Questions
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Bio II - Ex. II Question I Exos 1. Adaptation rapide des bactéries aux changements d’environnement. Expérience : Cooper et Lenski ont testé la capacité d’une souche E. coli à s’adapter à un nouvel environnement. L’environnement habituel est un milieu de culture riche, Luria broth (LB), le nouvel environnement est un milieu de culture pauvre, Davis minimal (DM25, glucose = 25 µg/mL). Ils ont établi 12 populations, chacune dérivant d’une cellule unique d’une souche asexuée d’E. coli. Ils ont suivi ces populations pendant 20’000 générations (3’000 jours) dans du DM25. Pour maintenir un apport nutritif régulier, 0.1 mL de culture bactérienne est transféré chaque jour dans un tube contenant 9.9 mL de milieu DM25 frais (dilutions 1/100 en série, Figure 1.1). Figure 1.1 : dilution 1/100 quotidienne Questions : 1) Sachant que la masse d’une bactérie E. coli équivaut à 7x10-16 kg et que le temps de génération (doublement) est de 20 min. en conditions optimales (LB normal), estimez le poids de la descendance d’une bactérie après 3 jours de culture ? Justifiez la nécessité de faire des dilutions en séries. ! 2) Sachant qu’il a fallu 3'000 jours pour obtenir 20'000 doublement dans le milieu DM25, quel est le temps de génération (doublement) dans ce milieu ? 1! 3) Interprétez/ commentez la courbe de la figure 1.2. 4) Suggérez les fonctions possibles des gènes dont la séquence codante ou l’expression a été altérée dans les populations adaptées au milieu minimal (DM25). Exos 2 : Analyse génétique chez Neurospora crassa Neurospora est un champignon microscopique haploïde dont les principales étapes du cycle de développement sont présentées de façon simplifiée sur la figure 2.1 : Le milieu DM25 contient toutes les ressources nécessaires à la croissance, la seule source de carbone (le glucose) est limitée. Des échantillons des cultures sont prélevés périodiquement, chaque 5'000 générations, et la croissance en DM25 des bactéries « évoluées » est comparée à la croissance dans ce même milieu de la souche E. coli initiale (maintenue congelée à -80 °C pour qu’elle n’évolue pas pendant les 8 années de l’expérience). Résultats : La figure 1.2 montre la moyenne des taux relatifs de croissance des souches « évoluées » (n=12) par rapport à la souche initiale (« Fitness relative to ancestor ») en fonction du nombre de générations en culture. Figure 1. 2 : Questions : Ques%on(1( Ce#que#l’on#veut:## Es%mez(le(poids(de(la(descendance(d’une(bactérie(après(3(jours(de(culture((milieu(LB).# Ce#que#l’on#sait:# Masse(d’une(bactérie(E.#coli(=(7x10E16(kg( Temps(de(doublement(=(20(min((milieu(LB)( # Réponses#:( Combien(de(doublement(par(heure(?(3(x(20(min(=(60(min( ! 3(doublements(par(heure(x(24(heures(x(3(jours(=(216(doublements(pour(3(jours(de( culture.(( ( Masse:(=(7(10E16(kg(x(2(216)(=(7.3(x(1049(kg(( Approxima.on:#(2#216##≈#10#65)# Ques%on(1((suite)( Ce#que#l’on#veut:## Quel(est(le(temps(de(généra%on((doublement)(dans(ce(milieu(?( Ce#que#l’on#sait:(3’000(jours(pour(avoir(20’000(doublement((DM25)( ( Réponse# Par(jour:(20'000(doublements(/(3'000(jours(=(6.6(doublements(par(jour( Par(minute:(24·60$minutes$=$1440(minutes( 1440([min/jour](/(6.6(doublement([jour]=(218(min(est(le(temps(de(doublement(pour(ce( milieu((DM25).( ( Conclusion# Le(temps(de(généra%on(dans(le(milieu(pauvre((≈200(minutes)(est(10(fois(plus(long(que( le((temps(de(généra%on(dans(le(milieu(riche((≈20(minutes).( Les(dilu%ons(quo%diennes(1/100(sont(appropriées(:(la(popula%on(bactérienne( augmente(d’un(facteur(d’environ(100((26.6(=(97)(par(jour.( Ques%on(I((suite)( Ce#que#l’on#veut:(( Interprétez/(commentez(la(courbe(de(la(figure(1.2.( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( On(observe(une(améliora%on(progressive(de(la(capacité(des(bactéries(à(pousser(dans( le(milieu(DM25(:(raccourcissement(du(temps(de(généra%on(au(cours(de(l’expérience.( L’améliora%on(est(d’abord(rapide(puis(plus(lente.(Les(bactéries(ont(accumulé(des( muta%ons(améliorant(la(croissance(dans(ce(milieu(;(ces(muta%ons(ont(été( sélec%onnées(au(cours(du(temps.( Ques%on(I((suite)( Ce#que#l’on#veut:## Suggérez(les(fonc%ons(possibles(des(gènes(dont(la(séquence(codante(ou(l’expression(a(été( altérée(dans(les(popula%ons(adaptées(au(milieu(minimal((DM25).( Ce#que#l’on#sait:# Le(milieu(DM25(con%ent(toutes(les(ressources(nécessaires(à(la(croissance,(la(seule(source(de( carbone((le(glucose)(est(limitée.( ( Réponse# Exemples(de(muta%ons(pouvant(accélérer(la(croissance(dans(DM25:(( • muta%ons(qui(augmentent(l’efficacité(d’un(transporteur(de(glucose(;(( • élimina%on(de(gènes(inu%les(dans(ce(milieu,(par(exemple(de(gènes(permeLant(l’u%lisa%on((( de(sucres(autres(que(le(glucose.(La(simple(présence(de(gènes(inu%les(a(un(coût(énergé%que( pour(les(répliquer(et(pour(les(réprimer((synthèse(d’un(répresseur).( 24#voies#cataboliques#parmi#les#64# testées#sont#perdues#chez#les# bactéries#adaptées.# # Rouge:#les#voies#qui#disparaissent# Vert:#les#voies#«#gain#of#func@on#»# 2) Dans la nature, il existe un système d’incompatibilité déterminé par 2 allèles du locus Mat (« mating type »). Un croisement peut se faire uniquement entre une souche Mat A et une souche Mat a ? Expliquez l’intérêt de ce système d’incompatibilité ? Question II Exos 3 : Antibiotiques Table 3.1 Antibiotique : Espèce productrice : Activité : Site d’action : Pénicilline Penicillium chrysogenum Gram + Peptidoglycan Tétracycline Streptomyces rimosus Gram + et - Synthèse des protéines Questions : 1) Quel est le rôle « naturel » des antibiotiques ? 2) Précisez le mode d’action de chaque antibiotique et pourquoi il n’est pas actif contre les eucaryotes ? 3) Proposez un mécanisme de résistance aux antibiotiques et expliquez l’émergence de souches multi-résistantes dans certains hôpitaux. ! 4) Pourquoi est-il plus difficile de trouver des molécules antiparasitaires (p. ex contre Plasmodium, agent causatif de la malaria) qu’antibactériennes ? Comment 3!la connaissance du génome de Plasmodium (disponible depuis 2002) peut-elle faciliter l’identification de molécules antiparasitaires ? Exos 4 : Communication entre bactéries Exemple! du! «!quorum! sensing!»! chez! les! bactéries! Gram?négatives! :! La! protéine! LuxI! produit!des!molécules!appelées!“auto?inducer!AI”!qui!diffusent!librement!à!l’extérieur!de! la!bactérie.!Chaque!bactérie!produisant!des!moélecules!AI,!la!concentration!en!AI!reflète!la! taille! de! la! population! bactérienne! (quorum).! Lorsque! [AI]! est! élevée,! AI! se! lie! sur! le! Question II - rappel Gram+ Gram- Question II - 1) penicillin Alexander Fleming (1881-1955) Penicillium chrysogenum 3 September 1928 (return from holidays) purification & production: 1940, prix Nobel 1945 Question II - 1) penicillin penicillin: isole en 1928 depuis Penicillium chrysogenum (fungi) DD-transpeptidase maintenance cell wall (peptidoglycan) gram+ penicillin doesn’t work with gram- bacteria (different enzyme sets) penicillin resistance: b-lactamase DD-transpeptidase maintenance cell wall (peptidoglycan) gram+ penicillin b-lactamase cell lysis Question II - 2) tetracyclin tetracycline: isole en 1945 depuis Streptomyces rimosus (bacteria) tetracycline translation, protein production attache au ribosome subunit 30S (prok cell), no gram specificity tetracyclin resistance: changement dans la permeabilite des membranes cellulaires Question II - point 3) & 4) milieu ‘‘hospitalier’’ (environnement) ! ! diversite des bacteries + personnes immuno-deficiente (malade) + proximite + forte pression evolutive... plasmid, conjugaison bacterienne (genetique) ! ! ! plasmids = DNA circulaire, replicable & recombinable, echangeable (transfert - facteur Fertility) pathogenes/parasites eukaryote: architectures & metabolisme similaire ! ! screen biochimique vs approach bioinformatique (prediction) connaissance du génome de Plasmodium (disponible depuis 2002) peut-elle faciliter l’identification de molécules antiparasitaires ? Question III Exos 4 : Communication entre bactéries Exemple! du! «!quorum! sensing!»! chez! les! bactéries! Gram?négatives! :! La! protéine! LuxI! produit!des!molécules!appelées!“auto?inducer!AI”!qui!diffusent!librement!à!l’extérieur!de! la!bactérie.!Chaque!bactérie!produisant!des!moélecules!AI,!la!concentration!en!AI!reflète!la! taille! de! la! population! bactérienne! (quorum).! Lorsque! [AI]! est! élevée,! AI! se! lie! sur! le! récepteur! LuxR.! Les! complexes! activateurs! LuxR?AI! se! lient! sur! certains! promoteurs! de! gènes!cibles,!lesquels!vont!influencer!le!comportement!de!la!bactérie.!! ! Questions : ! 1) Les!bactéries!Vibrio&fisheri!deviennent!bio?luminiscentes!lorsque!leur!gène!codant! l’enzyme!luciférase!est!exprimé.!!A!l’aide!du!schéma!ci?dessus,!expliquez!pourquoi! ces! bactéries! sont! bio?luminescentes! uniquement! lorsqu’elles! sont! en! grand! nombre!dans!un!espace!donné!?!! ! 2) Les! gènes! de! virulence! (p.! ex.! codant! des! toxines)! de! nombreuses! bactéries! pathogènes!sont!sous!la!dépendance!du!quorum!sensing.!!Quel!est!l’avantage!pour! la! bactérie! lors! d’une! infection?! Imaginez! une! stratégie! pour! lutter! contre! les! infections!par!ces!bactéries.! ! ! ! ! Ques%on(1( Les(bactéries(Vibrio&fisheri(deviennent(bio4luminiscentes(lorsque(leur(gène(codant( l’enzyme(luciférase(est(exprimé.((A(l’aide(du(schéma(ci4dessus,(expliquez(pourquoi(ces( bactéries(sont(bio4luminiscentes(uniquement(lorsqu’elles(sont(en(grand(nombre(dans( un(espace(donné(?(( ( Réponse( Sur(le(schéma(ci4dessous(le(gène(codant(la(luciférase(est(le(gène(cible.(La(transcrip%on( du(gène(luciférase(commence(quand(la(concentra%on(de(l’auto4inducer([AI](est(élevée( (supérieure(à(une(valeur(seuil).(Pour(que([AI](soit(élevée,(il(faut(qu’un(grand(nombre( de(bactéries(sécrètent(AI.( ( ( La(Luciférase(est(le( gène(cible( Ques%on(2( Les(gènes(de(virulence((p.(ex.(codant(des(toxines)(de(nombreuses(bactéries( pathogènes(sont(sous(la(dépendance(du(quorum(sensing.((Quel(est( l’avantage(pour(la(bactérie(lors(d’une(infec%on?(Imaginez(une(stratégie(pour( luDer(contre(les(infec%ons(par(ces(bactéries.( ( Réponse( ! Avantage(pour(les(bactéries(:(l’aDaque(en(groupe,(les(bactéries(aDendent( d’être(nombreuses(avant(de(passer(à(l’offensive(en((sécrétant(leur(toxine.( ! Stratégie(an%bactérienne(:(perturber(le(quorum(sensing(par(exemple(en( neutralisant(l’autoLinducer(AI(:( L avec(un(an%corps( L avec(un(récepteur(decoy((lié(à(l’apoptose)( LuxR%étant%une%protéine%intra/cellulaire,%il%est%plus%difficile%de%la%neutraliser.% Ce8e%stratégie%ne%sera%ni%bactéricide,%ni%bactériosta;que.(( 2) Sachant qu’il a fallu 3'000 jours pour obtenir 20'000 doublement dans le milieu DM25, quel est le temps de génération (doublement) dans ce milieu ? Question IV 3) Interprétez/ commentez la courbe de la figure 1.2. 4) Suggérez les fonctions possibles des gènes dont la séquence codante ou l’expression a été altérée dans les populations adaptées au milieu minimal (DM25). Exos 2 : Analyse génétique chez Neurospora crassa Neurospora est un champignon microscopique haploïde dont les principales étapes du cycle de développement sont présentées de façon simplifiée sur la figure 2.1 : On croise une souche [M+] avec une souche [M-]. Les spores obtenues, en place dans les asques, sont cultivées sur milieu minimum sans méthionine. Le résultat, observable après quelques heures, est schématisé sur la figure 2.2 . Figure 2.2 : Résultat de la culture d’asques de Neurospora sur milieu minimum (sans méthionine). Questions : 1) Expliquez comment ce croisement permet d'obtenir les différents types d'asques observés. Calculez la distance génétique du gène M au centromère ? 2) Dans la nature, il existe un système d’incompatibilité déterminé par 2 allèles du locus Mat (« mating type »). Un croisement peut se faire uniquement entre une souche Mat A et une souche Mat a ? Expliquez l’intérêt de ce système d’incompatibilité ? On connaît chez ce champignon deux souches qui se distinguent par leur capacité à croître sur un milieu "minimum" sans méthionine (un acide aminé) : Exos 3 : Antibiotiques · la souche sauvage [M+] peut se développer en l'absence de méthionine, · la souche mutante [M-] a besoin de méthionine pour se développer. Table 3.1 Antibiotique : Espèce productrice : Activité : Site d’action : On admet que ce phénotype est déterminé par l'expression d'un couple d'allèles notés M+ et M- au locus M. Pénicilline Penicillium chrysogenum Gram + Peptidoglycan Tétracycline Streptomyces rimosus Gram + et - Synthèse des protéines Questions : 1) Quel est le rôle « naturel » des antibiotiques ? Question IV M+; M- sont des marqueurs auxotrophes M+ x MM+ M- growth no growth 8/13 zygote 2n growth growth no growth no growth 5/13 (5/13)/2 = 19cM media -methionine
