Etude de p53 et blocage du cycle cellulaire

Etudes de p53 et Blocage du cycle cellulaire en G1/S
2006-2007
Cortèse Thomas
Zemmar Adbel
AuthorQuery
0
PLAN
Résumé ...................................................................................................................................... 2
I.
Introduction ...................................................................................................................... 3
1)
Structure de p53 ............................................................................................................. 3
2)
Fonction de p53 et modifications post-traductionnelles ................................................ 4
3)
Réponse dépendante de p53 après un stress génotoxique .............................................. 6
4)
Cdc25A et la prolifération :............................................................................................ 7
II. Résultats ............................................................................................................................ 9
1)
Recherche des promoteurs cibles de p53 : ..................................................................... 9
ab-
2)
Les techniques pour identifier les cibles d’un facteur de transcription...................... 9
Les résultats de l’étude des gènes cibles de p53. ..................................................... 11
Etude de la régulation de la phosphatase cdc25A ........................................................ 11
III. Projets de recherche : .................................................................................................... 14
1)
Isolation des partenaires protéique qui stabilisent la phosphatase cdc25A :................ 14
ab-
Le split ubiquitine..................................................................................................... 14
Caractérisation du ou des partenaires de cdc25A : .................................................. 17
2)
Vérification de l’interaction par CoImmuno-Précipitation : ........................................ 17
3)
Interférence sur l’ARN pour voir le rôle des partenaires :........................................... 18
IV. Perspectives..................................................................................................................... 19
Annexes ................................................................................................................................... 20
1
Résumé
La protéine p53 est un facteur transcriptionnel prépondérant dans la protection du
génome. Couramment appelée « suppresseur de tumeur » et « gardien du génome », cette
protéine est capable d’activer et de réprimer des gènes impliqués dans des processus
biologiques importants. p53 est l’un des marqueurs le plus étudié en cancérologie. Ainsi p53
est réellement une des clés de la régulation cellulaire aux stress génotoxique, sa réponse peut
se faire par la voie de l’apoptose, vers la sénescence ou l’arrêt du cycle cellulaire, en activant
les enzymes de la réparation de l’ADN. Pour ces raisons, son altération entraîne le
franchissement éventuel d’une étape vers la cancérogenèse.
Dans une situation classique, des senseurs vont détecter un dommage sur le génome.
Il s’en suit une activation de p53 conduisant au blocage du cycle cellulaire au niveau des
points de contrôle (checkpoints). Dans le cas de cellules où p53 est mutée (environ 50% des
cancers), le cycle cellulaire progresse malgré la présence d’un dommages sur le génome. Ceci
conduit à une prolifération non contrôlée des cellules (cancers), et une forte accumulation de
mutations génétiques. La protéine cdc25A (cell division cycle 25A) est une des phosphatases
importante qui contribue à la progression du cycle cellulaire au point de contrôle G1/S. Des
études montrent que l’expression de cdc25A est indirectement inhibée par p53, ce qui affecte
la stabilité de cdc25A lors d’un stress. Dans une lignée cancéreuse ayant p53 mutée, quelles
protéines stabiliseraient cdc25A, conduisant à la prolifération ? Dans ce projet, nous nous
focaliserons justement sur l’identification et la caractérisation des partenaires potentiels de
cdc25A. Ces partenaires nous permettraient de compléter nos connaissances sur les
mécanismes de la prolifération tumorale. Nous utiliserons la technique du split ubiquitine
pour identifier ces protéines. L’importance des partenaires de cdc25A dans la progression du
cycle cellulaire sera testée par interférence sur l’ARN (RNAi).
Dans l’avenir, des antagonistes de ces partenaires protéiques, constitueront peut être
une nouvelle stratégie thérapeutique contre la prolifération.
2
I. Introduction
La protéine p53, a été découverte en 1979 par Linzer et Levine1. En 1989, Baker2 a
mis en évidence son rôle anti-oncogène. Entre 1993 et 1996, plus de 4300 études de
recherches ont été publiées sur cette protéine. Son rôle prépondérant dans le contrôle du cycle
cellulaire, et la protection contre la prolifération en réponse aux stress génotoxique lui a value
le surnom de « gardien du génome » ou « suppresseur de tumeur ».
1) Structure de p53
Le gène TP53 qui code la protéine p53 est localisé sur le bras court du chromosome
17 (17p13). Ce gène est particulièrement conservé au cours de l’évolution (cf. annexe 1). Il
s’agit d’une phosphoprotéine nucléaire de 53kDa et de 393 acides aminés répartis en 5
domaines (Weston A. and Godbold JH., 19973) (fig1). Les principaux domaines sont :
-le N ter, domaine transactivateur
-le domaine de fixation à l’ADN au centre
-le Cter (COOH), région de la régulation de l’activité de la protéine
323- 356
TET
NLS
1- 42
Transactivation
60- 97
TET
NES
363- 393
100- 299
Pro rich
DNA BINDING
TET
NEG
Fig1 : Schématisation de l’organisation de p53 :
Transactivation, domaine d’interaction avec l’appareil de la transcription. Proline rich, domaine
riche en proline intervenant dans la voie apoptose et interaction protéine/protéine. DNA binding,
domaine de fixation à l’ADN. TET, domaine de tétramerisation de p53 contenant aussi les
domaines de translocation nucléaire NLS nuclear localisation signal et NES nulear exportation
signal. NEG, domaine principal de régulation de p53.
Elle possède un Domaine de liaison à l’ADN (DNA-Binding) composé de 3 boucles
L1, L2 et L3 stabilisées par un ion Zn2+. Ce facteur transcriptionnel est doté d’un motif
structural boucle-feuillet-hélice (loop-sheet-helix) (Joerger AC., et al, 20064) (fig2a). La
forme active tétramérique de p53 (Patrick Chene, 20015) se fixe dans 2 sillons majeurs
successifs de l’ADN par l’intermédiaire des résidus situés sur les hélices α de chaque
3
monomère p53 (fig 2b). Ce tétramère de p53 est capable de reconnaître un site spécifique de
10 paires de bases répété 2 fois (5’-PuPuPuC(A/T)GpyPyPyPy-3’ X2).
A
B
Asp352
Phe 328
Met 340
Arg345
leu 330
Phe 341
Phe 341
leu 344
Ala347
Phe 338
ile332
ile332
Phe 338
leu 348
leu 350
Arg337
Gly334
fig2 : A. Structure cristallographique du p53 core-domain complexé avec l’ADN (3a).
L’ion zinc (jaune or), sites de mutations de p53 retrouvé dans les cancers (résidus bleu et orange), ADN
(cyan et violet).
B. Représentation du domaine de tétramerisation p53 avec les résidus impliqué dans l’interaction
protéine-protéine (p53-p53).
2) Fonction de p53 et modifications post-traductionnelles
Le rôle précis de p53 réside dans l’activation et dans l’inhibition de l’expression de
gènes qui sont impliqués dans de nombreuses fonctions essentielles. Son activité est
impliquée dans la régulation de processus tels que le cycle cellulaire, l’apoptose et la
réparation de l’ADN (Vogelstein B., et al, 20006 - Vousden KH., et al, 20027). La régulation
par p53 se fait grâce à une interaction avec une séquence promotrice spécifique sur ses gènes
cibles. Le facteur transcriptionnel p53 est aussi capable d’activer et de réprimer d’autres gènes
grâce à des régulations indirectes (Valbuena A., et al, 20068). Ces phénomènes faisant
intervenir des intermédiaires protéiques, il est difficile de les caractériser.
Son activité est finement contrôlée par des modifications post-traductionnelles sur ses
domaines principaux. Le domaine N-terminal présente différents sites de phosphorylation
alors que sa partie Cter est acétylée et sumoylée (Appella E. and Anderson C.W., 20019). De
4
nombreuses études montrent que les modifications post traductionnelles sur p53 modulent son
activité Chaque modification est réalisée par des enzymes spécifiques (fig 3).
1
363
52
Nter
4
9
15
18 20
33 37
393
Cter
66
44
315
81
320
371 372 373
CK1
DNAPK
Chk 1/2
CAK
p38 MAPK
376 378
382 386
392
?
?
JNK
Cdk2
P/CAF
PKC
CBP/p300 SUMO
ATM
PKR
CK2
ATR
Phosphorylation résidu Serine
Acétylation résidu Lysine
Phosphorylation résidu Thréonine
Sumoylation résidu Lysine
fig3: Modifications post-traductionnelles des domaines de Transactivation et de Régulation de p53.
CK1 (casein kinase) 1. ATM & ATR (Ataxia-telangiectasia-mutated & Ataxia-telangiectasia Rad 53 related).
DNAPK (DNA-dependent protein kinase). Chk ½ (Check 1 & 2). CAK (Cdk Activating Kinase). p38 MAPK
(mitogen-activated protein kinase 38). JNK (Jun Nter kinase). Cdk2 (Cyclin dependent kinase 2). P/CAF
(P300/CBP Associated Factor). PKC (Proteine kinase C). CBP/p300 (CREB-binding protein and p300). SUMO
(Small ubiquitin-like modifier). CK2 (casein kinase 2). PKR (Protein kinase RNA activated).
La stabilité et la dégradation de p53 sont aussi régulées par ces modifications posttraductionnelles. En effet la phosphorylation de p53 contrôle son interaction avec MDM2
(Mouse double minute 2), cette protéine est capable d’adresser p53 au protéasome.
La protéine MDM2 est un proto-oncogène à activité ubiquitine-ligase E3. L’adressage
au protéasome de p53 par MDM2 se fait selon deux niveaux de régulation. Le premier niveau
s’effectue dans le cytoplasme. L’ubiquitine ligase MDM2 se fixe sur le domaine N-terminal
de p53 (domaine transactivateur) et induit une ubiquitinylation du domaine C-terminal
(domaine régulateur) (Kubbutat MH., 199710). Le second niveau d’action de MDM2 se
déroule dans le nucléoplasme. MDM2 recrute HAC1 (Histone acetylase1) qui empêche p53
d’agir sur son gène cible en ne permettant pas le recrutement de l’appareil transcriptionnel. La
gêne stérique occasionnée par l’interaction p53/MDM2/HAC1 empêche l’interaction de p53
avec sa cible ADN, il peut alors être ubiquitinylé. Ces événements conduisent à la
translocation de p53 du noyau vers le cytoplasme et à sa dégradation par le protéasome. De
plus, en masquant les sites de fixations de ses cofacteurs, MDM2 intervient négativement
dans la transcription des gènes cibles de p53 (Bond GL., et al, 200411- Li M., et al, 200312).
5
Il est intéressant de noter que le gène MDM2 est une cible directe de p53. Lorsque
l’expression de p53 n’est plus nécessaire, p53 stimulera l’expression de son propre régulateur
négatif ce qui constitue une boucle d’autorégulation négative (Momand J., et al, 200013).
p53-(Nter)
p53
MDM2
MDM2
A
B
fig4 :Régulation de p53 par MDM2.
A et B. MDM2 (magenta) se fixe sur la partie Nter de p53 ( jaune) dans le cytoplasme ou bien dans le
noyau au niveau de l’ADN (bleu et vert) pour ubiquitinyler sa partie Cter et engendrer sa translocation et
sa protéolyse par la voie du proteasome.
A. Cristallographie (X-ray diffraction, Res=2.60 Å) du core de MDM2 complexé avec le peptide Nter de
p53 (code PDB :1YCR), modélisation Pymol
3) Réponse dépendante de p53 après un stress génotoxique
Les principaux stress génotoxique tel que les rayonnements γ, UV, drogues et déficit
en nucléotides constituent des voies d’activation de p53. Lors d’un dommage à l’ADN, les
principaux senseurs ATM (Ataxia-telangiectasia-mutated) et ATR (Ataxia-telangiectasiareleased) (Lackinger D. and Kaina B., 200014) ainsi que Chk1 et Chk2 interviennent.
Fig5. Mise en jeu de p53 : Mécanismes et effets
sur le cycle cellulaire
Réponses aux différents stress génotoxiques par
p53 avec ses principales cibles. P53 est activé par
les senseurs, il va alors pouvoir bloquer le cycle
en induisant l’expression de p21. Mais p53
pourra aussi induire l’expression de protéines
réparatrices de l’ADN par l’intermédiaire de
GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage
inducible 45). Si il y a trop de dommages la
cellule entre en apoptose grâce à l’activation des
gènes de l’apoptose : Bax, Puma, Noxa, Aip1.
6
Ils vont phosphoryler le domaine transactivateur de p53. D’autre part, l’acétylation du
domaine régulateur de p53 est réalisée par P300/CBP. L’ensemble de ces modifications posttraductionnelles permettent l’interaction avec ses gènes cibles. Ces cibles interviennent dans
la réparation de l’ADN, dans l’arrêt du cycle cellulaire dans la transition G1/S et dans
l’apoptose (Stark GR. and Taylor WR., 200615) (fig5).
L’intégrité de l’ADN transmis au cours de la division cellulaire est sous le contrôle de
« Check-points ou points de contrôles ». Le facteur transcriptionnel p53 joue un rôle clé au
niveau du cycle cellulaire entre les phases G1/S. Il va aussi autoriser ou non la duplication de
l’ADN, et la mitose à travers d’autre point de contrôle (Schwartz D., et al, 199816) (fig5). Le
passage G1/S dépend de la présence d’un dommage sur l’ADN ce point de contrôle est donc
appelé DDCP (DNA damage Check-point) (fig.6).
Fig6. Blocage du cycle cellulaire suite à un dommage à l’ADN.
La protéine p53 est activé par les senseurs de la génotoxicité : ATM, ATR
P53 va activer l’expression de p21cip qui est un inhibiteur des complexes cycline / cdk, il en découle un arrêt du
cycle cellulaire sur les différents checkpoints.
Chk 1 : Checkpoint kinase 1, ATM/R : Ataxia Telangiectasia Mutated / Released, P21cip : cycline dependent
kinase inhibitor 1A, Cdc25 : Cell Division Cycle 25, Mad2 : Mitotic Arrest Deficient 2.
4) Cdc25A et la prolifération :
C’est sur la régulation de la transition G1/S que nous nous focaliserons. Lorsque
l'ADN est endommagé, la protéine Cdc25A est dégradée ce qui arrête le cycle cellulaire. La
protéine cdc25A est une phosphatase qui est capable d’activer les complexes inducteurs du
cycle, en particulier le complexe constitué de Cdk2 (Cyclin dependant kinase 2) et de la
cyclineE (cycline de type E). Ce complexe va permettre le passage de la phase G1 à la phase
7
S uniquement s’il est activé par la déphosphorylation de Cdk2 (fig 7A) (Bartova I., et al,
200417). D’autres complexes peuvent intervenir, les complexes Cycline D/Cdk4 et Cyclines
E,A/Cdk2. Quand Cdc25A est inactive, ces complexes ne seront pas activés. En parallèle de
ce processus de contrôle, une accumulation de p53 dans la cellule induit l'expression de p21,
cette protéine est aussi un inhibiteur des complexes Cyclines E,A/Cdk2 (Ceballos E., et al
200018) (fig 7B). Ces deux voies de contrôles sont donc complémentaires, elles permettent de
réguler avec précision la quantité de complexes Cyclines E,A/Cdk2 nécessaire pour de ce
point de contrôle afin de permettre la progression du cycle cellulaire.
A
B
Fig7 :Regulation phase G1/S
Lorsque l’ADN est lésé l'activation de deux voies inhibitrices des complexes Cycline / Cdk de la phase S
permet d'arrêter le déroulement de la phase S.
A. Le complexe Cdk2/Cycline E est inactivé par phosphorylation de la thréonine 14 et tyrosine
15Wee1 et myt1 (Kinases inhibitrices) et activé par le phosphatase Cdc25A (Cell division cycle
25 A)
B. Les 2 voies du blocage en G1/S du cycle cellulaire médié par p53 ou Cdc25A
8
II. Résultats
1) Recherche des promoteurs cibles de p53 :
a- Les techniques pour identifier les cibles d’un facteur de transcription.
ƒ
Le ChIP : Immuno–précipitation de chromatine.
Cette méthode permet d’identifier les promoteurs reconnus par un facteur de
transcription d’intérêt. C’est une technique puissante qui se développe depuis la fin du 20éme
siècle (Vu TH., et al, 200419). Elle constitue un outil indispensable à l’étude des régulations
transcriptionnelles.
D’abord il faut cross-linker le facteur transcriptionel et la chromatine in vivo. Pour
cela on utilise le Formaldéhyde, un agent cross linkant réversible, qui agit à faible distance
(2A). Le formaldéhyde entre dans la cellule par diffusion simple grâce à sa petite taille, il va
fixer les groupements amines et carboxyles des protéines et de l’ADN entre eux. Les cellules
seront lysées, puis le lysat cellulaire est récupéré pour être soniqué de façon a obtenir des
fragments de 500 paires de bases (∼ 2 nucléosomes). Puis on purifie les fragments par
immuno-précipitation. Cette étape est importante, elle nécessite d’avoir un anticorps capable
de reconnaître le facteur transcriptionnel lorsqu’il est lié sur son site de reconnaissance. Les
molécules non retenues sont éliminées par simple lavage. Le facteur transcriptionel et
l’anticorps sont séparés de la chromatine en reversant le cross link (5heures à 65°C). Puis le
facteur transcriptionel et l’anticorps sont éliminés par un traitement à la protéinase K. La
chromatine purifiée est alors amplifiée par une PCR. Les amorces choisies amplifient une
région promotrice cible du facteur transcriptionnel étudié.
Enfin l’amplification du promoteur est verifiée grâce à une électrophorèse sur gel
d’agarose. Cette approche est très utilisée pour comparer deux conditions de culture cellulaire
(cellules traitée ou non). Cependant il existe des variantes de cette technique : pour identifier
plusieurs promoteurs en même temps, en réalisant une hybridation sur puce génomique (ChIP
on chip). Il y a aussi la possibilité d’établir une cartographie complète des sites de fixations
d’un facteur transcriptionnel par une approche de Pet-ChIP (Pair end-ditag ChIP).
ƒ
Le Pet-ChIP : Pair End ditag Chromatine Immuno – précipitation.
Cette variante du ChIP permet une approche totalement différente. Ici, tous les
promoteurs liés au facteur transcriptionel d’intérêt seront identifiés (Ji H., et al, 200620). Une
9
cartographie complète des sites de fixation du facteur transcriptionel sera établie. La méthode
utilisée est basée sur le séquençage à haut débit (fig 8). Le Pet ChIP génère 2 signatures d’un
même fragment, la résolution est donc nettement meilleure qu’avec le ChIP classique.
Apres le séquençage de tous les fragments, les données sont traitées in silico les
séquences sont alignées sur le génome de l’organisme étudié. La cartographie ainsi obtenue
montre la nature des promoteurs régulés par le facteur transcriptionnel étudié. Les
informations recueillies concernent la totalité du génome (Chia-Lin Wei, et al, 200621), mais
elles sont aussi le reflet de la quantité de facteur qui était lié sur chaque promoteur. Certaine
séquence isolée seront chevauchantes, on parle alors de « cluster » Les auteurs ont montré que
l’ensemble des séquences localisées au niveau de cluster d’au moins 6 fragments,
correspondent systématiquement à des cibles réelles du facteur de transcription. Alors que
pour les singletons (séquence retrouvée une seule fois) ou les clusters moins importants, on
trouve beaucoup plus de séquences qui ne sont pas des cibles du facteur de transcription (faux
positifs). De plus, l’alignement des clusters permet de préciser la région d’interaction (fig.9).
Fig8 : Utilisation du plasmide pGIS3 qui contient les sites de restrictions de MmeI et de BseRI. Les
fragments immuno-précipités sont clonés dans le vecteur. Première digestion par MmeI qui va cliver 18
paires de base après son site de reconnaissance. Libération de fragment ayant des extrémités cohésives 3’
sortante. Après ligation du vecteur, une seconde digestion est effectués par BseRI ce qui va libérer les
fragments d’intérêt avec des extrémités 3’ sortante connues. Formation d’un concatémère avec tous les
fragments d’intérêts. Clonage dans le vecteur puis séquençage.
10
Fig9 : Visualisation des fragments chevauchants (Pet
cluster). Certaines séquences seront chevauchantes avec
d’autres prouvant la présence d’un site reconnu très
spécifiquement par le facteur transcriptionel d’intérêt
(TFBS = Transcription Factor Binding Site). D’autres
séquences sont isolés et donc moins significative
statistiquement.
b- Les résultats de l’étude des gènes cibles de p53.
L’étude par bioinformatique de l’ensemble des promoteurs cibles connus de p53, a
permis de proposer la sequence du site d’interaction (Chaolin Zhang., et al, 200622). Ces
gènes sont majoritairement impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose, la réparation
des dommages à l’ADN, la mobilité et l’adhésion cellulaire ainsi que dans des fonctions
métabolique physiologique. De nouvelles cibles de p53 ont été découverte grâce à la méthode
de Pet-ChIP (Pair end ditags ChIP) (fig10) (Wei, et al 200623), permettant d’établir la
cartographie complète des sites TFBS (Transcription Factor Binding Site) de p53 sur le
génome, mais aussi de caractériser avec précision cette séquence reconnue par p53 (fig11).
Fig10 : Listes complète des gènes régulés par p53. Tous ces gènes ont été identifiés par Pet-ChIP.
Expériences réalisé par Wei, et al 2006.
2) Etude de la régulation de la phosphatase cdc25A
Dans l’introduction, nous avons vu que cdc25A joue un rôle opposé à p53 dans le
blocage de la progression du cycle cellulaire. En effet, la phosphatase cdc25A permet la
reprise du cycle cellulaire en permettant le franchissement du checkpoint G1/S, par la
11
déphosphorylation de la protéine cdk2 (Sampath D, et al 200224) (fig.7). Cette réaction permet
l’activation du complexe cyclineE/cdk2, et par conséquent permet le passage dans la phase S.
Fig11 : Site spécifique de liaison du facteur de transcription p53.
Le modèle utilisé est basé sur les clusters Pet - 6+. C’est à dire que pour ce modèle, cette séquence a
été identifiée par un minimum de 6 fragments chevauchant. L’espaceur (trait vertical entre 11 et 12) a
été réduit grâce à cette technique. Les deux sites (nt 3 à 11 et 12 à21) peuvent être séparés par 1
nucléotide (Wei, et al 2006).
Des études ont établie une relation entre une augmentation de l’expression de p53 et la
répression de l’expression de cdc25A (Rother K., et al, 200625). Afin de déterminer si cet
effet est direct, des expériences de ChIP ont été réalisées avec un anticorps anti-p53,
révélation par PCR avec des amorces spécifiques du promoteur du gène de cdc25A. Un
contrôle étant réalisé avec le promoteur du gène de p21, cible connue de p53. Les auteurs ont
aussi montré que cdc25A n’est pas une cible directement régulée au niveau transcriptionnel
par p53. (fig12).
Fig12 : électrophorèse sur gel d’agarose et visualisation des fragments immuno-précipités.
Control : sans induction de p53, p53 expression : induction de p53 par le système tet off, no Ab :
pas d’immuno-précipitation, Anti-p53 : immuno-précipitation avec l’anticorps dirigé contre p53,
Input : témoin avec révélation des bandes contenant les séquences d’intérêt.
Un système tet off régule l’expression de p53 dans des cellules DLD-1. Le promoteur de p21 est
immuno-précipité avant et après induction de p53. On note une augmentation de la fixation de
p53 sur le promoteur de p21 après induction. Nous constatons qu’avant ou après induction de
p53, il n’y a aucune immuno-précipitation. Le promoteur de cdc25A ne possède donc pas la
séquence spécifique de liaison de p53.
12
L’absence de régulation directe de p53 sur le promoteur de cdc25A, implique
l’existence d’un intermédiaire protéique entre p53 et cdc25A. En effet, une augmentation de
l’expression de p53 conduit à une baisse de l’expression de cdc25A (fig13) au niveau
protéique et au niveau de son ARNm (Rother K., et al, 200625).
Fig13 : Visualisation des variations de l’expression de cdc25A en fonction de l’expression de p53 par
western blot.
C33A : cellules qui n’expriment pas cdc25A, elles sont transfectées (piste 1) ou pas (piste 2) par un vecteur
contenant l’ADNc de cdc25A.
DLD-1 : cellules induites (pistes 4 et 6) par le système tet off pour exprimer p53.
L’induction de p53 pendant 9 heures entraîne une baisse de la quantité de cdc25A dans le lysat cellulaire
total (pistes 3 et 4), ainsi que dans le noyau (pistes 5 et 6).
La β-actine sert de contrôle quantitatif ce qui permet une normalisation pour comparer les intensités des
bandes.
Cette baisse d’expression peut s’expliquer par l’existence de complexes protéiques
régulateurs stabilisant la protéine cdc25A en l’absence de p53. L’existence de mécanismes de
contrôle rapide du check point G1/S, agiraient directement sur cdc24A pour moduler son rôle.
Le cycle serait ainsi bloqué ou au contraire se poursuivrait selon les conditions subies par les
cellules (stress génotoxique par exemple).
Le projet de recherche est basé sur l’identification d’une ou plusieurs protéines
partenaires cdc25A. Les études menées à ce jour sur le cycle cellulaire, ont révélées des voies
de régulations lentes (fig 7B) et les thérapeutiques issues de ce contrôle, connaissent de
nombreuses applications. Les phénomènes de régulation rapide de cette voie pourraient être
intéressantes pour élargir la gamme de molécules cible pour le traitement de tumeurs.
13
III. Projets de recherche :
1) Isolation des partenaires protéique qui stabilisent la phosphatase cdc25A :
a- Le split ubiquitine.
Cette technique permet l’identification de partenaires protéiques d’une protéine
connue. La production des protéines partenaires potentiels est réalisée à partir d’une banque
d’ADNc. Cette approche a été initialement conçue pour identifier des interactions entre
protéines membranaires (Johnsson and Varshavsky, 199426). Il existe maintenant plusieurs
variantes de cette technique, toutes sont utilisées chez la levure Saccharomyces cerevisae.
L’intérêt de l’utilisation de cette technique est double. Cette technique nous facilitera la
détection des levures contenant un partenaire protéique interagissant avec cdc25A. Seules les
souches possédant cette interaction vont pousser, ce qui permet une plus grande efficacité de
criblage. D’autre part, elle évite les faux positifs que l’on rencontre dans le criblage de
protéine liant l’ADN par la technique plus communément utilisée : le double hybride.
ƒ
Choix de la lignée cellulaire pour faire la banque d’ADNc.
Pour la création de la banque d’ADNc, la lignée cellulaire du cancer du sein MDAMB-435 exprimant une p53 mutée sera choisie, afin de ne pas sélectionner des ADNc qui
codent pour des inhibiteur de cdc25A, présents dans les cellules normales.
ƒ
Description du split ubiquitine :
L’Ubiquitine est une protéine de 76 résidus d’acides aminées, elle peut être
artificiellement divisée en 2 partie : Nter (35 résidus) et Cter (41 résidus). Les deux moities
s’associeront reconstituant une ubiquitine native, si les deux moities sont co-exprimées dans
la cellule (Johnsson and Varshavsky, 199426). Lorsqu’une protéine en fusion avec la partie
Cter de l’ubiquitine interagit avec une autre protéine en fusion avec la partie Nter, l’ubiquitine
est reconstituée. Un complexe de protéases spécifique de l’ubiquitine (Ubps) va alors cliver la
protéine de fusion. Cette propriété de l’ubiquitine peut être mise en évidence par un gène
rapporteur comme Ura3p (Laser H., et al, 200027). Cette technique nécessite de travailler en
14
système eucaryote car elles expriment de façon endogène la protéase Ubps (fig14). Toutes les
applications du split ubiquitine ont été jusqu’à présent réalisées dans les levures.
Fig14 Schémas des protéines de fusions qui sont utilisées pour le split ubiquitine. Description de la
technique du split ubiquitine avec la méthode de sélection par RUra3p.
Lorsque l’ubiquitine est reconstituée, les protéases spécifiques de l’ubiquitine vont pouvoir cliver la
protéine de fusion. Si l’interaction entre les protéines X et Y existe dans la cellule, la protéine servant de
marqueur de sélection est libérée. Ici RUra3p sera libéré dans la cellule et sera rapidement dégradée
par le N-end degradation pathway, la cellule ne pourra pas transformer le FOA en un métabolite
toxique. Seules les levure contenant cette interaction pourront pousser.
Ura3p est une enzyme qui catalyse la décarboxylation de la Orotidine 5’phosphate
durant la synthèse de l’uracile. Les levures n’ayant pas cette activité ne peuvent croître sur un
milieu sans uracile. Ura3p est une protéine résidant constamment dans le cytosol. Une
modification de Ura3p (Arginine en N-terminal) a été effectuée pour faciliter sa dégradation
une fois libérée (fig. 14).
La protéine d’intérêt ici cdc25A sera clonée en fusion avec la partie C-terminale de
l’ubiquitine et de la protéine RUra3p. Les ADNc issues de la lignée cellulaire MDA-MB-435
sont clonées en fusion avec la partie N-terminale de l’ubiquitine dans un vecteur d’expression
de levure. Les levures Saccharomyces cerevisiae auxotrophes pour l’Uracile (Ura3-) sont
alors transfectées successivement avec les 2 vecteurs. Pour cela nous utiliserons
l’électroporation et des transfection transitoires seront suffisantes.
Pour ne transfecter qu’un exemplaire de vecteur par levure, on se place dans des
conditions optimales, c'est-à-dire en défaut de plasmides. Les levures qui vont intégrer le
15
premier plasmide seront sélectionnées grâce au système d’auxotrophie pour l’uracyle. Grâce à
la protéine de fusion contenant la protéine RUra3p, seules les levures qui auront intégrées le
vecteur vont être capable de métaboliser leurs uracile.
Apres cette première sélection les levures qui auront poussées seront transformées
avec les plasmides contenant les ADNc. La sélection qui suit nous permet de récupérer
uniquement les levures qui expriment une protéine qui interagit avec la phosphatase d’intérêt
cdc25A. Pour cela, de l’acide 5 fluoro-orotic (FOA) est mélangé aux milieux de culture. Si les
levures expriment la protéine RUra3p, le FOA sera transformée en une molécule toxique : le 5
fluorouracile ce qui tuera les levures (fig 14).
Si il y a une interaction entre cdc25A et un partenaire dans une levure, les protéases
spécifiques de l’ubiquitine (Ubps) vont pouvoir libérer la protéine RUra3p. Grâce à l’arginine
placée sur l’extrémité N-terminale de Ura3p, cette protéine sera rapidement dégradée. En
effet, les lois de dégradation selon la nature de l’acide aminé N-terminal (N-end rules
degradation pathway) vont faire que la demi-vie de RUra3p sera très réduite (fig. 15)
(Varshavsky A., 199625), elle n’aura pas le temps de métaboliser le FOA. Ainsi les levures
exprimant un partenaire de cdc25A vont pousser sur milieux complet + FOA grâce à la
libération et la rapide dégradation de RUra3p.
Fig.15 : Tableau représentant la durée
de demie vie de la protéine βgalactosidase en fonction de la nature de
son acide aminé N-terminal.
Les demies vies sont données en minutes,
et calculées dans E.coli et S.cerevisiae.
Une arginine en N-terminal confère la
demie vie la plus courte chez la levure
soit 2 minutes.
(Varshavsky, 1996).
Un témoin positif pour vérifier la fiabilité du split ubiquitine sera effectué avec la
protéine cdk2 qui est connue comme étant la cible principale de cdc25A. La GAPDH
(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) servira de témoin négatif. Cette expérience sera
également effectuée sans partenaire pour contrôler que l’ubiquitine ne se reconstitue pas à elle
seule. Enfin, pour vérifier l’efficacité du clivage par les protéases Ubps, une construction avec
l’ubiquitine entière en fusion avec RUra3p sera testé.
16
b- Caractérisation du ou des partenaires de cdc25A :
Les clones poussant sur le milieu contenant le FOA, expriment un partenaire de
cdc25A. Pour identifier la protéine partenaire de cdc25A, une PCR sera réalisée en utilisant
des amorces qui bordent l’ADNc du partenaire (fig 16), ces fragments PCR seront séquencés.
Les ADNc seront traduit in silico et les séquences protéiques seront comparées avec une base
de donnée protéique. La nature des partenaires isolés nous permettra d’avancer dans
l’élucidation du schéma de régulation de cdc25A dans les cellules cancéreuses pour p53
mutées.
ProtéineX
N-ter Ubiquitine
Fig.16 criblage par PCR :
L’ensemble des partenaires potentiels de cdc25A seront criblés par PCR en utilisant des
amorces bordant l’ADNc du partenaire (amorce en rouge).
2) Vérification de l’interaction par CoImmuno-Précipitation :
Pour contrôler les de l’interactions mises en evidence grâce au split ubiquitine, des
validations par des CoIP (coimmuno-précipitations). Nous travaillerons sur la lignée MDAMB-435 qui a son p53 muté et sur des fibroblastes possédant un p53 sauvage. Une induction
de p53 par un stress génotoxique tel que les Ultraviolets (rayons ionisant), sera effectuée sur
les 2 lignées pour observer si il y a une répercutions sur la formation du complexe.
L’induction de p53 sur la lignée MDA-MB-435 est un contrôle négatif, il ne devrait y avoir
aucune différence avec les résultats de la CoIP sans induction de p53. Les fibroblastes non
induits sont censés nous donner des résultats comparables aux CoIP de MDA-MB-435 (induit
et non induit).
Apres les CoIP, si on dispose d’un anticorps dirigé contre le partenaire potentiel de
cdc25A, sa présence au sein du complexe est vérifié par un western blot.
Le problème de cette étape réside dans le fait d’avoir ou pas un anticorps dirigé contre
les protéines qui interagissent avec cdc25A. Si les anticorps ne sont pas disponibles, nous
ferons des transfections par les partenaires taggés avec un FLAG ou c-Myc.
17
3) Interférence sur l’ARN pour voir le rôle des partenaires :
Apres avoir validé l’interaction in vitro, nous vérifierons le lien fonctionnel entre
cdc25A et ses partenaires par une approche de siRNA (silent RNA). Cette technique sera
appliquée sur la lignée cellulaire MDA-MB-435 (p53 muté) et sur des fibroblastes (p53
sauvage). Les siRNA seront élaborés par synthèse chimique à partir des séquences des ADNc
précédemment identifiés. Les cellules seront divisées en 2 lots, puis traitées ou non par des
rayonnements ultraviolets afin d’induire l’expression de p53. Si cette approche ne nous donne
pas des résultats significatifs, nous utiliserons une approche plus efficace : les shRNA (silent
hairpin RNA). Cette dernière technique coûte très cher mais elle va réprimer de façon plus
efficace plus l’expression des protéines ciblées.
Pour visualiser l’effet des « silencers » sur les différentes cellules testées, nous ferons
un comptage des cellules en fonction de leurs répartitions dans le cycle cellulaire par
cytométrie de flux (FACS).
18
IV. Perspectives
L’identification des protéines qui stabilisent la phosphatase cdc25A seront ainsi
caractérisés, ces protéines sont susceptibles d’être de nouvelle cible thérapeutique pour le
traitement du cancer. Des molécules antagonistes de ces partenaires stabilisateurs de cdc25A
vont pouvoir réduire l’efficacité de la réaction catalysée par cette phosphatase. Le complexe
cyclineE/cdk2 ne serait plus activé, ainsi le cycle cellulaire ne pourrait plus progresser de la
phase G1 à la phase S.
Pour identifier les molécules antagonistes des partenaires de cdc25A, il faudra dans
l’avenir, produire en grande quantité ces protéines. Pour cela, il faudra produire cdc25A et ses
partenaires chez E.coli. Ensuite il faudra mettre au point un test pour quantifier l’activité de la
phosphatase cdc25A (p-nitrophényl).
Les molécules à cribler pourront être issues d’une chimiothéque de molécules
anticancéreuses synthétiques et naturelles. Les molécules qui inhiberont de façon conséquente
l’activité phosphatase de cdc25A, seront étudiées plus en détail en vue de leurs utilisations
dans des traitements anti-cancéreux.
19
Annexes
Alignement des séquences des protéines p53 de l’Homme et de quelques Primates :
Il y a une forte conservation de p53 chez les mammifères.
20
Tableau des mutation de p53 dans les différents Cancers
Séquence nucléïque
Allèles
Nucléotides
changés
Codons
changés
Polypeptide
Acides aminés
changés
Type de mutation
Phénotype clinique
Facteurs supposés de
l'environnement
p53norm
référence
référence
référence
normal
P53mut7
G19C
GAT7CAT
Asp7His
faux-sens
cancer
soleil
p53mut132
G396C
AAG132AAC
Lys132Asn
faux-sens
cancer des bronches
ex fumeur
antécédente familial
p53mut175a G524A
CGC175CAC
Arg175His
faux-sens
cancer du colon
fumeur
p53mut175b C523G
CGC175GGC
Arg175Gly
faux-sens
cancer des bronches
?
p53mut175c C523A
CGC175AGC
Arg175Ser
faux-sens
cancer des bronches
fumeur
p53mut175d G524A
CGC175CAC
Arg175His
faux-sens
cancer du colon
?
p53mut175e G524T
CGC175CTC
Arg175Leu
faux-sens
cancer du colon
?
cancer des glandes
surrénales
?
p53mut175f C523- G524-
CGC175 del
Arg175
délétion cadre de
lecture modifié
p53mut245a G734T
GGC245GTC
Gly245Val
faux-sens
cancer des bronches et fumeur
de la langue
amiante
p53mut245b G733A
GGC245AGC
Gly245Ser
faux-sens
cancer du cou et de la
tête
fumeur
p53mut245c G733T
GGC245TGC
Gly245Cys
faux-sens
cancer du cou et de la
tête
fumeur
alcool
p53mut248a G743A
CGG248CAG
Arg248Gln
faux-sens
cancer
?
p53mut248b G743C
CGG248CCG
Arg248Pro
faux-sens
cancer des reins
ex fumeur
p53mut248c C742T
CGG248TGG
Arg248Trp
faux-sens
cancer de la tête et du
cou
p53mut248d G743-
CGG248del
Arg248del
délétion cadre de
lecture modifié
cancer des bronches
fumeur
p53mut249
G747T
AGG249AGT
Arg249Ser
faux-sens
cancer du foie
aflatoxine
Chine
p53mut273a C817T
CGT273TGT
Arg273Cys
faux-sens
cancer des glandes
surrénales
?
p53mut273b G818A
CGT273CAT
Arg273His
faux-sens
cancer du rectum et de
?
l'anus
p53mut273c C817T
CGT273TGT
Arg273Cys
faux-sens
cancer des os et des
articulations
?
p53mut273d G818C
CGT273CCT
Arg273Pro
faux-sens
cancer du sein
?
p53mut273e -817T
CGT273Ins
Arg273Ins
Insertion et cadre de
lecture modifié
cancer du sein
?
p53mut282a C844T
CGG282TGG
Arg282Trp
faux-sens
cancer des reins
ex-fumeur
p53mut282b C844T
CGG282TGG
Arg282Trp
faux-sens
cancer de l'oesophage
fumeur
thé bouillant
21
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