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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE D’ORAN, ES-SENIA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
MEMOIRE
Présenté par :
Mr. Kamel KRANTAR
Pour obtenir
LE DIPLOME DE MAGISTER
Spécialité: Microbiologie
Option : Microbiologie Alimentaire
Intitulé :
Caractérisation génétique du métabolisme du citrate chez
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 195.
Soutenue le : 23 Janvier 2007
Devant les membres du jury :
Pr.AOUES Abdelkader Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia, Algérie.
(Président)
Dr.CHEKROUN Abdellah Maître de conférence à l’Université d’Oran, Es-Sénia, Algérie.
(Examinateur)
Dr.KACEM Mourad Maître de conférence à l’Université d’Oran, Es-Sénia, Algérie.
(Examinateur)
Pr.BENSOLTANE Ahmed Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia, Algérie.
(Encadreur)
Dr.DRIDER Djamel Maître de conférence à l’ENITIAA., Nantes, France.
(Co-encadreur)

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REMERCIEMENTS
J’exprime ma profonde reconnaissance au Professeur Ahmed
BENSOLTANE qui m’a accueilli dans son équipe au sein de son laboratoire de
Microbiologie Alimentaire et Industrielle à l’Université d’Oran et d’accepter
de diriger ce travail. Ses conseils, ses encouragements et sa confiance m’ont
beaucoup stimulé dans la réalisation de ce mémoire de Magister.
Je tiens à remercier aussi le Professeur Charles DIVIES, Directeur
du Laboratoire de Microbiologie UMR INRA, ENSBANA à l’Université de
Bourgogne, Dijon, France, qui m’a permis de réaliser ce travail de recherche
en m’accueillant au sein de son Laboratoire.
Je remercie vivement Monsieur Djamel DRIDER, Maître de conférence
à l’ENITIAA., Nantes, France, pour sa rigueur scientifique et pour avoir co-
encadrer ce travail.
Je remercie infiniment le Professeur AOUES Abdelkader, le Docteur
CHEKROUN Abdellah et le Docteur KACEM Mourad pour avoir accepté de
lire et de juger ce travail.
Mes remerciements vont également à tous les membres des deux
laboratoires où ce travail a été réalisé qui par leur aide scientifique, technique
et administrative, ont contribué au bon déroulement de ce travail.

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SOMMAIRE
INTRODUCTION 1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I/ Généralités sur les bactéries lactiques. 3
I-1 Lactococcus 5
I-2 Lactobacillus 6
I-3 Leuconostoc 6
II/ Le métabolisme de l’acides citrique. 11
II.1. Protéines impliquées dans le métabolisme anaérobie du citrate. 12
II.2. Le métabolisme du citrate chez les bactéries lactiques. 19
II.2.1. Le cométabolisme sucre/citrate chez Leuconostoc. 21
II.2.2. Mécanismes du transport du citrate chez les bactéries lactiques. 22
II.2.3. Citrate lyase et Oxaloacétate décarboxylase des bactéries lactiques. 24
III/ Génétique de la fermentation du citrate chez les bactéries. 25
III-1. Chez les entérobactéries 25
III-1-1. Klebseilla pneumoniae, 25
III-1-2.Escherichia coli. 26
III-2. Chez les bactéries lactiques. 28
III-2-1.Chez Lactococcus lactis 28
III-2-2. Chez Weissella paramesenteroides 31
III-2-3.Chez Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 195 31
MATERIELS ET METHODES 32
Partie étude microbiologique 32
I. Les souches de bactéries lactiques utilisées. 32
II. Milieux de culture. 32
II. 1. MRS 32
II. 2. M17 32
II. 3. KmK 32
III. Fermentation des sucres 32
IV. Conservation des souches. 33
V. Réactivation et purification des souches 33
V. 1. Réactivation des souches 33
V. 2. Purification 33
VI. Caractérisation des souches 33

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Partie étude génétique 34
I. Souches bactériennes, milieux de culture, enzymes et oligonucléotides. 34
II. Techniques d’extraction et de purification des acides nucléiques 35
1. Extraction et purification de l’ADN 35
2. Amplification de l’ADN 36
3. Restriction et ligation 37
4. Extraction de l’ARN total 37
III. Techniques de manipulation et d’analyse des acides nucléiques. 39
1. Southern Blot 39
2. Norther Blot 41
3. Hybridation 41
IV. Séquençage de l’ADN. 42
V. utilisation du citrate par des cellules non proliférantes (resting cells). 42
RESULTATS 43
Etude microbiologique 43
I. Aspect morphologique 43
II. Aspect physiologique 43
III. Test des galeries Api 50 CH 43
IV. Co-métabolisme sucre citrate chez Lmc 195 45
V. Utilisation du citrate par des cellules non proliférantes. 45
Etude génétique 46
I. Séquençage et Analyse de la partie en aval du locus citCDEFG 46
I. 1. Clonage et Séquençage 46
I. 2. Analyse des séquences nucléotidiques. 48
II. Comparaison des séquences protéiques. 51
II. 1. Alignement de la séquence protéique CitO 51
II. 2. Alignement de la séquence protéique CitP 51
III. Caractérisation de la citrate perméase de Lmc 195 54
III. 1. Localisation de la citrate perméase de Lmc 195 54
III. 2. Expression hétérologue de citP chez Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 55
Construction du plasmide pGID075 55
IV. Analyse transcriptionelle 57

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DISCUSSION 59
Description d’un premier transporteur de citrate à localisation chromosomique
chez une bactérie lactique. 59
Organisation des gènes de la fermentation du citrate chez les bactéries 60
Discussion du rôle de citO dans le métabolisme du citrate chez Lmc 195 62
CONCLUSION 64
PERSPECTIVES 64
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 65
ACTIVITES SCIENTIFIQUES
Articles
Communications scientifiques
Séquences nucléiques déposées chez la banque génomique EMBL
ANNEXE
Composition des milieux de culture
RESUME/ABSTRACT