LA PAPAINE
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OLIGER KEVIN HELLERINGER Elise LA PAPAINE OLIGER HELLERINGER Master SCE La papaïne Généralités : Nom: PAPAINE Autres noms possible: -Papaya peptidase I -papaine -papayotin -summetrin -velardon Propriétés physiques et Cinétiques La papaïne est une sulfhydrile-protéase(RS-H) qui provient du latex et du fruit de la papaye et fait partie de la famille des peptidase C1.La papaïne est constituée d'une seule chaîne polypeptidique avec trois ponts disulfure ce qui lui confère une bonne stabilité et un groupe nécessaire pour l’activité de l'enzyme sulfhydrile, la chaine polypeptidique est également formé de 212 résidus acides-aminés. Cette chaine est pliée en deux groupes, une partie inactive et l’autre active, celle-ci est représenté par les groupes sulfhydrile oxydé essentiellement présent dans la CYS 25. L’hélice alpha quant à elle possède la liaison C=O dirigée vers l’axe de l’hélice, alors que les hydrogènes quant à eux sont en conformation antiparallèle, ils sont alors dirigés vers les noyaux des feuillets. Elle possède donc un site actif nucléophile Cystéine à la position 25 qui attaque la liaison peptidique. Poids moléculaire: 23 406Da (séquence d'acides aminés) 16 PH optimal pour l'activité: 6.0-7.0 N° EC : 3.4.22.2 N° CAS : 9001-73-4 [1] OLIGER HELLERINGER Master SCE Enchainement des acides aminés dans la papaïne. Spécificité La papaïne va digérer la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. La papaïne présente une large spécificité, clivant les liaisons peptidiques des acides aminés basiques, la leucine, ou la glycine. On hydrolyse les esters et les amides aussi. La papaïne présente une préférence pour un acide aminé portant une grande chaîne latérale hydrophobe à la position P2. Il n’accepte pas la valine à la position P1 Etude d’une thèse « Crystalline papain » by Joe R.Kimmel (1954) La papaïne serait active en milieu basique et neutre mais inactives en milieu acide. D’après les essais réalisés la cystéine de la papaïne peut être oxydée par I2 ou H2O2 la rendant ainsi inactive. La cystine réduite en cystéine par UV permettrait également l’activation de la papaïne. [2] OLIGER HELLERINGER Master SCE C’est ainsi qu’il a été déterminé la présence d’un disulfure dans la molécule. Bersin et Logemann ont également démontré le phénomène d’activation : Avec l’oxydoréduction du groupe thiol on a ainsi la possibilité de rendre la papaïne active ou inactive. Les agents activant utilisés sont : HCN, H2S, Cystéine, Glutathionne. Spécificité de la papaïne La papaïne est capable d’hydrolyser avec ou sans groupement amino ou carboxyle libre. Elle ne fractionne que les acides aminés L. [3] OLIGER HELLERINGER Master SCE Figure 1: Exemple d'enchainement d'acide aminé pour la papaïne. Figure 2: Vu en 3D de la papaïne 1PPP [4] OLIGER HELLERINGER Master SCE Solubilité et stabilité en solution La papaïne est soluble dans l'eau à 10 mg / ml. Immédiatement avant utilisation, l'enzyme est généralement dilué dans un tampon contenant 5 mM de L-cystéine. Bien que les solutions papaïne aient une bonne stabilité à la température, la stabilité en solution est dépendante du pH. Des solutions de papaïne sont instables dans des conditions acides, à savoir, à des valeurs de pH inférieures à 2,8, il existe une perte significative de l'activité. Pour l'enzyme active en solution, la perte d'activité est d'environ 1-2% par jour, probablement à la suite de l'autolyse et / ou de l'oxydation. Une forme inactive commune de la papaïne obtenue lors de l'isolement est un disulfure mixte formée entre le groupe sulfhydrile site actif de la protéine et la cystéine libre 23 Différentes applications : - - - La papaïne est couramment utilisée dans les procédures d'isolement cellulaire où il est révélé plus efficace et moins destructeur que d'autres protéases de certains tissus La papaïne est utilisée depuis des milliers d'années en Amérique du Sud d'où elle est originaire pour attendrir la viande. En cosmétique, elle agit comme une gomme douce et naturelle, aux propriétés assouplissantes et lissantes. Elle permet de détruire les cellules mortes de la peau sans affecter les cellules saines. La papaïne est également vendue comme complément alimentaire pour remédier aux brûlures d'estomac. La pâte de papaïne est utilisée pour traiter les verrues et les cors ainsi que les brûlures de méduses ou de raies car elle dégrade les toxines contenues dans leur venin. La papaïne est utilisée au laboratoire, en immunohématologie, pour la recherche d'anticorps irréguliers. La papaïne est également utilisée par l'industrie agro-alimentaire pour augmenter la tendreté de la viande. On s'en sert également lors des montages ostéologiques pour purifier les os de toute trace de muscle ou de tendon. ETUDE X-RAY DIFFRACTION Résolution 1.50 Angstrom Les tentatives d’isolement de la papaïne co-crystallisé cystéine protéase dérivée du latex de Carica papaya avec un inhibiteur de cystéine-protéases(PIC) de Trypanosome brucei ont été infructueuses. Cependant, des cristaux de papaïne diffractés à résolution plus élevée, 1,5 A, que les autres cristaux de cette cystéine protéase arche type ont été obtenus en poursuivant l'analyse. Étonnamment, la fente de liaison au substrat a été occupée par deux fragments peptidiques courts qui ont été affectés comme des vestiges de l'ICP. Les comparaisons montrent que ces peptides se lient au site actif d'une [5] OLIGER HELLERINGER Master SCE manière similaire à celle de la cystéine protéase humaine inhibiteur stefin B quand il est complexé à la papaïne. L'affectation des séquences de fragment est en accord avec la spécificité de la protéase. Structure secondaire obtenue : La structure secondaire de la papaïne est formé de: - 5 hélices 8 feuillets [6] OLIGER HELLERINGER Master SCE La séquence ainsi obtenue est donc : [7] OLIGER HELLERINGER Master SCE Etude avec la RMN [8] OLIGER HELLERINGER Master SCE La structure tridimensionnelle de deux polymorphes d'un complexe covalent ZLFG-CH2-papaïne a été déterminée par cristallographie aux rayons X. Les structures indiquent que: (i) (ii) (iii) l'atome de carbone de méthylène de l'inhibiteur est lié par covalence à l'atome de S gamma Cys25 de la papaïne la poche S2 hydrophobe formée par Pro68, Val133, Val157, et Asp158 est occupé par la chaîne latérale P2 phénylalanyl de l'inhibiteur une liaison très étendue d'hydrogène et des interactions hydrophobes sont responsables de l'interaction de l'inhibiteur avec l'enzyme. La comparaison avec des structures similaires donne à penser que dans les complexes covalents les préservations des interactions de chaînes principales entre l'enzyme et l'inhibiteur peut avoir une priorité supérieure aux interactions PS. Diagramme de Ramachandran Figure 3: Diagramme de Ramachandran général On peut voir dans le coin supérieur gauche, dans la zone rouge, la région où l’on retrouve les feuillets β. Dans la zone en orange on retrouve les hélices α. La zone en bleu correspond à une conformation en hélice gauche avec ψ>0. Nous allons maintenant nous intéresser à quelques acides aminés présents dans la molécule. [9] OLIGER HELLERINGER Master SCE Figure 4: Diagramme de Ramachandran de la papaine 1PPN On constate que l’on retrouve majoritairement l’isoleucine et la valine dans les feuillets β mais également dans les hélices α. La pré-proline se retrouve quant à elle uniquement dans les feuillets β. La glycine se retrouve quant à elle dans une conformation en hélice gauche. Cela provient sans doute du fait qu’elle ne possède pas de chaîne latérale donc elle possède une plus grande liberté conformationnelle. [10]
