– UE VIII –
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2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) Sciences analytiques – UE VIII – Électrophorèse capillaire (suite) Semaine : n°11 (du 14/11/2016 au 18/11/2016) Date : 17/11/2016 Heure : de 8h00 à 9h00 Binôme : n°30 Professeur : Pr. FOULON Correcteur : n°8 Remarques du professeur • dernier cours PLAN DU COURS I) Principes et généralités A) Principe général B) Appareillage C) Les différentes étapes d'une analyse D) Les phénomènes à l'origine du transport et de la séparation E) Les paramètres fondamentaux 1) Grandeur de rétention 2) Résolution II) Application de l'électrophorèse à l'analyse qualitative et quantitative A) Analyse qualitative B) Analyse quantitative III) Conclusion 1/13 2016-2017 I) Électrophorèse capillaire (suite) Principes et généralités A) Principe général Électrophorèse capillaire : technique séparative basée sur la migration, dans un capillaire et sous l'effet d'un champ électrique, d'espèces présentes dans un échantillon en solution, porteuses ou non d'une charge électrique globale. B) Appareillage Le capillaire : • silice vierge ou greffée, recouverte de polyimide • longueur totale : 25 < L < 1 m • diamètre interne : 25 µm < di < 100 µm Ce capillaire on est amené à le remplir avec l'électrolyte de séparation, on veut aussi appliquer une ddp. On va le faire à l'aide d'une cartouche qu'on place ds le système d'électrophorèse pour réaliser les opérations de remplissage et de séparation. La cartouche : • circulation d'air • ou circulation d'un fluide cryogénique La cartouche fait aussi circuler un fluide autour du capillaire en permanence pour réguler la température par circulation d'air ou d'un fluide cryogénique (en laboratoire) qui permet de refroidir en permanence le système car quand on impose une ddp dans le capillaire, il y a un courant qui va circuler dans le système et donc il va y avoir une augmentation de la température par un effet Joule. Couplée à un système de régulation de la température : 10 °C < T < 40 °C • intérêt : obtenir des pics fins et éviter la formation de bulles (pics fantômes) La cartouche est couplée a un système de régulation, la température est fixée entre 10 et 40 °C. Si j'applique ma tension il y a un dégagement de chaleur donc si la température évolue au cours de la séparation on va avoir une déformation des pics, donc une mauvaise séparation et la formation de bulles ds le solvant qui vont se balader au hasard et qu'on ne pourra pas contrôler, on aura donc des pics fantômes. Récipients contenant les échantillons à analyser et les solutions d'électrolyte nécessaires à la séparation : 2/13 2016-2017 • • Électrophorèse capillaire (suite) Vmax = 5 mL pour les solutions d'électrolytes Vmin = 200 µL pour les échantillons à analyser si volume disponible faible Support mobile pour placer les échantillons à analyser et les solutions d'électrolyte nécessaires à la séparation L'électrolyte de séparation : L'électrolyte de séparation c'est la solution qu'on introduit ds le capillaire pour mener la séparation. • solution conductrice qui contient des ions • on travaille en milieu aqueux • on choisit comme électrolyte de séparation une solution tampon dont l’objectif va être de fixer le pH pour : ◦ contrôler l'état d'ionisation des molécules qui sont ionisables (acides faibles et bases faibles) ◦ ainsi que contrôler les phénomènes de migration ▪ car le pH joue sur le phénomène de déplacement des espèces Rappel : solution tampon : acide faible + sa base conjuguée fixe le pH dans le domaine pKa ± 1,5 Exemples : Système d'injection : 1) Hydrodynamique : air comprimé (P (Pa ou psi), t (s ou min)) On va rincer le capillaire et injecter l’échantillon à analyser. On immerge le capillaire dans la solution que l'on veut faire rentrer ds le capillaire. On va appliquer une pression d'air comprimé sur la surface des liquides. Le liquide va monter ds le capillaire. On peut aussi créer un vide à l'extrémité opposée pour aspirer le liquide ou utiliser une différence de hauteur entre les flacons qui sont à chacune des extrémités des capillaires pour entraîner un phénomène de siphonnage. Ici on travaille sur des quantités qui sont très très petites. 2) Electrocinétique : application d'une tension (U (kV) et t (s ou min) 3/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) Ce sont les molécules chargées qui seront injectées. Technique beaucoup moins utilisée car injection d'un type d'ion à chaque fois. On ne peut pas injecter des molécules neutres. Rq : le mode hydrodynamique est le système le plus utilisé. Dispositif d'application de la haute tension : • électrode de platine • générateur de tension : 5 kV < V < 30 kV tension continue • champ électrique intense E (V.cm-1) : E = V / L ◦ V = tension appliquée ◦ L = longueur du capillaire Le système de détection : 1) Détection « on line » (sur le capillaire) ◦ spectrométrie de fluorescence : ce n'est pas la plus courante ◦ détecteur électrochimique : mesure de la conductimétrie ou de l'ampérométrie ◦ spectrométrie UV-visible +++ : en mesurant l'absorbance de ce qui passe dans le capillaire On mesure l'intensité du rayonnement avant et après traversée du capillaire pour calculer une absorbance. Le trajet optique correspond au diamètre du capillaire (50 µm). 2) Détection « off line » (en sortie de capillaire) ◦ spectrométrie de masse : coûte 2 à 3 fois plus chère donc très peu utilisée. On peut doser de plus petites quantités mais ici la détection se fait off line, on récupère ce qui sort du capillaire Système de pilotage : PC + logiciel • tout est géré via un logiciel installé sur ordinateur C) Les différentes étapes d'une analyse 1) Rinçage du capillaire (avec NaOH et/ou H2O) puis avec l'électrolyte de séparation • application d'une pression élevée (20 psi) pendant 1 à 2 min • introduction d'un volume égal à 10 fois le volume interne du capillaire 4/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) 2) Injection de l'échantillon • application d'une pression faible (1 psi = 20 fois plus faible que pour le rinçage) pendant 0,5 à2s • J'impose ma différence de potentiel aux bornes du capillaire (anode/cathode) grâce à l’application d'une haute tension qui est appliquée grâce à l'immersion dans les flacons d'électrolyte de séparation. On a immergé une électrode de platine. C'est entre ces 2 électrodes qu'on va appliquer une haute tension qui va générer un champ électrique intense. Après avoir injecté mon échantillon, je vais replacer chaque extrémité du capillaire dans l'électrolyte de séparation pour avoir un circuit électrique complet. 3) Application de la tension et mesure du signal en fonction du temps • déplacement des analytes dans le capillaire à une vitesse dépendante de leur charge et de leur taille • séparation des analytes • obtention de l'électrophérogramme : correspond à la réponse du détecteur en fonction du temps 1er pic qui correspond à la substance qui s'est déplacée le plus vite en bleu et la plus lente en rose 5/13 2016-2017 D) Électrophorèse capillaire (suite) Les phénomènes à l'origine du transport et de la séparation 2 phénomènes à l'origine du déplacement des solutés ds le capillaire : 1) Électromigration ou flux électrophorétique Les espèces (anions et cations) se déplacent vers l'électrode qui leur est de signe opposé à une vitesse qui leur est propre. • Quand j'applique ce champ électrique, les ions sont soumis à une force électrostatique Fe qui les • A cette force s'oppose une force de frottement : Ff : • Les ions se caractérisent par une mobilité électrophorétique qui leur est propre : 6/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) Chaque anion ou cation en solution aura une mobilité électrophorétique qui lui est propre et dépend de sa taille et de sa charge. On a un vecteur déplacement (mobilité électrophorétique) qui entraîne les cations vers le détecteur alors que pour les anions on aura un déplacement vers l'anode (à l'opposé du détecteur). Pour une molécule neutre, pas de déplacement. Cette propriété qui est la mobilité électrophorétique qui caractérise une espèce est indépendante de la longueur du capillaire et de la tension appliquée. 2) L'électroendosmose ou flux électroosmotique Origine du flux électroosmotique : Il est lié à la capacité de la silice à s'ioniser. La silice, ce sont des groupements SiOH à la surface. En contact avec une solution aqueuse (acide faible), elle est capable de perdre des ions H+ pr donner des ions SiO- et des H3O+. La silice s'ionise et perd ses protons H+, on se retrouve avec une surface sur le capillaire qui est anionique (excès de charge négative sur le capillaire). Il y a toujours excès de cations en solution par électroneutralité du système dans sa globalité. Ces cations 7/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) vont avoir tendance à venir se coller sur le capillaire pour former une couche de cations qui vont être fixes et fortement absorbés à la paroi du capillaire. Il se forme une 2eme couche qui est diffuse, où il y a un excès de cations qui ne sont pas absorbés directement par les parois du capillaire, ils vont avoir une capacité à se déplacer. L’ensemble de ces 2 couches est appelé la double couche électrique de cations qui se forme sur les parois du capillaire. => excès de charges - sur le capillaire, excès de cations + en solution -> formation d’une double couche électrique de cations sur les parois du capillaire Ces cations en excès sont des ions solvatés, quand je vais imposer une ddp au bord de mon capillaire, les cations vont êtres attirés par la cathode. Les cations solvatés, comme ils sont plus nombreux, vont attirer toute la solution vers la cathode = flux électroosmotique. Cela se produit seulement lorsque ma silice est ionisée donc cela va être dépendant du pH. • • • A pH 2 : ma silice est neutre je n'ai pas d'excès de cations, lorsque j'impose ma ddp, globalement il n'y a aucun déplacement de l'électrolyte. C'est quand j'ionise que ce phénomène augmente et il sera maximal quand toute la silice sera ionisée. Quand j'augmente le pH, j'augmente l'ionisation de la silice. La mobilité du flux électroosmotique ne dépend pas de l'état d'ionisation des espèces. Elle est liée au système et non pas aux espèces à séparer. Bilan : le mouvement des solutés ds le capillaire résulte de la somme des 2 phénomènes : le flux électrophorétique et le flux électroosmotique. La mobilité apparente traduit le déplacement global dans le capillaire. 8/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) (µeof ) Ce flux est commun à tout le monde donc j'ai le même vecteur pour chaque espèce. • • Si j'ai un cation, une molécule neutre ou un anion, ces 3 espèces sont soumis aux flux électroosmotique qui est l'écoulement de la solution vers la cathode. J'ai un vecteur déplacement qui traduit l’attraction du cation par la cathode, la molécule neutre et l'anion en raison de l'écoulement de la solution avec le flux électroosmotique. (µe) Si j'ai une molécule chargée, elle a une mobilité électrophorétique qui lui est propre : • • • cation : vecteur déplacement orienté dans le même sens que le flux électroosmotique car il est attiré par la cathode la molécule neutre : n'a pas de mobilité électrophorétique donc je n'ai pas de vecteur l'anion : il est attiré par l'anode donc il y a un vecteur déplacement en sens opposé (µapp) Le déplacement des mes espèces étant lié à ces 2 forces (flux électroosmotique et mobilité électrophorétique), je vais faire la somme des vecteurs pour imaginer à quelle force elles sont soumises. • cation : 2 vecteurs du même côté = grand vecteur • neutre : elle n'est soumise qu'au flux électroosmotique donc je n'ai qu'un petit vecteur • anion : 2 vecteurs opposés = vecteur très petit J'ai 3 vecteurs déplacements : • pour le cation le vecteur est élevé, elle sort donc rapidement et en premier • ensuite on a la molécule neutre • et en dernier l'anion qui est ralenti par le fait qu'il est attiré par l'anode Bilan : 1) Influence de la taille des ions Si on prend une famille de cation : • si le rayon augmente • le rapport de q/r diminue • donc on va avoir une mobilité électrophorétique qui va diminuer • donc quand la taille de l'espèce cationique augmente, j'ai une mobilité apparente qui diminue (attention erreur sur le schéma) • donc le gros cation sort après un temps plus important que le petit cation Rq : pour les anions c'est du plus grand au plus petit 9/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) 2) Influence de la charge des ions Pour les cations : • quand j'augmente la charge des cations • la mobilité électrophorétique (en valeur absolue) augmente • la mobilité apparente augmente • donc un cation porteur de 2 charges sort plus vite qu'un cation mono-chargé Rq : erreur sur le diapo : mettre des charges négatives pour les anions en violet • si j'ai un dianion, sa charge augmente • sa mobilité électrophorétique sera supérieure • le On va pouvoir séparer en électrophorèse la famille des cations par rapport à la famille des anions et à la molécule neutre. On va pouvoir séparer ds une même famille les espèces selon la taille ou la charge. Mais si je travaille ds des conditions simples, les espèces neutres ne sont pas séparées car elles ont la même mobilité apparente donc elles se déplacent toutes à la même vitesse. On peut quand même séparer des molécules neutres entre elles, mais il faut mettre des additifs supplémentaires ds l'électrolyte de séparation. Conclusion : sans additif dans l'électrolyte de séparation, seuls les ions sont séparés entre eux, contrairement aux molécules neutres qui migrent toutes en même temps. E) Grandeurs fondamentales 1) ➢ Grandeurs de rétention Le temps de migration : tm ✔ temps écoulé entre le moment de l'injection et le moment ou le soluté arrive en concentration max ds le détecteur ✔ en électrophorèse capillaire on ne définit pas de temps mort to 10/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite) ➢ Efficacité ou nombre de plateaux théorique : N ✔ dépend de la largeur à la base et du temps de migration qui caractérise la finesse de nos pics ✔ propre à chaque soluté ✔ dépend de la longueur de la bande d'injection ✔ dépend des phénomènes d'absorption ➢ La hauteur équivalente à un plateau théorique : H ✔ H = L/N 2) II) La résolution Application de l'analyse qualitative et quantitative A) • • Analyse qualitative Identification des composés d'un mélange par comparaison à des échantillons témoins. Analyse d’échantillons témoins purs ds les mêmes conditions d'analyse que mon mélange. 11/13 2016-2017 B) • Électrophorèse capillaire (suite) Analyse quantitative Dosage d'un ou plusieurs composés dans un mélange. On va utiliser l'étalonnage interne (contraire de ce qu'on fait en TP pour simplifier). Il faut retenir qu'en électrophorèse capillaire c'est toujours l'étalonnage interne qui est utilisé. Rq : l'aire corrigée est l'aire du pic divisée par le temps de migration du composé. Cela permet de s'affranchir des variations de la surface du pic liées à des modifs de la vitesse du passage des espèces ds le détecteur et non à une différence de concentration. Cette vitesse de passage dépend de la mobilité apparente. III) Conclusion 12/13 2016-2017 Électrophorèse capillaire (suite)
