliques utilisées par les cyanobactéries
Réactions
Substrats
Produits
+
+
1
Acétaldéhyde (CH3-CHO), NADH, H
2
Acétyl-CoA, NADH, H
3
Acétyl-CoA, Pi
Acétyl-phosphate, CoA
4
Acétyl-phosphate (CH3-COOP), ADP
Acétate, ATP
5
Formate (HCOOH)
H2, CO2
6
Pyruvate, CoA
Formate, Acétyl-CoA
7
S, H2
H2S
8
S, NADH, H
+
+
Ethanol (CH3-CH2OH), NAD
+
Acétaldéhyde, NAD , CoA
+
H2S, NAD
23
TD 6-Enzymologie III
TD6 Enzymologie III : Protéines allostériques
A- Modèle des transitions concertées
Changeux) et effecteurs allostériques.
(Monod, Wyman et
1) Un enzyme a pour substrat S et pour effecteurs F1, F2 et F3. Une étude cinétique donne les
résultats suivants :
1. Que peut-on déduire quant à la nature de l’enzyme et des divers effecteurs ?
2. Entre quelles limites peut varier la constante L0 d’une enzyme allostérique ?
3. La valeur du L0 de l’enzyme précédente sera-t-elle proche de l’une de ces limites ? Si oui, laquelle ?
2) L’étude cinétique d’un enzyme allostérique E a donné les résultats rapportés dans les figures 1 à 4.
Dans le cas des figures 2 3 et 4, [S] = 10-3 mol.L-1. Toutes ces expériences ont été réalisées avec la
même quantité d’enzyme et les vitesses sont exprimées en unités arbitraires.
4. Quels sont les rôles et les caractéristiques des effecteurs F1, F2 et F3 ?
5. Comparez les caractéristiques des deux formes de E vis-à-vis de S, F1, F2 et F3.
6. Calculez la constante L0 de cet enzyme.
24
TD 6-Enzymologie III
B. Hémoglobine
La liaison réversible ( P + L
PL ) d'un ligand L sur une protéine P peut être décrite avec une
bonne approximation par la relation empirique de Hill :
Y = [L]c/([KD]c + [L]c)
On définit:
Y = saturation de la protéine en ligand = fraction de sites occupés = ν/n ;
ν = [Llié]/[Po] = nombre moyen de molécules de ligand liées par molécule de protéine = nombre
moyen de sites occupés par molécule de protéine;
[Po] = concentration totale de protéine;
n = nombre total de sites de liaison de L sur P;
KD = constante microscopique de dissociation du complexe PL;
[L] = concentration de ligand libre.
1°) On dispose d'une solution d'hémoglobine humaine (6x10-5 M), équilibrée avec de l'oxygène (O2)
en milieu tamponné (pH 7,3 à 20°C). Par spectrophotométrie, on mesure la concentration molaire en
hémoglobine (Hb) d'une part, et les concentrations molaires d'oxygène lié sous la forme
d'oxyhémoglobine (HbOx) d'autre part, pour différentes pressions partielles de O2 (pO2) exprimées
en millimètre de mercure (mm de Hg).
On obtient les résultats suivants :
pO2 (mm de Hg)
[HbOx]/
[Hbtotale]
1.3
2.6
5.2
11.05
18.85
26
52
72.8
112
0.016
0.04
0.08
0.36
1.05
2
3.552
3.808
3.912
a) Quelle est la valeur du nombre total (n) de sites de liaison de O2 par molécule de Hb?
b) Quel est le mode de liaison de l'oxygène à l'hémoglobine?
c) A partir de la représentation de Hill, tracez la courbe log(Y/1-Y)=log(pO2) et calculez le nombre
de Hill c (encore appelé nH). Que représente-t-il?
Calculez le KD, la constante microscopique de dissociation (ici KD = P50 = la pression de O2 à 50%
de saturation de Hb).
2°) Si la protéine P qui se lie réversiblement au ligand L transporte la molécule L d'une région A de
forte concentration de L ([LA]) à une région B de faible concentration de L ([LB]), on définit la
quantité de ligand transporté par P en passant de la région A à la région B, comme la variation de la
saturation ΔY quand P passe de A à B: ΔY = YA - YB ;
avec YA = saturation à la région A
et YB = saturation à la région B.
a) En considérant que la P50 obtenue in vitro (en 1°) est la même dans l'organisme humain, calculez
la quantité relative (ΔY) de O2 libérée par une molécule de Hb quand elle passe des poumons au
muscle en activité.
On donne pO2 (poumons) = 100 mm de Hg, et pO2 (muscle en activité) = 20 mm de Hg.
b) Supposons que la liaison de O2 à Hb suive les lois de Michaelis, et que P50 (mesurée en 1°) reste
inchangée.
25
TD 6-Enzymologie III
Que serait ΔY pour un tel transporteur? Montrez la courbe théorique approximative qu'on aurait
obtenue dans ce cas sur chacune des représentations graphiques effectuées en 1°. Comparez les
valeurs de ΔY.
Quel avantage (ou désavantage) résulte du mode naturel de liaison de O2 à Hb?
3°) Supposons qu'il existe en circulation dans le sang un activateur de la liaison de O2 à Hb. En
supposant que cet activateur est en concentration saturante, et que la P50 en sa présence est
réduite d'un facteur 10 par rapport à la P50 obtenue en 1°), calculez la quantité relative (ΔY) de O2
libérée dans ces conditions par une molécule de Hb quand elle passe des poumons au muscle en
activité. On admettra que ces conditions impliquent aussi une absence totale d'inhibiteurs de la
liaison de O2 à Hb.
Montrez la courbe théorique approximative qu'on aurait obtenue dans ce cas sur chacune des
représentations graphiques effectuées en 1°. Comparez la valeur de ΔY à celles obtenues en 2°), et
proposez une explication à l'ensemble des résultats obtenus jusqu'ici.
Quelles seraient (en 2-3 lignes) les conséquences métaboliques?
4°) On étudie l'influence du 2,3-diphospho-glycérate (2,3-DPG) sur l'oxygénation de Hb (6x10-5M) au
cours d'une expérience identique à celle présentée en 1°).
On obtient les résultats suivants :
pO2 (mm de Hg)
13
16,25
20.8
26
32.5
40.95
[HbOx] [Hbtotale]
0.24
0.26
0.4
0.6
0.92
1.28
52
1.92
Analysez ces résultats. Quel peut être l'intérêt de la liaison du 2,3-DPG à Hb?
26
65
2.72
81.9
102.7
3.28
3.44
TD 6-Enzymologie III
C- La glucosamine-6-phosphate désaminase (Examen 1
ère
session 09/10)
La glucosamine-6-phosphate désaminase (E) catalyse la conversion réversible de la Dglucosamine-6-phosphate (GlcN6P) en D-fructose 6-phosphate (Fru6P) et ammoniaque (Figure 1) :
CH 2-O-P
O
OH
OH
E
P-O-CH 2
HO
OH
NH 3+
GlcN6P
HO
O
CH 2-OH
+
Fig. 1
OH
CH 2-O-P
NH4+
Fru6P
O
OH
OH
GlcNAc6P
OH
Fig. 2
NHCOCH 3
L'enzyme E, qui suit le modèle Monod-Wyman-Changeux (MWC), est un hexamère composé
de 6 sous-unités identiques, chacune ayant un site actif et un site allostérique distincts. Le principal
activateur allostérique de E est le N-acétyl-D-glucosamine-6-phosphate (GlcNAc6P, Figure 2). Les
substrats et le GlcNAc6P sont à fixation exclusive.
Problème :
Lorsqu'on porte les vitesses initiales de la réaction catalysée par E en
fonction des concentrations de GlcN6P, en absence ou en présence de
GlcNAc6P saturant, on obtient les résultats de la Figure 3.
Q1°. A quel système a-t-on affaire et pourquoi ? A quelles conditions
correspondent les courbes (a) et (b) et pourquoi ?
On étudie la cinétique de la réaction catalysée par E en présence de GlcNAc6P saturant et en
présence ou en absence de concentrations variables de A, un analogue structural du substrat GlcN6P
(Figure 5, u.a. = unités arbitraires).
Q2°. Pourquoi travaille-t-on en présence de GlcNAc6P
saturant ?
Q3°. A l'aide de la Fig. 5, caractérisez les effets de l'analogue A.
On étudie (A) la fixation de l'analogue A en présence ou en absence de GlcNAc6P saturant, et (B) la
fixation du GlcNAc6P en présence ou en absence de A saturant.
On obtient les résultats de la Figure 6 qui représente le nombre de moles de ligand lié par mole de
site, en fonction des concentrations des ligands utilisés.
27
TD 6-Enzymologie III
Q4. Expliquez grâce à cette figure les effets réciproques de ces 2 ligands de E. Ces observations
sont-elles compatibles avec vos précédentes conclusions ? Lequel de ces 2 ligands a le plus
d'affinité pour E et pourquoi ?
L'addition de GlcNAc6P, même en concentration saturante, n'affecte pas le spectre de dichroïsme
circulaire (DC) de E dans l'UV lointain (200-240 nm).
Q5. Quelles informations pouvez-vous déduire de cette observation ?
28
TD7-Métabolisme III
TD 7 Métabolisme III
Problème I : (sujet élaboré à partir de l’examen de métabolisme proposé par Eric Duplus à la première
session de Janvier 2008 de LV303)
Un excès de fructose dans l’alimentation entraîne une augmentation de la synthèse des triacylglycérols
(TAG) hépatiques à partir de glycérol 3-phosphate (G3-P) et d’acyl-coenzyme A (Acyl-CoA, acides gras activés).
La structure d’un TAG est représentée ci-dessous (R1, R2 et R3 correspondent à des chaînes aliphatiques) :
CH2-O-CO-R1
R2-CO-O-CH
CH2-O-CO-R3
Nous vous proposons d’étudier les différentes voies métaboliques qui conduisent à la production de G3-P
et d’acyl-CoA à partir du fructose.
I.1. Biosynthèse de glycérol-3P
Afin de faciliter la résolution de ce problème, on admettra que le fructose est exclusivement métabolisé
sous forme de Fructose-1P. Le Fructose-1-P est alors scindé en deux trioses selon une réaction catalysée par
une enzyme appelée aldolase B. Le mécanisme mis en jeu lors de cette réaction est similaire à celui impliqué
dans la scission du Fructose-1,6 bisP catalysée par l’aldolase A.
a. A l’aide de ces données, écrivez la suite des 5 réactions permettant d’obtenir, à partir d’une molécule
de fructose, deux molécules de Glycerol-3-P. Indications : entre autres enzymes, la triose phosphate isomérase
et une glycéraldéhyde kinase sont nécessaires à cette transformation. Vous préciserez, pour chaque réaction,
les coenzymes mis en jeu, les ATP produits ou utilisés ainsi que le type d’enzyme impliqué.
b. Ecrivez le bilan en carbones, énergie et électrons de cette transformation.
I.2. Biosynthèse d’acyl-CoA
Nous rappelons que la néosynthèse de triacylglycérol nécessite la formation d’acyl-CoA, de glycérol-3phosphate et de NADPH. L’incubation d’hépatocytes en présence de fructose, entraîne la production d’acétyl
CoA mitochondrial, de glycérol 3-phosphate, de NADPH et de CO2 selon un rapport molaire 4/1/6/7.
+
NB : du coenzyme A et du NAD sont consommés dans ce processus. Par la suite, on admettra que tout
l’acétyl-CoA produit est utilisé pour la synthèse des acides gras.
a. Compte-tenu de ces informations, quelles sont les grandes voies métaboliques impliquées dans la
transformation du fructose en acétyl-CoA ?
b. En tenant compte du rapport molaire mentionné ci-dessus, combien de moles de fructose sont
nécessaires pour produire 4 moles d’acétyl-CoA ? Justifiez votre réponse sur la base du nombre de carbones
mis en jeu.
c. Donnez la suite de réactions qui permet d’expliquer le bilan donné ci-dessus en précisant pour chacune
des réactions le nombre d’ATP et les coenzymes éventuellement impliqués. Vous préciserez également la
localisation subcellulaire des différentes étapes.
d. Ecrivez le bilan en carbones, énergie et électrons de la conversion du fructose en acétyl-CoA
mitochondrial en tenant compte des réactions précédentes.
e. Quelles sont les réactions qui permettent le passage de l’acétyl-CoA depuis la mitochondrie vers le
cytoplasme ?
f. Quelles sont les grandes étapes qui vont conduire à la biosynthèse des acyl-CoA à partir d’acétyl-CoA;
quelles sont les enzymes impliquées ?
29
TD7-Métabolisme III
Problème II : Métabolisme du muscle cardiaque (sujet élaboré à partir de l’examen de
métabolisme LV303 session 2 de Janvier 2011).
Parmi les différents substrats énergétiques des cellules du muscle cardiaque, l’acétoacétate est assimilé
par la réaction (1) suivante :
-
H3C-CO-CH2-COO + Succinyl-CoA
H3C-CO-CH2-CO~S-CoA + Succinate
(1)
II.1. Où et comment l’acétoacétate est-il produit ? Donnez la suite de réactions sans préciser les enzymes
ni détailler les formules.
II.2. L’acétoacétyl-CoA est alors métabolisé en acétyl-CoA qui, lui-même, entre dans le cycle de Krebs.
Ecrire la réaction de transformation de l’acétoacétyl-CoA, sans détailler les formules, et indiquez le type
d’enzyme impliqué.
II.3. Quelle est la conséquence de l’utilisation du succinyl-CoA dans la réaction (1) en ce qui concerne la
production de GTP lors de l’oxydation complète de l’acétoacétate en CO2 dans ces cellules ? Quel est alors le
+
bilan quantitatif précis de l’oxydation complète d’une mole d’acétoacétate en CO2, NADH, H , FADH2 et GTP
dans le muscle cardiaque. En déduire le nombre d’ATP produit par carbone oxydé à partir de l’acétoacétate.
II.4. La majorité des cellules de l’organisme utilise le glucose comme principal substrat énergétique.
Rappelez le bilan énergétique de l’oxydation complète du glucose lors de l’utilisation de la navette glycérol
phosphate. En déduire le nombre d’ATP produit par carbone oxydé. Comparez ce résultat à celui obtenu à la
question II.3 lors de l’oxydation de l’acétoacétate.
NB : Toute différence inférieure ou égale à 0,3 n’est pas considérée comme significative.
II.5. Quelles raisons font que l’acétoacétate a un métabolisme moins général que celui du glucose ?
30
TD8-Métabolisme IV
TD 8 Métabolisme IV
Problème I : Métabolisme hépatique du lactate, de l'alanine et de l'éthanol. (sujet élaboré à
partir de l’examen de métabolisme proposé par Pierre Sarthou à la première session de Janvier 2013 de LV303)
I.1. Des rats préalablement maintenus à l'état de jeûne pendant 24 heures, sont perfusés avec une solution
contenant soit du lactate soit de l'alanine comme seule source de carbone et d'énergie.
a. Compléter les 2 réactions ci-dessous et en déduire l'équation-bilan de l'entrée de l'alanine dans le
métabolisme hépatique, sachant que la réaction (1) est une transamination et que la réaction (2) est une
+
désamination oxydative ayant le NAD comme cofacteur :
(1)
Alanine + α-cétoglutarate  Composé W + Composé X
(2)
Composé X + Composé Y  α-cétoglutarate + NH4 + Composé Z + H
+
+
b. Sans donner les formules chimiques des intermédiaires, représenter par un schéma la suite de réactions de
métabolisation du lactate et de l'alanine en glucose au niveau du foie chez ces rats, permettant ainsi à l'ensemble
des voies du métabolisme du carbone d'avoir lieu. Vous mentionnerez précisément la localisation subcellulaire de
chacune de ces réactions.
NB : comparée à son homologue cytoplasmique, la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK)
mitochondriale a une activité négligeable dans les hépatocytes de ces rats. Vous n'en tiendrez donc pas compte
dans votre réponse.
c. Quelles sont les équations-bilans (bilan en atomes, bilan redox et bilan en énergie) de la métabolisation de
chacune de ces deux molécules en glucose ?
I.2. Après ingestion, l'éthanol (CH3-CH2-OH) est principalement métabolisé au niveau du foie en acétaldéhyde
lors d'une réaction inverse de la deuxième étape de la fermentation alcoolique. Puis, l'acétaldéhyde est à son tour
+
oxydé en acétate lors d'une réaction impliquant le NAD comme cofacteur. Une minorité de l'acétate est alors
importée dans les mitochondries hépatiques, alors que la majorité est libérée dans la circulation sanguine pour être
ultérieurement oxydée dans les tissus extra-hépatiques.
a. Etablir de manière détaillée les 2 réactions qui permettent la transformation d'une molécule d'éthanol en
une molécule d'acétate. En déduire l'équation-bilan de cette suite (bilan en atomes, bilan redox et bilan en
énergie).
b. La perfusion conjointe de lactate et d'éthanol à un autre lot de rats, également maintenus à l'état de jeûne
pendant 24 heures, entraîne l'apparition rapide d'une hypoglycémie. A votre avis, pour quelle raison (basée sur un
bilan redox cytoplasmique) l'addition d'éthanol en plus de celle du lactate provoque une hypoglycémie chez les rats
perfusés ?
c. Pensez-vous que le remplacement du lactate par de l'alanine lors de la perfusion avec l'éthanol permettrait
d'éviter l'apparition d'une hypoglycémie ? Justifiez votre réponse.
0
TD8-Métabolisme IV
Problème II : Le malate (sujet élaboré à partir de l’examen de métabolisme proposé par Pierre Sarthou à
la première session de Janvier 2011 de LV303)
II.1. Les cellules tumorales ont une activité réplicative intense, ce qui nécessite des propriétés métaboliques
particulières. Afin d’étudier le métabolisme de ces cellules, des mitochondries isolées de cellules tumorales sont
incubées dans un milieu complet contenant du glutamate comme seule source de carbone, d’azote et d’énergie.
Elles respirent activement et sécrètent de l’aspartate dans le milieu de culture. L’addition d’un inhibiteur de
transaminases bloque la respiration et l’exportation d’aspartate.
a. A partir de ces observations et à l’aide d’un schéma, donnez la suite de réactions permettant d’expliquer
l’utilisation du glutamate et la production d’aspartate. Vous préciserez pour chaque réaction, les enzymes et les
coenzymes impliqués, ainsi que les molécules d’ATP/GTP éventuellement produits ou consommés.
b. Pourquoi les mitochondries respirent-elles activement ?
II.2. Si on ajoute du malate au milieu précédent (contenant toujours du glutamate), les mitochondries
respirent activement, mais l’exportation d’aspartate est remplacée par celles du citrate et de l’alanine.
Sachant que ces mitochondries tumorales expriment l’enzyme malique, donnez la suite de réactions
permettant d’expliquer les effets du malate exogène observés ici, en vous aidant d’un schéma. Vous préciserez
pour ces réactions les enzymes et les coenzymes impliqués, ainsi que les molécules d’ATP/GTP éventuellement
produits ou consommés.
II.3. Alors que le glutamate est une excellente source de carbone, d’azote et d’énergie pour les cellules
tumorales, le glucose est préférentiellement métabolisé pour la biosynthèse des pentoses. Outre les cellules
tumorales, de nombreuses cellules embryonnaires, lors du développement précoce, expriment également l’enzyme
malique dans leurs mitochondries.
Pourquoi l’essentiel du glucose est-il métabolisé en pentoses dans ces cellules ? Compte-tenu de cette observation,
quels avantages ces cellules tirent-elles de l’expression mitochondriale de l’enzyme malique ?
1