Etude de p53 et blocage du cycle cellulaire

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Etudes de p53 et Blocage du cycle cellulaire en G1/S
2006-2007
Cortèse Thomas
Zemmar Adbel

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PLAN
Résumé ......................................................................................................................................2
I. Introduction......................................................................................................................3
1) Structure de p53 .............................................................................................................3
2) Fonction de p53 et modifications post-traductionnelles ................................................4
3) Réponse dépendante de p53 après un stress génotoxique..............................................6
4) Cdc25A et la prolifération :............................................................................................7
II. Résultats............................................................................................................................9
1) Recherche des promoteurs cibles de p53 :.....................................................................9
a- Les techniques pour identifier les cibles d’un facteur de transcription......................9
b- Les résultats de l’étude des gènes cibles de p53. ..................................................... 11
2) Etude de la régulation de la phosphatase cdc25A........................................................11
III. Projets de recherche : ....................................................................................................14
1) Isolation des partenaires protéique qui stabilisent la phosphatase cdc25A :................ 14
a- Le split ubiquitine.....................................................................................................14
b- Caractérisation du ou des partenaires de cdc25A : ..................................................17
2) Vérification de l’interaction par CoImmuno-Précipitation :........................................17
3) Interférence sur l’ARN pour voir le rôle des partenaires :........................................... 18
IV. Perspectives.....................................................................................................................19
Annexes ...................................................................................................................................20

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Résumé
La protéine p53 est un facteur transcriptionnel prépondérant dans la protection du
génome. Couramment appelée « suppresseur de tumeur » et « gardien du génome », cette
protéine est capable d’activer et de réprimer des gènes impliqués dans des processus
biologiques importants. p53 est l’un des marqueurs le plus étudié en cancérologie. Ainsi p53
est réellement une des clés de la régulation cellulaire aux stress génotoxique, sa réponse peut
se faire par la voie de l’apoptose, vers la sénescence ou l’arrêt du cycle cellulaire, en activant
les enzymes de la réparation de l’ADN. Pour ces raisons, son altération entraîne le
franchissement éventuel d’une étape vers la cancérogenèse.
Dans une situation classique, des senseurs vont détecter un dommage sur le génome.
Il s’en suit une activation de p53 conduisant au blocage du cycle cellulaire au niveau des
points de contrôle (checkpoints). Dans le cas de cellules où p53 est mutée (environ 50% des
cancers), le cycle cellulaire progresse malgré la présence d’un dommages sur le génome. Ceci
conduit à une prolifération non contrôlée des cellules (cancers), et une forte accumulation de
mutations génétiques. La protéine cdc25A (cell division cycle 25A) est une des phosphatases
importante qui contribue à la progression du cycle cellulaire au point de contrôle G1/S. Des
études montrent que l’expression de cdc25A est indirectement inhibée par p53, ce qui affecte
la stabilité de cdc25A lors d’un stress. Dans une lignée cancéreuse ayant p53 mutée, quelles
protéines stabiliseraient cdc25A, conduisant à la prolifération ? Dans ce projet, nous nous
focaliserons justement sur l’identification et la caractérisation des partenaires potentiels de
cdc25A. Ces partenaires nous permettraient de compléter nos connaissances sur les
mécanismes de la prolifération tumorale. Nous utiliserons la technique du split ubiquitine
pour identifier ces protéines. L’importance des partenaires de cdc25A dans la progression du
cycle cellulaire sera testée par interférence sur l’ARN (RNAi).
Dans l’avenir, des antagonistes de ces partenaires protéiques, constitueront peut être
une nouvelle stratégie thérapeutique contre la prolifération.

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I. Introduction
La protéine p53, a été découverte en 1979 par Linzer et Levine1. En 1989, Baker2 a
mis en évidence son rôle anti-oncogène. Entre 1993 et 1996, plus de 4300 études de
recherches ont été publiées sur cette protéine. Son rôle prépondérant dans le contrôle du cycle
cellulaire, et la protection contre la prolifération en réponse aux stress génotoxique lui a value
le surnom de « gardien du génome » ou « suppresseur de tumeur ».
1) Structure de p53
Le gène TP53 qui code la protéine p53 est localisé sur le bras court du chromosome
17 (17p13). Ce gène est particulièrement conservé au cours de l’évolution (cf. annexe 1). Il
s’agit d’une phosphoprotéine nucléaire de 53kDa et de 393 acides aminés répartis en 5
domaines (Weston A. and Godbold JH., 19973) (fig1). Les principaux domaines sont :
-le N ter, domaine transactivateur
-le domaine de fixation à l’ADN au centre
-le Cter (COOH), région de la régulation de l’activité de la protéine
Elle possède un Domaine de liaison à l’ADN (DNA-Binding) composé de 3 boucles
L1, L2 et L3 stabilisées par un ion Zn2+. Ce facteur transcriptionnel est doté d’un motif
structural boucle-feuillet-hélice (loop-sheet-helix) (Joerger AC., et al, 20064) (fig2a). La
forme active tétramérique de p53 (Patrick Chene, 20015) se fixe dans 2 sillons majeurs
successifs de l’ADN par l’intermédiaire des résidus situés sur les hélices α de chaque
Fig1 : Schématisation de l’organisation de p53 :
Transactivation, domaine d’interaction avec l’appareil de la transcription. Proline rich, domaine
riche en proline intervenant dans la voie apoptose et interaction protéine/protéine. DNA binding,
domaine de fixation à l’ADN. TET, domaine de tétramerisation de p53 contenant aussi les
domaines de translocation nucléaire NLS nuclear localisation signal et NES nulear exportation
signal. NEG, domaine principal de régulation de p53.
Transactivation Pro rich DNA BINDING TET NEG
TET TET
NESNLS
Transactivation Pro rich DNA BINDING TET NEG
TET TET
NESNLS
1- 42 60- 97 363- 393
323- 356
100- 299

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monomère p53 (fig 2b). Ce tétramère de p53 est capable de reconnaître un site spécifique de
10 paires de bases répété 2 fois (5’-PuPuPuC(A/T)GpyPyPyPy-3’ X2).
2) Fonction de p53 et modifications post-traductionnelles
Le rôle précis de p53 réside dans l’activation et dans l’inhibition de l’expression de
gènes qui sont impliqués dans de nombreuses fonctions essentielles. Son activité est
impliquée dans la régulation de processus tels que le cycle cellulaire, l’apoptose et la
réparation de l’ADN (Vogelstein B., et al, 20006 - Vousden KH., et al, 20027). La régulation
par p53 se fait grâce à une interaction avec une séquence promotrice spécifique sur ses gènes
cibles. Le facteur transcriptionnel p53 est aussi capable d’activer et de réprimer d’autres gènes
grâce à des régulations indirectes (Valbuena A., et al, 20068). Ces phénomènes faisant
intervenir des intermédiaires protéiques, il est difficile de les caractériser.
Son activité est finement contrôlée par des modifications post-traductionnelles sur ses
domaines principaux. Le domaine N-terminal présente différents sites de phosphorylation
alors que sa partie Cter est acétylée et sumoylée (Appella E. and Anderson C.W., 20019). De
Phe 341
Phe 338
ile332
Gly 334
Phe 328
leu 330
ile332
Arg 337
Phe 341
Phe 338
Arg 345
Asp 352
leu 344
Ala 347
leu 348
leu 350
Met 340
Phe 341
Phe 338
ile332
Gly 334
Phe 328
leu 330
ile332
Arg 337
Phe 341
Phe 338
Arg 345
Asp 352
leu 344
Ala 347
leu 348
leu 350
Met 340
B
A
fig2 : A. Structure cristallographique du p53 core-domain complexé avec l’ADN (3a).
L’ion zinc (jaune or), sites de mutations de p53 retrouvé dans les cancers (résidus bleu et orange), ADN
(cyan et violet).
B. Représentation du domaine de tétramerisation p53 avec les résidus impliqué dans l’interaction
protéine-protéine (p53-p53).