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Journal de la Société de Biologie Clinique
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ASPECTS MORPHOLOGIQUES DE L’EFFET DE L’HYDROXYANISOL BUTYLE SUR L’HYPERPLASIE THYROIDIENNE CHEZ LA SOURIS ICR
LALEYE A. et DARBOUX R. B.
Unité de Biologie Humaine, Faculté des Sciences de la Santé, Cotonou, Bénin ; 01 BP188 Cotonou,
Bénin Tél 00229 2138 41 90, Fax 00 229 21 38 09 38 ; e mail : [email protected] ou [email protected]
RESUME
Ce travail avait pour objet d'étudier, en utilisant une approche morphologique l'effet du BHA sur l'hyperplasie thyroïdienne induite chez la souris ICR par un régime carencé en iode et l'administration de
PTU ou de perchlorate.
Nous avons observé, que le BHA a un effet antigoitrigène chez les souris traitées au LID et PTU; il
induit une réduction du volume relatif de l'épithélium, une réaccumulation du colloïde, une réduction
de la prolifération cellulaire et une réduction de la vasodilatation
Par ailleurs, le BHA induirait une augmentation de l'interstitium non vasculaire pour une raison qu'il
reste à élucider.
La confrontation de nos observations avec certains aspects de la physiologie thyroïdienne nous fait
évoquer deux hypothèses pour expliquer l'action vasodilatation du BHA sur la cellule thyroïdienne,
une inhibition de la sécrétion de TSH par l'hypophyse ou une résistance de la glande à la TSH.
D’autres études fonctionnelles devront élucider ce point.
Mots-clés : goitrigenèse, hydroxyanisol butylé, antioxydant
SUMMARY
The aim of this work was to study, using morphological approaches, effects of BHA on thyroid hyperplasia induced in ICR mice by a lown iodide diet and PTU or perchlorate administration.
We observed, that BHA has a antigoitrogene effect in the mice treated with LID and PTU; it induces a
reduction of the relative volume of the epithelium, a accumulation of colloid, a reduction of the cellular
proliferation and of the vasodilatation. In addition, BHA would induce an increase in nonvascular interstitium for a reason which it remains to elucidate.
The confrontation of our observations with certain aspects of thyroid physiology makes us bring up two
assumptions to explain the action vasodilatation of BHA on the thyroid cell, an inhibition of TSH secretion by the pituitary gland or a resistance of gland to the TSH. Other functional studies will have to
elucidate this point.
Key-words : goitrigenesis, butylated hydroxyanisol, antioxidant
INTRODUCTION
Le goitre hyperplasique, élargissement de la
glande thyroïde, est un véritable problème de
santé publique dans nos régions où l’apport
iodé journalier est inférieur à 50µg. Il se caractérise par des modifications morphologiques et
fonctionnelles de la glande. On assiste non
seulement à une hyperplasie et une hypertrophie des cellules folliculaires mais la prolifération des cellules endothéliales et la vasodilatation constituent la modification thyroïdienne la
plus précoce (1). La quantité de collagène est
aussi accrue et les septa conjonctifs épaissis ;
la glande peut alors doubler son poids. Cette
carence iodée induit l’activation de la pompe à
iodure d’où accroissement de la captation de
l’iode par la glande. C’est le résultat d’une
stimulation importante par la TSH secrétée en
grande quantité. Elle s’accompagne d’une
diminution de la fixation de l’iode, une augmen-
tation de la production de T3 aux dépens de la
T4 qui chute suite à une synthèse préférentielle de T3 et à une accélération de la conversion de T4 en T3 (2, 3).
Le goitre hyperplasique est expérimentalement
induit par l’administration de drogues antithyroïdiennes qui bloquent le transport de l’iode
ou son oxydation et son organification.
L’iodation de la thyroglobuline est catalysée
par la thyroperoxydase (TPO) et suppose
l’intervention de radicaux libres. Au cours de
cette goitrigenèse expérimentale, la TSH secrétée en grande quantité exagère la production d’eau oxygénée (H2O2) par dismutation de
l’anion superoxyde, ce qui génère une production excédentaire de radicaux libres (4).
Il importe pour nous de comprendre
l’interférence possible d’un antioxydant lors de
l’installation expérimentale du goitre.
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L’objet du présent travail est d’étudier les effets
de l’administration du BHA, antioxydant synthétique utilisé dans la conservation des huiles,
graisses et aliments, sur l’hyperplasie thyroïdienne. Notre approche ici est essentiellement morphologique et comprend la description histologique, la morphométrie des différents composants glandulaires et la quantification de la prolifération cellulaire dans des
goitres induits chez des souris ICR et soumises à du BHA.
MATERIEL ET METHODES
1- Animaux et traitements
Des souris ICR (Institue für Zuchthygiene,
Zurich, Suisse) mâles âgées de 8 à 10 semaines, sont réparties en 6 groupes de 6 animaux. Les groupes I et II reçoivent une nourriture standard (U.A.R., Villemoisson-sur-orge,
France), fournissant environ 1,85µg d’iode par
jour et de l’eau potable pendant toute la durée
de l’expérience. Dans les groupes III et IV,
l’hyperplasie thyroïdienne est induite par un
régime carencé réduisant l’apport à 0,1µg
d’iode par jour (LID, Low Iodine Diet ; Remington, Animalabo, Bruxelles, Belgique) et par
l’administration d’un goitrigène, le 6-n-propyl-2thouracyl (PTU ; Sigma, St Louis, USA) qui
empêche l’organification ; l’eau potable est
remplacée par de l’eau distillée. Dans les
groupes V et VI, l’hyperplasie thyroïdienne est
induite par le LID et par l’administration de
perchlorate qui bloque le transport de l’iodure ;
le perchlorate est dissout dans l’eau distillée à
la dose de 1%. Les groupes II, IV et VI reçoivent par ailleurs en plus, mélangé à leur nourriture, du BHA (Sigma, St Louis, USA) à raison
de 1%. Tous ces traitements sont maintenus
pendant 12 jours. Par ailleurs au 12ème jour, et
2 heures avant d’être sacrifié, chaque animal
reçoit du bromodéoxyuridine (BrdU, Boehringer, Mannheim, Allemagne) à la dose de
50mg/kg..
2- Morphologie et morphométrie
Sous anesthésie par injection intrapéritonéale
de 15 mg de thiopental sodique dilué dans
0,3ml de sérum physiologique, (Penthotal ;
Abbott, Ottignies-Louvin-La-Neuve, Belgique),
le bloc thyroïde-trachée est réséqué, les lobes
thyroïdiens sont soigneusement libérés sous
loupe binoculaires et pesés. Ils sont ensuite
fixés au Bouin-Allen pendant 18 à 72 heures,
avec un fragment d’intestin qui servira de contrôle de l’incorporation du BrdU. Les lobes
ainsi fixés subiront les manipulations histologiques subséquentes pour la confection de
coupes histologiques de 5µm d’épaisseur et
colorées à l’hémalun-éosine-safran.
Après avoir décrit l’image histologique de façon qualitative, il est procédé à l’analyse morphométrique sur deux lames par animal afin
d’étudier les volumes relatifs du colloïde, de
l’épithélium et de l’interstitium. Cette analyse
morphométrique est réalisée par comptage par
points sur un microscope à sondages Wild. Le
volume relatif de chaque constituant A (VVA)
est donnée par la formule :
Nombre de points tombant sur A
VVA= -------------------------------------------------Nombre total de points comptés.
Pour plus de facilité, VVA est exprimé en pourcent. Le nombre de points comptés par coupe
varie de 380 à 2000. Les chiffres par animal
sont obtenus en faisant la somme des chiffres
des deux coupes. On calcule alors la moyenne
et l’erreur standard par groupe expérimental.
3- Immunohistochimie
Les cellules en phase S du cycle cellulaire
ayant incorporé du BrdU sont identifiées en
utilisant la technique d’immunoperoxydase
indirecte par la méthode d’avidine-biotine
complexe ou ABC (Hsu, 1981). Dans cette
technique, le premier anticorps est un anticorps monoclonal antiBrdU d’origine murine, le
deuxième est une immunoglobuline de chèvre
antisouris liée à la biotine et la troisième
couche est faite de strepavidinine couplée à la
peroxydase. Les coupes sont ensuite colorées
à l’hématoxyline de Harris et montées dans de
l’Entelan. Comme contrôle positifs des coupes
de duodénum provenant des mêmes animaux
et qui contiennent un grand nombre de cellules
en phase S sont utilisées. Comme contrôles
négatifs, il s’agit de thyroïdes hyperplasiées de
souris n’ayant pas reçu de BrdU avant le sacrifice. Des contrôles de spécificité sont faits en
omettant le premier anticorps.
Sur deux coupes ainsi marquées par animal,
on procède au comptage du nombre de cellules épithéliales ou interstitielles (vasculaires
ou non) marquées et non marquées. Pour
chaque groupe, l’indice de prolifération (IA )
des cellules épithéliales et des cellules interstitielles en est déduit par la formule :
Cellules A marquées
IA =----------------------------Total de cellules A
Pour plus de facilité, IA est exprimé en %o. Les
chiffres par animal sont obtenus en faisant la
somme des chiffres des deux coupes. On calcule alors la moyenne et l’erreur standard par
groupe expérimental
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4. Analyses statistiques
Pour les analyses statistiques, les différences
significatives entre les 6 groupes expérimentaux ont été recherchées en appliquant une
analyse de variance à un facteur (ANOVA), en
prenant les animaux comme unités expérimentales (n=6). Les effets purs des traitements
hyperplasiants et du BHA ont été comparés
par une analyse de variance à deux facteurs
(modèle 3 x 2) : A0= pas d’hyperplasie ; A1=
PTU ; A2= Perchlorate ; B0= pas de BHA ; B1=
BHA.
RESULTATS
1. Poids relatif de la thyroïde (Fig. 1a)
Les variations du poids relatif de la thyroïde
des souris suivant les groupes sont résumées
à la figure 1a.
L'analyse de variance à deux facteurs montre
qu'il y a un effet lié au groupe (p=0.0001) mais
qu'il n'y a pas d'effet lié au traitement
(p=0,626), ni d'effet lié à l'interaction entre
traitement et groupes (p=0,988).
2. Morphologie quantitative (Fig. 1b, 1c ; 1d
et 1e)
L’étude comparative des volumes relatifs de
l’épithélium thyroïdien, du colloïde, des vaisseaux et de l’interstitium non vasculaire est
consignée dans la figure 1.
L'analyse de variances à deux facteurs montre
que pour :
- le volume relatif de l'épithélium, il n'y a pas
d'effet lié au traitement (p= 0,84) mais il y a un
effet lié au groupe (p = 0,0001) et un effet lié à
l'interaction entre groupes et traitement (p =
0,0011);
- le volume relatif du colloïde, il y a un effet lié
au groupe (p = 0,001), un effet lié au traitement (p=0,025) et un effet lié à l'interaction
entre groupes et traitement (p = 0,011);
- le volume relatif des vaisseaux, il n'y a pas
d'effet lié au traitement (p = 0,53) mais il y a un
effet lié au groupe et à l'interaction entre
groupes et traitement (p = 0, 0001);
- le volume relatif de l'interstitium non vasculaire, il n'y a pas d'effet lié au groupe (p=0,799)
mais qu'il y a un effet lié au traitement (p
=0,0019) et à l'interaction entre traitement et
groupes (p = 0,0001).
3. Morphologie qualitative
Les aspects histologiques de la thyroïde de
souris contrôle et de souris soumises aux différents traitements antithyroïdiens (PTU ou perchlorate) avec ou non adjonction de BHA sont
décrits à la figure 3.
4. Prolifération cellulaire
Les résultats de l’étude de la prolifération épithéliale et interstitielle sont résumés à la figure3.
L'analyse de variances à deux facteurs montre
qu'il y a aussi bien pour la prolifération épithéliale qu’interstitielle un effet lié au groupe, un
effet lié au traitement et un effet lié à l'interaction entre traitement et groupes.
DISCUSSIONS
Au cours de nos expériences, le goitre obtenu
par un régime LID et l'administration de PTU
correspond à celui décrit par d'autres (6, 7).
L'hyperplasie est importante et marquée par
une augmentation du poids de la glande, une
résorption massive du colloïde, une hyperplasie épithéliale et le développement des vaisseaux. Le traitement au perchlorate est beaucoup moins efficace. En effet, après 12 jours,
le poids de la glande est faiblement augmenté
et le colloïde est bien conservé dans les follicules. Si l'hyperplasie des cellules thyroïdiennes est particulièrement importante,
comme le montre l'indice de prolifération, l'hypertrophie cellulaire est faible. Par contre, la
vascularisation est tout aussi développée que
dans les goitres obtenus avec le PTU. Ceci se
comprend aisément dans la goitrigenèse expérimentale ; en effet, le développement de la
vascularisation précède les modifications majeures du tissu glandulaire (8).
Les doses de BHA administrées aux animaux
dans la plupart des expériences sont extrêmement élevées comparées à celle de 0,5
mg/kg de poids corporel recommandées par
l’OMS dans la conservation des aliments. (9).
La dose de 1% de BHA dans la nourriture appliquée au cours de nos expériences et qui
correspond à 2 g/kg de poids corporel est tout
aussi très élevée. D’après Altman et Grunow
(10), le BHA n'a pas d'effet lorsqu'il est administré pendant 90 jours à la dose de 0,125%.
L'hyperplasie de la muqueuse digestive qu'il
induit à la dose de 2% est plus ou moins sévère selon la durée d'administration et parfaitement réversible à l'arrêt du traitement. Pour
Moch (11), chez le rat F344, seule une administration pendant au moins deux ans provoque des hyperplasies à la dose de 0,5% et
des papillomes ou des carcinomes gastriques
à la dose de 2%. Selon le même auteur, l'administration de 1 à 1,3 % de BHA à des chiens
pendant 180 jours ne produit aucune lésion
histologique du tractus digestif.
Par ailleurs, nos animaux traités au BHA maigrissent. Cette perte de poids pourrait être liée
à un effet anorexigène du BHA à forte dose.
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Un tel effet a été rapporté par plusieurs auteurs (12, 13) qui suggèrent par ailleurs une
susceptibilité différente au BHA selon la
souche et selon l’âge de l’animal.
Nos expériences nous font observer deux effets du BHA au cours de la goitrigenèse expérimentale.
1) Une augmentation de l'interstitium non
vasculaire déjà remarquable chez les souris
contrôles et plus accentuée encore dans les
thyroïdes des animaux goitreux. Pour une
raison que nous ne pouvons expliquer, elle est
particulièrement intense lorsque le goitre est
débutant et induit par le perchlorate. Cet effet
du BHA sur l'interstitium non vasculaire reste
encore à élucider. S'agit-il d'une fibrose, d'un
oedème interstitiel ou d'une modification de la
substance fondamentale ? Dans l'état actuel
de nos travaux nous ne saurions y répondre.
2) Un effet vasodilatation surtout lorsque
l'hyperplasie est importante suite à l'utilisation
du PTU. Il existe un faisceau d'arguments
morphologiques qui le démontrent : la réduction du volume relatif de l'épithélium, de la
prolifération cellulaire et la faible vasodilatation
dans les glandes des animaux soumis à la fois
au régime hyperplasiant et au BHA. Cet effet
vasodilatation serait moins marqué chez les
souris sous perchlorate probablement parce
que le goitre induit de cette manière n'est que
débutant.
Dans la goitrigenèse, les antithyroïdiens du
groupe des thiourés inhibent l'iodation par
compétition avec les résidus tyrosyls de la
thyroglobuline pour l'iode oxydé et donc réduisent la biosynthèse des hormones thyroïdiennes (14). Cette chute du taux des hormones thyroïdiennes circulantes a pour conséquence une sécrétion accrue de la TSH
hypophysaire et sans doute d'autres facteurs.
A court terme, la TSH stimule par la voie de
l'adénylate cyclase, diverses étapes de la biosynthèse et de la sécrétion des hormones
thyroïdiennes (15). A long terme, elle induit la
prolifération cellulaire.
Le BHA est un composé phénolique; les phénols sont efficacement oxydés par les peroxydases (16). Dans une thyroïde normale, le
composé 1 de la TPO est pourvu de deux
équivalents d'oxydation qui permettent l'iodation de la thyroglobuline par oxydation de I- en
IO- (I+) qui réagit avec un résidu tyrosyl. et le
couplage par prise successive d'un électron à
deux résidus iodotyrosyl qui fusionnent. Le
BHA pourrait alors prendre un des deux équivalents d'oxydation de la TPO et empêcher
ainsi l'iodation de la thyroglobuline. Le BHA,
converti en radical phénoxyl, pourrait régénérer la molécule oxydante par réduction ou
s'oxyder en une quinone stable.
Ceci aggraverait la baisse du taux des hormones thyroïdiennes circulantes déjà provoquée par les antithyroïdiens. On devrait alors
s'attendre à un effet aggravant du goitre par le
BHA. Mais nous avons plutôt observé chez
nos souris un effet vasodilatation Cette observation suggère deux hypothèses :
- Le BHA inhiberait la sécrétion de TSH par les
cellules hypophysaires. Ceci pourrait se faire
par action directe sur les membranes biologiques. (13). Une conséquence possible de
cette action du BHA sur les membranes serait
l'inhibition de l'endocytose et en particulier de
l'endocytose massive de la thyroglobuline qui
se produit au cours de l'hyperplasie. L'observation chez nos animaux d'une accumulation de
colloïde qui devient plus coloré avec des cellules épithéliales de plus petite taille le suggère. Cette observation a été également faite
fortuitement par Jeong et collaborateur, 2004
(13) alors qu’ils étudiaient les effets du BHA
sur le développement et les fonctions du système reproducteur chez le rat.
- Le BHA entraînerait une résistance de la
glande à la TSH qui serait par ailleurs sécrétée
normalement. Il pourrait agir au niveau du
récepteur. Ceci est corroboré par plusieurs
travaux récents qui signalent une interaction
avec les récepteurs aux hormones notamment
les récepteurs thyroïdiens de manière dose
dépendante, conduisant à une situation
d’hypothyroïdie (17, 18). Ceci expliquerait
d'emblée son effet vasodilatation par blocage
de la cascade AMPc dépendante et de la voie
des phosphoinositides.
Il serait donc utile de pouvoir faire une étude
fonctionnelle, dosant les hormones thyroïdiennes T3 et T4, la PBI et la TSH circulante. La souris se prêtant mal au dosage de la
TSH, il faudrait utiliser des rats ou tout autre
modèle animal adéquat.
CONCLUSION
Au total, le présent travail , utilisant une approche morphologique, a étudié les effets d’un antioxydant
phénolique, le BHA sur l'hyperplasie thyroïdienne induite par un régime carencé en iode et l'administration de deux antithyroïdiens le PTU ou le perchlorate.
Nous avons observé, que le BHA avait un effet vasodilatation chez les souris traitées au LID et PTU;
le BHA induit une réduction du volume relatif de l'épithélium, une réaccumulation du colloïde, une
réduction de la prolifération cellulaire et une réduction de la vasodilatation
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Par ailleurs, le BHA induirait une augmentation de l'interstitium non vasculaire pour une raison qu'il
reste à élucider.
La confrontation de nos observations avec certains aspects de la physiologie thyroïdienne nous fait
émettre deux hypothèses pour expliquer l'action vasodilatation du BHA sur la cellule thyroïdienne, une
inhibition de la sécrétion de TSH par l'hypophyse ou une résistance de la glande à la TSH. D’autres
études fonctionnelles devront élucider ce point.
Fig 1a : Poids relatifs de thyroïdes par groupe expérimental
Fig 1b : Volume relatif de l’épithélium thyroïdien par groupe
expérimental
Fig 1d : Volume relatif des vaisseaux par groupe expérimental
Fig 1c : Volume relatif du colloïde par groupe expérimental
Légendes
Fig 1e : Volume relatif de l’interstitium non vasculaire par groupe
expérimental
Groupe I : Contrôle
Groupe II : Contrôle plus BHA 1%
Groupe III : LID plus PTU 0,25%
Groupe IV : LID plus PTU 0,25% plus BHA 1%
Groupe V: Perchlorate 1%
Groupe VI: Perchlorate 1% plus BHA 1%
Figure 1 : Etude morphométrique
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a : Coupe de thyroïde de souris contrôle (groupe I)
La thyroïde est constituée d'un ensemble de follicules sphériques,
limités par un épithélium cubique simple et tassés les uns contre
les autres. La cavité folliculaire est large et remplie d'un colloïde
très éosinophile. L'interstitium est réduit à un réseau vasculaire
fait de capillaires collabés et de rares fibres conjonctives (320x)
b : Coupe de thyroïde de souris traitée uniquement au BHA
(groupe II)
Les follicules ressemblent à ceux du groupe contrôle. Par contre,
l'interstitium paraît déjà plus développé (320x)
c : Coupe de thyroïde de souris sous LID + PTU (groupe III)
L'épithélium folliculaire est hyperplasique; les cellules épithéliales sont cylindriques, leur cytoplasme est clair et finement
vacuolaire. La cavité folliculaire est très irrégulière et parfois très
réduite. Le colloïde est peu coloré et parfois absent. Dans l'interstitium le réseau vasculaire est développé (320x)
d : Coupe de thyroïde de souris sous LID + PTU et traitée au
BHA (groupe IV)
Certains follicules restent hyperplasiés, d'autres ont un épithélium
moins haut. La cavité folliculaire est plus large et contient un
colloïde plus abondant et plus coloré. L'interstitium est plus développé mais les vaisseaux y sont moins congestifs (320x)
e : Coupe de thyroïde de souris sous LID + Perchlorate
(groupe V)
Les follicules sont irréguliers et sphériques. Les cellules épithéliales sont plus grandes que les thyréocytes normaux. Leur noyau
est volumineux et pâle; leur cytoplasme est acidophile. L'interstitium est fourni et contient des capillaires congestifs (320x)
f : Coupe de thyroïde de souris sous LID + Perchlorate
et traitée au BHA (groupe VI)
La plupart des follicules sont petits, isolés les uns des autres par
un interstitium particulièrement développé. Les cellules épithéliales sont plus ou moins cubiques. On observe parfois des cellules desquamées dans les lumières folliculaires (320x)
Figure 2 : Aspects histologiques de la thyroïde normale et hyperplasique sans ou avec traitement au
BHA (fixation au Bouin-Allen et coloration à l’hémalun-éosine
Fig 3a : Indice de marquage épithélial par groupes expérimentaux
Fig 3b : Indice de marquage interstitiel par groupes expérimentaux
Figure 3 : Evaluation de la prolifération cellulaire
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