06 10 16 9h 10h hemato tagzirt

2016-2017
Le PNN, propriétés et fonctions
Hématologie
– UEVII: Sciences biologiques–
Annexe complet sur Moodle
Semaine : n°5 (du 03/10/16 au
09/10/16)
Date : 06/10/2016
Heure : de 9h00 à
10h00
Binôme : n°81
Professeur : Pr. Madjid
Correcteur : n°79
Remarques du professeur
• Diapos sur Moodle
• Séance de TP commence à 13h30
• ED obligatoire et à préparer
• Peu d'étudiants en cours !!!!:)
PLAN DU COURS
I. Généralités
a) Morphologie, caractéristiques
b) Principaux récepteurs membranaires
II. Propriétés des PPN
a) Recrutement
1) Roulement
2) Polarisation
3) Activation par les facteurs chimiotactiques
4) RCPG
5) Adhésion ferme
6) Diapédèse
7) Migration tissulaire
b) Réponse pro-inflammation
1) Phagocytose
2) Bactéricidie
3) Dégranulation
4) NADPH oxydase
1
I. Généralités
50%-70% des leucocytes circulants : durée de vie courte (quelques heures), turn-over rapide (si on en a
besoin,le déversement est très rapide) , cellules matures morphologiquement reconnaissables, se trouvant
dans la moelle osseuse. Ce sont les leucocytes les plus nombreux ++
3 répartition :
•
compartiment de réserve médullaire : très facilement mobilisable, durée de vie courte (3-5jours)
•
compartiment vasculaire : cellule transitoirement sanguine (6 à 8h) : pool circulant (2 à 7,5G/L) et
pool marginé sur l'endothélium (fixé sur la mono couche de cellules endothéliales donc la filtration
sera plus rapide)
•
Compartiment tissulaire (1-3jours) : infiltré dans
le tissus.
3 états du PNN dans le compartiment vasculaire :
•
au repos (inactif)
•
conditionné (pré activé) : intermédiaire, et
permet au PNN, suite à un 2nd stimuli de s'activer
plus rapidement et d'agir de manière rapide en
conséquence
•
actif
Rôles :
•
Régulation de la réponse immunitaire innée ( avec une fonction antibactérienne, mais non exclusive
au PNN) : ex des patients neutropéniques (faible en PNN) seront soumis à un risque infectieux.
•
Réponse inflammatoire, sous l'effet de facteurs de croissance, cytokines (chimiokines, interleukines
IL) : les PNN sont des granulocytes avec des granulations dans le cytoplasme qui sont remplies
d'enzymes, de facteurs de croissance et donc quand les PNN sont activés, ces granulations vont se
déverser dans l'environnement.
•
Cependant, a un effet délétère dans les maladies inflammatoires (ex glomérulonéphrétites aiguës ;
détresse respiratoire, maladies inflammatoires du tube digestif) quand le nombre de PNN est très
important (donc activation trop importante)
a) Morphologie, caractéristiques
•
Taille de 12-18 µm : soit 2-3 fois la taille d'une hématie. Plutôt ronde.
•
Rapport N/C : 0,5 → le noyau prend la moitié de la place du cytoplasme de la cellule
•
Noyau multilobé : 3-6 lobes reliés par des ponts chromatiniens, avec de la chromatine dense et
mottée
•
Cytoplasme : clair, avec des granulations neutrophiles (beige, marron), nombreuses et dispersées,
fine et hétérogènes (dû au différents types de granulations 1aire, 2aire, 3aire) : on ne peut pas les
quantifier tellement elles sont nombreuses
2
b) Principaux récepteurs membranaires
Le PNN joue un rôle dans la réponse anti-inflammatoire avec des stimuli (ex peptides) via des récepteurs. Ce
PNN, sur sa surface, contient de nombreux récepteurs (voir ci-dessous)
A côté de ces récepteurs, on a des molécules d'adhésion : le PNN est une molécule circulante mais aussi c'est
une cellule infiltrante dans le tissu. Donc pour adhérer la surface des cellules endothéliales, elle a besoin de
ces molécules (L-sélectines, et les intégrines CD18/CD11b)
Elles présentent aussi des récepteurs à l'anticorps, notamment pour les immunoglobulines de type G et A,
mais aussi des récepteurs au complément jouant un rôle important dans les fonctions de phagocytose du
PNN.
•
Récepteurs du complément
•
Récepteurs aux cytokines et chimiokines
•
Récepteurs aux Ac
•
Molécules d'adhésion cellulaire
•
Molécules de reconnaissance et présentation des Ag
•
Molécules de reconnaissance des molécules membranaires
II. Propriétés des PPN
a) Recrutement
C'est la première cellule infiltrant massivement le foyer inflammatoire. Lorsqu’un mécanisme inflammatoire
se met en place, les 1ères cellules présentes sur le site inflammatoire sont les PNN.
Les différentes étapes du recrutement forment une chorégraphie : les étapes sont effectuées suite à une
infection bactérienne.
1) Roulement
Les PNN roulent sur la paroi endothéliale : circulent dans le sang périphérique, mais aussi peuvent rouler
(cependant vont moins vite que les autres PNN qui sont circulants) à la recherche de stimuli à la surface des
cellules endothéliales (= cellules sentinelles) et détecte des changements moléculaires associés à
l'inflammation (car quand sera infecté, les cellules endothéliales vont sécréter des cytokines).
Ainsi :
•
Processus de marginalisation normal et réversible
•
Détectent les changements moléculaires associés à l'inflammation
•
Réagissent à des stimuli IL8, TNFα, IL1-β, IL-17, fMLP via des récepteurs membranaires
3
•
Implication des sélectines (« selected » + lectins)
Les sélectines (sucres) existent sous 3 types :
•
L-sélectine (CD62L) – expression par les leucocytes
•
E-sélectine – expression par les cellules endothéliales
•
P-sélectine – expression par les cellules endothéliales et plaquettes
Les sélectines sont toujours présentent à la surface des cellules, et jouent un rôle important dans les
interactions avec les récepteurs correspondants et les interactions ont une faible affinité et transitoires
(réversibles : attachement/détachement)
ENDOTHELIUM
PNN
RÔLE
glyCAM-1
CD62L : se lie à au glyCAM-1
Stabilise le roulement à la surface
de l'endothélium
P-sélectine
PSGL1 : liée à la P-sélecine de
l'endothélium
Diminue vitesse du roulement
E-sélectine
ESL1
Entretien l’interaction
L’ensemble de ces mécanismes permet la transition du roulement à l'adhésion (qui est encore réversible).
L'adhésion entraîne, en fonction du flux sanguin, une polarisation/front de polarisation.
2) Polarisation
Formation d'un front de migration avec 2 pôles :
•
à l'avant de la cellule : fillipode ou lamellipode
•
à l'arrière de la cellule : un uropode
La PSGL1 joue un rôle essentiel : elle va être reliée au cytosquelette du PNN et permettre sa
déformation/modification de sa morphologie en vue des étapes suivantes (notamment l'activation)
3) Activation par les facteurs chimiotactiques
Chimiotaxie : attraction cellulaire
Les facteurs sont IL8, PAF .. qui sont pro-inflammatoire particpant à l'activation de la cellule et sont libérés
par la cellule endothéliales et permettre son activation.
Production de médiateurs par l'endothélium vasculaire : IL-8, PAF, TNFα, IL1β (cytokine pro inflammatoire
participant à l'activation de la cellule, puis sont libérés par la cellule endothéliale).
Au cours de l'activation, on aura une expression croissante d'intégrine (de CD11b et de CD18).
Lorsque le PNN est activé, on a une augmentation de leur expression, → Entraîne coupure de la CD62L
(diminution de l'expression) par l'expression d'une métalloprotéinase : lors de l'activation par différentes
chimiokines, ces granulations se dégranulent et les vésicules fusionnent avec la membrane plasmique, et ces
vésicules contiennent le CD11b et CD18 et ainsi ces récepteurs se trouvent à la surface du PNN.
Ces différents médiateurs vont agir sur des récepteurs à la surface des PNN : ces récepteurs sont de type
récepteurs couplés aux protéines G.
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4) RCPG
Récepteurs à 7 domaines TM, complexe formé des protéines Gα, Gβ et Gγ.
Forme inactive lié au GDP, et la forme active liée au GRP : Gα se dissocie, Gβ et Gγ participent aux voies
de signalisation
Le 2nd messager est activé par la phospholipase C : activation de la phosphatidylinositoltriphosphate (PPI3),
génération localisée de DAG + 1,4,5 triphosphate (Ca2+ + activation de la PKC)
PPI3 participe à la réticulation des filaments de F-actine, et à la polarisation de la cellule par la création d'un
gradient interne.
5) Adhésion ferme
Expression des intégrines du PNN
PNN circulants → activés : induit un arrêt du roulement, une adhésion ferme irréversible, et l'initiation du
processus de diapédèse.
Cette adhésion est irréversible et implique l'intégrine CD11b, et CD18, on passe de l'état PNN circulant à un
état de PNN activé : d'ailleurs pour observer l'état d'activation des PNN, on utilise la cytométrie de flux où
on étudie l'expression de différents récepteurs, en utilisant des Ac dirigés vers des Ag. Ces Ac présentent un
chromophore et quand le cytomètre détecte la présence des Ac, plus le signal est important, plus l'Ag est
présent dans la cellule.
Quand on étudie l'expression de CD18 ou/et CD11b, l'expression dans la cellule activé au niveau des PNN,
est beaucoup plus importante que dans les cellules au repos. Expression des intégrines → adhésion ferme et
irréversible et initiation à la diapédèse (infiltration dans les tissus)
L'intégrine est un récepteurs avec 2 sous-unités : alpha et béta.
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6) Diapédèse
Les intégrines CD11b, CD18 et CD11a vont se lier à des récepteurs de la cellules ICAM1 et ICAM2.
C'est la dernière étape, le PNN a sur sa surface différents récepteurs (PECAM1 et JAM1 qui e lie à PECAM1
et JAM1 qui sont aussi sur les cellules endothéliales) qui sont homophiles : car sont exprimés par la cellule
endothéliale et par le PNN. Il existe d'autres types d'interactions qui sont hétérophiles car ont des interactions
différents (CD11b, CD18 sur le PNN) qui interagissent avec JAM-C à la surface de la cellule endothéliale.
CD11b et CD18 joue un rôle essentiel dans l'étape d'activation du PNN, d'adhésion ferme et dans
l'étape de diapédèse +++.
Au cours de cette diapédèse on aura un désassemblage des complexes cadhérine/caténine. On va séparer les
différentes jonctions par la libération d'élastases par le PNN.
Le PNN s'infiltre de manière transcellulaire et c'est la cellule endothéliale qui envoie des projections
recouverte de molécules d'adhésion→ le PNN peut donc traverser la mono couche de cellule endothéliale.
Arrivé dans le tissu, le PNN va devoir avancer jusqu'au niveau de la zone inflammatoire. Cette traversée sera
dépendante de l'expression de métaloprotéinase9 (qui sont présentent dans les vésicules 3aires de type
gélatinase) qui ont des interactions avec les intégrines et les chimiokines.
Ainsi :
→ PNN traverse à la manière d'amiboïdes la barrière endothéliale par interactions homophiles séquentielles :
PECAM-1/ PECAM-1, JAM-A/JAM-A mais aussi des interactions hétérophiles : CD11b/CD18B avec JAMC.
→ Désassemblage des complexes cadhérine/caténine : sécrétion d'élastase par les PNN
→ Migration trans-endothéliale peut s'effectuer par voie transcellulaire : la cellule endothéliale forme des
projections cytoplasmiques recouverte de molécules d'adhésion.
7) Migration tissulaire
Les PNN peuvent se déplacer rapidement : vélocité/vitesse de 20μm/min
Au moment de la migration, on a une réorganisation constante du cytosquelette du PNN et deux formes de
migration principalement décrite :
•
chemocinétique : mouvement global aléatoire de la cellule en présence de concentrations uniformes
de facteurs chimiotactiques
•
chimiotaxie : orientation (ou directionnelle) dans un gradient de chimiokines. C'est cette méthode qui
semble être le plus décrit au niveau du PNN, il aura un gradient. Le PNN, dans le tissu, recherche
des stimuli de manière croissante, ce qui permet de diriger le PNN en fonction de la concentrations
croissante de ce médiateur pro-inflammatoire.
b) Réponse pro-inflammatoire
Liée à la production de cytokines ++ au stade précoce de la réponse immunitaire innée : déverser au début de
la réponse immunitaire
Lorsque cette réponse est apportée par une bactérie, le PNN va agir selon différents mécanismes pour
détruire l'agent pathogène :
→ Phagocytose : ingestion de particules étrangères dans un compartiment intracellulaire (=phagosome),
nécessite un contact direct entre l'agent pathogène et le PNN.
→ Bactéricidie en plusieurs étapes: Dégranulation du PNN, formation du complexe NADPH oxydase
(nicotamide adénine dinucléiotide phosphate), présence de la MPO, et l'exocytose du contenu lysosomal
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→ Formation de neutrophils extracellular Traps (NETs) : la NETose est la formation de filets constitués
d'ADN et d'enzymes intervenant dans la destruction du pathogène. Ce mécanisme est très récent, utilisé
notamment dans les thromboses.
→ Production de médiateurs pro-inflammatoires (très nombreux).
1) Phagocytose
→ Reconnaissance de l'agent pathogène : nécessite contact direct entre la cellule et l'agent pathogène donc
nécessite des récepteurs à la surface des PNN reconnaissants des ligands présents sur la bactérie. Sur le PNN,
on a de nombreux récepteurs, tels que :
–
Récepteurs aux opsonines : CD64, CD32 ou récepteur
MCY, vont lier des
opsonines/immunoglobuline de type G1 et G3 présents à la surface des agents bactériens.
L'opsonisation de la bactérie augmente les capacités de reconnaissance du PNN en vue de sa
phagocytose → ainsi, ils augmentent la phagocytose.
–
Récepteurs du complément : relie des protéines dérivés du complément notamment C5a.
→ Internalisation : 1ère étape. Processus actif, extension et invagination de la membrane du PNN. En effet le
microbe attire le PNN via des récepteurs du complément qui vont entourer le pathogène → processus de
phagocyte commence. Ensuite on a une ingestion du phagocytose de l'agent bactérien à l’intérieur d'un
compartiment : le phagosome. Ce dernier va fusionner avec des lysosomes de la cellule pour former le
phagolysosome. A l'intérieur on a des enzymes, donc sera détruit et exocyter vers l'extérieur.
→ Dégranulation : formation du phagosome, endosomes précoces, endosomes tardifs, phagolysosomes.
Le phagosome se lie donc au lysosome pour forme le phagolysosome où l'agent bactérien sera détruit. Cet
ingestion à l'intérieur du phagolysosome sera phagocytée vers l'extérieur.
Ce mécanisme est dépendant de l'oxygène.
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2) Bactéricidie
→ Mécanisme de dégranulation indépendant de l'oxygène : implique seulement le déversement de
substances bactéricides dans la phagosome. Le PNN contient des enzymes différentes qui sont présentes
dans les granulations des PNN et permettant la destruction de pratiquement toutes les structures biologiques
→ Myélopéroxydase MPO : sera libérée dans le phagolysosome, et catalyse la formation d'acide
hypocloreux HoCl (eau de javel) qui est hautement bactéricide
→ Production de formes réactives de l'oxygène (ROS) donc dépend de d'oxygène : implique l'activation du
système enzymatique de la NADPH oxydase intervenant dans l'explosion oxydative.
3) Dégranulation
2 processus distincts de dégranulation :
•
fusion des granules azurophiles avec les vacuoles phagocytaires
•
fusion des vésicules avec la membrane plasmique
Les granulocytes renferment un équipements enzymatiques riches et variés (des produits
bactéricides, bactériostatiques et protéolytiques) → Élimination du corps étranger.
8
Fusion des granules azurophiles avec les vacuoles phagocytaires :
Formation du phagolysosome : livraison des enzymes protéolytiques →
•
collagènase : présente une activité anti microbienne.
•
protéines à activité antimicrobienne contre bactéries Gram + et Gram – (lactoferrine ++ capte le fer,
peptide NGAL se lie aux sidérophores, cytochrome b558 (NADPH oxydase) et MPO.
•
Les bactéries nécessitent le fer pour leur croissance +++. Or le PNN exprime une protéine
(lactoferrine) qui sera déversée dans le phagolysosomes qui captera le fer des bactéries pour
diminuer et interdire leur croissance.
•
Le PNN a aussi le peptide NGAL : qui se liera au sidérophores (récepteurs exprimés par les
bactéries permettant de se lier au fer, et ainsi de favoriser leur croissance). Le PNN libérera la
lactoferrine du fer environnant et la protéine NGAL qui inactivera le sidérophore bactérien.
•
Cytochrome b558 : ou NADPH oxydase, intervient dans la production de ROS et dans la MPO
En fonction des concentrations des agents bactéricides et limitation des dommages tissulaires environnant
4) NADPH oxydase
Rôle important dans l'explosion oxydative (=production des ROS)
REPOS : complexe protéique NADPH dispersé.
Complexe membranaire dissocié du complexe
cytosolique
ACTIF : assemblage des sous-unités par des stimuli
extérieurs
- Membranaire : cytochrome b558 = gp91phox +
protéine22phox
- Cytosolique : p40phox, p47phox, p67phox, p21rac
lié au GDP inactive, en association avec Rho-GDI
qui gaine sa queue hydrophobe pour permettre la
solubilité.
- Translocation des composants cytosoliques vers la
membrane plasmique
- Formation d'un complexe actif avec le cytochrome
b558
- Génération de peroxyde d'hydrogène (H2O2) qui
est une ROS. Donc la bactéries contient une catalase
permettant une détoxification de H2O2 et le
transforme en eau (élément inactif pour la bactérie).
Le PNN a aussi la MPO qui transforme l'H2O2 en
acide hypocloreux + OH- qui seront associés à la
protéases → destruction.
9
Ainsi :
•
Dépolariasation de la membrane phagosomale compensée par l'influx de K+ dans le phagosome :
augmentation du pH dans le phagosome et solubilisation et activation des protéases.
•
Défense contre les bactéries +++ : grâce à la catalase bactérienne, mécanisme de détoxification et
avec la MPO des PNN.
•
Espèce réactives de l'oxygène ROS + protéases = destruction du pathogène.
Attention : Cas des mycobactérium tuberculosis (bacille de la tuberculose) : Le PNN n'est pas capable de
détruire le bacille de la tuberculose, et intervient dans l'amplification de l'affection (effet inverse)
Il existe des déficits génétiques en composant de la NADPH : grranulomatose septique chronique. Donc la
mutation de NADPH entraîne des maladies. C'est donc une enzyme très importante.
5) MPO
Protéine très cationique chargée positivement (car contient arginine+++)
A un effet antimicrobien +++ car est capables de détruire :
→ paroi des différents agents infectieux
→ AGPI, l’ADN
Mais entraîne des dommage tissulaire +++ et des stress oxydatif +++ → perturbe le potentiel membranaire
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des mitochondries et entraîne aussi des mécanisme de mort cellulaire
Déficits héréditaires et acquis en MPO (SMD) : le plus souvent aymptomatique. Cet MPO est utilisé dans la
détection de certaines pathologies dans le diagnostic de leucémies aiguë myéloïdes (LAM) : les cellules sont
positives à la détection de la MPO dans les LAM.
6) Exocytose
2ème processus de dégranulation.
→ Fusion des vésicules avec la membrane plasmique (=exocytose). Lorsque les vésicules fusionnent avec la
membrane plasmique, le contenu enzymatique de ces granules se déversent dans le milieu environnant. La
mobilisation et l'exocytose des granulations ont un ordre :
•
d'abord les vésicules de sécrétion sont les plus mobilisables > ensuite granulations IIIaire >
granulations IIiaire > granulations Iaire (moins mobilisables que les vésicules de sécrétion)
•
Permet aux protéases de se déverser dans tout l'environnement de la cellule :
•
Entraîne dommages tissulaires +++ (maladies inflammatoires chroniques)
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