Crassostrea gigas et de bactéries associées.

THESE / Université de Bretagne-Sud
sous le sceau de L’université Européenne de Bretagne
pour obtenir le titre de :
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE
BRETAGNE-SUD
Mention : Biologie
École Doctorale SICMA
Thèse soutenue le 24 septembre 2009 devant le jury composé de :
Roch Philippe
Directeur de recherche CNRS, Université de Montpellier 2 / rapporteur
Nicolas Jean-Louis
Directeur de recherche Ifremer, Brest / rapporteur
Renault Tristan
Directeur de recherche Ifremer, La Tremblade / examinateur
Dufour Alain
Professeur, Université de Bretagne-Sud / examinateur
Henry Joël
Maître de Conférences, Université de Caen / examinateur
Baudy-Floc’h Michèle
Directrice de recherche CNRS, Université de Rennes 1 / examinateur
Fleury Yannick
Maître de Conférences, Université de Bretagne-Occidentale / Co-
encadrant de thèse
Bourgougnon Nathalie
Professeur, Université de Bretagne-Sud / Directrice de thèse
Recherche d’activités
antimicrobiennes chez des
mollusques marins.
Purification et caractérisation
partielle de peptides
antimicrobiens isolés à partir
de l’hémolymphe de
Crassostrea gigas et de
bactéries associées.
présentée par
Defer – Diane
Préparée à L’UBS, Vannes (Laboratoire de Biotechnologie et
Chimie Marines, EA3884) et à l’UBO, Quimper (Laboratoire
Universitaire de Biodiversité et d’Ecologie Microbienne, EA3882)
tel-00485008, version 1 - 19 May 2010

tel-00485008, version 1 - 19 May 2010

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Diane Defer
Recherche d’activités antimicrobiennes chez des mollusques marins.
Purification et caractérisation partielle de peptides antimicrobiens isolés à partir de
l’hémolymphe de Crassostrea gigas et de bactéries associées.
Thèse de doctorat, Biologie, Université de Bretagne-Sud, 2009
Résumé
Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans
l’établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de
relations entre individus, au sein d’un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système
immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant
un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la
défense vis-à-vis d’autres organismes potentiellement pathogènes. L’objectif de ces travaux a
été d’identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des
gastéropodes d’importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense
antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques
bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes,
Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu’à partir de
l’hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase
solide C18 (SPE) et l’élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80%
d’ACN-0,1% TFA. L’activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur
un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l’activité antivirale a été déterminée in vitro
sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces
C. edule, L. littorea et C. gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non
cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l’activité détectée chez ces espèces a permis de
déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides
antimicrobiens a été conduite sur l’hémolymphe de C. gigas et a permis l’identification d’un
peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne.
L’hypothèse d’une association entre C. gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de
cultures d’huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l’hémolymphe
et a permis d’isoler 2 Vibrio spp. et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie
Pseudoalteromonas spp. souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé.
L’ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire
pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves.
Mots clés : Mollusques marins, activités antibactériennes et antivirales, peptides
antimicrobiens, purification.
tel-00485008, version 1 - 19 May 2010

tel-00485008, version 1 - 19 May 2010

ii
Diane Defer
Screening for antimicrobial activities in marine molluscs.
Purification and partial characterisation of antimicrobial peptides from Crassostrea
gigas hemolymph and associated bacteria
PhD Thesis, Biology, Université de Bretagne-Sud, 2009
Abstract
The chemical communication systems constitute an essential element in the establishment
of intra- or inter-species relationships in marine environment, weaving a dense network of
relations between individuals, in ecosystem. The invertebrates lacking of an immune system
and usually sessile produce this type of bioactive metabolites playing a crucial role in the
answer to the environmental pressures like the predation and the defence against potentially
pathogens organisms. The aim of this work was to identify antimicrobial peptides in
commercially bivalve and gastropod marine molluscs. Thus, the search for antimicrobial
molecules from peptidic nature was undertaken in acid extracts of bivalve molluscs
Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis, and gastropods Crepidula
fornicata, Buccinum undatum and Littorina littorea and from Crassostrea gigas hemolymph.
The extracts were pre-purified by Solid Phase Extraction C18 (SPE) and elution was ensured
by three successive steps of 10%, 40% and 80% of ACN-0.1% TFA. The antibacterial
activities were assayed by determination of the CMI against a panel of target bacteria
including Gram+ and Gram- bacteria. In parallel, antiviral activities were assayed in vitro
against Herpes simplex virus type 1 and Vero cells by cell viability. The species C. edule, L.
littorea and C. gigas proved to be the most effective and non cytotoxic species. A partial
characterization of the activity detected in these species allowed determining the protenaceous
nature of the active molecules. The purification of antimicrobial peptides realised on the C.
gigas hemolymph led us to the identification of a peptide which structure lets foresee a
bacterial origin. The hypothese of an association between C. gigas and bacteria led us from
non axenic oysters culture to search for antagonist bacteria in C. gigas hemolymph and has
conduced to isolate 2 Vibrio spp. and 3 Pseudoalteromonas spp. The Pseudoalteromonas spp.
hCg 5 strain, allowed to partially characterized an active compound. Whole of these results
suggests that the bacteria associated with the immune system could play an essential function
of defence in bivalves.
Keywords : Marine molluscs, antibacterial and antiviral activities, antimicrobial peptides,
purification.
tel-00485008, version 1 - 19 May 2010