2012 examen Cinetique enzymatique L2 CB

L2
SCB
Année universitaire 2011-12
Première session d'examen
Cinétique enzymatique
Étude expérimentale et cinétique
Ce sujet comporte 3 pages. Les calculatrices sont autorisées
Partie I. (2 points)
Répondez aux questions suivantes :
Q1. Quelles sont les propriétés des enzymes permettant de les différentier des catalyseurs
classiques utilisés en chimie ?
Q2. Quelles avantages et quels inconvénients voyez vous à utiliser des enzymes dans de
transformations chimiques?
Q3. Donnez la définition de KM
Q4. Quelle avantage voyez vous à connaitre le KM d’une enzyme ?
Exercice 2 (10 points)
Les estérases sont des enzymes que catalysent l'hydrolyse d'esters RCOOR' selon la réaction :
RCOOR' + H2O
RCOO- + R'OH + H +
On se propose de déterminer avec exactitude le KM expérimentale d’une estérase dans un
milieu de pH 7. Les informations disponibles sont :
• Le KM théorique de cette enzyme est de 4 mM.
• On dispose d’un substrat (RCOOR’, en solution à 200 mM) qui n’absorbe pas à la
lumière mais qui donne un produit (R’OH) absorbant convenablement à 450 nm
(ε=8000 M-1cm-1).
• On souhaite fixer le volume réactionnel à 2 mL
• On dispose aussi d’une préparation d’enzyme contenant 2,5 U/mL
En tenant compte de l’ensemble de ces éléments, vous avez proposé un protocole permettant
de déterminer le KM expérimentale avec exactitude.
Q5. Répondre aux questions suivantes :
a) Quel volume de solution de substrat (RCOOR') et de tampon proposez-vous d'introduire
dans la cuve pour faire la première mesure d’activité ?
b) Quel volume d’estérase proposez-vous d'introduire dans la cuve pour faire la première
mesure d’activité ?
c) Quel type d’expérience devez vous réaliser afin de confirmer que la quantité d’enzyme que
vous proposez est correcte ? Indiquez le type de graphes à tracer.
d) Quelles mesures devez vous réaliser pour déterminer KM avec précision ? Aidez vous d’un
tableau dans lequel vous indiquerez les volumes à utiliser des différentes solutions.
e) Quelles sont les différentes graphiques que vous devez tracer pour déterminer KM avec
précision ?
1
On réalise une expérience à saturation de substrat. On introduit dans la cuve les composés
dans les quantités requises. On mesure la DO en fonction du temps et on trace ainsi la courbe
suivante :
Q6. Quelle était en réalité l’activité par mL de la préparation initiale ?
Vous testez maintenant le composé ‘A’, le composé ‘B’ et le composé ‘C’, qui ont des effets
différents sur l’activité de l’enzyme : L’un d’entre eux est un inhibiteur compétitif, un autre
est un activateur, et le troisième est un inhibiteur incompétitif. On ne sait pas qui est qui.
Q7. Quel type d’expérience proposez vous de réaliser pour définir qui est qui ?
Q8. Quels sont les types de graphes et quelles sont les allures de courbes que seront obtenues
à partir des expériences proposées ?
Exercice 2 (8 points)
On considère une enzyme michaélienne présentant un mécanisme à 2 étapes de modifications
covalentes :
S
E
ES
ES'
E+P
k2
K1
k3
De plus un inhibiteur I se fixe sur l’enzyme libre E et sur le complexe ES’ avec la même
affinité. Par contre il ne se fixe pas sur ES :
S
E
ES
K1
I
Ki
EI
ES'
E+P
k2
k3
I
Ki
ES'I
NB : L’affinité de I pour E et ES’ est la même
Q9. Sans développer la loi de vitesse, posez le système d’équations permettant de l’établir.
2
En résolvant ce système, on trouve la loi suivante :
k2[E]T[S]
[I]
[I]
K1(1+ )+[S][1+ Ke(1+ )]
Ki
Ki
Q10. Donnez à cette loi une allure michaelienne.
a=
Q11. Donnez les expressions des constantes vraies KM et kcat et des constantes apparentes
KM(I) et kcat(I).
Q12. Quel est le type d’inhibition provoqué alors par I. ?
On considère que l’étape 2 est la plus lente (k2<k3).
Q1 3. Donnez les expressions simplifiées de ces quatre constantes dans ce cas. Quel est le
type d’inhibition provoqué alors par I.
Q14. Dans ce cas (k2<k3), construisez un modèle simplifié tenant compte de la forme du
complexe enzyme substrat qui s’accumule lorsque l’enzyme se sature. Ceci permet t’il de
prévoir le type d’inhibition obtenu ?
Q15. Quel sera le modèle simplifié si l’étape 3 est la plus lente (k3<k2)?
Q16. Quel est le type d’inhibition provoqué alors par I.?
3