THESE DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE En vue de l'obtention du

THESE
En vue de l'obtention du
DO CTO RA T DE L ’UNI VE RSI TÉ DE TOUL OUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Physiopathologie
Présentée et soutenue par Cindy Canivet
Le 7 mai 2009
Titre : Apport du suivi pharmacodynamique des immunosuppresseurs en transplantation
d'organes
JURY
Dr. Nassim Kamar, Maitre de Conférences-Practicien hospitalier (CHU Toulouse) Directeur de thèse
Pr. Robert Salvayre, Professeur-Practicien hospitalier (CHU Toulouse) Directeur de thèse
Pr. Lionel Rostaing, Professeur-Practicien hospitalier (CHU Toulouse) Examinateur
Pr. Pierre Marquet, Professeur-Practicien hospitalier (CHU Limoges) Rapporteur
Pr. Christophe Mariat, Professeur-Practicien hospitalier (CHU Saint-Etienne) Rapporteur
Ecole doctorale : Ècole doctorale biologie santé et biotechnologies
Unité de recherche : I2MR/INSERM U858-Èquipe 10
Directeur(s) de Thèse : Dr Nassim Kamar/Pr Robert Salvayre
Rapporteurs : Pr Pierre Marquet/Pr Christophe Mariat
J’adresse mes sincères remerciements aux membres du jury qui ont accepté de
juger ce travail :
Monsieur le Professeur Christophe Mariat, je suis très honorée de l’intérêt que
vous avez porté à mon travail et je vous remercie d’avoir accepté d’en être le
rapporteur.
Monsieur le Professeur Pierre Marquet, je tiens à vous remercier pour notre
collaboration et pour avoir accepté d’être le rapporteur de ce travail.
Je tiens également à remercier
Le Professeur Dominique Durand qui m’a permis de travailler en collaboration
avec son service et qui m’a fait confiance.
Le Professeur Lionel Rostaing : merci pour votre confiance et votre générosité
tout au long de ce travail, je suis heureuse de vous avoir compté parmi les
membres du jury.
Le Professeur Robert Salvayre et le Dr Anne Nègre-Salvayre : merci de m’avoir
accueilli au sein de votre équipe, de votre amabilité, et de votre soutien au cours
de ce travail.
Je tiens tout particulièrement à remercier le Docteur Nassim Kamar sans qui
tout ce travail n’aurait pu être réalisé : de ta disponibilité malgré ton emploi du
temps surchargé, de m’avoir supporté de longues heures dans ton bureau, merci
pour ton humour, et encore merci pour la confiance que tu m’as apportée et pour
tout ce que tu m’as appris
Je remercie
Le Dr Mogens Thomsen qui m’a accueillie initialement dans son équipe.
Le Dr Torsten Böhler : merci de m’avoir fait confiance, merci pour nos
conversations franco-germano-anglophones, pour ton réconfort et ta joie de
vivre.
Je remercie toute l’équipe 10,
Nathalie pour son humour, son réconfort, sa disponibilité et ses connaissances
scientifiques très précieuses, Cécile pour nos discussions variées, et ta
disponibilité, Françoise pour ton réconfort dans les moments de doutes.
Tous les étudiants avec qui j’ai partagé quelques repas et apéros, Marie qui a
bien souvent partagé avec moi les nocturnes et les we au labo, mais aussi
Raphael, Cécile, Aurélie, Carole, Elodie, et tous ceux qui sont passés au
laboratoire.
L’aide technique, Corinne pour avoir partagé les plaisirs du grand froid et qui ne
m’a jamais laissée sans PBS, Stéphanie pour son aide précieuse avec les
commandes, sa gentillesse et son soutien.
Un remerciement un peu spécial à mes deux DEA préférés Thomas pour nos fous
rires, ton humour décalé, et les bons petits plats de ta maman, Magalie pour
avoir partagé mon bureau de ministre, merci pour ta gentillesse et ta générosité
je suis sûre que tu seras une parfaite thésarde !
Merci à Sylvain, pour tout ce que l’on a partagé ensemble dans notre petite
équipe greffe, pour nos franches rigolades qui ont apporté à ces 3 années de
thèse de merveilleux souvenirs, merci pour ton aide et pour les WE que tu m’as
épargné, est-ce que tu élucideras le mystère de l’agrafeur fou ?
Merci à Eve et Danièle pour leur disponibilité et leur aide tout au long de ma
thèse, à Chantal pour sa patience et son organisation.
Merci à Jean-Claude Lepert pour son aide précieuse au cytomètre et pour
m’avoir permis de venir travailler soir et we.
Un grand grand merci à tous les infirmiers et infirmières qui ont fait que ce
travail soit possible aussi bien les filles de l’hématologie qui ont épargné à mes
petits bras de se faire trouer trop souvent et les filles de l’UTO qui m’ont
toujours accueillies avec gentillesse et ont su m’accepter malgré la surcharge de
travail que je leur ai apportées.
Un merci tout particulier à Nicole Chincholle et Noëlle, les infirmières de la
planification ainsi que Nicole et Patricia qui ont été d’une patience admirable,
merci de m’avoir épargné tous ces we!
Un grand merci à toute l’équipe 14 qui a dû supporter ma présence et mes
bavardages à la pause-café.
Merci à Nicole pour avoir partagé 1 an de PD avec moi, merci pour ton aide, nos
rigolades et ta gentillesse.
Merci à Bruno pour ton humour et ta sincérité, merci à Hervé pour m’avoir
accepté comme compagnon de bureau, ce fut des moments très agréables et
Boby Lapointe et Georges Brassens ne diront pas le contraire.
Merci à tous les autres membres de l’équipe, Virginie, Elodie, Nathalie, Stéphane,
Caroline, Fred, Thierry…
Merci à ma dévergondée, ton amitié dés mon arrivée, ton dynamisme, ta gaîté
m’ont fait aimer ma vie à Toulouse, rien n’aurait été pareil sans toi, j’espère que
tout cela continuera bien au-delà de la recherche.
Merci à Cosette, au caractère explosif, maintenant que tu n’habites plus chez les
Tavernier, j’espère que tu m’inviteras toujours pour ta blanquette ou ton poulet
basquaise ! Reste telle que tu es !
Merci à ma conductrice préférée, nos petites conversations au labo me manquent
déjà, heureusement que l’on va encore partager pleins de soirées animées ou pas
d’ailleurs car la grand-mère qui est en moi n’a pas encore cessé de te surprendre.
Merci à mon hôtesse de charme, pour ta franchise, tes dîners presque parfaits
et ton amitié, même si on ne se croisera plus dans les couloirs, j’espère bien
partager encore de nombreuses soirées et we avec toi.
Merci au saltimbanque, j’espère que l’on partagera encore de nombreuses
soirées.
Merci à mes parents et mes sœurs qui m’ont soutenu tout au long de ce travail,
merci à mes beaux-parents pour leur accueil chaleureux.
Merci à Sylvain, qui partage mon quotidien, mes joies, mes peines, mes difficultés
et qui accepte sans rien dire ma mauvaise humeur et me soutient dans les
moments de stress. Merci pour ta patience et tout l’amour que tu me portes,
j’espère que l’on partagera ce chemin encore longtemps…
Résumé
La transplantation est une thérapeutique de plus en plus utilisée à l’heure actuelle. Les
traitements immunosuppresseurs permettent une meilleure prévention du risque de rejet. Mais
les immunosuppresseurs ont une fenêtre thérapeutique étroite. Le suivi thérapeutique des
immunosuppresseurs a été mis en place pour essayer de mieux contrôler les effets secondaires
sans augmenter le risque de rejet. Il existe le suivi thérapeutique pharmacocinétique et le suivi
thérapeutique pharmacodynamique.
Au cours de ces travaux, nous avons étudié en cytométrie de flux, la prolifération,
l’expression des marqueurs d’activation CD25 et CD71 et la sécrétion des cytokines intracytoplasmique IL-2 et TNF-α des lymphocytes T, chez des patients en attente de greffe et des
patients greffés rénaux et hépatiques.
Nous avons montré que les patients en attente de greffe hépatique, du fait d’une
hépatite C, ont une prolifération et une activation des lymphocytes T plus importante que les
patients en attente de greffe pour une autre pathologie hépatique. De plus ceux atteints d’une
hépatopathie ont une sécrétion de cytokines plus importante que les personnes saines. Ces
observations pourraient expliquer le risque plus élevé de rejet aigu après transplantation
hépatique chez les patients infectés par le virus de l’hépatite C.
Par la suite, nous avons comparé le statut immunitaire de patients en attente de greffe
rénale (sous dialyse), avec celui de patients transplantés rénaux et celui de volontaires sains
en fonction de leur âge. Dans chaque groupe de patients, nous avons constaté une corrélation
entre l’âge du receveur et la sécrétion de TNF-α.
Nous avons également utilisé l’approche de l’étude pharmacodynamique pour
comparer différents immunosuppresseurs. Nous avons comparé l’effet immunosuppresseur du
léflunomide avec celui du mycophénolate mofétil (MMF) chez des patients transplantés
rénaux présentant une néphropathie à virus BK. Le léflunomide s’est avéré être aussi
immunosuppresseur que le MMF, ce qui suggère que son effet bénéfique dans le traitement de
la néphropathie à virus BK est dû, au moins en partie, à son activité antivirale. Puis nous
avons comparé l’effet des deux formulations de l’acide mycophénolique : le MMF et le
mycophénolate sodique (MPS). Le MPS tend à avoir une activité immunosuppressive
légèrement moins importante que le MMF ; ceci peut-être le reflet des différences
pharmacocinétiques entre les 2 formulations. Enfin, nous avons comparé les facultés
immunosuppressives du belatacept à la ciclosporine A.
L’étude pharmacodynamique des immunosuppresseurs a permis de comparer
l’efficacité de différentes stratégies immunosuppressives visant à diminuer le taux d’anticalcineurines administré chez des patients transplantés afin d’éviter leur effet néphrotoxique
et diminuer le risque de perte de greffon. Nous avons observé que la diminution voir l’arrêt
des anti-calcineurines chez des patients transplantés stables n’entraînait pas d’augmentation
de l’activation, la prolifération et la sécrétion des cytokines des lymphocytes T.
Ce travail a montré l’intérêt d’un suivi pharmacodynamique des immunosuppresseurs
au cours du développement d’une nouvelle molécule mais également pour analyser l’utilité et
l’efficacité d’une nouvelle stratégie immunosuppressive. De plus elle permet de montrer la
variabilité inter-individuelle du statut immunitaire des patients en attente de greffe et permet
d’appréhender le traitement post-greffe.
Abstract
To date, solid-organ transplantation is used worldwide. The use of novel
immunosuppressive drugs improved both patients’ and graft’s survivals. However, these
drugs have a narrow therapeutic window. The therapeutic drug monitoring has been set up to
reduce the acute rejection rate and to better avoid the side effects. It relies on both
pharmacokinetic and pharmacodynamic monitoring of immunosuppressive drugs.
Using a flow cytometry whole blood assay, we assessed T-cell function, i.e. intralymphocyte cytokine expression (IL-2 and TNF-α), T-cell activation (CD25 and CD71
expressions), and T-cell proliferation in different clinical situations before and after kidney
and liver transplantation.
First, we showed that patients waiting for a liver transplantation with an hepatitis C
virus (HCV)-related cirrhosis have a higher proliferation and activation of T lymphocytes
than patients awaiting for a liver transplantation with an other liver disease. Furthermore,
patients with a liver disease have an increase of cytokines secretion compare to healthy
volunteers. These observations could explain the higher level of graft rejection after liver
transplantation in HCV-positive patients.
Then we compared the immune status of dialysis patients, kidney-transplant patients,
and healthy volunteers. We found decreased T-cell functions in kidney-transplant patients
compared to healthy volunteers and dialysis patients, increased IL-2 expression in dialysis
patients compared to healthy volunteers and in all three populations we found a correlation of
age and TNF-α expression in T-cells.
Latter, we used pharmacodynamic monitoring approach to compare various
immunosuppressive drugs. First, we compared the effect upon T-cells of leflunomide and
mycophenolate mofetil (MMF) in kidney-transplant patients with polyoma BK virusassociated nephropathy. Leflunomide was found to be as immunosuppressant as MMF. These
results suggest that the beneficial effect of leflunomide in the polyoma BK virus-associated
nephropathy is due in part to his anti-viral activity. Then we compared the two mycophenolic
acid formulations: MMF and mycophenolate sodium (MPS). MPS tended to have a lower
immunosuppressive effect than MMF. This may be related to the difference in
pharmacokinetics the two formulations. Finally, we compared immunosuppressive effect of
belatacept and cyclosporine A.
Then, we studied various immunosuppressive strategies in order to reduce calcineurin
inhibitor-induced nephrotoxicity. We analyzed T-cell function, T-cell activation, and T-cell
proliferation in patients receiving an immunosuppressive regimen with a low exposure or
without calcineurin inhibitors, and compared the results to those obtained in patients receiving
a conventional therapy including tacrolimus, MMF, and steroids. Our data suggest that, in
stable maintenance patients, an immunosuppressive therapy based on MMF and steroids with
or without a low exposure to calcineurin inhibitors provided a similar reduction in T-cell
proliferation and T-cell activation as compared to standard immunosuppressive therapy.
Our data showed that the pharmacodynamic monitoring of immunosuppressive drugs
based on the assessment of T-cell function can be used to evaluate the efficacy of new drugs,
and to assess the immunosuppressive effect of various immunosuppressant combinations.
Liste des abréviations
ACN : anti-calcineurines
mTOR : mammalian-Target Of Rapamycin
ADN : acide désoxyribonucléique
NAD : dicotinamide adénine dinucléotide
ALG : Lymphoglobulines
PBS : Phosphate Buffer Saline
ARN : acide ribonucléique
PCNA : proliferating cell nuclear antigen
ASC : aire sous la courbe
PD : pharmacodynamique
ATG : Thymoglobulines
PE : phycoerythrin
AUE : Area under exposition
PerCP : Peridinin-chlorophyl-protein
CaN : activité phosphatase de la
Complex
calcineurine
PK : pharmacocinétique
C0 : concentration résiduelle
PMA : phorbol myristate acétate
C`max : concentration maximale
SRL : sirolimus
CsA : ciclosporine
TNF-α : Tumor necrosis factor-α
EMIT : Enzyme-multiplied immunoassay
TRL : tacrolimus
technique
XMP : xanthosine-5’-monophosphate
FITC : fluorescein isothiocyanate
FK : tacrolimus
GVHD : graft versus host disease
HLA : Human leukocyte antigen
HPLC : chromatographie liquide haute
performance
IFN-γ : interféron-γ
IL-2 : Interleukine-2
IMP : inosine monophosphate
IMPDH : Inosime monophosphate
déshydrogénase
IP : iodure de propidium
MEIA : essai immunologique enzymatique
à microparticules
MMF : mycophénolate mofétil
MPA : Acide mycophénolique
MPS : mycophénolate sodique
SOMMAIRE
INTRODUCTION ............................................................................................................... 5
Revue générale..................................................................................................................... 7
1.Le rejet et ses traitements............................................................................................. 8
1.1.Le rejet................................................................................................................... 8
1.1.1.Le rejet hyper-aigu ........................................................................................... 8
1.1.2.Le rejet aigu ..................................................................................................... 9
1.1.2.1.Le rejet cellulaire........................................................................................ 9
1.1.2.2.Le rejet humoral ....................................................................................... 11
1.1.3.La néphropathie chronique d’allogreffe .......................................................... 12
1.2.Les traitements immunosuppresseurs.................................................................... 13
1.2.1.Les traitements d’induction ............................................................................ 14
1.2.2.Les traitements d’entretien.............................................................................. 14
1.2.2.1.Les inhibiteurs de la calcineurine.............................................................. 14
1.2.2.1.1.La ciclosporine ................................................................................... 14
1.2.2.1.2.Le tacrolimus...................................................................................... 15
1.2.2.2.L’acide mycophénolique........................................................................... 15
1.2.2.3.Les inhibiteurs de la mTOR ...................................................................... 16
1.2.2.3.1.Le sirolimus........................................................................................ 16
1.2.2.3.2.L’évérolimus ...................................................................................... 17
1.2.2.4.Les corticoïdes.......................................................................................... 18
1.2.2.5.Le léflunomide ......................................................................................... 18
1.2.2.6.Les immunosuppresseurs en cours de validation ....................................... 18
2.Le suivi thérapeutique des immunosuppresseurs ........................................................ 19
2.1.Le suivi pharmacocinétique.................................................................................. 19
2.1.1.Définition....................................................................................................... 19
2.1.2.Les anti-calcineurines..................................................................................... 20
2.1.2.1.Propriétés pharmacocinétiques.................................................................. 20
2.1.2.1.1.La ciclosporine ................................................................................... 20
2.1.2.1.2.Le tacrolimus...................................................................................... 20
2.1.2.2.Méthodes de dosage.................................................................................. 21
2.1.2.2.1.La ciclosporine ................................................................................... 21
2.1.2.2.2.Le tacrolimus...................................................................................... 21
1
2.1.2.3.Les applications........................................................................................ 22
2.1.2.3.1.La ciclosporine ................................................................................... 22
2.1.2.3.2.Le tacrolimus...................................................................................... 23
2.1.3.L’acide mycophénolique ................................................................................ 24
2.1.3.1.Les propriétés pharmacocinétiques ........................................................... 24
2.1.3.1.1.Le MMF ............................................................................................. 24
2.1.3.1.2.Le MPS .............................................................................................. 24
2.1.3.2.Les méthodes de dosage............................................................................ 24
2.1.3.3.Applications ............................................................................................. 25
2.1.3.3.1.Dose fixe ............................................................................................ 25
2.1.3.3.2.Dose adaptée....................................................................................... 26
2.1.4.Les inhibiteurs de la mTOR............................................................................ 27
2.1.4.1.Les propriétés pharmacocinétiques ........................................................... 27
2.1.4.1.1.Le sirolimus........................................................................................ 27
2.1.4.1.2.L’évérolimus ...................................................................................... 28
2.1.4.2.Les méthodes de dosage............................................................................ 28
2.1.4.3.Les applications........................................................................................ 28
2.1.4.3.1.Le sirolimus........................................................................................ 28
2.1.4.3.2.L’évérolimus ...................................................................................... 29
2.1.5.Les limites de la pharmacocinétique ............................................................... 29
2.2.Le suivi pharmacodynamique............................................................................... 30
2.2.1.Définition....................................................................................................... 30
2.2.2.Comptage des populations lymphocytaires ..................................................... 30
2.2.3.Dosage des molécules cibles........................................................................... 31
2.2.3.1.Les anti-calcineurines ............................................................................... 31
2.2.3.1.1.Dosage de l’IL-2................................................................................. 31
2.2.3.1.2.Dosage de l’activité phosphatase de la calcineurine............................. 32
2.2.3.2.L’acide mycophénolique........................................................................... 34
2.2.3.2.1.Méthodes de dosage de l’activité de l’IMPDH .................................... 35
2.2.3.2.1.1.Méthode radioactive...................................................................... 35
2.2.3.2.1.2.Méthode non-radioactive............................................................... 36
2.2.3.3.Les inhibiteurs de la mTOR ...................................................................... 37
2.2.4.Mesure d’un phénomène biologique complexe nécessaire à la fonction immune
normale ............................................................................................................................... 38
2
2.2.4.1.Études chez l’animal................................................................................. 38
2.2.4.2.Etudes chez l’homme................................................................................ 40
Matériel et méthodes ......................................................................................................... 42
1.Patients ...................................................................................................................... 43
2.Étude de la fonction immunitaire ............................................................................... 43
2.1. Etude de la sécrétion des cytokines intra-lymphocytaires à partir de sang total : IL-2
et TNF-α ............................................................................................................................. 43
2.1.1.Stimulation des cellules .................................................................................. 43
2.1.2.Marquage pour analyse en cytométrie de flux................................................. 43
2.2.Étude de l’activation des lymphocytes T et de la prolifération .............................. 44
2.2.1.Stimulation du sang total ................................................................................ 44
2.2.2.Étude des marqueurs d’activation ................................................................... 44
2.2.3.Étude de la prolifération ................................................................................. 45
3.Analyse des résultats et statistiques ............................................................................ 46
Résultats............................................................................................................................. 47
1.Article n°1 : La stimulation par des agents mitogènes in vitro des lymphocytes T chez
des patients en attente de transplantation hépatique pour hépatite virale C, augmente les
marqueurs d’activation et la prolifération des lymphocytes T............................................... 48
2.Article n°2 : La fonction des lymphocytes T est corrélée avec l’âge chez des volontaires
sains, des patients hémodialysés et des patients transplantés rénaux. .................................... 50
3.Étude pharmacocinétique et pharmacodynamique du mycophénolate mofétil, du
tacrolimus et du sirolimus chez les patients en attente de transplantation hépatique.............. 53
4.Article n°3 : La néphropathie à virus BK chez des patients transplantés rénaux : effets
du léflunomide sur la fonction des lymphocytes T et la pathologie....................................... 80
5.Article n°4 : Etude pharmacodynamique du changement d’un traitement à base de
mycophénolate mofétil en mycophénolate sodique chez des patients transplantés rénaux
stables. ................................................................................................................................ 82
6.Comparaison de la prolifération, l’activation et la fonction des lymphocytes T chez des
patients transplantés rénaux de novo recevant du belatacept ou de la ciclosporine A (étude de
phase III) ............................................................................................................................. 84
3
7.Étude pharmacodynamique entre un groupe de patients transplantés rénaux stables
recevant un traitement standard de MPS et de tacrolimus et un groupe recevant une double
dose de MPS et une dose de tacrolimus réduite. ................................................................... 86
8.Article n°5 : Étude de la fonction lymphocytaire chez des patients transplantés rénaux
stables recevant du mycophénolate mofétil et des corticostéroïdes avec ou sans tacrolimus. 89
Conclusion générale........................................................................................................... 91
Bibliographie ..................................................................................................................... 94
4
INTRODUCTION
La transplantation d’organes est pratiquée depuis plus d’un demi-siècle. Grâce aux
progrès de la chirurgie et à une meilleure compréhension du mécanisme du rejet, la
transplantation est devenue une thérapeutique reconnue de plus en plus utilisée.
La
découverte
et
le
développement
de
plusieurs
molécules
à
activité
immunosuppressive ayant des mécanismes d’actions différents ont considérablement fait
évoluer la transplantation d’organes en termes de survie du greffon et de survie des patients
depuis ces 20 dernières années. Ces molécules présentent toutes un index thérapeutique faible
avec pour la plupart des toxicités concentration dépendante. Il est très difficile de trouver des
marqueurs fiables et reproductibles de l’activité immunosuppressive in vivo et donc de
déterminer une dose ou une concentration minimale efficace.
L’individualisation de la dose de ces thérapeutiques, pour obtenir la balance optimale
entre efficacité thérapeutique et toxicité, est devenue une priorité pour améliorer la survie
post-transplantation. L’approfondissement des connaissances dans le domaine des relations
pharmacocinétique-pharmacodynamie est une voie à explorer.
De nombreuses études pharmacocinétiques de la ciclosporine, du tacrolimus et du
mycophénolate mofétil ont montré la possibilité de doser la concentration plasmatique des
principes actifs de ces médicaments. À partir de cette concentration, la posologie de ces
traitements a été adaptée. Mais cette méthode a ses limites : la variabilité interindividuelle des
paramètres pharmacocinétiques, les interactions médicamenteuses, l’influence de la
pathologie sur le métabolisme des immunosuppresseurs. De plus, l’étude pharmacocinétique
ne permet pas de connaître l’effet des immunosuppresseurs sur le système immunitaire et
donc de déterminer la concentration efficace.
Le suivi pharmacodynamique des immunosuppresseurs représente une alternative pour
individualiser le traitement antirejet. Il implique la mesure des effets biologiques du
médicament sur sa cible, mais également la mesure d’un phénomène complexe nécessaire à
une fonction immunitaire normale. L’effet des différents traitements sur les lymphocytes
responsables du rejet a été étudié in vitro en utilisant des lignées de lymphocytes immortalisés
ou isolés du sang. Ce n’est que récemment que des études ont été faites in vivo chez l’animal
et chez l’homme pour mieux connaître l’effet des immunosuppresseurs sur le système
immunitaire. Des études complémentaires, pour mieux comprendre les effets d’associations
5
de différents immunosuppresseurs sur le système immunitaire, sont encore nécessaires afin de
confirmer l’intérêt du suivi pharmacodynamique.
L’objectif de ce travail est d’effectuer une étude pharmacodynamique des
immunosuppresseurs dans différentes situations cliniques en transplantation rénale et
hépatique. Nous présenterons tout d’abord dans une revue générale les mécanismes du rejet et
les traitements qui
lui
sont
associés,
le principe du
suivi
thérapeutique des
immunosuppresseurs (études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques), et l’historique de
la technique utilisée au cours de nos travaux. Puis, dans une deuxième partie, nous
présenterons les études que nous avons menées pour étudier la fonction, l’activation et la
prolifération lymphocytaires dans différentes situations cliniques chez des transplantés rénaux
et hépatiques.
6
Revue générale
7
1. Le rejet et ses traitements
La transplantation d’organes est aujourd’hui une thérapie de plus en plus utilisée et qui
connaît un fort taux de réussite. Au cours des dernières décennies, la survie des patients et des
greffons a nettement augmenté. Le risque de rejet aigu a baissé de façon significative. Enfin,
la meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la
réponse immunitaire a permis le développement de nouveaux agents immunosuppresseurs (1,
2).
1.1. Le rejet
La principale complication de la transplantation d’organes est le risque de rejet. Ce rejet
dépend essentiellement de la réaction immunitaire du receveur contre les cellules du greffon.
On distingue différents types de rejet en fonction de leur survenue plus ou moins précoce
après la greffe et en fonction de la réaction immune mise en jeu. Il existe trois types de rejet :
le rejet hyper-aigu, le rejet aigu et le rejet chronique.
1.1.1. Le rejet hyper-aigu
Le rejet hyper-aigu survient au cours des premières minutes suivant la transplantation jusqu’à
quelques heures après l’achèvement des anastomoses vasculaires, et entraîne une nécrose
nécessitant le retrait du greffon (3). Ce rejet est dû à la présence d’anticorps anti-HLA
(Antigènes Leucocytaires Humains) acquis le plus souvent au cours d’une transfusion, d’une
grossesse ou d’une transplantation antérieure. La seule façon de prévenir ce rejet est de faire
un test de compatibilité entre le donneur et le receveur. La toxicité des anticorps du receveur
contre les cellules du donneur est déterminée, c’est le « cross-match », et un dépistage avant
la greffe de la présence de ces anticorps anti-HLA chez le receveur est effectué.
8
1.1.2. Le rejet aigu
Le rejet aigu a lieu quelques jours à quelques semaines après la greffe. C’est une réaction du
système immunitaire du receveur contre le greffon. Il peut être de 2 types, cellulaire ou
humoral.
1.1.2.1.Le rejet cellulaire
Le rejet cellulaire est dû principalement aux lymphocytes T du receveur qui reconnaissent le
complexe majeur d’histocompatibilité présent à la surface des cellules présentatrices
d’antigène (CPA) du donneur ; c’est la présentation directe de l’antigène comme une
molécule du non soi. Les lymphocytes T du receveur peuvent également reconnaître des
peptides appartenant à une molécule d’un complexe majeur d’histocompatibilité étranger. Ces
peptides sont présentés par des cellules présentatrices d’antigènes du receveur, c’est la
reconnaissance indirecte. Cette reconnaissance directe peut activer les lymphocytes T de
manière plus importante et serait la cause d’une forte réponse immunitaire dans le rejet aigu
(4). La reconnaissance indirecte jouerait un rôle plus important dans le rejet chronique (5).
Les lymphocytes T expriment à leur surface des glycoprotéines CD4 ou CD8. Les cellules
T-CD4+ sont probablement les plus initiatrices dans le rejet aigu (6). Les cellules CD4+ sont
responsables de la production de nombreuses cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α…) nécessaires à
la stimulation de la réponse immune et vont promouvoir différents mécanismes impliqués
dans le rejet de greffe.
L’activation totale du lymphocyte nécessite deux signaux distincts mais synergiques :
- Le récepteur d’antigène des lymphocytes T (TCR) reconnaît le complexe formé par
l’antigène et le CMH sur la cellule présentatrice d’antigène. Cette reconnaissance constitue un
premier signal qui active le lymphocyte. Ce premier signal entraîne l’expression de différents
récepteurs à la surface des lymphocytes CD4+. Le TCR est associé à un complexe de 3
protéines qui constituent CD3 et à un homodimère d’une autre protéine de signalisation
appelée chaîne ζ. Ils forment le complexe du TCR.
- Conjointement à ce signal, des molécules de costimulation fournissent un stimulus
aux lymphocytes T. Ce deuxième signal ou signal de costimulation n’est pas spécifique de
l’antigène. Les molécules de costimulation les mieux définies sont les CD80 et CD86 présents
à la surface des cellules présentatrices d’antigène. Ces protéines sont reconnues par un
9
récepteur appelé CD28 sur les lymphocytes T. L’engagement du TCR seul n’est pas en
mesure d’activer les lymphocytes T. Une autre voie participant au renforcement des signaux
de costimulation destinés aux lymphocytes T est constituée par le ligand de CD40 (CD40L ou
CD154) sur les lymphocytes T et CD40 sur les CPA.
En réponse à l’antigène et aux costimulateurs, les lymphocytes T, en particulier les
lymphocytes T CD4+, sécrètent rapidement plusieurs types de cytokines qui présentent des
activités diverses.
Dans un délai très court après le début de l’activation, la première cytokine sécrétée est l’IL-2.
En outre, l’activation stimule rapidement la capacité des lymphocytes à se lier et à répondre à
l’IL-2, en régulant l’expression du récepteur à l’IL-2. Le récepteur à haute affinité pour l’IL-2
est une molécule à 3 chaînes. Les lymphocytes T naïfs expriment deux chaînes de
signalisation pour ce récepteur, les chaînes β et γc, mais n’expriment pas la chaîne qui permet
au récepteur de se lier à l’IL-2 avec une haute affinité. Quelques heures après l’activation par
les antigènes et les molécules de costimulation, les lymphocytes T produisent la 3e chaîne du
récepteur, la chaîne α (CD25). Après quoi, le récepteur de l’IL-2 est en mesure de se lier
fortement à l’IL-2. L’IL-2 produite par un lymphocyte T stimulé par un antigène se lie
préférentiellement au même lymphocyte T et agit sur celui-ci (signal 3, Figure 1). L’IL-2
stimule les lymphocytes T pour qu’ils s’engagent dans le cycle cellulaire et commencent à se
diviser. L’IL-2 entraîne l’expression d’autres récepteurs à la surface des lymphocytes T
comme le récepteur à la transferrine (CD71). L’expression du CD71 à la surface d’une cellule
est représentative d’une forte activité métabolique de la cellule (7). Pour que les cellules
progressent vers le cycle cellulaire, l’expression du CD71, à la surface cellulaire, doit être
augmentée pour internaliser le fer nécessaire à la synthèse d’ADN et à la prolifération (8, 9).
L’expression de ces différents récepteurs entraîne une expansion clonale du lymphocyte T et
une différenciation en lymphocyte effecteur qui regagne l’organe greffé pour le détruire
(Figure 1).
Les voies biochimiques qui relient la reconnaissance de l’antigène aux réponses des
lymphocytes T se composent de l’activation d’enzymes, du recrutement de protéines
adaptatrices et de la production de facteurs de transcription. Cette région de contact entre la
CPA et le lymphocyte qui comprend les protéines membranaires porte le nom de synapse
immunologique. Le complexe du TCR comprend des motifs riches en tyrosine qui vont être
phosphorylés et devenir la zone d’arrimage d’une tyrosine kinase appelée ZAP-70. ZAP-70
activée effectue ensuite la phosphorylation de différentes protéines adaptatrices et de
plusieurs enzymes qui assurent elles-mêmes d’autres événements de signalisation. Les deux
10
voies liées à ZAP-70 sont la voie calcique et la voie Ras. ZAP-70 active la phospholipase C
qui catalyse l’hydrolyse du phosphatidyl-inositol de la membrane plasmique. Cela va stimuler
la libération des ions calcium et le calcium cytoplasmique se lie à la calmoduline. Ce
complexe ainsi formé active une phosphatase appelée la calcineurine. Cette enzyme
déphosphoryle NFAT (facteur nucléaire des lymphocytes T activés) qui va se lier aux
promoteurs de plusieurs gènes comme celui de l’IL-2 afin de les activer. La phosphorylation
de ZAP-70 initie également la voie Ras/Rac-MAP-kinases qui après une cascade enzymatique
va permettre de former le facteur de transcription actif AP-1 qui augmente la transcription de
plusieurs gènes des lymphocytes T. D’autres évènements biochimiques participant à la
signalisation du TCR comprennent l’activation d’une protéine kinase C et l’activation d’un
facteur de transcription, le facteur nucléaire-κB (NF-κB). Enfin l’activation du 3e signal qui
correspond à la fixation de l’IL-2 sur son récepteur, provoque une cascade de phosphorylation
recrutant les protéines PI-3K et Akt puis mTOR (mammalian Target of Rapamycin) qui
aboutit à la progression du cycle cellulaire de la phase G1 à S et donc à la prolifération
lymphocytaire.
Fig. 1. Signaux d’activation d’un lymphocyte T lors du rejet de greffe [d’après (10)]
1.1.2.2. Le rejet humoral
Le rejet humoral, médié par les anticorps, a été mieux identifié au cours des dernières années.
Il serait dû à l’activation du système du complément et au recrutement in situ des neutrophiles
11
(11). Feucht et coll. ont mis en évidence chez des patients transplantés rénaux la présence de
fragments du complément C4d déposés au niveau des capillaires péritubulaires du greffon
rénal. Ils postulent que ces dépôts sont le reflet d’un « état d’alloréactivité humorale » contre
le greffon (12, 13). En 1999, Collins et coll. ont trouvé une corrélation entre la présence de
C4d dans les capillaires péritubulaires du greffon et la présence de novo d’anticorps anti-HLA
spécifiques dirigés contre le donneur (14).
1.1.3. La néphropathie chronique d’allogreffe
La néphropathie chronique d’allogreffe se manifeste en clinique par une diminution
progressive de la fonction rénale associée à une protéinurie et accompagnée d’hypertension
artérielle, des mois ou des années après la greffe.
Elle peut se caractériser par deux types de lésions, soit une fibrose progressive du parenchyme
du greffon, soit une sténose des vaisseaux, en particulier les artères et les artérioles : c’est
l’athérosclérose de greffe. L’état d’avancement de la néphropathie chronique d’allogreffe est
déterminé par la sévérité des lésions de fibrose interstitielle et d’atrophie tubulaire (FIAT)
(15).
Ces lésions peuvent êtres provoquées par différents facteurs, immunologiques ou nonimmunologiques.
Les mécanismes immunologiques qui interviennent dans la néphropathie chronique
d’allogreffe sont encore mal connus. Le rejet chronique est souvent dû à la fréquence de rejet
aigu. Les incompatibilités HLA sont également des facteurs de risque dans la perte tardive du
greffon. La production d’anticorps anti-HLA après la transplantation est corrélée à une
augmentation du risque de néphropathie chronique d’allogreffe (16).
Des facteurs non-immunologiques peuvent également jouer un rôle dans la pathogenèse de la
néphropathie chronique d’allogreffe. En effet, les caractéristiques initiales du donneur comme
son âge, ses pathologies sont des facteurs de risque. Les lésions péri-transplantation comme
les lésions d’ischémie froide ou les lésions d’ischémie-reperfusion peuvent être des facteurs
de néphropathie chronique d’allogreffe. Les facteurs non-immunologiques comprennent aussi
ceux qui interviennent après la greffe, comme l’hypertension artèrielle, l’hyperlipidémie et la
toxicité rénale des immunosuppresseurs. À ce jour la néphropathie chronique d’allogreffe est
la cause principale de perte du greffon et il est encore très difficile de la prévenir et de la
traiter. (17),(18).
12
1.2. Les traitements immunosuppresseurs
Les traitements immunosuppresseurs ont pour but de protéger les organes transplantés du
rejet. Au cours du temps, la recherche dans ce domaine a fait évoluer les traitements vers une
spécificité de plus en plus importante.
L’immunosuppression peut être obtenue par la déplétion des lymphocytes, le blocage de leur
activation ou de leur prolifération. Chaque signal d’activation des lymphocytes est une cible
potentielle
pour
le
développement
d’un
immunosuppresseur
(Figure
2).
Les
immunosuppresseurs peuvent êtres classés en fonction de leur mode d’action.
Fig. 2. Évolution des traitements immunosuppresseurs au cours du temps : traitement anti-prolifératif
(vert), traitement immunomodulateur (rouge), traitement bloquant les voies d’activation des
lymphocytes (bleu) et traitement corticoïdes (noir).
On peut distinguer deux grandes classes de traitements immunosuppresseurs :
Les traitements d’induction sont administrés avant la transplantation et quelques jours après.
Les traitements d’entretien sont nécessaires tout au long de la vie du greffon pour éviter tout
risque de rejet aigu ou chronique.
13
1.2.1. Les traitements d’induction
Le traitement d’induction se réfère à l’utilisation d’anticorps mono- ou polyclonaux juste
avant l’implantation du greffon pour diminuer la réponse immune du receveur. Son utilisation
n’est pas systématique.
Les anticorps employés sont:
•
Les anticorps polyclonaux de lapin ou de cheval dirigés contre les lymphocytes
T : Thymoglobuline (ATG) ou Lymphoglobuline (ALG)
•
Les anticorps monoclonaux anti-CD3 (OKT3) ; mais ils sont de moins en
moins utilisés à cause de leurs effets secondaires importants
•
Les anticorps monoclonaux dirigés contre la chaine α du récepteur de
l’interleukine 2 (anti-CD25) : basiliximab, daclizumab
Les ATG ou ALG et les anti-CD25 sont généralement bien tolérés (19), (20), (21).
1.2.2. Les traitements d’entretien
Le plus grand nombre de patients transplantés reçoit de nos jours une trithérapie qui comporte
des corticoïdes, un agent antiprolifératif et un inhibiteur de la calcineurine (ACN). Ce
traitement peut évoluer en fonction des effets secondaires du traitement.
1.2.2.1.Les inhibiteurs de la calcineurine
1.2.2.1.1. La ciclosporine
La ciclosporine ou Néoral (Novartis) représente une période-charnière dans l’histoire de la
transplantation. C’est le premier traitement spécifique des lymphocytes T qui a amélioré
considérablement la survie du greffon. C’est un polypeptide cyclique dérivé d’un métabolite
de champignon de sol Tolypocladium inflatum. La ciclosporine se lie dans le cytoplasme à
une protéine du groupe des immunophilines, la ciclophiline. Le complexe ainsi formé se fixe
sur une phosphatase, la calcineurine, qui régule de nombreuses activités enzymatiques et qui
est calcium dépendante. Ce complexe va inhiber des facteurs de transcription dont notamment
NFAT (nuclear factor of activated T cells) (22), NF-κB (nuclear factor-κB) et JNK (JUN N14
terminal kinase). Ces facteurs de transcription sont essentiels dans la régulation de l’ARN
messager de diverses cytokines (23), en particulier celle de l’IL-2 qui est nécessaire à la
prolifération et à la maturation des lymphocytes T et de l’IFN-γ essentiel à l’activation des
macrophages (24).
1.2.2.1.2. Le tacrolimus
Le tacrolimus ou FK506 ou Prograf (Astellas) est un macrolide issu de la bactérie
Streptomyces tsukubaensis qui inhibe la production par les lymphocytes T de l’IL-2 de la
même façon que la ciclosporine. Le tacrolimus forme un complexe avec une autre
immunophiline la FKBP12 (FK-binding proteins) et ce complexe va inhiber l’activité
phosphatase de la calcineurine.
La ciclosporine et le tacrolimus ont des effets secondaires importants qui sont dépendants de
la dose. Ces effets secondaires concernent le plus souvent les sites où se concentre la
calcineurine en particulier le cerveau et les reins (25).
Ces deux inhibiteurs de la calcineurine sont responsables d’hypertension artérielle, de
dyslipidémie, de diabète et surtout d’une néphrotoxicité. Les anti-calcineurines (ACNs)
entraînent une sévère vasoconstriction des artérioles afférentes au glomérule, et dans un
même temps une réduction du flux sanguin rénal et du débit de filtration glomérulaire. Ces
effets sont réversibles avec une réduction du dosage des ACNs (26, 27). Mais à long terme,
les ACNs sont la cause de lésions irréversibles caractérisées par une fibrose interstitielle et
une oblitération artériolaire due à un rétrécissement de l’intima des vaisseaux (28). Ce
phénomène peut entraîner une néphropathie chronique d’allogreffe.
1.2.2.2.L’acide mycophénolique
L’acide mycophénolique (MPA) est issu de la fermentation de Penicillium brevicompactum et
d’autres champignons (29). Il est utilisé comme immunosuppresseur depuis les années 90.
Deux formes existent (Figure 3). La forme ester, le mycophénolate mofétil (MMF) ou
Cellcept (Roche), est une prodrogue qui est absorbée dans l’estomac et convertie en MPA,
la molécule active : c’est une libération rapide. La forme sodique, le mycophénolate sodique
15
(MPS) ou Myfortic (Novartis) est gastroprotégée et permet une libération prolongée en
retardant la libération du MPA dans l’intestin.
Fig. 3. Formule chimique des deux formes du MPA
Le MPA est un inhibiteur réversible et non compétitif de l’inosine monophosphate
déshydrogénase (IMPDH) qui est l’enzyme clef de la voie de synthèse de novo des
nucléotides de la guanosine, eux-mêmes essentiels à la synthèse d’ADN. La plupart des
cellules utilisent deux voies de synthèse des nucléotides de la guanosine, la voie de novo et la
voie de sauvetage. Les lymphocytes utilisent très peu la voie de sauvetage, c’est pourquoi le
blocage de la voie de novo entraîne une inhibition relativement sélective de la prolifération
des lymphocytes.
Les effets secondaires du MMF et du MPS sont similaires et sont principalement des
problèmes gastro-intestinaux tels que diarrhées, nausées, vomissements. Ils augmentent
l’incidence d’infections virales (cytomégalovirus, herpes simplex, BK virus…), et ont une
toxicité hématologique (anémie, neutropénie, thrombopénie).
Le MMF et le MPS sont le plus souvent associés à une anti-calcineurine, avec ou sans
corticoïdes.
1.2.2.3.Les inhibiteurs de la mTOR
1.2.2.3.1. Le sirolimus
Le sirolimus (Rapamune®, Wyeth) est une lactone macrocyclique issue de la fermentation de
la bactérie streptomyces hygroscopicus (30). Il se lie à la même immunophiline que le
tacrolimus, FKBP12, mais n’inhibe pas l’activité de la calcineurine. Le complexe est un
inhibiteur hautement spécifique de la cible de la rapamycine chez les mammifères
16
(mammalian target of rapamycin, mTOR). La mTOR est une sérine/thréonine kinase
impliquée dans la voie de signalisation du phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K/AKT).
L’inhibition de mTOR a un effet sur la voie de signalisation nécessaire à la progression du
cycle cellulaire et à la prolifération cellulaire (signal 3 d’activation, figure 1). La mTOR est
nécessaire à l’activation de la synthèse protéique de 70-KDa S6 kinase (p70S6K) qui est une
enzyme nécessaire à l’activation de la protéine ribosomale S6 (31).
Ses principaux effets secondaires sont l’hyperlipidémie, la toxicité hématologique (anémie,
leucopénie, thrombocytopénie), ainsi que des lésions sur les muqueuses (aphtes).
1.2.2.3.2. L’évérolimus
L’évérolimus (Certican®, Novartis) a la même cible que le sirolimus. C’est une modification
chimique du sirolimus pour améliorer son absorption (Figure 4). La différence entre ces 2
molécules se situe au niveau de la pharmacocinétique. La demi-vie de l’évérolimus est plus
courte (28h) que celle du sirolimus (62h). La concentration d’évérolimus atteint l’état stable
sanguin au bout de 4 jours au lieu de 6 jours pour le sirolimus (32).
Fig. 4. Structure chimique des inhibiteurs de la mTOR
17
1.2.2.4.Les corticoïdes
Les corticostéroïdes ont été introduits en tant que traitement immunosuppresseur dans les
années 60. Ils ont un effet anti-inflammatoire non spécifique. Ils inhibent la transcription des
gènes de cytokines sécrétées par les lymphocytes T et les macrophages en bloquant
l’activation des facteurs nucléaire-κB (NF-κB). Ainsi, ils interrompent l’activation des
cellules T et l’atteinte tissulaire médiée par les macrophages (33, 34). Ils ont de nombreux
effets secondaires comme l’hypertension, la dyslipidémie et le diabète sucré.
1.2.2.5.Le léflunomide
Le léflunomide ou ARAVA (Aventis Corp.) est un immunosuppresseur approuvé pour le
traitement de la polyarthrite rhumatoïde depuis 1998. Il possède de nombreuses activités
biologiques. Il inhibe une enzyme mitochondriale, l’acide dihydroorotique déshydrogénase
(DHOH) (35), nécessaire à la synthèse de l’orotate dans la voie de novo des nucléotides
pyrimidiques. Il inhibe certaines tyrosines kinases (36). De nombreuses études ont montré la
capacité du léflunomide à contrôler et « réverser » le rejet aigu (37), (38). Il a été également
montré in vitro que le léflunomide a des effets anti-viraux contre le cytomégalovirus et le BK
virus (39), (40).
1.2.2.6.Les immunosuppresseurs en cours de validation
Le LEA 29Y ou Belatacept® (BMS) est une protéine de fusion humaine qui combine la
portion extracellulaire du cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA4) avec la
région constante (fragment Fc) d’une IgG1 humain (CTLA4-Ig) (41). Il se lie à la surface des
ligands de co-stimulation (CD80 et CD86) des cellules présentatrices d’antigènes avec une
meilleure affinité que le CD28. Il bloque ainsi la co-stimulation et inhibe l’activation des
lymphocytes T. Une étude de Phase II en greffe rénale a montré qu’il était aussi efficace que
la ciclosporine pour prévenir le rejet. En revanche, la fonction rénale était meilleure chez les
patients recevant du Belatacept par rapport à ceux recevant de la ciclosporine (42).
18
2. Le suivi thérapeutique des immunosuppresseurs
Le suivi thérapeutique est utile pour apporter des informations sur le dosage approprié d’un
médicament et sur le risque de toxicité qui lui est associé.
Pour qu’un médicament nécessite un suivi thérapeutique pharmacologique, il faut qu’il y ait :
1) une relation meilleure entre la concentration du médicament et son effet que la
relation dose-effet
2) un index thérapeutique étroit, c’est-à-dire une faible différence entre la
concentration efficace et la concentration toxique,
3) une variabilité interindividuelle pharmacocinétique importante
4) une réponse pharmacologique difficile à mesurer directement (43).
La ciclosporine, le tacrolimus, le MMF et les inhibiteurs de la mTOR remplissent les critères
pour justifier un suivi thérapeutique pharmacologique. Ce suivi permet d’individualiser la
posologie des immunosuppresseurs et ainsi de prolonger la durée de vie du greffon.
Différentes approches peuvent être utilisées pour déterminer le dosage adéquat d’un
immunosuppresseur. La première est d’observer les signes cliniques. La deuxième implique
de déterminer les propriétés pharmacocinétiques des immunosuppresseurs afin de pouvoir
mesurer leur concentration circulante et d’adapter la dose en fonction d’une concentration
cible : c’est le suivi pharmacocinétique (PK). La troisième approche est l’étude
pharmacodynamique (PD) des immunosuppresseurs, qui implique la mesure de l’effet
biologique du médicament sur sa cible.
2.1. Le suivi pharmacocinétique
2.1.1. Définition
L’étude pharmacocinétique d’un médicament concerne le devenir du médicament dans
l’organisme. L’étude pharmacocinétique est l’étude de l’absorption, de la distribution dans le
temps d’un médicament et de ses métabolites dans les différents compartiments du corps
(sang, liquide interstitiel, cellule), ainsi que de son métabolisme et de son élimination.
19
L’étude pharmacocinétique va permettre de déterminer quelle est la concentration
plasmatique maximale, minimale et moyenne de la molécule et sa durée de vie dans
l’organisme. Ainsi, la posologie du médicament pourra être adaptée pour obtenir une
concentration plasmatique efficace avec un minimum d'effets indésirables, à conditions que
des essais cliniques observationnels aient déterminé la relation concentration-effets.
2.1.2. Les anti-calcineurines
2.1.2.1.Propriétés pharmacocinétiques
2.1.2.1.1. La ciclosporine
La ciclosporine existait initialement sous une forme huileuse (Sandimmum®). Cette forme
avait une forte lipophilie et une biodisponibilité faible (<30%), très variable d’un sujet à
l’autre, ou chez un même sujet au cours du temps. Ces inconvénients ont pu être améliorés
grâce à une nouvelle formulation en microémulsion (Néoral®). Cette nouvelle formulation a
augmenté la biodisponibilité de plus de 49% (44).
La ciclosporine est distribuée dans tout l’organisme avec un volume de distribution (Vd) de 3
à 5 L/kg ; et la clairance est faible, en moyenne 6-10 mL/min/kg.
Elle est métabolisée principalement dans le foie et la paroi intestinale par le CYP3A4. Il
existe plus de 25 métabolites. AM1, AM9-hydroxylé et AM4-déméthylé sont les métabolites
majoritairement présents. L’augmentation d’AM1 et AM19 entraîne une néphrotoxicité (44).
La plus grande partie des métabolites est excrétée par la bile. Seulement 1% est excrété sous
forme inchangée. La ciclosporine a une élimination biphasique avec une demi-vie terminale
qui varie de 5 à 18h.
2.1.2.1.2. Le tacrolimus
Le tacrolimus a une absorption variable avec une concentration sanguine maximale obtenue
1,5h après la prise, et une biodisponibilité moyenne de 20% (6 à 43%).
20
Le tacrolimus se lie très fortement aux érythrocytes. Dans le plasma, il se lie principalement à
l’albumine et à l’α-1-glycoprotéine acide. Il est largement distribué dans l’organisme avec un
volume de distribution de 5 à 65 L/kg (45), (44). Il est métabolisé au niveau du foie par
CYP3A4 et il existe 8 métabolites caractérisés à ce jour. Son élimination se fait
majoritairement par la bile et sa demi-vie est de 3,5 à 40,5h due à la variabilité inter-patient.
2.1.2.2.Méthodes de dosage
2.1.2.2.1. La ciclosporine
La ciclosporine peut être dosée par HPLC : c’est la méthode la plus spécifique et donc la
méthode de référence. L’utilisation de l’HPLC n’est pourtant pas très répandue car elle
demande une bonne connaissance de la technique et beaucoup de temps. La plupart des
laboratoires utilisent généralement des tests immunologiques mis au point par des industriels.
La difficulté de mise au point d’un test immunologique est de développer des anticorps
spécifiques de la ciclosporine qui n’interagissent pas avec les métabolites inactifs de celle-ci.
Il existe 8 tests immunologiques sur le marché. Les tests les plus couramment utilisés sont
mFPIA/axSYM®, mFPIA/TDx®, pFPIA/TDx® (Abbot), EMIT® (Dade-Behring), Cyclotrac
mRIA® et CEDIA/Plus® (Boehringer Mannheim). D’après Steimer et coll., la méthode la plus
sensible est mFPIA/TDx® (46). Ces méthodes présentent toujours un biais et il est difficile de
comparer les résultats entre 2 laboratoires. De plus, la spécificité varie en fonction de la
pathologie du patient et du type de transplantation. La LC-MS/MS (chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse en tandem) est une méthode plus rapide, facile et
réellement spécifique avec une grande précision et sensibilité ; elle est de plus en plus utilisée
par les laboratoires (47).
2.1.2.2.2. Le tacrolimus
La concentration sanguine du tacrolimus est relativement faible (<30µg/L), ce qui rend sa
mesure difficile. Il existe différents types de méthodes de dosage comme l’HPLC associé à un
spectromètre de masse ou des méthodes immunologiques (ELISA, MEIA : essai
immunologique enzymatique à microparticule, EMIT, CEDIA). La majorité des laboratoires
21
utilisent la MEIA car elle peut mesurer la concentration dans le sang avec une fourchette de 3
à 30 µg/L et elle ne réagit que faiblement avec les métabolites du tacrolimus. De plus, elle est
moins contraignante que l’HPLC ou l’ELISA en temps et en coût (48). La méthode la plus
sensible reste l’HPLC couplée à la spectrométrie de masse.
2.1.2.3.Les applications
2.1.2.3.1. La ciclosporine
Le suivi thérapeutique de la ciclosporine s’effectue depuis plus de 20 ans. La concentration
sanguine résiduelle (C0), qui correspond à la concentration résiduelle de la molécule 12h après
la prise du traitement, a été la plus utilisée pour déterminer son dosage. L’ASC0-24h (Aire
Sous la Courbe) de la ciclosporine est associée aux effets secondaires et aux risques de rejets
(49). La nécessité de multiples prélèvements et la contrainte que cela engendre rendent ce
paramètre difficilement mesurable en routine clinique (49), (50). Une ASC0-12h estimée à
partir d’un nombre limité de prélèvements peut être une alternative à ce problème.
L’estimation Bayesienne permet d’estimer une ASC0-12h à partir de seulement 3 prélèvements.
Cette méthode a été développée par Léger et ses collaborateurs (51), et est actuellement
appliquée dans une étude multicentrique française chez des patients transplantés rénaux
stables afin d’évaluer une stratégie pour diminuer la dose de ciclosporine (52).
La mesure d’un seul prélèvement 6h après la prise (C6) permettrait de diminuer la dose de
ciclosporine de 30% sans pour autant altérer la prévention du rejet (53).
La concentration sanguine de la ciclosporine 2h après la prise du médicament (C2) (54), est
une zone très variable de la concentration sanguine entre les patients, et à C2 l’inhibition de la
calcineurine est maximale (55), (56).
La mesure du C2 s’est révélée être bénéfique (57), (58). Elle est la méthode la plus utilisée à
l’heure actuelle en clinique pour adapter la dose de ciclosporine (tableau 1). Deux grandes
études cliniques randomisées, MO2ART et LIS2T, impliquant différents centres, montrent
l’efficacité du dosage du C2 chez des patients transplantés rénaux et hépatiques dans les 3
premiers mois après la greffe (59, 60).
22
Tableau 1. Concentration cible de C2 de la ciclosporine dans le sang total d’après (61) et (62)
Type de transplantation
Temps post-transplantation
Concentrations cible de C2
(mois)
(ng/mL)
1
1300-1700
2-3
1000-1300
4-6
900-1000
>7
600-800
0-3
1000
4-6
800
>7
600
Rénale (62)
Hépatique (61)
2.1.2.3.2. Le tacrolimus
La pharmacocinétique du tacrolimus est très variable (63).
La prédiction de l’ASC0-12h du tacrolimus à partir d’un nombre limité de prélèvements est
réalisable (64). La concentration résiduelle du tacrolimus reste tout de même la plus utilisée à
l’heure actuelle pour le suivi thérapeutique en clinique (tableau 2). Cela peut être dû en partie
à la forte corrélation observée entre la concentration résiduelle et le Cmax ou l’ASC0-12h (65).
Il existe enfin une corrélation entre le C0 du tacrolimus et l’efficacité thérapeutique ainsi que
la toxicité (66), (64).
Tableau 2. Marges thérapeutiques du tacrolimus dans le sang total basées sur C0, d’après (67)
Type de transplantation
Rénale
Hépatique
Temps post-transplantation
Marge thérapeutique d’après
(mois)
C0 (ng/mL)
1-3
7-20
4-12
5-15
1-12
5-20
23
2.1.3. L’acide mycophénolique
2.1.3.1.Les propriétés pharmacocinétiques
2.1.3.1.1. Le MMF
Le MMF est rapidement absorbé lorsqu’il est administré par voie orale et hydrolysé en MPA
par des estérases. La biodisponibilité est située entre 80,7% et 94%. La concentration
plasmatique du MPA est atteinte après 0,5-1,3h. Le volume de distribution est d’environ 4
L/kg (44, 68). Le MPA se lie fortement à l’albumine sérique à 97-99%.
Le MPA est métabolisé dans le foie en acide mycophénolique glucuronide (MPAG) qui est
éliminé principalement dans les urines. Une partie du MPAG est sécrétée par la bile dans les
intestins et forme un cycle entéro-hépatique (69). Deux métabolites minoritaires ont
également été observés dans le plasma, le 7-O-glucoside et la forme acyl-glucuronide
(AcMPAG) qui serait pharmacologiquement actif (70). La demi-vie d’élimination du MPA
est d’environ 17h (44).
2.1.3.1.2. Le MPS
Le MPS et le MMF ont une biodisponibilité différente, elle est de 72% pour le MPS. La
concentration maximale du MPA est atteinte plus tardivement que celle du MMF du fait de
l’absorption du MPS retardée, mais le tmax du MPS est très variable, la médiane est de 1,5h
avec une fourchette de 0-6h après la prise du MPS. La dose résiduelle du MPA est donc plus
élevée chez les patients ayant reçu du MPS que ceux ayant reçu du MMF (71), (72).
2.1.3.2.Les méthodes de dosage
Il existe trois méthodes pour mesurer la concentration plasmatique du MPA, l’HPLC (High
Performance Liquid Chromatography), la méthode EMIT (Enzyme-multiplied immunoassay
technique) et l’inhibition enzymatique de l’IMPDH 2 recombinante. La méthode EMIT est
moins spécifique que l’HPLC dans la mesure de la concentration du MPA car un des
24
métabolites glucuro-conjugués du MPA, l’AcMPAG, interagit avec les anticorps
reconnaissant le MPA. C’est pour cela que la concentration en MPA obtenue par la méthode
EMIT est très souvent supérieure à celle de l’HPLC qui peut différencier les deux molécules.
La méthode enzymatique du dosage du MPA a permis d’obtenir des résultats en accord avec
ceux qui sont obtenus par un dosage du MPA en HPLC. Toutefois, elle surestime la
quantification du MPA par la présence de son métabolite, l’AcMPAG ; mais cette
augmentation ne serait pas relevante cliniquement (73). La méthode EMIT et l’HPLC sont
utilisées en routine même si l’HPLC reste plus spécifique (74).
2.1.3.3.Applications
2.1.3.3.1. Dose fixe
Au milieu des années 90, trois importants essais cliniques ont montré l’efficacité clinique du
MMF en transplantation rénale. Le MMF est plus efficace qu’un placebo, aussi bien à la dose
de 2g/jour que de 3g/jour en association avec la ciclosporine et des corticoïdes, avec une
diminution significative du risque de rejet au cours des 6 mois après la greffe. Les mêmes
résultats ont été observés entre le MMF et l’azathioprine (75-77). D’autres études confirment
l’efficacité du MMF à 1 an (78) et à 3 ans (79) (80) (81) post-greffe en termes de survie du
greffon. Depuis ces différentes études, le MMF a été largement utilisé à 2g par jour en
association avec une anti-calcineurine, aussi bien la ciclosporine que le tacrolimus (82), et des
corticoïdes. La dose de MMF est généralement adaptée en fonction des effets secondaires
provoqués, telles que les complications gastro-intestinales ou hématologiques.
Des études ont comparé différents paramètres pharmacocinétiques du MPA avec les
observations cliniques. Elles montrent une forte association entre la concentration d’acide
mycophénolique et ses effets pharmacologiques notamment son efficacité, définie par la
prévention du rejet aigu (83), (84), (85), (86). Pillans et ses collaborateurs observent une
relation significative entre le risque de rejet aigu et l’ASC du MMF mais pas entre le taux
résiduel du MMF et le rejet (85).
L’ASC du MPA et la concentration pré-dose (C0) présentent une grande variabilité
interindividuelle chez des patients transplantés rénaux recevant une dose fixe de MMF (87),
(88).
25
Ces différentes observations laissent entrevoir un nouveau mode d’individualisation de la
posologie du MMF, en adaptant la posologie au dosage plasmatique du principe actif.
2.1.3.3.2. Dose adaptée
Le suivi thérapeutique du MMF en fonction de sa pharmacocinétique est de plus en plus
développé et de nombreuses études ont été menées ou sont en cours. En revanche, des études
montrent que le suivi thérapeutique du MPS est beaucoup plus difficile à réaliser, du fait de la
grande variation de ses paramètres pharmacocinétiques (71, 89). Le seul suivi thérapeutique
du MPS possible est la mesure d’une ASC0-12h effectuée à partir de multiples prélèvements.
De nombreuses études tentent de déterminer quel paramètre pharmacocinétique est le plus
représentatif de l’effet immunosuppresseur du MPA. L’ASC0-12h du MPA est le paramètre qui
prédit le plus spécifiquement les évènements cliniques en comparaison au C0 (90).
Des études randomisées, chez des patients transplantés rénaux, préconisent un intervalle de
l’ASC0-12h du MPA de 30 à 60 mg.h/L dans la période précoce post-transplantation (84, 86,
91). Les valeurs de l’ASC en dessous de cet intervalle sont associées à une augmentation du
risque de rejet aigu alors que des valeurs supérieures à 60 mg.h/L ne montrent pas une
meilleure réduction du risque de rejet aigu (84).
Toutefois, l’ASC0-12h nécessite de nombreux prélèvements qui peuvent s’avérer coûteux et
difficilement réalisables.
C’est pourquoi de nombreuses stratégies sont mises en places afin d’estimer l’ASC0-12h
complète du MPA à partir d’un faible nombre de prélèvements et différentes méthodes de
régression (92-94). Une autre méthode plus robuste a été développée pour prédire l’ASC0-12h
du MPA à partir d’un nombre de prélèvements limités, c’est la méthode d’estimation
bayesienne (52, 95). L’estimation bayesienne utilise les résultats d’un nombre limité de
prélèvements (20min, 1h et 3h après la prise) du patient en association avec un modèle
pharmacocinétique basé sur une population donnée pour prédire l’ASC0-12h du MPA et
adapter son dosage.
Malgré la forte association qui existe entre l’ASC0-12h du MPA et les résultats cliniques, il
subsiste toujours un doute quant au suivi thérapeutique du MPA en routine, et au bénéfice que
cela peut apporter.
Des essais cliniques ont été menés afin de déterminer si le suivi thérapeutique
pharmacologique du MPA améliore l’efficacité et diminue la toxicité. Ces essais étudient
26
l’avantage du suivi thérapeutique du MPA chez des transplantés rénaux en comparant le
MMF administré en dose fixe et en dose adaptée à l’ASC0-12h. Les résultats de l’étude FDCC
n’ont pas montré de différence d’effet clinique entre la dose fixe et la dose adaptée de MMF
(96). En revanche, l’étude APOMYGRE, une étude nationale française, a montré que
l’individualisation de la dose du MMF à partir de son ASC0-12h ,estimée par un modèle
Bayesien, est possible et induit une diminution significative du rejet aigu chez les patients
ayant une dose de MMF adaptée (12,3% vs 30,7%), sans danger pour les patients transplantés
du rein lorsque le MMF est associé à la ciclosporine et à des corticoïdes. Les patients qui ont
une dose adaptée du MMF atteignent plus rapidement la concentration thérapeutique de MPA
que ceux qui reçoivent une dose fixe (97). De nouvelles études sont en cours pour déterminer
si l’adaptation du MMF en fonction de son ASC0-12h est utile et efficace lorsqu’il est associé
au tacrolimus ou au sirolimus, et si elle est utile et efficace en transplantation hépatique et
pulmonaire.
2.1.4. Les inhibiteurs de la mTOR
2.1.4.1.Les propriétés pharmacocinétiques
2.1.4.1.1. Le sirolimus
Le sirolimus est très rapidement absorbé par voie orale avec une concentration maximale
atteinte environ 2h après la prise. Sa biodisponibilité est faible et estimée à environ 14%. La
fraction libre plasmatique de sirolimus est d’environ 8%. Son volume de distribution est
d’environ 1,7 L/kg. Il est métabolisé par le CYP3A4 par des O-déméthylation et/ou des
hydroxylation en une dizaine de métabolites (44). Il existe une grande variabilité
pharmacocinétique interindividuelle. Les métabolites sont excrétés majoritairement par la
bile. Sa demi-vie d’élimination est de 62h.
27
2.1.4.1.2. L’évérolimus
L’évérolimus est comme le sirolimus rapidement absorbé par voie orale avec une
concentration sanguine maximale aux environs de 2h après la prise. Sa biodisponibilité est
d’environ 5 à 26%. Sa fraction libre plasmatique est de 26%. Son volume de distribution est
de 1,5 L/kg. Il est métabolisé par le CYP3A4 par des déméthylations et des hydroxylations en
une dizaine de métabolites (98). La variabilité pharmacocinétique interindividuelle est moins
importante qu’avec le sirolimus. Les métabolites sont excrétés majoritairement par la bile et la
demi-vie d’élimination est de seulement 28h.
2.1.4.2.Les méthodes de dosage
La méthode de dosage la plus utilisée aussi bien pour le sirolimus que l’évérolimus est la
chromatographie liquide associée à un détecteur UV ou un spectromètre de masse. Il existe
également des essais immunologiques, mais ils réagissent dans la plupart des cas avec les
métabolites du sirolimus ou de l’évérolimus et sont moins souvent utilisés (99) (100).
2.1.4.3.Les applications
2.1.4.3.1. Le sirolimus
Il existe une bonne corrélation entre la concentration résiduelle du sirolimus et son ASC0-12h
(101). Chez les patients transplantés rénaux, une fourchette de concentration résiduelle de
sirolimus à respecter en fonction du traitement qui lui est associé a été établie. La fourchette
thérapeutique de la concentration du sirolimus en association avec la ciclosporine et des
corticostéroïdes est de 4-12ng/mL. La fourchette est de 12-20ng/mL lorsque le sirolimus est
associé à des corticostéroïdes seuls, et de 5-10ng/mL en association avec du MMF et des
corticostéroïdes. Il est recommandé de mesurer la concentration 5 jours après le changement
de posologie, puis une fois par semaine pendant les premiers mois de la transplantation, puis
tous les mois (102).
28
2.1.4.3.2. L’évérolimus
L’évérolimus a également une bonne corrélation entre sa concentration résiduelle et son
ASC0-12h. La fenêtre thérapeutique de la concentration résiduelle de l’évérolimus est comprise
entre 3-8ng/mL chez des patients transplantés rénaux recevant une trithérapie à base de
ciclosporine et corticoïdes (103).
2.1.5. Les limites de la pharmacocinétique
Il existe de nombreuses limites à l’utilisation du suivi thérapeutique basé sur la
pharmacocinétique en routine clinique, aussi bien pour les anti-calcineurines que pour le
MMF ou les inhibiteurs de la mTOR.
L’application du suivi thérapeutique pharmacologique nécessite du temps et pose souvent
problème par son coût et son manque d’applicabilité en routine, en égard au grand nombre de
prélèvements à effectuer. Aussi est-il plus couramment utilisé dans des centres spécialisés, le
plus souvent en Europe (104).
L’intervalle thérapeutique est très difficile à définir et dépend souvent du type de
transplantation, de la période post-transplantation et du traitement qui est associé au
médicament d’intérêt. Il est donc difficile de trouver une réelle corrélation entre la dose et
l’efficacité ou la toxicité.
La concentration du principe actif mesuré dans le sang ne correspond pas forcément à la
concentration pharmacologiquement active, ce qui peut être dû à une interaction des
métabolites inactifs au cours de la méthode de mesure, mais plus souvent à la variabilité du
rapport concentration sanguine/concentration au site d’action.
L’état pathologique du patient peut affecter le dosage de la molécule active comme la
fonction rénale qui peut affecter la fraction libre du MPA en altérant sa liaison à l’albumine
(92, 105). La pharmacocinétique de la ciclosporine a une grande variabilité interindividuelle.
En effet, l’absorption de la ciclosporine varie grandement d’un individu à l’autre et les
patients ayant une faible absorption ont un risque d’augmentation de toxicité si l’on se fie
essentiellement au dosage du C2 (106).
Les traitements anti-rejet sont l’association de plusieurs immunosuppresseurs, si bien que la
mesure du taux résiduel ou de l’ASC d’un seul ne suffit pas pour prévenir le risque de rejet ou
pour diminuer la toxicité. Toutefois, la quasi-totalité des immunosuppresseurs font l’objet
29
d’un suivi thérapeutique et des stratégies de réduction des concentrations des uns avec
contrôle des concentrations des autres apparaissent.
Le suivi pharmacocinétique ne permet pas de déterminer l’effet pharmacologique sur le
système immunitaire.
2.2. Le suivi pharmacodynamique
2.2.1. Définition
L’étude pharmacodynamique des immunosuppresseurs détermine les effets du médicament
sur l’organisme et plus précisément sur le système immunitaire. Cela peut être le comptage
des lymphocytes dans le sang, ou la mesure de l’effet du médicament sur sa molécule cible
qui a un grand rôle dans l’activation des lymphocytes, ou la mesure d’un phénomène
biologique complexe nécessaire à une fonction immunitaire normale (107).
2.2.2. Comptage des populations lymphocytaires
Dès l’introduction des immunosuppresseurs, une des solutions utilisées pour éviter une surou sous-immunosuppression a été de compter la population des lymphocytes T CD3+ ainsi
que les différentes sous populations lymphocytaires CD2, CD4, CD8, CD19 et CD56 dans le
sang circulant en cytométrie de flux.
Le comptage de ces populations a tout d’abord été utilisé en vue de prévenir le rejet (108).
Une augmentation du nombre de lymphocytes T CD3 est observée juste avant le rejet aigu, et
sert de facteur prédictif du rejet aigu précoce (109).
Avec le développement de l’utilisation des traitements d’induction comme les ATG et OKT3,
l’individualisation du dosage de ces molécules par le comptage des lymphocytes s’est
développée. Les différentes études faites afin de déterminer l’utilité d’un tel suivi
thérapeutique ne se basent pas sur le même nombre absolu de lymphocytes pour doser les
ATG. Alors que certains considèrent comme limite, pour l’adaptation de la dose, 10-20%
(110, 111) du nombre de lymphocytes T circulant avant transplantation, on retrouve
également comme limite 100 cellules/mm3 (112), 50 cellules/mm3 (113) et 10 cellules/mm3
(114). Pour chaque étude, les observations sont la plupart du temps similaires, l’adaptation de
30
la dose des ATG entraîne une diminution de la dose moyenne administrée en comparaison
avec une dose fixe, n’entraînant pas de risque de rejet et diminuant le risque de maladies
infectieuses. L’adaptation de la dose diminue également de façon significative le coût du
traitement.
En revanche cette méthode ne permet pas de définir l’activité des traitements comme les anticalcineurines ou les antimétabolites au sein de l’organisme. Cette technique permet de
compter les cellules présentes dans le sang, mais ne prend pas en considération celles qui se
sont infiltrées dans l’organe greffé. Elle limite la sur-immunosuppression et peut prédire le
rejet aigu précoce mais elle ne permet pas de diminuer la toxicité des autres traitements antirejet ou de prévenir le rejet chronique.
2.2.3. Dosage des molécules cibles
2.2.3.1.Les anti-calcineurines
Le tacrolimus et la ciclosporine ont des structures chimiques différentes, mais ils ont le même
mécanisme d’action qui implique la formation d’un complexe avec une immunophiline qui va
inhiber l’activité phosphatase calcium- et calmoduline- dépendante de la calcineurine. La
calcineurine est une enzyme clé pour l’activation des lymphocytes T. Elle régule le facteur
nucléaire des cellules T activées (NFAT) qui active la transcription des gènes de cytokines
comme l’interleukine-2 et l’interféron-γ (115). Ces différents facteurs ont servi de cibles dans
la mise au point d’études pharmacodynamiques des ACNs.
2.2.3.1.1. Dosage de l’IL-2
Dans les années 80, Yoshimura et Kahan ont publié une étude pharmacodynamique visant à
déterminer l’effet de la ciclosporine sur la production d’IL-2 par les lymphocytes (116). Elle
montre que l’IL-2 produite par les lymphocytes T isolés du sang de patients transplantés
rénaux, après stimulation avec de la PHA (Phytohémagglutinine), est inhibée à 40%.
L’absence ou une faible inhibition sont liées à un fort taux de rejet aigu.
31
Stein et ses collaborateurs ont mis au point une méthode pour mesurer la production d’IL-2 à
partir de sang total et observent une relation dose-effet après mise en présence de ciclosporine
in vitro et ex vivo (117).
Boleslawski et ses collaborateurs suggèrent également qu’un fort taux d’IL-2, produit par les
lymphocytes T CD8+, puisse refléter la capacité de ces cellules à entraîner un rejet aigu chez
des patients transplantés du foie (118). La mesure du taux d’IL-2 avant la greffe serait un
moyen de déterminer quels sont les patients qui nécessitent un plus fort dosage d’ACN (118).
Dans cette étude, les patients qui ont une production d’IL-2 constitutivement plus importante
ont développé un épisode de rejet.
Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si le seul dosage de l’IL-2 est
suffisant pour aider à l’individualisation thérapeutique des ACNs.
Plus récemment, Sommerer et ses collaborateurs ont mis au point une étude
pharmacodynamique de la ciclosporine en mesurant l’expression des gènes régulés par
NFAT. Ils montrent que la faible expression des gènes de l’IL-2, de l’INF-γ et de GM-CSF
(granulocyte-macrophage colony stimulating-factor) est étroitement liée avec la fréquence des
infections et des complications malignes lors d’un traitement sous ciclosporine (119). Ils
proposent l’utilisation de cette méthode pour diminuer la dose de ciclosporine chez les
patients transplantés rénaux à long terme (120).
2.2.3.1.2. Dosage de l’activité phosphatase de la calcineurine
La cible des anti-calcineurines la plus étudiée est l’activité phosphatase de la calcineurine
(CaN). En effet de nombreux groupes se sont penchés sur la relation entre les paramètres
pharmacocinétiques des anti-calcineurines et la CaN dans le sang total ou les cellules
mononucléées du sang chez des patients transplantés afin de trouver une corrélation. Il existe
de nombreuses études concernant l’inhibition de la CaN par la ciclosporine mais les études
sur le tacrolimus sont plus limitées (Tableau 3).
32
Tableau 3. Mesure de l’activité phosphatase de la calcineurine chez les patients transplantés
d’organes [d’après (121)]
Inhibiteur de la calcineurine
Ciclosporine
Auteurs (références)
Type de transplantations
Résultat
Pai et al. (122)
Cellules souches (n=33)
CaN avec GVHD est plus faible que sans GVHD
Batiuk et al. (123)
Rein (n=4)
CaN change rapidement avec la concentration sanguine
Batiuk et al. (124)
Rein (n=62)
50% de réduction de CaN comparé au groupe contrôle
Piccini et al. (125)
Rein (n=30)
Courbe d’inhibition de CaN est indépendante du PK de CsA
Halloran et al. (56)
Rein (n=4)
CaN est étroitement liée à la concentration sanguine de la CsA
Caruso et al. (126)
Rein (n=15)
Pas de relation entre PK de CsA et CaN
CaN basale est corrélée avec l’AUA0-12h
Millàn et al. (127)
Rein (n=65)
CaN est corrélée avec C2, même associé au MMF
Brunet et al. (128)
Rein (n=15)
CaN est corrélé avec C2
Sanquer et al. (129)
Cellules souches (n=31)
CaN prédit GVHD aigu
Fukudo et al. (130)
Foie (n=40)
Csa est un plus fort inhibiteur de CaN que FK
Koefoed-Nielsen et al. Rein (n=40)
Csa est un plus fort inhibiteur de CaN que FK
(131)
Fukudo et al. (132)
Tacrolimus
Foie (n=14)
CaN initiale est corrélée avec le AUA0-24h
Koefoed-Nielsen et al. Rein (n=21)
Aucune concentration de FK est corrélée avec AUA0-6h
(133)
CaN est corrélée à AUA0-6h à chaque temps
Blanchet et al. (134)
Foie (n=20)
CaN est corrélée avec C2 mais pas avec C0
Millàn et al. (127)
Rein (n=65)
CaN est corrélée avec C2, même en association avec MMF
Fukudo et al. (130)
Foie (n=40)
Csa est un plus fort inhibiteur de CaN que FK
Koefoed-Nielsen et al. Rein (n=40)
Csa est un plus fort inhibiteur de CaN que FK
(131)
CsA :ciclosporine, FK :tacrolimus, CaN :activité phosphatase de la calcineurine, GVHD :Rejet du greffon contre
l’hôte, AUA :aire sous la courbe CaN-temps, C0 :concentration résiduelle, C2 :concentration sanguine 2h après la
prise.
Halloran et ses collaborateurs ont mis en évidence que l’activité phosphatase de la
calcineurine est étroitement liée à la concentration dans le sang de la ciclosporine chez des
patients transplantés rénaux (56, 123, 124). Aussi bien pour le tacrolimus que la ciclosporine,
l’activité phosphatase de la calcineurine est corrélée avec le C2 mais pas avec le C0 (127, 128,
134). En revanche aucune corrélation n’a été mise en évidence entre l’ASC de la ciclosporine
et la CaN (126).
Koefoed-Nielsen et ses collaborateurs montrent, chez des patients transplantés rénaux, que le
tacrolimus et la ciclosporine ont un profil d’inhibition de la CaN différent (131). Le
tacrolimus possède des mécanismes moléculaires encore inconnus, et cette observation peut
expliquer la différence de mesure de la concentration pour le suivi thérapeutique
pharmacocinétique entre la ciclosporine (C2) et le tacrolimus (C0).
33
L’activité phosphatase de la calcineurine basale est corrélée avec l’aire sous la courbe de
l’activité de la calcineurine en fonction du temps (AUA0-12h) chez des patients transplantés
rénaux traités avec la ciclosporine mais également avec le tacrolimus (126, 133). La mesure
de l’activité phosphatase de la calcineurine basale pourrait donc être suffisante pour
déterminer l’effet de la ciclosporine ou du tacrolimus.
Une étude a montré que le rejet aigu est associé à une augmentation de l’activité phosphatase
de la calcineurine chez des patients transplantés du foie recevant du tacrolimus. (130).
Il existe également une relation entre la CaN et le risque de GVHD, Pai et ses collaborateurs
montrent que la CaN de patients traités par ciclosporine, ayant une GVHD aigüe, était plus
faible que les patients sans GVHD (122).
La méthode de dosage de l’activité phosphatase de la calcineurine se fait à partir de radioéléments, et demande beaucoup de temps, il sera donc difficile d’appliquer ce dosage dans
tous les centres de transplantation et de l’utiliser en routine. Il est donc nécessaire de mettre
au point une méthode de dosage par une technique employée en routine comme l’HPLC.
Le suivi de l’activité phosphatase de la calcineurine pourrait être un bon moyen de déterminer
la fourchette de concentrations de la ciclosporine et du tacrolimus, pour un patient donné,
traité par une anti-calcineurine.
2.2.3.2.L’acide mycophénolique
Le MPA est un anti-métabolisme. Il inhibe l’inosine monophosphate déshydrogénase
(IMPDH) qui est l’enzyme nécessaire à la synthèse des nucléotides de la guanosine de la voie
de novo. Il a une action spécifique aux lymphocytes car ces derniers n’ont pas de voie de
sauvetage pour la synthèse de ces nucléotides (29, 135). L’IMPDH convertit l’insosine
monophosphate (IMP) en xanthosine-5’-monophosphate (XMP) en présence de dicotinamide
adénine dinucléotide (NAD+) (Figure 5).
34
Fig. 5 . Voie de synthèse des nucléotides de la guanosine
La meilleure cible biologique pour déterminer l’effet du MPA sur l’organisme est la mesure
de l’activité de l’IMPDH. Deux isotypes de l’IMPDH existent : l’IMPDH 1 et l’IMPDH 2
(136). Le type 1 est constitutif dans les lymphocytes alors que le type 2 est surexprimé dans
les cellules en cours de réplication (137, 138). L’IMPDH 2 est 4,8 fois plus sensible au MPA
que l’IMPDH 1 (139).
2.2.3.2.1. Méthodes de dosage de l’activité de l’IMPDH
2.2.3.2.1.1.Méthode radioactive
En 1995, Langman et ses collaborateurs ont utilisé une méthode radioactive, mise au point par
Balzarini et De Clercq (140) qui consiste à utiliser des précurseurs de la réaction enzymatique
ayant un hydrogène radiomarqué [2,8-3H]hypoxanthine et [2,8-3H]inosine. Ils comptent le
nombre de 3H relargués au cours de la réaction, pour doser l’activité de l’IMPDH dans le sang
total de lapin et de chien. Ils ont observé une relation inverse entre le taux de MPA dans le
sang, aussi bien chez le lapin que chez le chien, après une dose de MMF et l’inhibition de
35
l’activité de l’IMPDH. Ils constatent des différences entre ces deux espèces. La demi-vie du
MPA est de 8h chez le chien et de 90min chez le lapin. L’activité de l’IMPDH, 24h après la
prise du MMF, revient à sa valeur normale chez le lapin alors qu’elle augmente jusqu’à 3 fois
par rapport à son activité basale chez le chien (141, 142).
Ils ont utilisé cette technique chez des patients transplantés rénaux, et observent une forte
variabilité interindividuelle de l’activité de l’IMPDH. Le maximum d’inhibition de l’activité
est d’environ 40% au bout d’1 heure après la prise du MMF, lorsque la concentration de MPA
est à son maximum. Une simple diminution de l’activité suffit donc à entraîner une
immunosuppression. Dans cette étude chez l’homme, ils n’ont pas retrouvé l’augmentation de
l’activité comme chez le chien mais un retour à une activité normale 12h après la prise du
traitement (143). Ces différences peuvent êtres dues à la pharmacocinétique du MPA qui peut
être variable en fonction des espèces.
Dans une autre étude avec cette méthode, il a été observé que le traitement à long terme de
patients transplantés rénaux avec du MMF entraîne une augmentation de l’activité de
l’IMPDH par rapport à l’activité pré-transplantation (144).
Cette méthode radioactive a de nombreuses limites : il y a un manque de reproductibilité de la
méthode, elle nécessite un matériel et des locaux spéciaux pour manipuler la radioactivité et
n’est donc pas applicable en routine dans tous les centres.
2.2.3.2.1.2.Méthode non-radioactive
Montero et ses collaborateurs ont mis au point une méthode de dosage de l’activité de
l’IMPDH dans les érythrocytes par HPLC (145) chez des patients traités par de la Ribavirine,
un autre inhibiteur de l’IMPDH. Elle consiste à doser en HPLC le produit de la réaction
enzymatique, l’XMP, dans le lysat cellulaire supplémenté avec de l’IMP et du NAD.
Cette technique a été reprise et mise au point pour le dosage de l’activité de l’IMPDH dans les
lymphocytes ou les cellules mononucléées du sang (146, 147). Cette méthode est spécifique et
reproductible.
Son utilisation a permis de montrer qu’il existe une grande variabilité interindividuelle de
l’activité de l’IMPDH. Cette observation justifie que l’administration du MMF à dose fixe
n’est peut-être pas adéquate (148, 149). Il existe une relation entre les effets secondaires
induits par le MMF, observés chez les patients transplantés rénaux, et une faible activité de
l’IMPDH avant transplantation. Mais ces résultats sont à analyser avec précaution car il existe
36
également des effets secondaires liés au MMF chez des patients ayant une forte activité de
l’IMPDH (149).
Budde et ses collaborateurs ont également utilisé cette technique pour comparer l’efficacité et
la sûreté des traitements ayant comme principe actif le MPA. Ils montrent que la forme IV du
MMF est aussi efficace que la forme orale (150), et que la forme sodique du MPA (MPS) est
aussi efficace et sûre que la forme ester (MMF). Le MMF et le MPS ont un profil
pharmacodynamique similaire chez des patients transplantés rénaux (72, 151).
Devyatko et ses collaborateurs constatent que l’inhibition de l’IMPDH entraîne une activation
de la voie de sauvetage pour compenser la synthèse de GTP chez des transplantés cardiaques.
Ils montrent qu’il existe une association entre l’activité de l’IMPDH basale et l’expression de
marqueurs d’activation (152, 153).
Il existe un lien entre la mesure de l’ARN messager de l’IMPDH 1 et 2 et le risque de rejet
aigu (154, 155). La mesure de l’activité de l’IMPDH en parallèle de l’expression des gènes
des deux isotypes 1 et 2 est donc à envisager.
Ces observations permettent de mieux comprendre les mécanismes d’action du MPA et
l’impact biologique qu’il peut avoir sur l’organisme au niveau de l’expression des gènes ou
de l’activité enzymatique de l’IMPDH dans les différents compartiments. Mais, aucune de ces
études n’a encore pu montrer le réel intérêt de mesurer l’activité de l’IMPDH, du fait d’un
manque de reproductibilité de la méthode de mesure, à un nombre de patients souvent limité
et à des résultats controversés. Des études complémentaires sont donc nécessaires pour
montrer l’efficacité d’une telle mesure dans l’individualisation de la posologie du MMF ou du
MPS.
2.2.3.3.Les inhibiteurs de la mTOR
Les inhibiteurs de la mTOR inhibent la synthèse protéique qui accompagne l’activation des
lymphocytes
T,
en
déphosphorylant
et
en
inhibant
p70-S6
kinase.
Le
suivi
pharmacodynamique des inhibiteurs de la mTOR consiste donc en la mesure de l’activité de
la p70 S6 kinase. Une équipe canadienne a mis au point une méthode de dosage radioactive
de l’activité de p70 S6 kinase. Ils montrent qu’il y a une diminution quantifiable et
significative de l’activité de p70 S6 kinase dans des cellules mononucléées du sang après
37
traitement avec la rapamycine. Mais ce ne sont que des résultats préliminaires et la méthode
qu’ils ont utilisée nécessite encore d’être validée (156).
2.2.4. Mesure d’un phénomène biologique complexe nécessaire à la fonction immune
normale
Une des approches les plus courantes pour effectuer une étude pharmacodynamique des
immunosuppresseurs a été de mesurer l’inhibition de l’activité des enzymes spécifiques à
chacun. Mais la mesure de l’activité de ces enzymes ne permet qu’en partie de déterminer
l’action des immunosuppresseurs sur le système immunitaire et sur le mécanisme de rejet, car
les patients reçoivent plusieurs immunosuppresseurs. C’est pourquoi il était important de
mettre au point une nouvelle approche pharmacodynamique visant à mesurer l’impact des
immunosuppresseurs sur la fonction des lymphocytes.
2.2.4.1.Études chez l’animal
Le phénomène qui a été le plus étudié afin de déterminer l’effet des traitements
immunosuppresseurs sur la fonction immunitaire est l’inhibition de la prolifération
lymphocytaire. De nombreuses études ont montré que les anti-calcineurines, aussi bien que
l’acide mycophénolique inhibaient cette prolifération. La mesure de la prolifération des
lymphocytes se fait majoritairement avec deux méthodes distinctes, la première est le
comptage de cellules ayant incorporé de la thymidine tritiée et la deuxième est la détection en
cytométrie de flux des cellules en phase S/G2M. La cytométrie en flux est beaucoup plus
sensible que la méthode radioactive et est privilégiée au cours des études qui ont été mises en
place (157).
L’inhibition de l’activation des lymphocytes T a été également étudiée en mesurant
l’inhibition de l’activation du récepteur de l’IL-2 (CD25). Mais les résultats observés sont très
controversés. Aucune inhibition du CD25 n’est observée après un traitement avec du MPA
d’après Eugui et coll. (29) et Thomson et coll. (158) alors que Weaver et ses collaborateurs
observent une inhibition du CD25 après un traitement par MPA (159).
Gummert et ses collaborateurs ont étudié en parallèle l’inhibition de la prolifération et de
l’activation des lymphocytes T à partir du sang total.
38
L’utilisation du sang total comme matrice pour mesurer l’effet des immunosuppresseurs sur la
fonction immunitaire est avantageux pour diverses raisons :
(1) cela nécessite 10 à 100 fois moins de volume d’échantillons et moins de temps de
préparation qu’une technique d’isolation ou de purification de cellules,
(2) il n’y a pas de risque de perte cellulaire, comme dans une séparation, qui puisse
altérer la population cellulaire et altérer les interactions cellulaires,
(3) le sang total inclue les composants du plasma, ainsi que les érythrocytes dans
lesquels les principes actifs se lient et se distribuent,
(4) il n’y a pas le risque de séparation du principe actif de son récepteur cellulaire qui
peut exister au cours d’une purification (160).
Ils ont étudié différents modes d’activation non spécifiques des lymphocytes à partir de sang
total chez le rat pour observer l’effet inhibiteur des immunosuppresseurs aussi bien in vitro
qu’in vivo. La sélection du stimulus non spécifique pour activer les lymphocytes T dépend de
la voie du signal de transduction inhibé par les immunosuppresseurs. Ainsi l’activation des
lymphocytes par la PMA/Ionomycine a été choisie pour activer la sécrétion des cytokines. La
Concanavaline A permet de stimuler la prolifération des lymphocytes (160).
La stimulation des lymphocytes T par la concanavaline A a permis de tester l’effet
immunosuppresseur du MPA et du MMF chez le rat sain in vitro et in vivo et dans un modèle
de rat transplanté cardiaque. Le MPA a un effet inhibiteur sur la prolifération et sur
l’activation des lymphocytes T. Cette inhibition est corrélée à la pharmacocinétique du MPA
et à la sévérité du rejet de greffe (161), (162), (163).
Cette
méthode
a
mis
en
évidence
l’utilité
d’associer
différents
traitements
immunosuppresseurs. Une étude montre que l’association du sirolimus avec une anticalcineurine provoque une inhibition synergique séquentielle de la prolifération et de
l’expression de CD25. En revanche à de fortes doses, cette association a un effet antagoniste
(164). L’association du MPA avec une anti-calcineurine provoque une diminution de la
prolifération et de l’expression du CD25 en comparaison au MPA administré seul (165).
Cela
confirme
donc
l’intérêt
d’associer
une
étude
pharmacodynamique
à
la
pharmacocinétique pour diminuer le risque de toxicité du traitement tout en assurant une
inhibition suffisante du système immunitaire. Cette technique a été ensuite mise en place dans
des études chez l’homme.
39
2.2.4.2.Etudes chez l’homme
L’étude pharmacodynamique des immunosuppresseurs, en mesurant leur impact sur le
système immunitaire chez des patients transplantés, est relativement récente.
Les
cytokines
sont
très
étudiées,
comme
marqueurs
pharmacodynamiques
des
immunosuppresseurs, par différents groupes de recherche. L’effet pharmacodynamique des
immunosuppresseurs sur la sécrétion des cytokines intracellulaires a été étudié dans les
cellules mononucléées du sang en cytométrie de flux (166, 167). D’autres ont étudié
l’expression des cytokines dans des biopsies de rein (168). La technique ELISA a permis de
mesurer la concentration de cytokines et chimiokines dans le sérum (169), l’urine (170), et le
surnageant de cellules mononucléées du sang dérivé de patients transplantés (171, 172).
L’association de la méthode utilisée dans le modèle animal avec la mesure des cytokines
intra-cytoplasmiques en cytométrie de flux permet de déterminer la fonction lymphocytaire
plus spécifiquement.
Cette technique a été utilisée pour tester l’interaction des différentes molécules sur le système
immunitaire in vitro et in vivo chez des volontaires sains et des patients transplantés. Les
résultats montrent que cette méthode permet de mesurer l’immunosuppression. Cette
démarche permet de déterminer la puissance de certaines associations comme le sirolimus
avec la ciclosporine ou le MMF et le tacrolimus et connaître les limites de la dose efficace
(173), (174, 175), (176).
Des études préliminaires montrent, en mesurant la prolifération, l’activation et la fonction
lymphocytaire, que l’on peut évaluer l’immunosuppression chez des patients transplantés
cardiaques
(177).
Elle
a
le
potentiel
d’augmenter
l’efficacité
d’une
thérapie
immunosuppressive quand elle est associée à un suivi pharmacocinétique (178-180).
Böhler et ses collaborateurs ont validé l’utilisation de cette technique chez l’homme pour le
suivi pharmacodynamique des immunosuppresseurs. Ils ont étudié la variabilité inter et intraessai de la méthode. Ils ont testé différents traitements immunosuppresseurs et pour chacun il
existe un effet sur la prolifération (181).
Cette technique va permettre de comparer l’effet et l’efficacité d’association de différents
traitements, et de répondre à certaines questions que l’on se pose encore (1) sur l’utilité du
suivi thérapeutique des immunosuppresseurs, (2) sur la pertinence de l’association de certains
médicaments, (3) sur la possibilité de prévenir le rejet, (4) sur le fait de mettre au point un
suivi thérapeutique à partir de la pharmacodynamique.
40
L’objectif de ce travail est d’utiliser la technique validée par Böhler et coll. (181) dans
différentes situations cliniques. Nous avons :
(1) étudié l’impact de la maladie initiale sur le système immunitaire
(2) étudié l’influence de facteurs comme l’âge ou le sexe sur le système immunitaire
(3) recherché des corrélations entre la PK/PD du MMF, tacrolimus et sirolimus chez
des patients en attente de transplantation hépatique
(4) comparé différents immunosuppresseurs (leflunomide vs MMF ; MMF vs MPS ;
Belatacept vs ciclosporine)
(5) étudié différentes stratégies immunosuppressives à base de MMF+corticoïdes±FK
donnés à différentes doses.
41
Matériel et méthodes
42
La méthode utilisée au cours de ce travail a été validée par une équipe allemande (181) ; elle
permet de mesurer en cytométrie de flux, à partir de sang total, la sécrétion intracytoplasmique des cytokines IL-2 et TNF-α par les lymphocytes T, les marqueurs
d’activation des lymphocytes T : CD25 et CD71, et la prolifération des lymphocytes T par un
marquage PCNA/IP.
1. Patients
Les patients ayant participé à ces études étaient suivis dans le service de néphrologie, dialyse
et transplantation multi-organes, au CHU Rangueil de Toulouse. Les patients sont prélevés à
jeun de médicament, au moins 12h après la prise du dernier traitement. Le sang est recueilli
dans des tubes héparinés de 6ml et conservé à température ambiante. Comme il avait été
précédemment montré, le sang peut être conservé maximum 24h après le prélèvement (181).
2. Étude de la fonction immunitaire
2.1. Etude de la sécrétion des cytokines intra-lymphocytaires à partir de sang total : IL-2
et TNF-α
2.1.1. Stimulation des cellules
Pour chaque prélèvement, 100 µL de sang est incubé avec 2 µl de PMA (15ng/mL) et 2 µl de
Ionomycine (0,75µg/mL) pendant 30 min dans un incubateur à 37°c et 5% de CO2. La
sécrétion des cytokines est bloquée par ajout de 1µl de bréfeldine A (1µg/mL).
Le sang est incubé pendant 4h à 37°C dans une ambiance humide contenant 5% de CO2.
Pour chaque prélèvement, un échantillon stimulé et un échantillon non stimulé est analysé.
2.1.2. Marquage pour analyse en cytométrie de flux
Après les 4h d’incubation, 50 µl de sang stimulé est incubé avec 2µL d’un anticorps
monoclonal anti-CD3 PerCP (0,5 µg/mL) pendant 15 min à température ambiante à l’abri de
43
la lumière. Les cellules sont ensuite fixées avec 100µL d’intraprep 1 (Beckman-Coulter)
contenant du formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Les
cellules sont rincées avec 4 mL de PBS et centrifugées pendant 6min à 1300 tours/min. Le
surnageant est aspiré. Les globules rouges sont ensuite lysés et les cellules perméabilisées
avec 100µL d’intraprep 2 (Beckman-Coulter) contenant de la saponine pendant 5 min à
température ambiante à l’abri de la lumière. Les cytokines sont marquées avec des anticorps
monoclonaux anti-IL-2 PE (2µL, 100tests /2mL) et anti-TNF-α FITC (2µL, 0,5µg/mL)
pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Les cellules sont ensuite lavées
avec 4 mL de PBS et après une centrifugation de 6 min à 1300 tours/min, le surnageant est
jeté, les cellules sont re-suspendues dans 250µL de formaldéhyde à 0,5%. Elles sont alors
prêtes pour êtres analysés en cytométrie en flux.
Tous les anticorps utilisés proviennent de chez Becton Dickinson.
2.2. Étude de l’activation des lymphocytes T et de la prolifération
2.2.1. Stimulation du sang total
Le sang est prélevé dans des tubes héparinés de 6mL.
Dans une plaque 24 puits, le sang est dilué au 1/10 dans du RPMI 1640 glutamax (200µL de
sang dans 1800µL de RPMI) contenant des antibiotiques (Penicilline 100U/ml et
Streptomycine 100µg/mL) et stimulé avec de la concanavaline A (7,5µg/mL, SIGMA)).
La plaque est incubée 72h à 37°c dans une ambiance humide contenant 5% de CO2.
Pour chaque prélèvement, un échantillon stimulé et un échantillon non stimulé sont analysés.
2.2.2. Étude des marqueurs d’activation
Après 72h d’incubation, 400µL de mélange sang/RPMI est incubé 30min à température
ambiante à l’abri de la lumière avec 100µL de solution de marquage contenant 100µL de PBS
3% SVF, 2µL d’anti-CD3 PerCP (0,5µg/mL), 2 µL d’anti-CD25 FITC (100 tests/2mL) et
2µL d’anti-CD71 PE (100 tests/2mL). Les globules rouges sont ensuite lysés dans 10mL de
tampon de lyse contenant du NH4Cl (8,29g/L, SIGMA), Na2EDTA (37,2mg/L, SIGMA),
KHCO3 (1g/L, SIGMA) et de l’eau distillée. Les échantillons sont centrifugés 8 min à 1900
44
tours/min. Le surnageant est aspiré et les culots sont lavés dans 4mL de PBS puis centrifugés
6min à 1900 tours/min. Le surnageant éliminé, les culots sont re-suspendus dans une solution
de formaldéhyde 1%. Les cellules sont prêtes à être analysés en cytométrie de flux. Le
pourcentage de cellules CD25+ et CD71+ sur les cellules CD3+ est déterminé.
Tous les anticorps utilisés proviennent de chez Becton Dickinson.
2.2.3. Étude de la prolifération
Après 72h d’incubation, 800µL de mélange sang/RPMI est ajouté à 10mL de tampon de lyse
contenant du NH4Cl (8,29g/L, SIGMA), Na2EDTA (37,2mg/L, SIGMA), KHCO3 (1g/L,
SIGMA) et à de l’eau distillée afin de lyser les globules rouges. Les échantillons sont
centrifugés pendant 8min à 1900 tours/min à une température de 10°C. Le surnageant est
aspiré puis les cellules sont lavées avec 3 mL de PBS et centrifugées à nouveau pendant 6 min
à 1900 tours/min à 10°C. Le surnageant est aspiré et les culots sont re-suspendus dans 1 mL
de formaldéhyde 1% pour fixer les cellules. Les tubes sont placés sur la glace pendant 5min.
Puis les cellules sont rincées avec 2mL de PBS et centrifugées 6 min à 1900 tours/min à
10°C. Le surnageant est éliminé. Les cellules sont perméabilisées par 2mL de méthanol 100%
froid et gardées sur la glace à l’abri de la lumière pendant 10 min. Elles sont lavées avec 4 mL
de PBS et centrifugées pendant 6 min à 1900 tours/min à 10°C. Après aspiration du
surnageant, les cellules sont marquées avec 125µL de solution de marquage contenant 107 µL
de tampon de perméabilisation (PBS+1% de SVF+0,1% de saponine), 10 µL de ribonucléase
A (10mg/mL, SIGMA), 5 µL d’iodure de propidium (1 mg/mL, Fluka) et 2,5 µL de PCNAFITC (100 tests/2ml, Becton Dickinson). Les cellules sont incubées dans un bain marie à
37°C pendant 30min dans l’obscurité. Après un dernier lavage avec 2 mL de PBS et une
centrifugation de 6 min à 1900 tours/min, les culots sont re-suspendus dans 250 µL de PBS
contenant 1% d’iodure de propidium. Les échantillons sont conservés à 4°C en attendant
d’êtres analysés en cytométrie en flux. Les lymphocytes, qui ont tendance à s’amalgamer et
qui pourraient êtres détectés comme de faux positifs, sont visualisés sur l’analyse d’un dotblot en FL3-A /FL3-W et sont exclus par une fenêtre d’acquisition. Les lymphocytes, détectés
comme PCNA+/IP+, sont comptés en pourcentage de cellules en cours de prolifération.
45
3. Analyse des résultats et statistiques
La fluorescence des cellules est analysée avec un FACSCalibur (Becton Dickinson) 4
couleurs ayant un laser argon-ion de 488nm. Les données sont ensuite analysées avec le
logiciel CellQuest (Becton Dickinson) et sont exprimées en pourcentage du nombre total de
cellules positives.
Les moyennes et les écarts types ont été calculés avec Excel et les statistiques ont été
déterminées avec le logiciel Statview.
Les résultats sont considérés comme significativement différents lorsque p<0,05.
46
Résultats
47
1. Article n°1 : La stimulation par des agents mitogènes in vitro des
lymphocytes T chez des patients en attente de transplantation hépatique pour
hépatite virale C, augmente les marqueurs d’activation et la prolifération des
lymphocytes T.
Ces dernières années, la transplantation hépatique a augmenté la survie des patients atteints
d’une pathologie hépatique (182). La perte du greffon est le plus souvent due à rejet
chronique, à la récidive de la maladie initiale ou à une dysfonction chronique du greffon
(183). L’incidence de rejet aigu est significativement plus importante chez des patients
transplantés pour une hépatite C que chez des transplantés pour une autre pathologie du foie
comme une cirrhose alcoolique (184). L’infection par une hépatite C a été montrée comme
un facteur prédictif indépendant du risque de rejet aigu en transplantation hépatique (185). De
plus la diminution de l’incidence de rejet aigu chez les patients atteints d’une cirrhose
alcoolique est associée à une augmentation du risque d’infection bactérienne (184).
Une infection par le virus de l’hépatite C induit une réponse spécifique des lymphocytes T.
Mais il n’a pas été montré qu’elle pouvait entraîner une augmentation de la réponse des
lymphocytes T après une stimulation par un mitogène. C’est pourquoi nous avons décidé
d’étudier le statut immunitaire des patients en attente d’une greffe hépatique.
Le but de ce travail a été tout d’abord d’étudier le statut immunitaire des patients en attente de
greffe hépatique. Puis de déterminer si l’hépatopathie initiale avait une influence sur le statut
immunitaire et pouvait expliquer les différences observées en termes de risque de rejet et
d’infection.
Les résultats de cette étude ont été publiés : Canivet C., et al. In vitro mitogen-stimulated Tcell from hepatitis C virus-positive liver transplantation candidates, increases T-cell activation
markers and T-cell proliferation. Transplant Immunology 2008 ; 19 :112-119
48
Available online at www.sciencedirect.com
Transplant Immunology 19 (2008) 112 – 119
www.elsevier.com/locate/trim
In vitro mitogen-stimulated T-cell from hepatitis C virus-positive liver
transplantation candidates, increases T-cell activation markers
and T-cell proliferation
Cindy Canivet a , Torsten Böhler a , Sylvain Galvani a , Jean-Marie Péron b ,
Fabrice Muscari c , Laurent Alric d , Karl Barange b , Robert Salvayre a ,
Anne Negre-Salvayre a , Dominique Durand e , Bertrand Suc c , Jacques Izopet f,g ,
Mogens Thomsen a , Lionel Rostaing e,g , Nassim Kamar a,e,⁎
a
e
INSERM U858/I2MR, Equipe 10, CHU Rangueil, Toulouse, France
b
Department of Hepatology, CHU Purpan, Toulouse, France
c
Department of Surgery and Liver Transplantation, CHU Rangueil, Toulouse, France
d
Department of Internal Medicine, CHU Purpan, Toulouse, France
Department of Nephrology, Dialysis and Multi-Organ Transplantation, CHU Rangueil, Toulouse, France
f
Department of Virology, CHU Purpan, Toulouse, France
g
INSERM U563, IFR 30, CHU Purpan, Toulouse, France
Received 25 January 2008; received in revised form 27 February 2008; accepted 5 March 2008
Abstract
The incidence of acute rejection is significantly higher in hepatitis C virus (HCV) liver-transplant patients than in patients who have received a
graft for other liver diseases, i.e., mainly alcoholic cirrhosis. The aim of this study was to assess T-cell function, i.e., intralymphocyte cytokine
expression (IL-2 and TNF-α), T-cell activation [i.e., transferrin receptor (CD71) and interleukin (IL)-2 α-chain (CD25) expression], and T-cell
proliferation using a flow-cytometry whole-blood assay in patients waiting for a liver transplantation (n = 49). Our data suggest that, in mitogenstimulated T-cells, (i) intra-lymphocyte cytokine expression is significantly higher in patients with liver disease than in healthy volunteers (n = 25);
(ii) the expression of T-cell activation markers is decreased in patients with liver cirrhosis compared to healthy volunteers, and (iii) the expression
of T-cell activation markers and T-cell proliferation are increased in patients with HCV infection (n = 15) compared to those without HCV infection
(n = 34), particularly compared to patients with alcoholic liver disease (n = 19). Circulating CD19-positive cells count was also significantly higher
in HCV-positive patients. In conclusion, in vitro, mitogen-stimulated T-cell seem to induce a higher immune response in the blood from patients
waiting for a liver transplant for HCV-related liver disease than those without HCV infection, and particularly those with alcoholic liver disease.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Hepatitis C virus; Alcoholic cirrhosis; Liver transplantation; T-cell function; T-cell proliferation; T-cell activation
1. Introduction
During previous decades, orthotopic liver transplantation
(OLT) has significantly improved the survival of patients with
⁎ Corresponding author. Department of Nephrology, Dialysis and Multi-organ
Transplantation, CHU Rangueil, TSA 50032, 31059 Toulouse Cedex 9, France.
Tel.: +33 5 61 32 26 84; fax: +33 5 61 32 28 64.
E-mail address: [email protected] (N. Kamar).
0966-3274/$ - see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.trim.2008.03.001
end-stage liver disease with or without hepatocellular carcinoma. After OLT, patient- and graft-survival rates are 80 and
75%, respectively, at 1 year, 70 and 63% at 5 years, and 62 and
55% at 10 years [1]. Graft loss is mostly related to acute
rejection, relapse of the initial liver disease, and chronic
allograft dysfunction [2]. Modern immunosuppression significantly decreases the rate of acute rejection. However, the
recurrence of hepatitis C virus (HCV) infection is universal after
OLT, and occurs as early as the third postoperative day [3]; this
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
is detrimental to both patient and graft survival in the long term
[2,4]. In addition, the incidence of acute rejection is
significantly higher in HCV-positive liver-transplant patients
than in those who have received a graft for other liver diseases,
i.e., mainly alcoholic cirrhosis [5,6]. By means of a multivariate
analysis, McTaggard et al. identified HCV infection as an
independent predictive factor for early acute rejection after OLT.
No difference was observed between patients who did or did not
receive α-interferon therapy. In contrast, the reduced incidence
of acute rejection in patients with alcoholic liver disease is
associated with an increased risk of bacterial infection [5].
HCV infection is well known to induce a specific T-cell
response. In contrast, it is not well known whether patients infected by HCV have a higher mitogen-stimulated T-cells response
than those who are not infected by HCV. If so, this point might
explain, at least in part, the higher rate of acute rejection observed
in HCV-positive liver-transplant patients as compared to HCVnegative liver-transplant patients. Therefore, we decided to
address this specific issue in patients waiting for a liver
transplantation. Hence, the primary objective of this study was
to assess T-cell function, i.e., intralymphocyte cytokine expression, T-cell activation [i.e., transferin receptor (CD71) and interleukin (IL)-2 α-chain (CD25) expression], and T-cell proliferation
using a flow-cytometry whole-blood assay in patients waiting for
a liver transplant. The secondary endpoint was to compare T-cell
function in patients with and without HCV infection.
1.1. Patients and methods
Between February 2006 and January 2007, all patients who were referred to
our institution for OLT and who were listed on our waiting list were considered
for this study (n = 57). Eight patients were excluded from the study: four of these
were receiving immunosuppressive therapy (three for autoimmune hepatitis and
one was waiting for a second liver transplantation), three patients were infected
by human immunodeficiency virus (HIV) and were receiving anti-HIV therapy,
and the eighth patient was receiving anti-tumoral chemotherapy. Hence, 49
patients were included in the study, after having given their informed consent
(group I). There were 40 men and 9 women, ranging in age from 30 to 77 years.
Fifteen patients had HCV-related cirrhosis, 19 had alcohol related-cirrhosis, and
15 patients had various liver diseases [Budd Chiari disease (n = 1), hepatitis B
virus (HBV)-related cirrhosis with negative HBV DNAemia (n = 4), hepatitis D
virus (n = 1), hepatopulmonary syndrome (n = 2), familial amyloid polyneuropathy (n = 2), primary hyperoxaluria (n = 1), polycystic kidney disease (n = 2),
epithelioid hemangioendothelioma (n = 1), and neuroendocrine cancer (n = 1)].
None of these patients had consumed alcohol for at least 6 months. Carbohydratedeficient transferrin was assessed every 2 weeks in patients with alcohol-induced
liver disease. All HCV-infected patients were viremic, despite previous antiHCV therapy, which consisted of pegylated α-interferon and ribavirin. However,
at the beginning of this study, none of the patients had received anti-HCV therapy
for at least 6 months. Fourteen out of the 49 patients (28.6%) presented with
hepatocellular carcinoma upon cirrhosis: seven in the HCV group, seven in the
alcohol-related cirrhosis group (ns).
Results obtained in this population were compared with those observed in a
control group of 25 healthy volunteers (group II). The control group consisted of
seven men and eighteen women, ranging in age from 25 to 45 years (30 ± 7 years).
1.2. Study design
We used a validated assay [7] to assess the pharmacodynamic effect of immunosuppressive drugs in a clinical setting.
Blood samples were collected at 8 a.m.: all patients had fasted
113
overnight. T-cell function, including intralymphocyte cytokine
expression (IL2, TNF-a), T-cell activation markers (CD25 and
CD71), and T-cell proliferation, were measured on two separate
occasions in each patient. For each patient, biomarkers were
assessed twice in order to reduce any bias that might be related
to an ongoing infection even though none of the patients had a
clinical infection when tested and C-reactive protein levels were
negative (data not shown). The time between these two
measurements was 1 month.
For each patient, we assessed liver-enzyme levels [alanine
(ALT) and aspartate (AST)-aminotransferase, γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT), alkaline phosphatase (AP), and total bilirubin
levels], hematological parameters (hemoglobin level, white
blood-cell and platelet counts), and serum-albumin level. Renal
parameters were assessed by serum creatinine level and
creatinine clearance calculated according to the Cockcroft and
Gault formula. We also assessed total lymphocyte count and
lymphocyte subset counts, i.e., cells positive for CD3, CD2,
CD8, CD4, CD19 or CD56, and determined the CD4/CD8 ratio.
In addition we determined a value for the Child–Turcotte–Pugh
class through clinical assessment and laboratory values on the
day that T-cell function was measured.
1.3. Flow cytometry whole-blood assay
T-cell function was assessed by calculating the percentage of
proliferative T-cells and the percentage of T-cells expressing
intracytoplasmic IL-2, and tumor necrosis factor (TNF)-α, as
well as transferin receptor (CD71) and IL-2 receptor α-chain
(CD25). A validated flow-cytometry whole-blood assay was
performed as previously described [7]. Briefly, for the measurement of intracytoplasmic cytokine expression, 96 μl of undiluted
whole blood was stimulated by phorbol myristate acetate (PMA)
(15 ng/mL) and ionomycin (0.75 μg/mL) for 30 min. Cytokine
secretion was blocked by adding brefeldin (1 μg/mL). Samples
were incubated at 37 °C for 4 h. To assess the percentage of IL-2
and TNF-α-producing T-lymphocytes produced by T-lymphocytes, 50 μL of each blood sample was mixed in 5-mL polystyrene round-bottomed tubes (BD-Falcon) with 2 μL of PerCPlabeled antihuman CD3 antibody (final concentration was
0.5 μg/mL, Becton Dickinson, Cat. no. 345766). After 15 min
in the dark and at room temperature the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were fixed by adding 100 μL of Intraprep1 solution (containing 5.5% formaldehyde) followed by a further
15-min period of darkness at RT. Then, 4 mL of PBS was added
and the samples were centrifuged at 210 ×g for 6 min at RT. The
supernatant was aspirated and the pellet resolved in 100 μL
Intraprep-2 solution (containing saponin), to make lymphocytes
permeable and to perform red cell lysis. After 5 min in the dark at
room temperature, 2 μL of PE-labeled antihuman IL-2 antibody
(100 tests/2 mL, Becton Dickinson, Cat. no. 559334) and 2 μL of
FITC-labeled antihuman TNF-α antibody (0.5 mg/mL, Becton
Dickinson, Cat. no.554512) were added, followed by another
15 min in the dark at room temperature. The samples were washed
with 4 mL PBS and were then centrifuged for 6 min at 210 ×g at
RT. The pellets were dissolved in 500 μL formaldehyde (0.5%)
and stored at 4 °C in the dark until measured by a three-color
114
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
5 μL PI (1 mg/mL) + 2.5 μL PCNA-FITC (100 tests/2 mL) for
124.5 μL of staining mixture. The cells were then incubated in a
water bath at 37 °C for 30 min in the dark. After a final washing
with 2 mL of PBS, and centrifugation and aspiration of the
supernatant, the pellet was dissolved in 500 μL PBS containing PI
1% v/v. The samples were stored at 4 °C in the dark until flow
cytometry. Any lymphocytes that stuck together, which could be
detected as false positive-proliferating cells, were visualized in a
dot blot assay by FL3-A against FL3-W, and were then excluded
by gating. Lymphocytes, detected as PCNA+ and PIhigh were
counted as percentages of proliferating cells.
For each blood sample, one stimulated and one unstimulated
sample were analyzed. In addition, each time the assay was
performed, one stimulated and one unstimulated sample from a
healthy volunteer served as an external control. Three thousand
CD3 positive cells of each sample were analyzed.
Fig. 1. Biomarkers expression measured two times at one-month intervals in
patients waiting for a liver transplantation. There is no significant difference
between the two measures. Abbreviation: ns, not significant.
FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson). Three
thousand CD3 positive cells of each sample were analyzed.
For T-cell activation and T-cell proliferation, diluted whole
blood (1:10; 200 μL of whole blood) was stimulated with
concavalin A (Sigma) for 3 days at 37 °C. For T-cell activation
markers, after incubation, 400 μL of the blood-RPMI-solution
was harvested and mixed with 100 μL of staining mixture [i.e.
100 μL PBS, 3% FCS, 2 μL CD3-PerCP (12.5 μg/mL, (Becton
Dickinson, Cat. no. 345766), 2 μL CD25-FITC (100 tests/2 mL,
Becton Dickinson, Cat. no. 555431), 2 μL CD71-PE/sample (100
tests/2 mL, Becton Dickinson, Cat. no. 554512)] in a 15-mL
Falcon tube and incubated for 30 min in the dark at RT.
Erythrocytes were eliminated by addition of 10 mL fresh prepared
lysis buffer (5.76 g/L NH4Cl, 25.8 mg/L Na2EDTA, 0.69 g/L
KHCO3) and the samples were centrifuged at 477 ×g for 8 min.
The pellets were washed with 4 mL PBS and, after a further
centrifugation at 477 ×g for 6 min, the pellets were resuspended in
500 μL formalin (1% in PBS) to fix the cells. Samples were
immediately measured by flow cytometry and the percentage of
CD25+ and CD71+ on CD3+ cells was determined.
For T-cell proliferation, after 72 h of incubation, 800 μL of
blood-RPMI-solution was harvested in 15-mL Falcon tubes.
After lysis of erythrocytes, by adding 10 mL of lysing buffer
(prepared as described above), the samples were centrifuged at
477 ×g for 8 min and the supernatant was aspirated. Cells were
washed with 3 mL PBS and centrifuged again for 6 min at 477 ×g.
The cells were then fixed with 1 mL ice-cold formalin (1% in
PBS) and kept for 5 min in the dark on ice, and then washed with
2 mL PBS. Following a centrifugation step (477 ×g for 6 min and
aspiration of the supernatant), the pellet was resuspended. Then,
2 mL of ice-cold MeOH was added and the suspension was kept
for 10 min on ice in the dark. The cells were re-washed with 4 mL
PBS and centrifuged at 477 ×g for 6 min. After aspiration of the
supernatant, the cells were stained by adding 125 μL of staining
mixture: i.e. 107 μL Perm buffer [PBS-based solution of FCS (1%
v/v) and saponine (0.1% w/v) + 10 μL RNase A (10 mg/mL) +
1.4. Statistical analyses
The data are expressed as the mean ± standard deviation
(SD), or median (ranges) when required. Biomarker expression
was determined using CellQuest software (Becton Dickinson,
Heidelberg, Germany) and was expressed as a percentage of the
positive total cell count. For biomarkers, the mean value of two
measurements was used to compare the different groups.
Quantitative variables between different groups were compared
by the non-parametric Kruskal–Wallis test. If a significant
statistical difference was observed, each two groups were
compared using the Mann–Whitney test. Repeated measurements of biomarkers were compared with the Wilcoxon test. A
p-value b 0.05 was considered to be statistically significant.
2. Results
2.1. Comparison of biomarkers at one-month intervals
In patients waiting for OLT, we compared expression of biomarkers
at one-month intervals (Fig. 1). There were no significant changes in
Fig. 2. Comparison of biomarkers expression in patients waiting for a liver
transplantation (filled-in bars) and healthy volunteers (open bars). Abbreviation:
OLT, orthotopic liver transplantation; ns, not significant.
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
115
Table 1
Patients' characteristics
Age (years)
Gender (M/F)
Serum Bilirubin level (mmol/L)
Serum albumin level (g/L)
Prothrombin index time (%)
Child–Pugh score (A/B/C)
Serum aspartate
aminotransferase level (IU/L)
Serum alanine aminotransferase
level (IU/L
Serum γ-glutamyl transpeptidase
level (IU/L)
Serum alkaline Phosphatase
level (IU/L)
Serum creatinine level (μmol/L)
Hemoglobin level (gdL)
White blood-cell count (/mm3)
Lymphocyte count (/mm3)
Polymorphonuclear
leukocytes (/mm3)
Platelet counts (/mm3)
HCV-induced
liver-disease (n = 15)
Alcohol-induced
liver-disease (n = 19)
Non-HCV, non-alcohol-induced
liver-disease (n = 15)
P-value
50 ± 9
12/3
30 ± 17
35 ± 5
66 ± 11
5/1/4
93 ± 40
57 ± 8
16/3
49 ± 37
33 ± 6
60 ± 11
5/7/4
69 ± 28
50 ± 11
12/3
56 ± 45
37 ± 7
66 ± 11
7/3/1
58 ± 31
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
83 ± 33
48 ± 17
43 ± 22
0.004
154 ± 123
183 ± 120
182 ± 137
ns
287 ± 94
398 ± 81
487 ± 198
0. 001
74 ± 13
13.5 ± 1
5543 ± 2,164
1478 ± 483
3446 ± 1,861
97 ± 35
13 ± 1.3
5780 ± 994
1265 ± 344
3629 ± 825
126 ± 64
13 ± 2
6737 ± 2,310
1098 ± 496
4226 ± 1,713
ns
ns
ns
ns
ns
111,933 ± 50,444
115,579 ± 47,108
140,200 ± 67,413
ns
expression of biomarkers at the two time points [32.9 ± 14 vs. 34.8 ± 14
for IL-2 expression (p = ns), 37.5 ± 18 vs. 41 ± 16 for TNF-α expression
(p = ns), 47.5 ± 18 vs. 50 ± 16 for CD25 expression (p = ns); 33.8 ± 17 vs.
34 ± 13 for CD71 expression (p = ns), and 18 ± 8 vs. 17 ± 7 for T-cell
proliferation (p = ns)].
2.2. Comparison of biomarkers in patients with or without hepatocellular
carcinoma
Fourteen of the 49 patients presented with hepatocellular carcinoma
upon cirrhosis. With respect to these fourteen patients, there were no
significant differences in biomarkers expression. Those with hepatocellular carcinoma vs. those without had, respectively, 33.5 ± 11.3 vs.
34.5 ± 11.3 IL-2 expression (p = ns), 39.85 ± 15.2 vs. 38 ± 16.8 TNF-α
expression (p = ns), 42 ± 18 vs. 50 ± 15.9 for CD25 expression (p = ns);
29 ± 14 vs. 36 ± 15 for CD71 expression (p = ns), and 15.6 ± 6.7 vs. 19 ±
7.4 for T-cell proliferation (p = ns).
2.3. Biomarkers expression in patients waiting for a liver transplant
(n = 49) and in healthy volunteers (n = 25) (Fig. 2)
Intra-lymphocyte IL-2 and TNF-α expressions were significantly
different in patients waiting for a liver transplant (group I) compared to
healthy volunteers (group II), i.e., 34.2 ± 11.9 vs. 18.8 ± 8.7 for IL-2
expression (p b 0.0001) and 38.6 ± 16 vs. 21 ± 7.3 for TNF-α expression
(p b 0.0001), respectively. In contrast, expression of T-cell-marker
activation was lower in group I than in group II at 48.2 ± 16.8 vs. 56.3 ±
15 for CD25 expression (p = 0.045) and 34.5 ± 15.4 vs. 41.1 ± 16 for
Table 2
Biomarkers expression according to the etiology of the liver disease
IL-2 expression (%)*
TNF-α expression (%)**
CD25 expression (%) #
CD71 expression (%) ##
T-cell proliferation (%) ¤
HCV-induced
liver-disease (n = 15)
Alcohol-induced
liver-disease (n = 19)
Non-HCV, non-alcohol-induced
liver-disease (n = 15)
Healthy-volunteers
(n = 25)
36.6 ± 13
43.3 ± 17
55.6 ± 12.4
43.4 ± 11.8
21.9 ± 7.5
36.7 ± 9.5
40.3 ± 15.6
42.6 ± 16
27.6 ± 13.5
15.7 ± 5.4
28.6 ± 11.6
31.2 ± 14.6
47.9 ± 19.4
34.4 ± 16.9
17.2 ± 8.2
18.8 ± 8.7
21 ± 7.3
56.3 ± 15
41.1 ± 16
17.1 ± 8.9
*IL-2 expression was significantly lower in healthy volunteers than in patients with HCV-induced liver disease (P b 0.0001), those with alcohol-induced liver-disease
(P b 0.0001) and those with non-HCV, non-alcohol-induced liver-disease (P = 0.007). No difference was observed between the 3 groups of patients awaiting for a liver
transplantation.
**TNF-α expression was significantly lower in healthy volunteers than in patients with HCV-induced liver disease (P b 0.0001), those with alcohol-induced liverdisease (P b 0.0001) and those with non-HCV, non-alcohol-induced liver- disease (P = 0.05). No difference was observed between the 3 groups of patients awaiting for
a liver transplantation.
#CD25 expression was significantly higher in patients with HCV-induced liver disease than in those with alcohol-induced liver-disease (P = 0.02). CD25 expression is
also significantly higher in healthy volunteers than in patients with alcohol-induced liver-disease (P = 0.01).
##CD71 expression was significantly higher in patients with HCV-induced liver disease than in those with alcohol-induced liver-disease (P = 0.003), and those with
those with non-HCV, non-alcohol-induced liver- disease (P = 0.04). CD71 expression is also significantly higher in healthy volunteers than in patients with alcoholinduced liver-disease (P = 0.008).
¤T-cell proliferation expression is significantly higher in patients with HCV-induced liver disease than those with alcohol-induced liver-disease (P = 0.0003), those with
non-HCV, non-alcohol-induced liver-disease (P = 0.09), and healthy volunteers (P = 0.009).
Abbreviations: HCV, hepatitis C virus; IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor.
116
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
CD71 expression (p = 0.08), respectively. However, T-cell proliferation
was similar in both groups: 18.06 ± 7.3 in group I vs. 17.1 ± 8.9 in group
II (ns). (Fig. 2).
expression of CD25 or CD71 between patients infected by HCV and
healthy volunteers (Fig. 4B).
2.8. T-cell proliferation
2.4. Biomarkers expression according to the etiology of end-stage
liver disease
We compared biomarkers expression in three subgroups of patients:
those with HCV-related liver cirrhosis (n = 15), those with alcoholinduced liver cirrhosis (n = 19), and those who presented with other
causes of liver disease, i.e., non-HCV, non-alcohol-related liver disease
(n = 15). The patient characteristics and biomarker expression are
presented in Tables 1 and 2.
Intra-lymphocyte IL-2 and TNF-α expressions were similar in all
three patient subgroups, but were significantly higher than those
measured in the healthy volunteer group. With respect to T-cell activation
markers, CD25 and CD71 expressions were significantly higher in HCVpositive patients compared to expressions in patients with alcohol-related
liver disease and in those with non-HCV, non-alcohol-related liver
disease. In contrast, there were no differences between HCV-positive
patients and healthy volunteers, nor between patients with alcoholic liver
disease and those with non-HCV, non-alcoholic liver disease. Finally,
expression of T-cell activation markers was significantly higher in healthy
volunteers than in the alcohol-induced liver-disease group. T-cell
proliferation was significantly higher in the HCV group compared to
that in the alcohol-induced liver-disease group. There was also a trend
toward a higher proliferation in the HCV group than in the non-HCV,
non-alcohol-induced liver-disease group (p = 0.09). In contrast, there
were no differences between the HCV group and the healthy volunteers,
nor between patients with alcoholic liver disease and those with nonHCV, non-alcoholic liver disease.
T-cell proliferation was significantly higher in HCV patients (21.9 ±
7.5%) compared to that of patients without HCV-related cirrhosis
(16.35 ± 6.67%, p = 0.006) or to the healthy volunteers (17.1 ± 8.9%,
p = 0.009). In contrast, there was no significant difference between
healthy volunteers and patients without HCV-related cirrhosis in this
respect (Fig. 4C).
2.5. Comparison of biomarkers expression between patients with or
without HCV-related end-stage liver disease and healthy volunteers
Because biomarkers expression was quite similar in patients with
alcohol-related liver disease and those with non-HCV, non-alcoholinduced liver disease, we pooled the results obtained from these two
groups (n = 34), and compared them to those obtained from HCV
patients (n = 15) and healthy volunteers (n = 25) (Fig. 3).
2.6. Intra-lymphocyte cytokine expression
With respect to intra-lymphocyte IL-2 and TNF-α expression, no
differences were observed between patients with HCV infection (36.6 ±
13% for IL-2 and 43.3 ± 17% for TNF-α) and those without HCV
infection [33.1 ± 11% for IL-2 (ns), and 36.3 ± 15% for TNF-α (ns)]. In
contrast, in both groups, intra-lymphocyte IL-2 and TNF-α expressions
were significantly higher than in healthy volunteers [18.8 ± 8.7% for
IL-2 (p b 0.0001 when compared to HCV patients, and p b 0.0001 when
compared to patients without HCV infection); and 21 ± 7.3 for TNF-α
(p b 0.0001 when compared to HCV patients, and p = 0.0003 when
compared to patients without HCV infection)] (Fig. 4A).
2.7. T-cell activation markers
Expression of T-cell activation markers was significantly lower in
patients without HCV-induced liver disease (44.9 ± 14.1% for CD25
and 30.6 ± 15.2% for CD71) than in those infected with HCV [55.6 ±
12.6% for CD25 (p = 0.03), 43.4 ± 11.8% for CD71 (p = 0.004)], or in
healthy volunteers [56.3 ± 15% for CD25 (p = 0.01), and 41.1 ± 16% for
CD71 (p = 0.01)]. In contrast, there was no significant difference in
Fig. 3. FACS plots from patients with (A) or without (B) hepatitis C virus.
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
117
Fig. 4. Intralymphocyte cytokine expression (A), T-cell activation marker expression (B), T-cell proliferation (C), and lymphocyte subset (D) counts in patients waiting
for a liver transplantation with (grey bars) and without (black bars) hepatitis C virus infection and in healthy volunteers (white bars).
2.9. Lymphocyte subsets
Total lymphocytes, CD2 positive-cells, CD3 positive T-cells, CD4
positive T-cells, CD8 positive T-cells, and NK-cell counts, as well as the
CD4/CD8 ratio, did not differ significantly between patients with or
without HCV-related cirrhosis. In contrast, CD19-positive cell counts
were significantly higher in HCV patients compared to those without
HCV infection (256.3 ± 155/mm3 vs. 114 ± 79/mm3; p = 0.0018; Fig. 4D).
2.10. Correlation between expression of T-cell biomarkers and
biological parameters
No correlation was observed between any of the biomarkers and
liver-enzyme levels, i.e., alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, γ-glutamyl transpeptidase, alkaline phosphatase, and
bilirubin level (data not shown). Similar data were obtained in the
HCV population. In addition, no correlation was observed between
biomarker expression and HCV viral load (data not shown).
3. Discussion
After liver transplantation, long-term patient and graft
survival rates are significantly lower in HCV-positive patients
than in HCV-negative patients [4]. This increased rate of graft
loss is related to the universal relapse of HCV infection on the
liver graft [3,8,9], and to the higher risk of acute rejection in this
population [6]. McTaggard et al. reported the risks of acute
rejection within the first 6 months following liver transplantation
as 49% for HCV-related cirrhosis, 49% for primary biliary
cirrhosis/primary sclerosing cholangitis/autoimmune hepatitis,
34% for cryptogenic cirrhosis, 27% for alcoholic-related
cirrhosis, and 19% for HBV-related cirrhosis [6]. However,
few studies have assessed T-cell function in these different
groups. Therefore, we have undertaken the present study to
assess T-cell function, T-cell activation, and T-cell proliferation
in patients waiting for a liver transplant. Our data suggest that, in
mitogen-stimulated T-cells, (i) intra-lymphocyte cytokine
expression is significantly higher in patients with liver disease
compared to healthy volunteers; (ii) the expression of T-cell
activation markers is decreased in patients with liver cirrhosis
compared to healthy volunteers, and (iii) the expression of T-cell
activation markers and T-cell proliferation are increased in
patients with HCV infection compared to those without HCV
infection.
Liver injury occurs in the context of the immune response
[10]. Lymphocytes in the liver are scattered throughout the
parenchyma and portal tracts, and include conventional T-cells
(CD4-positive, CD8-positive) and unconventional T-cells, e.g.
γδ T cells [10]. Plasma concentrations of proinflammatory
cytokines are often significantly raised in cirrhotic patients
[11,12]. In the present study we found that, in stimulated T-cells,
118
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
intra-lymphocyte IL-2 and TNF-α expressions are significantly
higher in patients with liver cirrhosis than in healthy volunteers.
Nevertheless, we did not find a significant difference in intralymphocyte expression according to the etiology of liver disease.
The production of TNF-α, first by macrophages and thereafter
by T-lymphocytes, is one of the earliest events in many types of
liver injury. Activation of TNF-α receptors leads to induction of
a death signal. Since hepatocytes can minimize these death
signals and survive, it has been suggested that liver injury first
requires an increased exposure to TNF-α, and second, an
inability of hepatocytes to protect themselves from TNF-αinduced cell death [13,14]. HCV core protein increases the
apoptosis induced by TNF-α and, consequently, hepatocytes
become more vulnerable to the higher levels of TNF-α found in
chronic HCV patients [15,16]. Furthermore, intrahepatic interferon-γ and IL-2 messenger RNA levels are correlated with liver
fibrosis and portal-tract inflammation, suggesting that progressive liver injury in chronic hepatitis C infection is associated
with a T-helper cell type 1 (Th1) profile [17]. In liver-transplant
patients, different patterns of HCV-related liver allograft injury
are observed. Intrahepatic cytokine expression analysis has
revealed that liver-transplant patients with recurrent HCV
infection, and patients with HCV infection who have not undergone transplantation, have similar Th1 intrahepatic cytokine
profiles [18]. In contrast, HCV-positive liver-transplant patients
with cholestatic hepatitis show a Th2 type immune response
[18]. It has also been shown previously that in animals and
patients with alcoholic or non-alcoholic liver diseases ranging
from steatosis to cirrhosis, TNF-α is involved in the progression
from steatohepatitis to cirrhosis [13]. Indeed, TNF-α promotes
activation of stellate cells, matrix-gene expression, and matrix
remodelling [2,14,16,19,20]. Laso et al. previously found higher
intra-lymphocyte IL-2 and IFN-γ expression in patients with
alcoholic liver cirrhosis with active alcohol intake compared to a
control group [21]. In contrast, after an alcohol withdrawal
period of at least 1 year, no significant difference in intralymphocyte cytokine expression was observed between patients
with alcoholic liver cirrhosis and the control group [21].
Eggers et al. investigated the preoperative stress-like
response to a corticotrophin-releasing hormone challenge in
patients awaiting a liver transplantation [22]. Despite a median
alcohol abstinence of 3.5 years, patients with alcohol-related
liver disease showed a stronger anti-inflammatory immune
status and response than patients with virus-induced cirrhosis
[22]. In the latter study, the immune response observed in
cirrhotic patients was not compared to a control group. In the
present study, patients awaiting a liver transplantation for
alcoholic liver disease had only abstained from alcohol for at
least 6 months. This may explain the differences observed
between our study and that of Laso et al.
Another finding in our study is the lower expression of T-cell
activation markers in patients with alcoholic liver disease when
compared to the control group. The comparison of expression of
T-cell activation markers in different groups of patients waiting
for a liver transplant shows that CD25 and CD71 expression,
after T-cell stimulation, are significantly lower in patients without HCV infection compared to patients with HCV infection and
the control group. Hence, we can conclude that liver disease
decreases T-cell activation, except in HCV-positive patients in
whom HCV stimulates the immune response. Furthermore, Tcell proliferation after mitogen stimulation is significantly
higher in HCV-positive patients compared to those without
-HCV and to the healthy volunteers, suggesting once again that
HCV stimulates the immune response. Indeed, E2, an HCV
envelope protein, interacts with CD81, a putative cellular
receptor of HCV [23]. Tetraspanin/CD81 is a widely expressed
cell-surface protein. On T cells, CD81 is associated with CD4
and CD8, and provides a co-stimulatory signal with CD3 [24],
resulting in a strongly enhanced T-cell proliferation [25,26].
This might explain the increased risk of acute rejection in HCVpositive liver-transplant patients [6]. On B cells, CD81 is part of
a complex with CD19, CD20, and Leu 13 [24]. The interaction
of HCV with this complex could reduce the threshold for B cell
activation and, subsequently, increase auto-antibody production, such as rheumatoid factors. This can explain the higher
number of circulating CD19-positive cells that we observed in
HCV-positive patients when compared to non-HCV patients.
Conversely, prolonged alcohol consumption reduces T-cell
proliferative responses [27,28] and impairs delayed-type
hypersensitivity reactions [29], as well as reduces the expression of the co-stimulatory molecules CD80 and CD86 [30].
Mikszta et al. have shown that deficiencies in immune responsiveness in alcohol-consuming C57BL/6 mice may be related to impaired antigen presentation [20]. More recently, Lau
et al. have shown that alcohol impairs cytokine-driven differentiation and function of myeloid and plasmacytoid dendritic
cells in vitro [31]. The authors suggest that this might be a
potential mechanism by which alcohol consumption is associated with immunosuppression. However, it is unknown if this
impairment persists after alcohol withdrawal. These findings
may explain the lower risk of acute rejection and the higher risk
of infections in liver-transplant patients with alcoholic liver
disease [5].
The main limitation of our study is the absence of biomarkers
measurements after liver transplantation. Indeed, the higher
mitogen-stimulated response observed in vitro before transplantation, may be modified in vivo by immunosuppressive
therapy. In vitro data may not reflect in vivo findings. A prospective measurements of T-cell activation and T-cell proliferation markers after liver transplantation are required in order to
correlate biomarker expression and clinical events. In addition,
the results should be considered with caution because of the
lack of matching for age and gender between the control group
and the study group.
In conclusion, patients waiting for a liver transplant for
HCV-related liver disease seem to have a higher immune
response, i.e., T-cell activation and T-cell proliferation, than
those without HCV infection, and in particular those with
alcoholic liver disease.
Acknowledgements
T.B. is a recipient of a grant from Novartis, C.C. from Roche,
and S.G. from the Francophone Society of Transplantation.
C. Canivet et al. / Transplant Immunology 19 (2008) 112–119
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Dans cette étude, nous avons montré qu’avec des lymphocytes T stimulés avec un
mitogène, (1) l’expression des cytokines intra-lymphocytaires IL-2 et TNF-α est
significativement plus élevée chez des patients atteints d’une hépatopathie que chez des
volontaires sains, (2) l’expression des marqueurs d’activation des lymphocytes T est plus
faible chez des patients ayant une hépatopathie en comparaison avec des volontaires sains, (3)
l’expression des marqueurs d’activation et la prolifération des lymphocytes T sont plus
élevées chez des patients atteins d’une infection à l’hépatite C que ceux qui n’en ont pas.
L’expression élevée des cytokines sécrétées par les lymphocytes T chez des patients
atteins d’une hépatopathie a déjà été observée. En effet, la sécrétion du TNF-α est l’un des
premiers évènements qui se produit lors d’une lésion hépatique (186). De plus, chez des
patients ayant une cirrhose alcoolique, le TNF-α est impliqué dans la progression de la
stéatose hépatique vers la cirrhose (187). Il avait déjà été montré que l’expression de l’IL-2 et
de l’IFN-γ était plus importante chez des patients ayant une cirrhose alcoolique qu’un groupe
contrôle (188).
Nous avons observé qu’une hépatopathie diminue l’expression des marqueurs
d’activation des lymphocytes T, sauf chez les patients atteints du virus de l’hépatite C qui eux
présentent une augmentation de l’expression du CD25 et du CD71. De plus la prolifération
des lymphocytes T est plus élevée chez les patients atteints d’une hépatite C en comparaison
avec les volontaires sains et les patients atteints d’autres hépatopathies. Ces résultats
suggèrent que le virus de l’hépatite C stimule le système immunitaire. Une des protéines
d’enveloppe E2 du virus de l’hépatite C interagit avec CD81 (189), qui est associé au CD4 et
CD8 sur les lymphocytes T. Cette association assure un signal de co-stimulation avec CD3
(190) et entraîne une forte prolifération des lymphocytes T (191). Sur les lymphocytes B,
CD81 est une partie d’un complexe avec le CD19, CD20 et Leu 13 (190). L’interaction du
virus de l’hépatite C avec ce complexe peut expliquer le grand nombre de cellules CD19+
circulantes chez les patients atteints du virus de l’hépatite C en comparaison des patients qui
ne l’ont pas.
En conclusion, les patients en attente de greffe hépatique, pour une hépatopathie liée à
une hépatite C, ont une réponse immunitaire plus élevée que ceux n’ayant pas l’hépatite C.
Ceci pourrait expliquer la plus forte incidence de rejet aigu observée en transplantation
hépatique chez les patients atteints d’une hépatite C. Toutefois, des études en posttransplantation hépatique sont nécessaires.
49
2. Article n°2 : La fonction des lymphocytes T est corrélée avec l’âge
chez des volontaires sains, des patients hémodialysés et des patients transplantés
rénaux.
Malgré les progrès pour prévenir le rejet aigu, les effets toxiques des immunosuppresseurs
entraînent
une
hospitalisation
chez
80%
des
patients
(192).
Aussi,
l’étude
pharmacodynamique des marqueurs biologiques de la fonction lymphocytaire peut jouer un
rôle dans le suivi thérapeutique pour affiner et individualiser la posologie des
immunosuppresseurs.
Afin de déterminer seulement l’effet pharmacodynamique des immunosuppresseurs, il est
important de connaître les co-facteurs qui peuvent moduler l’expression des différents
marqueurs biologiques de la fonction des lymphocytes T.
Des études antérieures ont montré que l’âge du donneur d’organe et du receveur a une
influence sur la survie du greffon (193). En effet, la transplantation d’un organe venant d’une
personne âgée a une durée de vie plus réduite (194). De plus, les hormones sexuelles semblent
avoir un impact sur le système immunitaire. Les femmes sont plus résistantes à certaines
infections et souffrent d’une plus forte incidence de maladies auto-immunes (195).
Le but de cette étude était de déterminer si la prolifération lymphocytaire, l’activation et la
sécrétion des cytokines par les lymphocytes T sont modifiées par l’âge ou le sexe dans
différentes populations, c’est-à-dire, chez des patients hémodialysés, des patients transplantés
rénaux et des volontaires sains.
Les résultats de cette étude sont acceptés pour publication : Böhler T., Canivet C., et al. Tlymphocyte functions correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients and kidneytransplant patients, Cytokine 2009.
50
ARTICLE IN PRESS
Cytokine xxx (2009) xxx–xxx
Contents lists available at ScienceDirect
Cytokine
journal homepage: www.elsevier.com/locate/issn/10434666
Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients
and kidney-transplant patients
Torsten Böhler a,c,*, Cindy Canivet a, Phuong Ngan Le Nguyen a, Sylvain Galvani a, Mogens Thomsen a,
Dominique Durand b, Robert Salvayre a, Anne Negre-Salvayre a, Lionel Rostaing b, Nassim Kamar a,b
a
INSERM U. 858 EQ 10, Institut Louis Bugnard, 1 Ave J Poulhès, CHU Rangueil, 3100 Toulouse, France
Department of Nephrology, Dialysis and Multi-Organ Transplantation, CHU Rangueil, Toulouse, France
c
Gambro Dialysatoren GmbH, Hechingen, Germany
b
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 25 February 2008
Received in revised form 5 October 2008
Accepted 29 November 2008
Available online xxxx
Keywords:
Therapeutic drug monitoring
Biomarker
Age
Transplantation
Dialysis
a b s t r a c t
T-cell functions are currently used as biomarkers for the pharmacodynamic monitoring of immunosuppressive drugs or as disease biomarkers of inflammation/sepsis and organ rejection. In order to evaluate
co-factors potentially influencing the expression of the immunological biomarkers, we explored T-cell
proliferation, T-cell activation (CD25 and CD71 expressions) and intra-lymphocyte cytokine production
(interleukin (IL)-2 and tumor necrosis factor (TNF)-a) in healthy volunteers, dialysis patients and stable
kidney-transplant patients treated with standard immunosuppressive therapy, i.e. tacrolimus, mycophenolic acid with or without steroids. Age was positively correlated with TNF-a expression in all three
patient populations, and with IL-2 expression in healthy volunteers and kidney-transplant patients. Further age was correlated with inhibition of lymphocyte proliferation in healthy volunteers and with the
T-cell activation marker CD25 in kidney-transplant patients. In healthy volunteers lymphocyte proliferation was higher in woman as compared to men. Other biomarkers of T-cell function were independent of
the gender. In the kidney-transplant patient group a significantly lower expression of all biomarkers of
T-cell functions compared to healthy volunteers and dialysis patients. In dialysis patients we found
significant increased IL-2 expression compared to healthy volunteers, while the other T-cell functions
were not significantly different. Further time on dialysis had no effect on the level of biomarker expression.
In conclusion we found decreased T-cell functions in kidney-transplant patients compared to healthy volunteers and dialysis patients, increased IL-2 expression in dialysis patients compared to healthy volunteers and in all three populations we found a correlation of age and intra-T-lymphocyte TNF-a expression.
Ó 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Despite the improvement to prevent acute allograft rejection,
toxic side effects of immunosuppressive drugs lead to re-hospitalization in 80% of patients [1]. Thus pharmacodynamic (PD)
biomarkers of T-cell function may play an increased role in PDmonitoring to refine and individualize anti-rejection therapy.
Biomarkers of immunological functions are also employed to
determine the efficacy of immunosuppressive drugs: in clinical
proof of concept (PoC) or proof of efficacy (PoE) studies and for
the evaluation of different strategies of immunosuppressive drug
combinations [2]. Recently standardized assays were been validated for the PD-monitoring of immunosuppressive drugs on T-cell
proliferation, activation and cytokine production [3]. This PD-assay
was reliable for its use in clinical studies despite relative high
inter-patient variability [3]. However to determine solely the PD
* Corresponding author.
E-mail address: [email protected] (T. Böhler).
effect, it is of importance to know which co-factors may modulate
biomarker expression of T-cell function. In this study we investigated the influence of age and gender on biomarkers of T-cell
function in healthy volunteers, dialysis patients and stable
kidney-allograft recipients.
Previous studies have shown that the age of organ donors and
recipients has implications on graft survival [4]. Several studies
have reported that transplantation of organs from elderly have
an inferior outcome [5–7]. Increased immunogenicity may be, in
part, responsible of chronic rejection, and consequently of graft
loss. However, the reluctance to use organs from elderly subjects
has decreased with the increasing demand [4]. Thus age matching
programs have been developed to serve the organ demand by dialysis patients [8].
In addition to their effects on sexual differentiation and reproduction, sex hormones appear to influence the immune system.
This results in a sexual dimorphism in the immune response in humans: for instance, females produce more vigorous cellular and
more vigorous humoral immune reactions are more resistant to
1043-4666/$ - see front matter Ó 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
Please cite this article in press as: Böhler T et al., Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients ..., Cytokine (2009),
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
ARTICLE IN PRESS
2
T. Böhler et al. / Cytokine xxx (2009) xxx–xxx
certain infections, and suffer a higher incidence of autoimmune
diseases [9]. The aim of the present study was to determine
whether T-cell proliferation, T-cell activation, and intra-lymphocyte cytokine production were modified according to age or gender
in different populations, i.e. kidney-transplant patients, dialysis patients, and healthy volunteers.
2. Materials and methods
2.1. Study subjects and clinical study design
The study was performed in accordance to the ethical guidelines of Helsinki. In this single-center study we included 27 stable
kidney-allograft recipients, 28 patients on hemodialysis and 84
healthy volunteers. Stable kidney-allograft patients had a serum
creatinine level ranging from 91 to 220 lmol/L (median 139.5).
Immunosuppressive therapy consisted of Tacrolimus (9.3 ±
3.2 ng/mL trough level), Cellcept (1 g/day) ± steroids (n = 18).
Peripheral blood for immunological biomarker assessment was
drawn from the antecubital vein using a sterile butterfly-21 needle
and plastic syringe, and blood was anti-coagulated by Li-heparin.
Time points of blood drawing were for healthy volunteers between
9 am and 11 am, for dialysis patients 9 am before dialysis and for
kidney-transplant patients at 8.30 am before immunosuppressive
drug intake. Collected blood was stored at room temperature for
use within 1–3 h. The patients’ characteristics are summarized in
Table 1.
factor (TNF)-a, T-cell activation markers [transferin receptor
(CD71) and a-chain IL-2 receptor (CD25), and T-cell proliferation]. These methods are described in detail elsewhere [3].
Briefly, for the measurement of intracytoplasmic cytokine
expression, undiluted whole blood was stimulated by phorbol
myristate acetate (PMA) and ionomycin for 30 min. Cytokine
secretion was blocked by adding brefeldin. After 4 h of incubation at 37 °C, intracytoplasmic cytokine expression was analyzed
by a three-color FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson)
after the blood had been labeled with monoclonal antibodies,
i.e. anti-CD3-PerCP, anti-IL-2 PE, and anti-TNF-a FITC antibodies.
For T-cell activation, the surface markers (CD25 and CD71), Tcell proliferation, and diluted whole blood (1:10) were stimulated with concavalin A (sigma) for 3 days. Thereafter, antigen
surface markers were stained using labeled anti-CD3-PerCP,
CD25-FITC, and CD71-PE monoclonal antibodies, and were analyzed by flow cytometry. Lymphocyte proliferation was measured by bivariate flow cytometric analysis using directly
labeled FITC monoclonal antibodies against proliferating nuclear
cell antigen (PCNA) and propidium iodide labeled for DNA content. Because un-stimulated blood has no or only little biomarker expression, we only investigated stimulated blood of
patients and in parallel, as a positive control, stimulated and
un-stimulated blood from one healthy volunteer. Three thousand CD3 positive cells of each sample were analyzed with a
flow cytometer.
2.3. Statistics
2.2. Lymphocyte function assays
Lymphocyte function was studied by measuring the expression of intracytoplasmic interleukin (IL)-2, and tumor necrosis
Table 1
Volunteers and patient characteristics.
Healthy volunteers
n = 84
Age (years)
Gender, male/female
43.0 ± 17.1
47/37
Dialysis patients
n = 28
Age (years)
Gender, male/female
Time on dialysis (month)
47.3 ± 12.6
8/20
50.7 ± 26.6
Initial nephropathy
Polycystic kidney disease
Chronic glomerulopathy
Nephroangiosclerosis
Reflux nephropathy
Alport
Interstitial nephritis
CA, nephrectomy
Undetermined
2
6
5
2
1
2
1
9
Stable kidney-transplant patients
n = 27
Age (years)
Gender, male/female
Time since transplantation (months)
Steroids, (yes/no)
Serum creatinine level (lmol/L)
50.0 ± 9.7
16/11
3.6 ± 1.7
18/9
139.5 (92–220)
Initial nephropathy
Polycystic kidney disease
Chronic glomerulopathy
Nephroangiosclerosis
Lupus nephritis
Alport
Undetermined
3
1
1
1
1
5
Age and gender was not statistically different between the three groups.
Data are expressed as mean ± SEM. All three groups were compared for statistic significant differences by Kruskall & Wallis test
and comparison between two groups was performed by Mann
Whitney test. For differences in gender between the groups we used
Fischer exact test. The Spearman test was used to search for a correlation between two quantitative variables. A value of p < 0.05
was considered as statistically significant.
3. Results
3.1. T-cell function in healthy volunteers, dialysis patients and in stable
kidney-transplant patients
We analyzed biomarkers of T-cell function in 84 healthy volunteers. We observed an intracellular expression of 19.5 ± 11.5% IL-2
and 23.2 ± 13.6% TNF-a in CD3+ T-cells. For activation marker we
determined expression of 45.3 ± 12.8% CD25 and 33.1 ± 10.6%
CD71 on CD3+ T-cells and for lymphocyte proliferation (PCNA+/
PIhigh) 16.8 ± 4.5% (Fig. 1).
We analyzed biomarkers of T-cell function in 28 dialysis
patients. Compared to healthy volunteers we found significant
increased IL-2 expression in CD3+ T-cells (36.3 ± 19.6% vs
19.5 ± 11.5%, p < 0.0001). All other biomarkers were not significantly different compared with the healthy volunteers group. Further we found no significant correlation between time on dialysis
and biomarker expression (Fig. 1).
We analyzed biomarkers of T-cell function in 27 kidney-transplant patients receiving standard triple therapy based on tacrolimus, mycophenolic acid with or without steroids. We observed
an intracellular expression of 10.1 ± 6.5% IL-2 and 14.7 ± 9.6%
TNF-a in CD3+ T-cells. For activation marker we determined an
expression of 31.7 ± 12.3% CD25 and 18.1 ± 9.3% CD71 on CD3+
T-cells and for lymphocyte proliferation (PCNA+/PIhigh) a mean ± SEM of 5.5 ± 3.4%. All biomarkers were significantly lower as in
comparison to healthy volunteers and also compared to dialysis
patients (Fig. 1).
Please cite this article in press as: Böhler T et al., Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients ..., Cytokine (2009),
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
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T. Böhler et al. / Cytokine xxx (2009) xxx–xxx
3
In dialysis patients and in transplant patients, we detected no
significant differences in T-cell proliferation, activation and intracytoplasmic cytokine expression. (Fig. 4).
4. Discussion
Fig. 1. Biomarker of T-cell function are expressed [mean ± SEM] as % of PCNA+/
PIhigh lymphocytes for proliferation, % CD25 or % CD71 on CD3+ lymphocytes for
T-cell activation and % IL-2 or % TNF-a in CD3+ T-cells for cytokine expression.
Symbols indicate significant p < 0.05, and #p < 0.001 differences as compared to
healthy volunteers.
3.2. T-cell function and age
3.2.1. Cytokine expression
In healthy volunteers cytokine expression was significantly correlated with age. We determined as correlation coefficient r2 = 0.16
(p = 0.0007) for TNF-a (Fig. 2A) and r2 = 0.14 (p = 0.016) for IL-2
(Fig. 2B). In dialysis patients we detected a significant correlation
between TNF-a and age (r2 = 0.2, p = 0.03) (Fig. 2A). Also in kidney-transplant patients, cytokine expression was significantly correlated with age. We determined as correlation coefficient r2 = 0.18
(p = 0.03) for TNF-a (Fig. 2A) and r2 = 0.3 (p = 0.006) for IL-2
(Fig. 2B).
We further investigated the correlation between the organ donors’ age and cytokine expression of transplant recipients. We
found a significant (p = 0.035) correlation for IL-2 and age
(r2 = 0.19) and a trend (p = 0.06) towards a correlation between
TNF-a and age (r2 = 0.37).
3.2.2. T-cell activation
In healthy volunteers and in dialysis patients we detected no
correlation between T-cell activation markers (CD25 and CD71)
and age. However in kidney-transplant patients, we found a significant correlation of age and T-cell activation marker CD25,
r2 = 0.16 (p = 0.05), (Fig. 3). No correlation was observed between
the organ donors’ age and T-cell activation of transplant
recipients.
3.2.3. Lymphocyte proliferation
We found in healthy volunteers an inverse correlation between
lymphocyte proliferation and age; r2 = 0.06 (p = 0.03), (Fig. 2). In
dialysis patients and in kidney-transplant patients we detected
no correlation between lymphocyte proliferation and age. No correlation was observed between the organ donors’ age and lymphocyte proliferation of transplant recipients.
3.3. T-cell function and gender
In healthy volunteers we found significant (p = 0.02) higher
proliferation rate in women (20.3 ± 7.6%) as compared to men
(16.6 ± 8.5%) but we found no differences between men and women for intracytoplasmic cytokine expression and T-cell
activation.
We have investigated cytokine synthesis, T-cell activation and
proliferation in healthy volunteers, dialysis patients and stable kidney-transplant patients. We found evidence that age exerts an
influence on specific T-cell functions. Strikingly in all study cohorts
we found a significant correlation of age and the percentage of Tlymphocytes expressing the pro-inflammatory cytokine TNF-a.
Further the percentage of T-cells expressing IL-2 correlated with
age in healthy volunteers and kidney-transplant patients. The increase of pro-inflammatory cytokine expression with age may have
implications on allograft survival. It has been previously shown
that kidneys from elderly donors exert increased immunogenicity
associated with a higher susceptibility for graft loss due to allograft
rejection and to chronic allograft nephropathy [7]. Therefore several studies have identified the donor age as the most powerful
predictor of long-term kidney-allograft function [4]. Goyal et al.
studied the histopathological changes and detected intimal thickening of arteries, glomerulosclerosis, tubular atrophy and interstitial fibrosis in the aging kidney [10]. It is evident that antigens in
damaged renal tissues are more likely to cause an immune response than those in a healthy environment. The pro-inflammatory
cytokine TNF-a stimulates the proliferation of smooth muscle cell
proliferation, the hallmark of arteriosclerosis, by the matrix
metalloproteinase/sphingolipid mitogenic pathway [11]. Further
TNF-a is known to increase the expression of human leucocytes
antigens (HLA) in endothelial cells [12]. Therefore our finding of
an age-related increased synthesis of cytokines by T-cells in transplant patients (and to the organ donors’ age) provides an explanation of the increased immunogenicity observed in kidneys of
elderly donors. Additionally we found in stable kidney-allograft
patients a correlation of CD25+ (activated) T-cells and age which
may favour the proliferation of T-cells in response to IL-2.
Many studies have demonstrated that functional changes occur
in leucocytes with age which may be partially responsible for cellular and humoral immunodeficiency in the elderly [13]. In line
with these previous reports we have shown in the present study
that decreased lymphocyte proliferation correlates with age in
healthy volunteers. This is in line with a study of Cameron. reporting fewer failures due to rejections in recipients older than 60
years as compared to recipients in the age group between 6 and
18 years [14]. The observation that the immune responses steadily
decreases as the age of the recipient increases is also reflected by
infections and malignancies, which play an increasing role in the
elderly patient [15]. In contrast to healthy volunteers we detected
no significant correlation of T-cell proliferation in the dialysis- and
kidney-transplant patients. The reason might be that the immune
modulating effects of dialysis membranes and immunosuppressive
drugs diminished the effects of age on lymphocyte proliferation.
Lymphocyte proliferation is known to be stimulated by IL-2
production. Therefore it was unexpected that IL-2 and lymphocyte
proliferation did not in all study cohorts correlate identical with
age. An explanation may be other cytokines, like IL-15 or IL-10,
or cell–cell interaction in this whole blood assay which can modulate lymphocyte proliferation. Further it has to be considered that
different stimuli were been used in the proliferation assay (ConA)
as compared to the cytokine expression of T-cells (PMA/
Ionomycin).
In conclusions age exerts diverse effects on the adaptive immune system which may modulate immunogenicity of organs in
the donor as well on the recipient’s capacity to reject organs.
Please cite this article in press as: Böhler T et al., Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients ..., Cytokine (2009),
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
ARTICLE IN PRESS
4
T. Böhler et al. / Cytokine xxx (2009) xxx–xxx
Fig. 2. (A) Spearman test: correlation between age (years) and TNF-a + T-cells (%) in healthy volunteers (p = 0.0007, r2 = 0,16), in dialysis patients (p = 0.03, r2 = 0.2) and in
stable kidney-transplant patients (p = 0.03, r2 = 0.18). (B) Spearman test: correlation between age (years) and IL-2+ T-cells (%) in healthy volunteers (p = 0.0016, r2 = 0.14) and
in stable kidney-transplant patients (p = 0.006, r2 = 0.3).
We have also investigated the influence of gender on T-lymphocyte proliferation, activation and cytokine production. In healthy
volunteers we found a higher proliferation rate in women as compared to men. These differences, although statistically significant,
were quite small in absolute terms. Our observations of increased
lymphocyte proliferation is in line with previous reports, which
attributed direct immunological effects of sex hormones that impact a clear gender dimorphism on the immune system [16]. In
contrast to lymphocyte proliferation no influence of gender in dialysis patients and stable kidney-allograft recipients was detected.
We compared the T-lymphocyte function between healthy volunteers, dialysis patients and stable kidney-allograft recipients. We
found that dialysis patients had a significant higher expression of
IL-2 in T-lymphocytes as compared to healthy volunteers. The increased IL-2 expression is eventually due to the dialysis membrane, which is known to stimulate T-cells. As shown in a
previous report by Rostaing et al. different dialysis membranes
have different capacity to stimulate IL-2 expression [17]. In contrast to increased IL-2 expression, the IL-2 receptor expression on
T-cells might not be affected as demonstrated in a report of Weimer et al. [18]. The induction of the pro-inflammatory cytokine
IL-2 during dialysis might be unfavorable in the early course after
kidney-transplantation, because high IL-2 expression levels in Tcells may sensitize the host immune system towards the allograft.
Please cite this article in press as: Böhler T et al., Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients ..., Cytokine (2009),
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
ARTICLE IN PRESS
T. Böhler et al. / Cytokine xxx (2009) xxx–xxx
5
In conclusion we found decreased T-cell functions in kidneytransplant patients compared to healthy volunteers and dialysis
patients, increased IL-2 expression in dialysis patients compared
to healthy volunteers and in all three populations we found a correlation of age and intra-T-lymphocyte TNF-a expression.
Acknowledgements
T.B. is a recipient of a grant from Novartis, C.C. from Roche, and
S.G. from the Francophone Society of Transplantation.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, in
the online version, at doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014.
References
Fig. 3. Spearman test: inverse correlation between age (years) and T-cell proliferation (%) in healthy volunteers (p = 0.03, r2 = 0.06).
Fig. 4. Spearman test: correlation between age (years) and CD25+ T-cells (%) in
stable kidney-transplant patients (p = 0.047, r2 = 0.16).
Future PD-monitoring studies are needed to determine whether
patients with high pre-transplantation IL-2 expression levels are
at higher risk to experience rejection episodes.
We also observed that stable kidney-transplant patients with
standard immune therapy have significantly lower T-cell proliferation, T-cell activation and IL-2 and TNF-a expression in T-cells
as compared to healthy volunteers and dialysis patients. This result
was expected, since calcineurin inhibitors are known to inhibit
efficiently cytokine production and inosine monophosphate dehydrogenase inhibitors are known to inhibit very efficiently lymphocyte proliferation and both drugs T-cell activation [3]. However in
this study, we found no correlation between tacrolimus trough level and any biomarker.
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Please cite this article in press as: Böhler T et al., Cytokines correlate with age in healthy volunteers, dialysis patients ..., Cytokine (2009),
doi:10.1016/j.cyto.2008.11.014
Dans cette étude, nous avons observé que l’âge exerce une influence sur la fonction
lymphocytaire T. Nous avons constaté, aussi bien chez les volontaires sains que chez les
patients hémodialysés ou transplantés rénaux, une corrélation significative entre l’âge et le
pourcentage de lymphocytes T exprimant la cytokine pro inflammatoire TNF-α. De plus, le
pourcentage de lymphocytes exprimant l’IL-2 est corrélé avec l’âge chez les volontaires sains
et les patients transplantés rénaux.
Cette corrélation de l’âge avec le TNF-α peut expliquer l’importance de
l’immunogénicité et du plus grand risque de rejet, que peut entraîner un greffon provenant
d’un donneur âgé, constatée dans d’autres études (194). De plus, nous avons trouvé, chez les
patients transplantés rénaux stable, une corrélation de l’expression du CD25 et de l’âge qui
doit favoriser la prolifération des lymphocytes T en réponse à l’IL-2.
Des études montrent que des changements fonctionnels se produisent dans les
leucocytes avec l’âge qui peuvent être responsable en partie d’une immunodéficience
cellulaire et humorale chez les personnes âgées (196). Dans la continuité de ces observations,
nous constatons dans cette étude qu’une diminution de la fonction lymphocytaire est corrélée
avec l’âge chez les volontaires sains. En revanche, nous n’observons pas de corrélation avec
la prolifération des lymphocytes chez les patients transplantés et les hémodialysés. Cela peut
être dû à l’immunomodulation induite par la membrane de dialyse et les traitements
immunosuppresseurs, qui diminue l’effet de l’âge sur la prolifération des lymphocytes.
Nous avons également étudié l’effet du sexe sur les différents marqueurs biologiques.
Nous observons un plus fort taux de prolifération chez les femmes que chez les hommes dans
le groupe des volontaires sains. Cela est en continuité avec d’autres travaux qui attribuent un
effet immunologique aux hormones sexuelles (197).
Cette étude met en évidence que les patients hémodialysés ont une plus forte
expression de l’IL-2 dans les lymphocytes T en comparaison aux volontaires sains. Cette
augmentation de l’IL-2 peut être dû à la membrane de dialyse qui est connue pour stimuler les
lymphocytes T. Des études montrent que les membranes de dialyse peuvent induire
l’expression d’IL-2 (198).
Nous observons également, comme attendu, une inhibition des différents marqueurs
biologiques des lymphocytes T chez les patients transplantés rénaux, dû à l’activité des
immunosuppresseurs qu’ils reçoivent.
En conclusion, nous observons une diminution de la fonction des lymphocytes T chez
les patients transplantés rénaux en comparaison aux volontaires sains et aux patients
hémodialysés, une augmentation de l’expression de l’IL-2 chez les patients hémodialysés en
51
comparaison aux volontaires sains et dans les trois populations, nous trouvons une corrélation
de l’âge avec l’expression du TNF-α dans les lymphocytes T.
52
3. Étude
pharmacocinétique
et
pharmacodynamique
du
mycophénolate mofétil, du tacrolimus et du sirolimus chez les patients en attente
de transplantation hépatique
Introduction
La majorité des patients transplantés reçoivent un traitement composé de mycophénolate
mofétil, d’une anti-calcineurine ou d’un inhibiteur de la mTOR. Tous ces traitements ont une
marge thérapeutique étroite et une grande variabilité pharmacocinétique. Ils nécessitent un
suivi thérapeutique pharmacocinétique afin de limiter la toxicité et le risque de sur-dosage.
Le suivi pharmacodynamique de ces immunosuppresseurs permet de mesurer leur action
directe sur le système immunitaire et donc de connaître leurs effets.
La connaissance des relations qui existent
entre la pharmacodynamique et la
pharmacocinétique de ces différentes molécules peut aider à optimiser ces traitements.
Le but de cette étude in vivo était de rechercher une corrélation entre la pharmacocinétique du
tacrolimus (TRL), du mycophénolate mofétil (MMF) et du sirolimus (SRL), et leurs effets sur
la fonction, l’activation et la prolifération lymphocytaire T chez des patients en attente d’une
transplantation hépatique. Une analyse descriptive de l’exposition PK et de l’effet observé a
été menée et une modélisation de la population PK/PD a été réalisée.
Cette étude a été effectuée en collaboration avec l’équipe INSERM U850 de Limoges, qui
travaille sur la pharmacologie des immunosuppresseurs, dirigée par le professeur Pierre
Marquet.
Patients et méthodes :
Treize patients (11 hommes et deux femmes) en attente de transplantation hépatique pour une
cirrhose alcoolique ou post-hépatite B ou C ont été initialement inclus dans cette étude.
Aucun n’était en décompensation oedémato-ascitique lors de l’étude et le taux de
prothrombine était supérieur à 60% chez tous.
Chaque patient a bénéficié de 3 profils PK/PD à une semaine d’intervalle. Le premier profil a
été établi après la prise d’une dose de TRL (0,08 mg/kg per os), le second après la prise de 1
gramme de MMF per os et le dernier après la prise de 4 mg de SRL per os.
Les taux sériques des immunosuppresseurs ont été mesurés avant la prise du médicament,
puis 20 minutes, 1, 2, 3, 4, 6, 9 et 12 heures plus tard. Pour le sirolimus, 3 mesures
53
additionnelles ont été réalisées 16, 20 et 24 heures après la prise du médicament. L’étude
pharmacodynamique a été réalisée aux mêmes temps. Les paramètres pharmacodynamiques
ont été mesurés selon la méthode validée et publiée par Böhler et ses collaborateurs (181).
Pour l’étude pharmacodynamique, l’inhibition / heure (AUEC, Area Under the Effect Curve)
de la sécrétion de cytokines intra-lymphocytaires, de l’activation et de la prolifération
lymphocytaire ont été calculées selon la méthode décrite par Gummert et coll. (161). L’aire
sous la courbe des concentrations des immunosuppresseurs en fonction du temps (AUC, Aera
Under Curve) a été calculée selon la méthode des trapèzes.
Un profil pharmacocinétique et pharmacodynamique de ces trois immunosuppresseurs a été
modélisé à partir des résultats obtenus. Les paramètres pharmacocinétiques individuels ont été
déterminés par estimation Bayesienne (en prenant en compte les 9 concentrations mesurées)
sur la base d’un modèle de PK de population précédemment développé en transplantation
rénale.
Plusieurs modèles structuraux PD ont été testés pour décrire la relation immunosuppresseureffet :
•
Un modèle linéaire de type y=ax+b
•
Un modèle polynomial de type y=ax2+bx+c
•
Un modèle Emax sigmoïde sans compartiment effet
•
Un modèle Emax sigmoïde avec un compartiment effet
Ces modèles ont été testé pour chacun des marqueurs PD.
Les relations entre variables d’exposition PK (AUC, Cmax, C12h ou C24h) et les variables
d’effet (Aires, Emax, Delta=((E0-Emax)/E0) ont été évaluées grâce à un test nonparamétrique de Spearman.
Résultats
•
Présentation des variables PK/PD
Le MPA :
Les médianes de la concentration maximale de MPA et de la concentration collectée
12h après administration du médicament observées étaient 26,5 mg/L (étendue : 9,7-53,1) et
0,81 mg/L (0,3-3,8).
54
Les valeurs médianes pour les valeurs de base (E0) obtenues pour les marqueurs
pharmacodynamiques sont de 46,1% (6,4-61,1) pour CD25, 33,2% (6,1-45,3) pour CD71,
28,3% (19,2-55,6) pour IL-2, 36,7% (19,8-58,4) pour TNFα et 17,6% (5,9-29,3) pour la
prolifération lymphocytaire.
La médiane de l’effet maximum observé exprimé en pourcentage de la valeur de base
(Emax) est de 62% (34-78) pour CD25, 68% (54-85) pour CD71, 15% pour IL-2 (-4,3-48),
26% pour TNF-α (-15-49) et 94% pour la prolifération (84-98) (Figure 6).
Fig 6. Profil PK du MPA, concentration plasmatique en fonction du temps et Profils PD du
MPA : IL-2, TNF-α, CD25, CD71, prolifération cellulaire (n=10)
L’ASC obtenue est de 55 mg.h/L (21 ; 86) pour le MPA. Les AUEC obtenues sont de
353 %.h (98 ; 492) pour CD25, 253 %.h (64 ;362) pour CD71, 382 %.h (201 ;712) pour IL-2,
446 %.h (198 ;809) pour TNFα et 87%.h (11 ;122) pour la prolifération.
Le sirolimus (SRL) :
Les médianes de la concentration maximale du SRL et de la concentration collectée
24h après administration du médicament observées étaient 12,3 ng/mL (étendue : 5,1-26,2) et
3,7 ng/mL (3-5,4).
55
Les valeurs médianes pour les valeurs de base (E0) obtenues pour les marqueurs
pharmacodynamiques sont de 43,8% (21-61,9) pour CD25, 26,2% (16,5-41) pour CD71, 32%
(8,1-54,7) pour IL-2, 34,3% (13,7-53,5) pour TNFα et 15,8% (2,8-30,2) pour la prolifération
lymphocytaire.
La médiane de l’effet maximum observé exprimé en pourcentage de la valeur de base
(Emax) est de 16% (7-62) pour CD25, 28% (2-73) pour CD71, 14% pour IL-2 (0-81), 31%
pour TNF-α (4-70) et 40% pour la prolifération (0-61) (Figure 7).
Fig. 7. Profil PK du SRL, concentration plasmatique en fonction du temps et Profils PD du
SRL : IL-2, TNF-α, CD25, CD71, prolifération cellulaire (n=9)
L’ASC obtenue est de 135 ng.h/mL (32,1 ; 196) pour le SRL. Les AUEC obtenues
sont de 1065 %.h (276 ; 1498) pour CD25, 628 %.h (191 ;1010) pour CD71, 653 %.h
(322 ;995) pour IL-2, 666 %.h (238 ;1151) pour TNFα et 278%.h (53 ;603) pour la
prolifération.
Le tacrolimus (TRL) :
Les médianes observées de la concentration maximale de tacrolimus et de la
concentration collectée 12h après administration du médicament sont 37,2 ng/mL (étendue :
10,5-68,1) et 7,9 mg/L (2,5-21,9).
56
Les valeurs médianes pour les valeurs de base (E0) obtenues pour les marqueurs
pharmacodynamiques sont de 48,3% (24-59,3) pour CD25, 33,4% (10,2-40,1) pour CD71,
30,7% (12,3-52,1) pour IL-2, 41,7% (24,4-50,8) pour TNFα et 14,3% (5,3-22,4) pour la
prolifération lymphocytaire.
La médiane de l’effet maximum observé exprimé en pourcentage de la valeur de base
(Emax) est de 32% (4-65) pour CD25, 37% (8-64) pour CD71, 88% pour IL-2 (61-100), 83%
pour TNF-α (28-100) et 29% pour la prolifération (0-100) (Figure 8).
Fig. 8. Profil PK du TRL, concentration plasmatique en fonction du temps et Profils PD du
TRL : IL-2, TNF-α, CD25, CD71, prolifération cellulaire (n=9)
L’ASC obtenue est de 175 ng.h/mL (58,2 ; 350) pour le FK. Les AUEC obtenues sont
de 484 %.h (255 ; 723) pour CD25, 374 %.h (64 ;563) pour CD71, 133 %.h (52 ;420) pour
IL-2, 217 %.h (122 ;536) pour TNFα et 196%.h (35 ;306) pour la prolifération.
57
•
Relations entre variables PK/PD :
Le MPA :
Pour CD25, Emax est linéairement corrélé avec la concentration maximale de MPA
(r2=0,709, p<0,002). En revanche, il n’y a pas de relation significative observée entre les
variables PK et les variables PD CD71, IL-2 et TNF-α. (Tableau 4)
Tableau 4. Corrélations entre variables PK et PD (R2s : coefficient de Spearman ; Delta=(E0Emax)/E0)
Calcul des aires
selon l'AUEC (a)
R_s
p
Cmax MPA / Delta CD25 0,709 0,002
Le sirolimus (SRL) :
Aucune corrélation significative n’a été observée entre les variables PK du SRL et les
aires calculées selon l’AUEC.
Le tacrolimus (TRL) :
Lorsque les aires sont calculées selon les AUEC, nous observons une corrélation entre
les variables PK du TRL (AUC, Cmax, C12h) et les AUEC de l’IL-2 et de TNF-α (Tableau
5).
58
Tableau 5. Corrélations entre variables PK et PD (R2s : coefficient de Spearman au carré ;
Delta=(E0-Emax)/E0).
Calcul des aires
selon l'AUEC (a)
Calcul des aires
selon l'AUEC (a)
AUC TRL / AUEC IL2
AUC TRL / AUEC TNFa
AUC TRL / Emax CD71
AUC TRL / Delta TNFa
AUC TRL / Delta Prolifération
Cmax TRL / AUEC IL2
Cmax TRL / Emax CD71
Cmax TRL / Emax IL2
Cmax TRL / Delta CD25
Cmax TRL / Delta Prolifération
C12h TRL / AUEC IL2
C12h TRL / Delta Prolifération
•
R_s
p
0,764
0,372
0,315
0,308
0,556
0,378
0,387
0,327
0,308
0,511
0,591
0,330
<0,001
0,027
0,046
0,049
0,003
0,025
0,023
0,041
0,049
0,006
0,002
0,04
Modélisation pharmacocinétique
Le MPA :
Le modèle PK utilisé dans NONMEM décrit de façon satisfaisante les profils de
concentration de MPA obtenus. Le biais obtenu sur les valeurs d’ASCMPA variait de –1.2% à
7.6%. La corrélation entre les valeurs estimées et les valeurs observées est excellente (Figure
Concentrations individuelles
estimées de MPA (mg/L)
9).
60
50
40
30
y = 0,9782x + 0,1249
R2 = 0,9855
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
Concentrations individuelles
observées de MPA (m g/L)
Fig. 9. Concentrations individuelles estimées de MPA (mg/L) en fonction des concentrations
observées (mg/L) ; (----) droite y=x. (n=10)
59
Le sirolimus (SRL) :
Le modèle PK utilisé dans NONMEM décrit de façon satisfaisante les profils de
concentration de SRL obtenus. Le biais obtenu sur les valeurs d’ASCSRL variait de –10,5% à
21,5%. La corrélation entre les valeurs estimées et les valeurs observées est excellente (Figure
Concentrations individuelles
estimées de SRL (ng/ml)
10).
30
25
20
15
y = 1,0052x - 0,0455
R2 = 0,9632
10
5
0
0
5
10
15
Concentrations individuelles
observées de SRL (ng/ml)
20
25
Fig. 10. Concentrations individuelles estimées de SRL (mg/L) en fonction des concentrations
observées (mg/L) ; (----) droite y=x. (n=9)
Le tacrolimus (TRL) :
Le modèle PK utilisé dans NONMEM décrit de façon satisfaisante les profils de
concentration de TRL obtenus. Le biais obtenu sur les valeurs d’ASCTRL variait de –11.4% à
8%. La corrélation entre les valeurs estimées et les valeurs observées est excellente (Figure
11).
60
Concentrations individuelles
estimées de TRL (ng/ml)
70
60
50
40
30
y = 0,9769x - 0,0452
R2 = 0,9654
20
10
0
0
20
40
60
80
Concentrations individuelles observées de TRL (ng/ml)
Fig. 11. Concentrations individuelles estimées de TRL (mg/L) en fonction des concentrations
observées (mg/L) ; (----) droite y=x. (n=13)
•
Modélisation pharmacodynamique
Le MPA :
Les profils d’expression de CD25 et CD71 ont pu être modélisés de façon satisfaisante
avec un modèle PD concentration-effet sigmoïde type Emax sans compartiment d’effet. Ce
modèle a conduit à des résultats très corrects pour CD25 et CD71 comme le montrent les
coefficients de corrélation entre les valeurs observées et les valeurs estimées (CD25 :
R2=0,926 et CD71 : R2=0,912). La variabilité résiduelle (c’est-à-dire l’erreur sur les taux de
CD25 et CD71 non expliquée par le modèle) était respectivement de 4,5% et 3,7%. En
revanche, l’estimation des valeurs de prolifération cellulaire présente un biais important et
une mauvaise précision. Concernant les marqueurs IL-2 et TNF-α, les cinétiques d’effets
n’ont pas pu être décrites à l’aide des modèles testés.
Les figures 13, 14 et 15 montrent les profils PK de MPA et les cinétiques de CD25, CD71 et
de prolifération cellulaire observés et estimés par le modèle.
61
70
60
70
50
60
50
60
40
30
30
20
20
10
40
30
30
20
0
8
10
12
14
0
0
2
4
14
60
70
50
60
50
60
40
40
30
30
20
20
MPA mg/L
50
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50
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20
10
10
0
10
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
60
70
60
70
50
60
50
60
40
40
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30
20
20
10
MPA mg/L
50
CD25 %
MPA mg/L
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0
0
0
2
4
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10
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40
30
30
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20
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0
10
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
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12
14
Te m ps (h)
60
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60
70
50
60
50
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40
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30
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10
MPA mg/L
50
CD25 %
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10
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0
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0
10
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
60
70
60
70
50
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50
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40
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0
0
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6
8
Te m ps (h)
10
12
14
MPA mg/L
50
CD25 %
MPA mg/L
8
Te m ps (h)
CD25 %
MPA mg/L
Te m ps (h)
6
CD25 %
6
CD25 %
4
CD25 %
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40
40
30
30
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CD25 %
0
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10
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0
50
40
CD25 %
40
MPA mg/L
50
CD25 %
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0
0
0
2
4
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8
10
12
14
Te m ps (h)
Fig. 12. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de MPA (mg/L) et
de l’expression de CD25 (%) en fonction du temps (h).
62
50
40
50
40
30
30
20
20
10
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0
10
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0
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0
0
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50
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20
20
MPA mg/L
60
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40
30
30
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0
0
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0
2
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Te m ps (h)
6
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14
Te m ps (h)
50
60
50
50
40
50
40
40
30
30
20
20
MPA mg/L
60
CD71 %
MPA mg/L
12
50
0
10
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0
2
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6
8
10
12
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
50
60
50
50
40
50
40
40
30
30
20
20
MPA mg/L
60
CD71 %
MPA mg/L
10
60
10
10
10
0
2
4
6
8
10
12
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
50
60
50
50
40
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0
2
4
6
8
Te m ps (h)
10
12
14
MPA mg/L
60
CD71 %
MPA mg/L
8
Te m ps (h)
CD71 %
MPA mg/L
Te m ps (h)
6
CD71 %
8
10
CD71 %
6
20
20
CD71 %
4
30
30
40
30
30
20
20
CD71 %
2
40
40
10
0
0
50
CD71 %
60
MPA mg/L
50
CD71 %
MPA mg/L
60
10
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
Fig. 13. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de MPA (mg/L) et
de l’expression de CD71 (%) en fonction du temps (h).
63
60
40
60
30
20
20
10
30
MPA mg/L
40
30
20
20
10
10
10
0
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
0
2
4
60
40
14
40
20
20
10
40
30
20
20
10
10
Prolifératrion %
30
30
MPA mg/L
40
Prolifératrion %
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
0
14
0
0
2
4
Te m ps (h)
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
60
40
60
30
20
20
10
10
0
30
MPA mg/L
40
2
4
6
8
10
12
30
20
20
10
10
0
0
0
40
Prolifératrion %
50
30
Prolifératrion %
50
40
14
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
Te m ps (h)
60
40
60
50
40
30
20
20
10
10
0
30
MPA mg/L
30
Prolifératrion %
50
40
2
4
6
8
10
12
30
20
20
10
10
0
0
0
40
Prolifératrion %
MPA mg/L
12
50
30
MPA mg/L
10
60
50
MPA mg/L
8
Te m ps (h)
Te m ps (h)
14
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Te m ps (h)
Te m ps (h)
60
40
60
40
50
40
30
20
20
10
10
0
0
0
2
4
6
8
Te m ps (h)
10
12
14
30
MPA mg/L
30
Prolifératrion %
50
MPA mg/L
6
40
30
20
20
10
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
Te m ps (h)
Fig. 14. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de MPA
(mg/L) et de l’expression de la prolifération (%) en fonction du temps (h).
64
14
Prolifératrion %
MPA mg/L
40
Prolifératrion %
50
30
Prolifération %
50
40
Le sirolimus (SRL) :
Les profils d’expression de CD25, CD71 et de la prolifération cellulaire ont pu être
modélisés de façon satisfaisante avec un modèle PD concentration-effet sigmoïde type Emax
sans compartiment d’effet. Ce modèle a conduit à des résultats très corrects pour CD25,
CD71 et la prolifération cellulaire comme le montrent les coefficients de corrélations entre les
valeurs estimées et les valeurs observées (CD25 : R2=0,853 ; CD71 : R2=0,845 ;
prolifération : R2=0,793). La variabilité résiduelle (c’est-à-dire l’erreur non expliquée par le
modèle) était respectivement de 5,4% ; 4% et 3,3% pour CD25, CD71 et la prolifération
cellulaire. Concernant les marqueurs IL-2 et TNF-α, les cinétiques d’effets n’ont pas pu être
décrites à l’aide des modèles testés.
Les figures 16, 17 et 18 montrent les profils PK du SRL et les cinétiques de CD25, CD71 et
de la prolifération cellulaire observés et estimés par le modèle.
65
25
80
30
70
25
80
70
60
60
20
40
30
10
SRL ng/ml
50
15
CD25 %
50
15
40
30
10
20
20
5
5
10
0
15
20
0
0
25
5
10
15
20
25
Te m ps (h)
Te m ps (h)
30
80
30
70
25
80
70
25
60
60
20
15
40
30
10
SRL ng/ml
50
CD25 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
5
20
5
10
0
0
0
5
10
15
20
10
0
25
0
0
5
10
Te m ps (h)
15
20
25
Te m ps (h)
30
80
30
70
25
80
70
25
60
60
20
15
40
30
10
SRL ng/ml
50
CD25 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
5
20
5
10
0
0
0
5
10
15
20
10
0
25
0
0
5
10
Te m ps (h)
15
20
25
Te m ps (h)
30
80
30
70
25
80
70
25
60
60
15
40
30
10
SRL ng/ml
20
50
CD25 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
5
0
0
5
10
15
20
20
10
5
0
0
25
10
0
0
5
10
Te m ps (h)
25
80
30
20
25
70
25
80
Fig. 15. Courbes individuelles des70
valeurs observées et estimées des60
60
15
40
30
10
CD25 %
50
SRL ng/ml
20
20
SRL ng/ml
15
Te m ps (h)
30
50
concentrations de SRL (ng/mL) et de40
15
30
10
l’expression de CD25 (%) en fonction20
20
5
5
10
0
0
0
5
10
15
Te m ps (h)
CD25 %
10
CD25 %
5
20
25
10
du temps (h).
0
0
5
0
10
15
20
25
Te m ps (h)
66
CD25 %
0
10
0
0
CD25 %
SRL ng/ml
20
CD25 %
30
25
80
30
70
25
80
70
60
60
20
15
40
30
10
SRL ng/ml
50
CD71 %
50
15
40
30
10
20
20
5
5
10
0
5
10
15
20
0
0
25
5
10
15
20
25
Te m ps (h)
Te m ps (h)
30
80
30
70
25
80
70
25
60
60
20
15
40
30
10
SRL ng/ml
50
CD71 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
5
20
5
10
0
0
0
5
10
15
20
10
0
25
0
0
5
10
Te m ps (h)
15
20
25
Te m ps (h)
30
80
30
70
25
80
70
25
60
60
20
15
40
30
10
SRL ng/ml
50
CD71 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
5
20
5
10
0
0
10
15
20
25
0
0
5
10
Te m ps (h)
15
20
25
Te m ps (h)
30
25
80
30
70
25
80
70
60
60
15
40
30
10
SRL ng/ml
20
50
CD71 %
SRL ng/ml
20
50
15
40
30
10
20
20
5
5
10
0
5
10
15
20
10
0
0
0
0
0
25
5
10
30
20
25
30
80
70
25
15
40
30
10
CD71 %
50
SRL ng/ml
20
80
70
25
20
60
Fig. 16. Courbes individuelles des valeurs
15
40 SRL
observées et estimées des concentrations de
60
SRL ng/ml
15
Te m ps (h)
Te m ps (h)
10
20
50
30
(ng/mL) et de l’expression de CD71 (%)
en
20
5
5
10
0
0
0
5
10
15
Te m ps (h)
CD71 %
5
10
0
20
25
0
CD71 %
0
CD71 %
0
10
0
0
CD71 %
SRL ng/ml
20
CD71 %
30
10
fonction du temps (h).
0
5
10
0
15
20
25
Te m ps (h)
67
35
30
35
25
30
25
30
20
15
15
10
10
5
15
20
5
0
0
0
25
5
10
20
25
Temps (h)
Temps (h)
30
35
30
35
25
30
25
30
20
20
15
15
10
10
25
20
SRL ng/ml
25
Prolifération %
20
15
15
10
10
5
5
5
0
0
0
5
10
15
20
25
0
0
5
10
35
25
30
20
25
20
15
15
SRL ng/ml
30
35
25
30
20
25
15
20
15
10
5
5
5
0
0
0
5
10
15
20
10
10
5
0
25
0
5
10
15
20
25
Temps (h)
35
30
35
25
30
25
25
30
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
SRL ng/ml
30
Prolifération %
SRL ng/ml
Temps (h)
20
5
10
15
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
0
25
0
0
5
10
Temps (h)
15
20
25
Temps (h)
30
35
Fig.30 17. Courbes individuelles des valeurs35
25
30
25
25
observées
et estimées des concentrations de25
20
15
15
10
5
10
5
0
0
0
5
10
Temps (h)
15
20
25
30
SRL ng/ml
20
Prolifération %
SRL ng/ml
25
30
10
0
20
Temps (h)
Prolifération %
SRL ng/ml
Temps (h)
15
Prolifération %
0
5
Prolifération %
SRL ng/ml
15
Prolifération %
10
10
5
20
SRL
(ng/mL) et de l’expression de la20
15
15
10
prolifération (%) en fonction du temps (h).
10
5
5
0
0
0
5
10
15
20
25
Temps (h)
68
Prolifération %
5
15
10
0
0
20
15
5
0
25
20
SRL ng/ml
SRL ng/ml
Prolifération %
25
20
Prolifération %
30
Le tacrolimus (TRL) :
Lors de la modélisation des données PD, les meilleurs résultats ont été obtenues avec
le modèle PD concentration-effet sigmoïde type Emax sans compartiment à effet. Cependant
ce modèle conduit à des résultats qui restent médiocres pour chaque marqueur PD comme le
montrent les coefficients de corrélations entre les valeurs observées et les valeurs estimées
(IL-2 : R2=0,796 ; TNF-α : R2=0,797 ; CD25 : R2=0,592 ; CD71 : R2=0,775 ; prolifération :
R2=0,576). Ceci est probablement dû au nombre limité de patients. Les figures 18, 19, 20, 21,
22 montrent les profils PK de TRL est les cinétiques d’IL-2, TNF-α, CD25, CD71 et de la
50
TRL es timé
40
IL2 obs erv é
30
IL2 es timé
20
10
0
4
6
8
10
12
14
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
40
30
20
TRL ng/ml
50
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
60
50
40
30
20
10
0
0
40
30
20
10
0
6
8
Temps (h)
10
12
14
TRL ng/ml
50
IL2 %
TRL ng/ml
60
4
14
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
12
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
10
Temps (h)
IL2 %
TRL ng/ml
Temps (h)
8
IL2 %
2
60
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
69
IL2 %
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
IL2 %
60
TRL obs erv é
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
IL2 %
TRL ng/ml
prolifération cellulaire observés et estimés par le modèle.
40
30
20
TRL ng/ml
50
10
0
6
8
10
12
40
30
20
10
0
14
0
2
4
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
40
30
20
TRL ng/ml
50
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
30
20
TRL ng/ml
40
IL2 %
TRL ng/ml
50
10
0
6
8
50
40
30
20
10
0
2
4
10
12
14
30
20
10
0
8
10
12
14
Temps (h)
TRL ng/ml
40
IL2 %
TRL ng/ml
50
6
10
12
14
60
50
40
30
20
10
0
0
60
4
8
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
14
60
0
60
4
12
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
IL2 %
TRL ng/ml
Temps (h)
6
IL2 %
4
50
IL2 %
2
60
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
IL2 %
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
IL2 %
60
IL2 %
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
Fig. 18. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de TRL (ng/mL) et
de l’expression d’IL2 (%) en fonction du temps (h).
70
TRL estimé
40
TNFa observé
30
TNFa estimé
20
TRL ng/ml
50
10
0
8
10
12
30
20
10
0
14
0
2
4
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
40
30
20
TRL ng/ml
50
10
0
0
2
4
6
8
10
12
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
30
20
TRL ng/ml
40
TNFa %
TRL ng/ml
50
10
0
6
8
10
12
14
30
20
10
0
8
10
12
TRL ng/ml
40
TNFa %
TRL ng/ml
50
6
50
40
30
20
10
0
2
4
6
14
30
20
10
0
8
Temps (h)
10
12
14
TRL ng/ml
40
TNFa %
TRL ng/ml
50
6
12
14
60
50
40
30
20
10
0
0
60
4
10
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
8
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
14
60
0
60
4
12
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
60
4
14
60
14
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
12
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
10
Temps (h)
TNFa %
TRL ng/ml
Temps (h)
8
TNFa %
6
40
TNFa %
4
50
TNFa %
2
60
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
71
TNFa %
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TNFa %
60
TRL observé
TNFa %
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
40
40
30
20
20
TRL ng/ml
50
60
10
0
0
2
4
6
8
10
12
60
50
40
30
20
10
0
0
14
2
4
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
TRL ng/ml
50
TNFa %
TRL ng/ml
Temps (h)
0
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
TNFa %
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TNFa %
60
TNFa %
TRL ng/ml
80
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
Fig. 19. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de TRL (ng/mL) et
de l’expression de TNFα (%) en fonction du temps (h).
72
60
40
30
20
TRL ng/ml
50
10
0
8
10
12
30
20
10
0
14
0
2
4
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
40
30
20
TRL ng/ml
60
50
10
0
0
2
4
6
8
10
12
40
30
20
10
0
2
4
6
10
0
10
12
TRL ng/ml
30
20
CD25%
TRL ng/ml
40
8
14
TRL ng/ml
30
20
10
CD25%
TRL ng/ml
60
50
40
0
6
8
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
10
12
14
10
0
6
8
10
12
14
TRL ng/ml
CD25%
TRL ng/ml
50
40
30
20
Temps (h)
12
14
70
60
50
40
30
20
10
0
0
70
60
4
10
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
8
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
14
Temps (h)
70
4
12
70
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
60
50
6
14
50
0
70
4
12
70
60
14
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
CD25%
TRL ng/ml
Temps (h)
CD25%
6
50
40
CD25%
4
60
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
73
CD25%
2
70
CD25%
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CD25%
70
CD25%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
0
2
4
4
6
8
10
12
Temps (h)
14
TRL ng/ml
70
60
50
40
30
20
10
0
CD25%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
8
10
12
70
60
50
40
30
20
10
0
14
Temps (h)
Temps (h)
0
6
70
60
50
40
30
20
10
0
CD25%
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CD25%
50
40
30
20
10
0
TRL ng/ml
70
60
CD25%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
Fig. 20. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de TRL (ng/mL) et de
l’expression de CD25 (%) en fonction du temps (h).
74
60
CD71 observé
50
CD71 estimé
40
30
20
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10
0
8
10
12
0
14
0
2
4
6
70
40
30
20
10
0
4
6
8
10
12
50
40
30
20
10
0
14
0
2
4
6
40
30
20
10
TRL ng/ml
60
50
CD71%
TRL ng/ml
70
0
4
6
8
10
12
14
0
8
10
12
TRL ng/ml
30
20
10
CD71%
TRL ng/ml
60
50
40
6
50
40
30
20
10
0
2
4
6
14
10
0
8
Temps (h)
10
12
14
TRL ng/ml
CD71%
TRL ng/ml
50
40
30
20
6
12
14
70
60
50
40
30
20
10
0
0
70
60
4
10
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
8
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
14
70
60
0
70
4
12
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
14
70
60
Temps (h)
0
12
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TRL ng/ml
60
50
CD71%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
Temps (h)
Temps (h)
0
8
CD71%
6
20
10
CD71%
4
40
30
CD71%
2
60
50
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
Temps (h)
75
14
CD71%
0
70
CD71%
70
TRL estimé
TRL ng/ml
TRL observé
CD71%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
30
20
10
0
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
TRL ng/ml
70
60
50
40
CD71%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
8
10
12
14
Temps (h)
Temps (h)
0
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
Fig 21. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de TRL (ng/mL) et de
l’expression de CD71 (%) en fonction du temps (h).
76
CD71%
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CD71%
50
40
30
20
10
0
TRL ng/ml
70
60
CD71%
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
50
40
30
20
TRL ng/ml
60
10
0
8
10
12
0
14
0
2
4
6
70
40
30
20
10
0
4
6
8
10
12
14
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
40
30
20
10
TRL ng/ml
60
50
Prolifération %
TRL ng/ml
70
0
4
6
8
10
12
14
TRL ng/ml
30
20
10
Prolifération %
TRL ng/ml
60
50
40
0
6
8
50
40
30
20
10
0
2
4
10
12
14
10
0
6
8
10
12
14
TRL ng/ml
Prolifération %
TRL ng/ml
50
40
30
20
Temps (h)
10
12
14
70
60
50
40
30
20
10
0
0
70
60
4
8
2
4
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
14
70
60
0
70
4
12
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Temps (h)
0
8
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
14
70
60
Temps (h)
0
12
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TRL ng/ml
60
50
Prolifération %
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
10
Temps (h)
Temps (h)
0
8
Prolifération %
6
20
10
Prolifération %
4
40
30
Prolifération %
2
60
50
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
Temps (h)
10
12
77
14
Prolifération %
0
70
Prolifération %
70
Prolifération %
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Prolifération %
TRL ng/ml
Temps (h)
0
6
8
10
12
14
Temps (h)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
Temps (h)
6
8
10
12
14
Temps (h)
Fig. 22. Courbes individuelles des valeurs observées et estimées des concentrations de TRL (ng/mL)
et de l’expression de la prolifération cellulaire (%) en fonction du temps (h).
78
Prolifération %
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Prolifération %
50
40
30
20
10
0
TRL ng/ml
70
60
Prolifération %
TRL ng/ml
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Conclusion
En conclusion, ces résultats confirment, in vivo, que le FK entraîne une baisse
significative de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Cette baisse est corrélée à
l’ASC du TRL. Le MMF est un inhibiteur de la prolifération lymphocytaire plus puissant que
le TRL ou le SRL. De plus, la concentration maximale du MPA est corrélée linéairement avec
le Emax du CD25. En revanche aucune corrélation n’est observée entre l’exposition au SRL
et son AUEC.
La modélisation pharmacocinétique a permis d’estimer les paramètres PK avec une
bonne précision et les concentrations individuelles de MPA, de SRL et de TRL avec un biais
acceptable entre les valeurs observées et les valeurs estimées. La corrélation entre les
concentrations observées et les valeurs estimées, aussi bien de MPA, de SRL et de TRL, était
excellente.
Les résultats de modélisation PD obtenus sont encourageants. Le modèle PD a estimé
des valeurs d’expression des marqueurs CD25 et CD71 avec un biais médian acceptable et
une bonne précision. Cependant l’estimation des valeurs PD pour le SRL et le FK est
médiocre avec de mauvaises précisions associées.
Ces résultats représentent la première étude de relation PK/PD de ces trois
immunosuppresseurs chez des patients en attente de greffe hépatique. Aussi, l’inclusion de
nouveaux patients pourrait permettre d’augmenter la précision de cette estimation des
paramètres moyens.
79
4.
Article n°3 : La néphropathie à virus BK chez des patients
transplantés rénaux : effets du léflunomide sur la fonction des lymphocytes T et
la pathologie
Le BK virus, qui appartient à la famille des polyomaviridae, est connu pour jouer un rôle en
transplantation rénale depuis plus de 30 ans (199). Mais, il n’a été reconnu comme une cause
significative de lésions du greffon rénal que récemment (200). La néphropathie à virus BK est
une maladie destructrice qui atteint environ 8% des patients transplantés rénaux, avec un taux
de perte du greffon entre 30 et 65% à un an (201).
Aucun traitement pour la néphropathie à virus BK n’a été clairement établi. Il a été montré
qu’une diminution de l’immunosuppression améliorait l’état clinique du patient. En revanche,
cela augmente le risque de rejet aigu (202).
Le léflunomide (ARAVA®, Aventis Corp.) est un immunosuppresseur qui est indiqué dans le
traitement de la polyarthrite rhumatoïde depuis 1998. Il inhibe l’acide dihydroorotique
déshydrogénase (DHOH), une enzyme mitochondriale nécessaire pour la synthèse de l’orotate
dans la voie de novo de nucléotides pyrymidiques, et l’inhibition de certaines tyrosines
kinases (203). L’effet immunosuppresseur du léflunomide a été utilisé en transplantation
d’organes pour prévenir et réverser le rejet aigu (204). Chez des patients transplantés rénaux,
plusieurs études ont déjà montré que le leflunomide pourrait être efficace pour traiter la
néphropathie à virus BK (40), (205), (206). Dans cette étude, le léflunomide a remplacé le
mycophénolate mofétil (MMF) chez des patients recevant pour la majorité un anticalcineurine et des corticoïdes. En effet, on ne sait pas si l’effet bénéfique du léflunomide
observé chez des patients traités pour une néphropathie à virus BK est dû à son plus faible
effet immunosuppresseur en comparaison au MMF ou à son activité antivirale.
Le but de cette étude est de comparer l’effet du léflunomide et du MMF sur la fonction des
lymphocytes T chez des patients transplantés rénaux atteint d’une néphropathie à virus BK
Les résultats de cette étude ont été accepté pour publication : Canivet et al., Polyoma BK
virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: effects of leflunomide on T-cell
functions and disease outcome. Int. Immunopharmacology (sous presse)
80
INTIMP-01819; No of Pages 6
ARTICLE IN PRESS
International Immunopharmacology xxx (2009) xxx–xxx
Contents lists available at ScienceDirect
International Immunopharmacology
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s ev i e r. c o m / l o c a t e / i n t i m p
Preliminary report
Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of
leflunomide on T-cell functions and disease outcome
Cindy Canivet a, Lionel Rostaing b,c, Sylvain Galvani a, Torsten Böhler a, Peggy Gandia d, Catherine Mengelle c,
Céline Guilbeau-Frugier e, Mogens Thomsen a, Robert Salvayre a, Anne Negre-Salvayre a, Nassim Kamar a,b,⁎
a
INSERM U858/I2MR, 1 avenue J. Poulhès, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex, France
Department of Nephrology, Dialysis and Multi-Organ Transplantation, CHU Rangueil, 1 avenue J. Poulhès, TSA 50032, 31059 Toulouse Cedex 9, France
Department of Virology, CHU Purpan, 330 Ave. de Grande Bretagne, TSA 40031, 31059 Toulouse Cédex 9, France
d
Laboratory of Pharmacology, CHU Purpan Place Dr Baylac, TSA 50032, 31059 Toulouse Cedex 9, France
e
Laboratory of Histopathology, CHU Rangueil, 1 avenue J.Poulhès, TSA 50032, 31059 Toulouse Cedex 9, France
b
c
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 14 March 2009
Received in revised form 26 April 2009
Accepted 7 May 2009
Available online xxxx
Keywords:
BK virus nephropathy
Leflunomide
Flow cytometry
T-cell function
Kidney transplantation
a b s t r a c t
Background: In kidney-transplant recipients, leflunomide has been shown to be efficient for treating
polyomavirus BK virus-associated-nephropathy (PVAN). However, it is unknown whether the beneficial
effect of leflunomide is related to it having a lower immunosuppressive effect than mycophenolate mofetil
(MMF), or to its anti-viral activity. The aim of this study was to assess i) T-cell functions before and after
conversion from MMF to leflunomide in kidney-transplant patients with PVAN, and ii) effects of leflunomide
on PVAN outcome.
Patients and methods: Twelve patients were enrolled in this study. At PVAN diagnosis, MMF was replaced by
leflunomide. Other immunosuppressive drug doses and levels were maintained unchanged. T-cell functions,
i.e., intralymphocyte cytokine expression (IL-2 and TNF-α), T-cell activation [i.e., transferrin receptor (CD71)
and interleukin (IL)-2 α-chain (CD25) expression], and T-cell proliferation were measured using a flowcytometry whole-blood assay before and at one month after conversion.
Results: Despite a slight decrease in tacrolimus trough levels, no significant change in T-cell-function
biomarkers was observed after conversion. After a follow-up of 6 (4–30) months, five patients were cleared
of the virus, and decreased viral load was observed in four patients. Only one patient suffered a graft loss. No
difference in immunological parameters was observed between patients who were cleared or not of BKV.
Conclusion: Results of this pilot study suggest that the potential benefits of leflunomide to treat PVAN in
kidney-transplant patients is not related to reduced immunosuppression induced by replacing MMF by
leflunomide. Virological studies are required to determine the anti-BKV effect of leflunomide.
© 2009 Published by Elsevier B.V.
1. Introduction
The BK virus (BKV), which belongs to the polyomaviridae family,
has been known to play a role in kidney transplantation for more than
30 years [1,2]. However, it has not been clearly recognized as a
significant cause of graft injury until recently [3,4]. Polyomavirusassociated nephropathy (PVAN), which is mostly induced by BKV
rather than the JC virus, another virus from the polyomaviridae family,
is an aggressively destructive disease occurring in up to 8% of kidneyallograft recipients [3,5], with graft-loss rate within one year ranging
from 30 to 65% [6,7].
⁎ Corresponding author. Department of Nephrology, Dialysis and Multi-Organ
Transplantation, CHU Rangueil, TSA 50032, 31059 Toulouse Cedex 9, France. Tel.: +33
5 61 32 26 84; fax: +33 5 61 32 28 64.
E-mail address: [email protected] (N. Kamar).
The management of PVAN is still not clearly established. It has
been shown that reducing immunosuppression improves the clinical
outcome [8,9]. However, it increases the risk of acute rejection [8].
Leflunomide (Arava®, Aventis Corp.) is an immunosuppressant
drug that has been approved for the treatment of rheumatoid arthritis
since 1998. It inhibits dihydroorotic acid dehydrogenase (DHOH), a
mitochondrial enzyme necessary for orotate synthesis in the de novo
pathway to uridine, and the inhibition of selected tyrosine kinases
[10,11]. In solid organ-transplant patients, leflunomide has been
shown to have a significant immunosuppressive effect, preventing
and even reversing acute rejection [12,13]. In contrast, in in vitro
culture systems, leflunomide has been shown to inhibit both cytomegalovirus and BKV replication [14–16]. In kidney-transplant (KT)
recipients, several studies have previously shown that leflunomide
may be efficient for treating PVAN [17–19]. In these studies,
leflunomide was given instead of mycophenolate mofetil (MMF) to
patients mostly receiving calcineurin inhibitors and steroids. However,
1567-5769/$ – see front matter © 2009 Published by Elsevier B.V.
doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
Please cite this article as: Canivet C, et al, Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of leflunomide on
T-cell functions and disease outcome, Int Immunopharmacol (2009), doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
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2
C. Canivet et al. / International Immunopharmacology xxx (2009) xxx–xxx
it is unknown whether the beneficial effect of leflunomide in treating
PVAN is related to a lower immunosuppressive effect than MMF, or to
its anti-viral activity.
The aims of the present study were to assess T-cell functions, i.e.,
intralymphocyte cytokine expression, T-cell activation [i.e., transferin
receptor (CD71) and interleukin (IL)-2 α-chain (CD25) expression],
and T-cell proliferation using a flow-cytometry whole-blood assay
before and after a switch from MMF to leflunomide, and to assess the
effect of leflunomide therapy for treating PVAN in kidney-transplant
patients.
2. Patients and methods
2.1. Patients
Between January 2006 and May 2008, 12 consecutive KT patients
who developed PVAN, which was diagnosed at the Department of
Nephrology, Dialysis, and Multi-Organ Transplantation in Toulouse
University Hospital, were enrolled in this study. There were 12 patients
(six males, six females), ranging in age from 31 to 71 years (median
59.5). The patients' characteristics are summarized in Table 1. The
diagnosis of PVAN was based on BKV replication in blood and histological evidence of polyomavirus involvement. Polyomavirus involvement was based on the identification of viral cytopathic changes in the
renal tubular epithelium, and included multi-focal or diffuse intranuclear viral inclusions, lytic cell death, and tubular necrosis, which was
confirmed by immunohistochemical SV40 LT-Ag staining associated
with a tubulo-interstitial inflammatory response [8]. At diagnosis, the
median time since transplantation was 6.5 (3–34) months.
At transplantation, all but two patients had received an induction
therapy with either anti-CD25 monoclonal antibodies (n = 6) or
antithymocyte globulins (n = 4). At the time of PVAN diagnosis, all
patients were receiving steroids and MMF, 10/12 were receiving
tacrolimus, 1/12 was receiving cyclosporin-A, and 1/12 was receiving
belatacept (see Table 1). Biopsy-proven acute humoral rejection was
diagnosed in two patients at 1 and 3 months prior to the diagnosis of
PVAN. Steroid pulses were administered in each case (10 mg/kg/day for
3 consecutive days). The two patients with humoral rejection also
received rituximab infusions and plasmapheresis, and one of these 2
patients also received three antithymocyte globulin infusions. In
addition, a third patient who received a graft against which he had a
donor specific alloantibodies (DSA) received preventive therapy of
Table 1
Patients' characteristics.
n = 12
Age (years)
Gender Male/Female
Number of HLA A/B/DR compatibilities
Panel-reactive antibodies (%)
Number of kidney transplantations
1
2
Initial nephropathy
Interstitial nephropathy/malformative uropathy
Glomerulonephritis
Polycystic kidney disease
Nephroangiosclerosis
Unknown
Induction therapy
None
Anti-CD25 monoclonal antibodies
Antithymocyte globulins
Immunosuppressive therapy at PVAN diagnosis
Tacrolimus/cyclosporine A/belatacept
Mycophenolate mofetil
Steroids
59.5 (31–71)
6/6
2 (1–5)
0 (0–100)
8
4
4
3
2
2
1
0
6
4
10/1/1
12
12
Abbreviations: PVAN, polyomavirus-associated nephropathy; HLA, human leukocyte
antigen.
rituximab and plasmapheresis at 8 months before the diagnosis of
PVAN. None of the other patients experienced an acute rejection before
PVAN diagnosis. When PVAN was diagnosed, five patients were still
receiving valganciclovir CMV prophylaxis, and two other patients had
concomitant CMV replication.
When the diagnosis of PVAN was made, MMF was replaced by
leflunomide (Arava®). The loading dose was 100 mg/day for 5 days,
followed by 40 mg/day. Trough levels were measured at 15 and
30 days, and then at 2-month periods after starting leflunomide
therapy, in order to maintain levels above 40 mg/L. BKV DNAemia, as
well as renal function, liver enzymes, and hematological parameters
were assessed at the same time points.
In order to assess the effect of leflunomide upon T-cell functions,
intralymphocyte cytokine expression [IL2, tumor necrosis factor (TNF-α)],
T-cell activation markers (CD25 and CD71), and T-cell proliferation, were
measured during MMF therapy and at 1 month after its replacement with
leflunomide. At the same time points, we also assessed total lymphocyte
count and lymphocyte subset counts, i.e., cells positive for CD3, CD2, CD8,
CD4, CD19, and determined the CD4/CD8 ratio.
2.2. BKV-load measurements
Blood samples were collected into potassium EDTA tubes for
quantitative real-time PCR, which was performed from DNA extracted
from whole blood. DNA was extracted from 200 µl of whole blood with
a MagNA™ Pure instrument (Roche Molecular Biochemicals). A
MagNA™ Pure LC DNA Isolation Kit I was used according to the
manufacturer's instructions [22]. BKV DNA was detected using a
LightCycler™ system. The primers were Pep1: 5'-AgT CTT TAg ggT CTT
CTA CC-3' and Pep2: 5'-ggT gCC AAC CTA Tgg AAC Ag-3'. The fluorogenic
probe BKYAQ1 was 6FAM-5'gCA ACA gCA gAT TCT CAA CAC TCA ACA
XT-3'TAMRA. Real-time PCR was carried out using Fast Start™ DNA
Master hybridization probes (Roche Molecular Biochemicals).
Extracted DNA (5 µl) was added to the PCR mixture containing
2 mM MgCl2, 0.833 µM of each primer, and 0.100 µM of probe. The
conditions were initial denaturation for 1 cycle of 2 min at 50 °C,
followed by 2 min at 95 °C. This was followed by 45 cycles of 20 s at
95 °C, and 60 s at 58 °C.
The reaction, data acquisition, and analyses were all done using a
LightCycler™ instrument. The Light Cycler™ software generated a
best-fit line that defined the crossing line. The point of intersection
between the emitted fluorescence and the crossing line defined the
crossing point. The presence of target DNA was determined by plotting
the crossing point of each sample. The threshold of detection was 20
copies per reaction, but was set to 500 copies/mL whole blood for the
purpose of this study. Contamination of the PCR was checked by
including a negative sample and a sample with distilled water in each
run.
2.3. Measurement of leflunomide trough levels
After oral administration, leflunomide (Arava®) is rapidly and
completely converted to its active metabolite A77126 (HMR1726 or
Teriflunomide). For that reason, leflunomide plasma concentrations
are undetectable. Therefore, therapeutic drug monitoring should focus
on the metabolite. A77126 concentrations are determined using
validated HPLC with UV detection (23). A77126 was provided by
Sanofi-Aventis (Germany). The internal standard was warfarin. The
equipment was a Thermo Electron apparatus consisting of a P4000
gradient pump, a SCM1000 degassing system, an AS3000 autosampler
with a column heater, and an UV6000 photodiode array detector.
Chromatographic separation was performed on a Bischoff C18
column (ULTRASEP ES 100 RP 18–6.0 µm, 125 × 4.0 mm).The mobile
phase consisted of phosphate buffer (pH 3.8) and acetonitrile. A
linear gradient was used to achieve component elution. Initial conditions were 25% acetonitrile and 75% buffer delivered at a flow rate of
Please cite this article as: Canivet C, et al, Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of leflunomide on
T-cell functions and disease outcome, Int Immunopharmacol (2009), doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
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1 mL/min. Then, the proportion of acetonitrile was increased to 70% in
15 min. UV detection was set at 292 nm. The column temperature was
maintained at 30 °C. Calibration standards and quality controls were
separately prepared by spiking drug-free human plasma with appropriate dilutions of working standard solutions and were further
processed as patient samples. Samples were prepared by adding
0.5 mL sodium acetate buffer (0.1 M, pH 5), 100 µL internal standard
stock solution (50 mg/L), and 10 mL ethyl acetate to 0.25 mL plasma. The
tubes were capped, shaken for 15 min, and centrifuged at 2500 rpm for
10 min. The organic layer was evaporated under nitrogen stream.
Prior to analysis, the residue was dissolved in a solution consisting
of acetonitrile and phosphate buffer. The injection volume was 25 µL.
Concentrations were calculated from a calibration curve (eight
standards). A linear regression with a weighting factor was used to
plot the peak area ratio (compound to internal standard) versus the
corresponding analyte concentration.
The method was validated according to principal guidelines in the
matter [19]. The specificity was examined by analyzing six plasma
samples from different persons who did not take any medication.
Chromatograms displayed no interference of endogenous substances.
The peaks were well resolved and the respective retention times were
5.4 (A77126) and 10.1 (internal standard) minutes. Linearity was
demonstrated for concentrations ranging from 0.05 to 100 mg/L. The
limit of quantification was established at 0.05 mg/L. The intra- and
inter-day variability were evaluated by multiple analysis of six quality
controls at each concentration (0.15, 7.5, and 75 mg/L) on the same
day (repeatability) and of two controls for each concentration on 5
consecutive days (reproducibility). The validation criteria were
calculated using commonly accepted statistical procedures. The
precision and accuracy of each quality control value did not exceed
15% deviation. Thus, the method fulfilled the principal criteria set in
the validation recommendations. The described HPLC method is
suitable for the determination of the plasma active leflunomide
metabolite with the precision and accuracy for concentrations ranging
from 0.05 to 100 mg/L.
2.3.1. Assessment of T-cell functions using a flow-cytometry whole-blood
assay
Blood samples were collected at 8 a.m.: all patients had fasted
overnight, and had not taken immunosuppressants for at least 12 h.
T-cell functions were assessed by calculating the percentage of
proliferative T-cells and the percentage of T-cells expressing intracytoplasmic IL-2, and TNF-α, as well as transferin receptor (CD71) and IL-2
receptor α-chain (CD25). A validated flow-cytometry whole-blood
assay was performed as previously described [20]. Briefly, for the
measurement of intracytoplasmic cytokine expression, 96 µl of
undiluted whole blood was stimulated with phorbol myristate acetate
(PMA) (15 ng/mL) and ionomycin (0.75 µg/mL) for 30 min. Cytokine
secretion was blocked by adding brefeldin (1 µg/mL). After 4 h of
incubation at 37 °C, intracytoplasmic cytokine expression was analyzed
by a three-color FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson) after
the blood had been labeled with monoclonal antibodies: anti-CD3PerCP (0.5 µg/mL), anti-IL-2 PE (2 µl, 100 test/2 ml), and anti-TNF-α
FITC (0.5 mg/mL) (Becton Dickinson, Cat. no. 345766 for anti-CD3,
559334 for anti-IL-2, and 554512 for anti-TNF-α). Three thousand CD3
positive cells from each sample were analyzed.
For T-cell activation and T-cell proliferation, diluted whole blood
(1:10; 200 µL of whole blood) was stimulated with concavalin A
(Sigma) for 3 days. Thereafter, antigen surface markers were stained
using labeled anti-CD3-PerCP (12.5 µg/mL), CD25-FITC (2 µl, 100 test/
2 mL), and CD71-PE (2 µl, 100 test/2 mL) monoclonal antibodies
(Becton Dickinson, Cat. no. 345766 for anti-CD3, 555431 for anti-CD25,
and 554512 for anti-CD71), and were analyzed by flow cytometry.
Lymphocyte proliferation was measured by bivariate-flow cytometric
analysis using directly labeled FITC monoclonal antibodies against
proliferating nuclear cell antigens (PCNA, 2.5 µL, 100 test/2 mL) and
3
propidium iodide (1 mg/mL) to determine the DNA content. For each
blood sample, one stimulated and one unstimulated sample were
analyzed. In addition, each time the assay was performed, one stimulated
and one unstimulated sample from a healthy volunteer served as an
external control. Three thousand CD3 positive cells from each sample
were analyzed.
2.3.2. Statistical analyses
Results are presented as mean ± standard deviation, or median
(ranges) where appropriate. Biomarker expression was determined
using CellQuest software (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)
and expressed as a percentage of the positive total cell count.
Comparisons of qualitative variables were done by the chi-squared
test; comparisons of quantitative variables were done by the nonparametric Friedman test for serial measurements and the Wilcoxon
tests, when appropriate. The Spearman test was used to search for a
correlation between two quantitative variables. A p-value b 0.05 was
considered statistically significant.
3. Results
3.1. Immunosuppressive drug trough levels and doses during the study
(Table 2)
At PVAN diagnosis, MMF, which was given at the median dose of 1
(1–2) g/day, was replaced by leflunomide as described above. The
median daily dose of leflunomide was 40 (30–100) mg at 1 month, and
40 (20–60) mg/day at last follow-up, i.e., 6 (4–30) months after PVAN
diagnosis. The leflunomide trough level was 70 ± 39 mg/l at 1 month,
and 80 ± 38 mg/l at last follow-up (not significant). For the ten patients
treated by tacrolimus (Tac), Tac trough level was 7.68 ± 1.7 ng/ml at
PVAN diagnosis, 6.34 ± 2.3 ng/ml at one month post MMF-leflunomide
conversion (p = 0.08), and 5.5 ± 2.3 ng/mL at last follow-up (p = 0.1
compared to baseline, and p = 0.8 compared to the value at 1 month
post-PVAN diagnosis). For the patient who was receiving cyclosporine A,
C2 levels remained unchanged before and after PVAN diagnosis, i.e.,
between 400 and 600 ng/mL. Finally, for the last patient, belatacept
infusions were continued monthly at the same dose. Five patients
received three steroid pulses (10 mg/kg) each because of concurrent
diagnosis of cellular acute rejection, and thereafter steroid doses were
tapered rapidly to 5 mg/day at day 15. In all other patients, steroid
medication remained unchanged at 5 mg/day.
3.2. Effect of leflunomide on T-cell functions and lymphocyte subsets
Intra-lymphocyte TNF-α tended to be higher one month after the
start of leflunomide therapy (23.4 ± 17.6%) compared to MMF therapy
(i.e., MMF therapy was 17.2 ± 14.6%, p = 0.08). Intra-lymphocytes IL-2
expression was similar before and after leflunomide therapy, i.e., 18.3 ±
Table 2
Immunosuppressive drugs doses and levels.
Leflunomide dose
(mg/day)
Leflunomide trough
level (mg/l)
Tacrolimus trough
level (ng/ml)a
Before the
switch
from MMF to
leflunomide
1 month after
the switch
from MMF to
leflunomide
Last follow-up
[6 months
(4–30)]
P-value
(before vs.
last follow-up)
–
40 (30–100)
40 (20–60)
ns
–
70 ± 39
80 ± 38
ns
7.68 ± 1.7
6.34 ± 2.3
5.5 ± 2.3
ns
Abbreviations: MMF, mycophenolate mofetil; ns, not significant.
a
No significant difference in tacrolimus trough levels between “before the switch”,
1 month after the switch, and last follow-up.
Please cite this article as: Canivet C, et al, Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of leflunomide on
T-cell functions and disease outcome, Int Immunopharmacol (2009), doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
ARTICLE IN PRESS
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C. Canivet et al. / International Immunopharmacology xxx (2009) xxx–xxx
Fig. 1. Outcome of T-cell function biomarkers before and after conversion from
mycophenolate mofetil (MMF) to leflunomide. Abbreviation: ns, not significant.
21.7% vs. 20.7 ± 16.6% (p = not significant). T-cell activation markers, i.e.,
CD25 and CD71, were similar after MMF and leflunomide treatments,
respectively, at 32 ± 17.1% vs. 37.1 ± 21.1% for CD25 (p = not significant),
and 21.9 ± 14.7% vs. 24.7 ± 15% for CD71 (p = not significant). Finally,
T-cell proliferation tended to be higher with leflunomide treatment
compared to MMF therapy (8.4 ± 7.7% vs. 12.4 ± 10%, p = 0.2). However,
the difference was not statistically significant. (Fig. 1) There was no
correlation between leflunomide or tacrolimus trough levels and any of
these biomarkers. Similarly, no correlation was found between leflunomide dose and any of the biomarkers (data not shown). C-reactive
protein levels were similar before and after conversion, i.e., 5.2 ± 3.5 mg/
L vs. 6.5 ± 3.6 mg/L (p = not significant, normal value b 10 mg/L).
The number of total lymphocytes, CD2-positive cells, CD3-positive
T-cells, CD4-positive T-cells, CD8-positive T-cells counts, as well as the
CD4/CD8 ratio, did not differ significantly between the values before
and at one month after the switch from MMF to leflunomide (Fig. 2).
3.3. Outcome of BKV infection
Initial BKV DNAemia was 4.5 (3–8.3) log copies/mL. Clearance of
BKV DNAemia was observed in five cases (41.6%) within 6 (4–30)
months of initiating leflunomide therapy (Fig. 3). BKV clearance
occurred at 1 month in two patients and at 3 months for three other
patients. For the seven remaining patients, overall BKV DNAemia
remained unchanged, 4.5 (3.4–5) log copies/mL at baseline vs. 3.3
(3.1–5.91) log copies/mL at last follow-up (p = 0.24). However, BKV
DNAemia decreased in four patients, increased in two other patients,
and remained stable in the last patient. The latter patient had been
treated for acute humoral rejection prior to PVAN, and his renal
function declined rapidly leading to graft loss at 2 months after PVAN
Fig. 2. Outcome of lymphocyte subset counts before and after conversion from
mycophenolate mofetil (MMF) to leflunomide. Abbreviation: ns, not significant.
Fig. 3. Outcome of BKV DNAemia after conversion from mycophenolate mofetil (MMF)
to leflunomide.
diagnosis. BKV DNAemia, T-cell function biomarkers, total lymphocyte
and lymphocyte subset counts at diagnosis and at one month later, as
well as leflunomide dose and trough levels at one month postconversion did not differ significantly between patients who were
cleared of the virus and those who were not (data not shown).
3.4. Evolution of renal allograft function
At the time of PVAN diagnosis, the median serum creatinine level
was 162.5 µmol/L (93–199), with a median estimated glomerular
filtration rate (eGFR, according to the Cockcroft and Gault equation) of
40.2 mL/mn (25.3–94.6) (Table 3). Allograft function had significantly
declined compared to 3 months earlier, when a median creatinine
level of 119.5 µmol/l (85–185) (p = 0.003) and a median eGFR of
44 mL/mn (30–103) (p = 0.005) had been determined. At last followup, i.e., 6 months (4–30), median serum creatinine was 197 (80–237)
vs. 162.5 (93–199) µmol/l at PVAN diagnosis (p = 0.06), and eGFR was
34.5 (18–112) vs. 40.2 (25.3–94.6) mL/mn, p = 0.2). Creatinine
clearance had stabilized in six patients (50%, 34.6 ± 5 mL/min at
baseline vs. 34.2 ± 5.1 mL/min at last follow-up), had deteriorated in
four patients (33.4%, 44.7 ± 13.8 mL/min at baseline vs. 30.4 ±
12.2 mL/min at last follow-up), and improved in one patient from
94.3 to 112.8 mL/min. Finally, one patient developed end-stage kidney
disease because of concomitant acute humoral rejection and PVAN.
3.5. Adverse events
3.5.1. Hematological
During leflunomide therapy, platelet counts decreased from
257.000 ± 86.000/mm3 at baseline to 205.000 ± 57.000/mm3 at last
follow-up (p = 0.02). However, no bleeding events occurred during
the study period. Hemoglobin level did not change significantly
during follow-up, i.e., 12.9 g/dL (9.2–15.1) at baseline vs. 12.6 g/dL
(10–14.4) at last follow-up (p = not significant). Three patients were
receiving erythropoietin therapy for PVAN. Only one additional
patient required erythropoietin therapy during follow-up.
3.5.2. Allograft
In addition to the two patients who developed acute humoral
rejection before PVAN diagnosis, and the patient who was grafted
with a DSA, only one patient who was cleared of BKV developed a DSA
29 months after leflunomide treatment was started. This was not
associated with increased serum creatinine. A kidney biopsy was
performed and no features of acute rejection were found (t0 i0 g0 v0
ah0 ci0 cg0 ct0 cv0 mm0 with negative C4d and SV40 stainings); at
this point, leflunomide was discontinued and replaced by MMF. One
month later, BKV DNAemia was still negative. No acute rejection
occurred during the follow-up.
Please cite this article as: Canivet C, et al, Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of leflunomide on
T-cell functions and disease outcome, Int Immunopharmacol (2009), doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
ARTICLE IN PRESS
C. Canivet et al. / International Immunopharmacology xxx (2009) xxx–xxx
5
Table 3
Outcome of renal function.
Serum creatinine level (µmol/L)
Creatinine Clearance (mL/min)
3 months before
PVAN diagnosis
PVAN diagnosis
Last follow-up
[6 months (4–30)]
P-value (before
PVAN vs. at diagnosis)
P-value (PVAN diagnosis
vs. last follow-up)
119.5 (85–185)
44 (30–103)
162.5 (93–199)
40.2 (25.3–94.6)
197 (80–237)
34.5 (18–112)
0.003
0.005
0.06
0.2
Abbreviations: PVAN, polyoma-associated nephropathy.
3.5.3. Liver function
No significant elevation of liver enzymes was observed during the
follow-up.
4. Discussion
Polyomavirus BKV-associated nephropathy has emerged within
the last few years as an important complication after kidney
transplantation [4–7]. The main risk factor for PVAN is overimmunosuppression [21]. To date, there are still no randomized
prospective studies evaluating therapeutic strategies in kidneytransplant patients with PVAN. Relying on pilot studies that include a
small numbers of patients, reducing immunosuppressive therapy was
and is still recommended as a first-line strategy for treating PVAN [8].
However, an important reduction in immunosuppressive therapy may
increase the risk of acute rejection. In the absence of a virological
response to the reduction in immunosuppressive-drug dose, alternative strategies should be considered. Several studies report encouraging results using leflunomide [17,18,22] or cidofovir [17,23–25]. The
use of quinolone antibiotics and intravenous immunoglobulin (IVIg)
have been used with anecdotal success [26,27]. Because of its wellknown nephrotoxicity [28], and despite encouraging results using low
doses of cidofovir [25], nephrologists are still reluctant to use cidofovir
in kidney-transplant patients with PVAN-induced impaired renal
function. In contrast, because of its combined immunosuppressive and
anti-viral effects, the use of leflunomide seems to be more attractive in
this setting. In published studies where leflunomide has replaced MMF
in the immunosuppressive regimen, it is unknown whether the
beneficial effect of leflunomide is related to a lower immunosuppressive effect as compared to MMF, or to its antiviral effect. Hence, the
objective of the present study was to assess T-cell function at one
month after replacing MMF with leflunomide.
MMF inhibits the de novo pathway of purine synthesis, which is
mandatory for the proliferation and function of T and B lymphocytes.
Previous experiments had shown, in in vitro [20,29] and in vivo in nonhuman animal models, that MMF [30,31] as well as its active metabolite
[29], i.e. mycophenolic acid (MPA), has a high potency to inhibit T-cell
proliferation as well as lymphocyte surface-antigen expression. MPA
dose-dependent inhibition of CD25 has been demonstrated [29,30,32].
In a rat heart-transplant model, both MPA [32] and MMF [30,31]
therapies suppressed T-cell proliferation and T-cell-activation markers
(CD25 and CD134). In patients, it has been also recently shown that MPA
does not only inhibit IMPDH activity, but also influences T-cell
proliferation and activation [33,34]. Leflunomide inhibits lymphocyte
proliferation by inhibiting pyrimidine synthesis [10,35]. Using a wholeblood flow-cytometry assay, Birsan et al. showed that FK778, the active
metabolite of leflunomide, inhibits lymphocyte proliferation and the
expression of various T-cell activation surface antigens (CD25, CD11a,
CD95, and CD154) in mitogen-stimulated whole blood from cynomolgus
monkeys and humans [36,37]. In contrast, FK 778 did not affect
intracellular T cell production of IFN-γ or TNF-α, but inhibited
production of IL-2 at high concentrations, i.e. N150 µmol/L [37]. In the
present study, we also used a whole-blood flow-cytometry assay that we
had previously adapted to humans [20]. We found that, despite a slight
decrease in tacrolimus trough level, no significant difference was
observed in T-cell activation marker (CD25 and CD71) expression, in
T-cell proliferation, and in intra-lymphocyte IL-2 expression before and
after the conversion from MMF to leflunomide. In contrast, there was a
trend towards an increase in intra-lymphocyte TNF-α expression after
the switch. This is probably related to the lower exposure of tacrolimus,
which is well known to inhibit cytokine production [38]. The
immunosuppressive effect of leflunomide is probably due to depletion
of pyrimidine nucleotides. Indeed, it has been previously shown that the
addition of uridine to rat blood at the same time as malononitrilamides
antagonizes the inhibitory effects of the drugs on lymphocyte proliferation and CD25 expression [39]. The persisting immunosuppression
observed in our patients in whom MMF was replaced by leflunomide is
in line with previous reports that found FK 778 to be efficient in
preventing acute rejection after solid-organ transplantation [12,13].
In the present study, five patients were cleared of the virus, and BKV
DNAemia was decreased in four patients. We assessed T-cell function
after one month of conversion from MMF to leflunomide, when
leflunomide was at a steady state. However, because tacrolimus and
leflunomide trough levels, cyclosporin A C2 levels (in one patient),
belatacept dose (one patient) and steroid doses remained unchanged as
compared to 1 month post-conversion, we can speculate that T-cell
function did not change significantly during the follow-up. Consequently, our observation suggests that the putative beneficial effect of
leflunomide for treating PVAN seems to be more related to its anti-viral
effect rather than to its less important immunosuppressive effect when
compared to MMF.
The anti-viral activity of leflunomide against BKV is still unknown.
A77 1726, the active form of leflunomide, has been previously shown to
exert an antiviral effect against human cytomegalovirus (HCMV) and
herpes simplex 1 in vitro [15,40]. Waldamn et al. reported that A 77
1726 does not inhibit viral DNA synthesis but, rather, disrupts virion
assembly at the level of nucleocapsid tegumentation [15]. More
recently, Evers et al. found that the treatment of HCMV-infected cells
with FK778 prevented the appearance of HCMV proteins at 12–24 h
post-infection, and inhibited viral DNA synthesis [41]. Leflunomide
also reduced HCMV DNA levels [41]. The authors suggest that DHODH
may be an effective cellular antiviral target [41]. Hence, the mechanism
of anti-viral of leflunomide remains controversial. Likewise, cidofovir
is believed to exert its anti-CMV effect by inhibiting viral DNA
polymerase [42]. The common denominator of leflunomide and
cidofovir with respect to their anti-BKV effect is their effect on viral
DNA synthesis. Further virological studies are required to discover the
anti-viral mechanism of leflunomide.
The main limitations of this study are the small number of patients
enrolled, the lack of assessment of T-cell function beyond one month
after conversion from MMF to leflunomide, and the lack of a control
group.
In conclusion, the results of this pilot study suggest that the potential
beneficial effect of leflunomide for treating PVAN in kidney-transplant
patients is not related to reduced immunosuppression induced by the
conversion from MMF to leflunomide. Further virological studies are
required to determine the anti-BKV effect of leflunomide.
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Please cite this article as: Canivet C, et al, Polyoma BK virus-associated nephropathy in kidney-transplant patients: Effects of leflunomide on
T-cell functions and disease outcome, Int Immunopharmacol (2009), doi:10.1016/j.intimp.2009.05.004
La néphropathie à virus BK est apparue depuis ces dernières années comme une importante
complication après transplantation rénale (201). Le risque principal d’une néphropathie à
virus BK est une sur-immunosuppression (207). Si on se réfère aux études pilotes, une
diminution de l’immunosuppression est recommandée (202). Mais cette stratégie augmente le
risque de rejet aigu. Des études ont également montré des résultats encourageant avec le
léflunomide ou le cidofovir comme antiviraux contre le virus BK (40). Le léflunomide, grâce
à ses effets combinés d’immunosuppresseur et d’antiviral, pourrait être un bon compromis.
Dans les études publiées où le léflunomide remplace le MMF dans le traitement
immunosuppresseur, on ne sait pas si l’effet bénéfique du léflunomide est lié à un effet
immunosuppresseur plus faible que le MMF ou à un effet antiviral. C’est pourquoi, l’objectif
de cette étude était de mesurer la fonction des lymphocytes T un mois après le remplacement
du MMF par le léflunomide.
Il a déjà été montré la capacité du MMF et de son métabolite actif, le MPA, à inhiber
la prolifération des lymphocytes T ainsi que l’expression de leurs marqueurs d’activation
(161). Des observations similaires ont été constatées avec le métabolite actif du léflunomide,
le FK778 (208). Dans cette étude, nous avons observé que, malgré une faible diminution du
taux résiduel du tacrolimus, il n’y a pas de différence significative dans les lymphocytes T de
l’expression des marqueurs d’activation (CD25 et CD71), de la prolifération et de
l’expression intra-lymphocytaire de l’IL-2 avant et après la conversion du MMF pour le
léflunomide. En revanche, il y a une tendance à l’augmentation de l’expression intralymphocytaire du TNF-α après la conversion. Cela est très certainement dû à la plus faible
exposition du tacrolimus observée. En effet, le tacrolimus est bien connu pour inhiber la
production des cytokines. L’effet immunosuppresseur du léflunomide est probablement dû à
la déplétion en nucléotides de la pyrimidine.
Dans cette étude, 5 patients sur 12 ont négativé leur virémie, et la virémie du BK virus
a été diminuée chez 4 patients. La fonction des lymphocytes T a été mesurée un mois après la
conversion du MMF par le léflunomide, quand le léflunomide était stable. Parce que les taux
résiduels du léflunomide, du tacrolimus, le taux du C2 de la ciclosporine, et la dose du
belatacept et des corticoïdes sont restés inchangés au cours de l’étude, nous pouvons spéculer
que la fonction des lymphocytes T est restée inchangée au cours du suivi. Nos observations
suggèrent que l’effet bénéfique du léflunomide pour traiter la néphropathie à virus BK semble
être plutôt lié à son effet antiviral qu’à un effet immunosuppresseur moins important comparé
au MMF. L’activité antivirale du léflunomide contre le virus BK reste encore inconnue.
81
5. Article n°4 : Etude pharmacodynamique du changement d’un
traitement à base de mycophénolate mofétil en mycophénolate sodique chez des
patients transplantés rénaux stables.
L’acide mycophénolique (MPA) est un puissant immunosuppresseur qui agit de façon
sélective sur l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T et B en inhibant la synthèse
d’ADN (209), (210).
Le MPA est commercialisé sous forme d’ester, le mycophénolate mofétil (MMF), qui est
relativement bien toléré chez la plupart des patients. Ses effets secondaires les plus décrits
sont la leucopénie et les problèmes gastro-intestinaux qui sont associés chez certains patients
à des diarrhées sévères et à une nécessité de réduction de la dose, et ainsi peut compromettre
la fonction rénale à long terme en favorisant les épisodes de rejet aigu (211), (212).
Afin de réduire les effets gastro-intestinaux du MMF, une nouvelle formulation du MPA a été
développée. La nouvelle formulation est une forme sodique, le mycophénolate sodique
(MPS), qui libère le MPA au niveau de l’intestin. Le MPS est bien toléré chez les patients
transplantés rénaux avec un faible taux de réduction de la dose ou d’interruptions du
traitement (213).
Des études pharmacocinétiques chez les patients transplantés rénaux ont montré une
équivalence de dose entre les deux molécules, 1g de MMF est équivalent à 720mg de MPS
(214). En revanche, il a été montré une grande variabilité interindividuelle du tmax du MPA
pour le MPS (151).
Le but de cette étude est de comparer les effets pharmacodynamiques de ces deux
formulations de MPA après une conversion du MMF au MPS chez des patients transplantés
rénaux stables.
Les résultats de cette étude ont été publiés : Böhler T., Canivet C., et al. Pharmacodynamic
monitoring of the conversion from mycophenolate mofetil to enteric-coated mycophenolate
sodium in stable kidney-allograft recipients, International Immunopharmacology 2008 8 :
769-773
82
International Immunopharmacology (2008) 8, 769–773
w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / i n t i m p
PRELIMINARY REPORT
Pharmacodynamic monitoring of the conversion from
mycophenolate mofetil to enteric-coated mycophenolate
sodium in stable kidney-allograft recipients
Torsten Böhler a,⁎, Cindy Canivet a , Sylvain Galvani a , Nicole Therville a ,
Robert Salvayre a , Anne Negre-Salvayre a , Dominique Durand b ,
Mogens Thomsen a , Lionel Rostaing b , Nassim Kamar a,b
a
INSERM U858, Equipe 10, IFR 31, Institut Louis Bugnard, Bâtiment L3, CHU Rangueil, France
Department of Nephrology and Multiorgan Transplantation, CHU Rangueil, Toulouse, France, 1 Avenue J Poulhès,
31059 Toulouse Cedex 9, France
b
Received 4 December 2007; received in revised form 28 January 2008; accepted 28 January 2008
KEYWORDS
Therapeutic drug
monitoring;
Pharmacodynamics;
Mycophenolic acid;
Mycophenolate mofetil;
Enteric-coated
mycophenolate sodium;
Kidney transplantation
Abstract
Background: The formulations of mycophenolic acid, i.e., mycophenolate mofetil (MMF) and
enteric-coated mycophenolate sodium (EC-MPS), seem to have different pharmacokinetic
profiles. The aim of this study was to compare the effects MMF and EC-MPS on T-cell
proliferation, T-cell activation, T-cell function, and lymphocyte subsets.
Clinical study and methods: Ten stable kidney-transplant patients on standard maintenance
therapy of tacrolimus and MMF (1 g/d), with or without steroids, were converted from MMF to EC-MPS
at equivalent dose (720 mg/d). Tacrolimus and steroid doses remained unchanged before, and at 1,
2, 3, and 6 months (M) after conversion. Intra T-lymphocyte cytokines IL-2 and TNF-α, lymphocyteactivation surface markers (CD25 and CD71), T-cell proliferation (PCNA+ PIhigh), total lymphocyte
count, as well as lymphocytes subsets (CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, NK cells) were measured by flow
cytometry before conversion and at M1, M2, M3, and M6.
Results: We found no significant differences of MMF versus EC-MPS on lymphocyte function. T-cell
proliferation and T-cell activation (CD25 and CD71 expression), but not cytokine expression (TNF-α
and IL-2), showed a trend to increase after conversion from MMF to EC-MPS. Total lymphocyte, CD2,
CD3, CD4, CD8, and NK cells counts were not significantly modified.
Conclusion: This study revealed a trend to a lower immunosuppression with EC-MPS as compared
to MMF in stable renal transplant patients.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
⁎ Corresponding author. INSERM U858, Equipe 10, Institut Louis Bugnard, CHU Rangueil, 1 Avenue J Poulhès, 31059 Toulouse Cedex 9, France.
E-mail address: [email protected] (T. Böhler).
1567-5769/$ - see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.intimp.2008.01.023
770
1. Introduction
The discovery of the immunosuppressive potency of mycophenolic acid (MPA) [1] has led to more specific immunosuppressive regimens to prevent allograft rejection [2].
Mycophenolate mofetil (MMF, Cellcept ® Hoffmann-la
Roche, Basel Switzerland), the 2-morpholinoethyl ester
pro-drug of MPA, is an improved prophylaxis for decreased
rejection and results in a better safety profile of the purine
synthesis inhibitor azathioprin (Aza) [3]. MPA, the active
metabolite of MMF, is a non-competitive, reversible inhibitor
of inosine mono-phosphate de-hydrogenase (IMPDH) [4], a
key enzyme in the de-novo-synthesis pathway of nucleotide
guanine triphosphate (GTP) [4]. Hence, MPA prevents lymphocyte proliferation via inhibition of DNA synthesis. It has
been shown that MPA exerts its immunosuppressive effects
by the selective inhibition of T- and B-cell proliferation [5],
which are specifically sensitive to MPA as they lack the
salvage pathway for DNA synthesis [4].
MMF is rapidly and completely hydrolyzed to MPA, and
MPA maximum concentration (Cmax) is achieved within
1 hour [6]. Mycophenolic acid is subsequently glucuronidated in the liver to mycophenolic acid glucuronide (MPAG),
is then excreted in the bile and then reabsorbed from the
gastrointestinal tract. This entero-hepatic cycle creates a
secondary peak after 6–12 hours in the plasma concentration–time profile [7]. It is well documented that combinatory treatment with cyclosporin A (CsA), but not tacrolimus,
decreases exposure to MPA, which requires dose adjustments. This phenomenon is explained by CsA-mediated
inhibition of the biliary excretion of MPAG by the Mrp-2
transporter [8,9]. MMF is well tolerated in most patients.
Described side effects are leucopenia and gastrointestinal
(GI) problems, which are associated in some patients with
severe diarrhea that then requires a dose reduction [10],
and thus may compromise renal function [11]. During the
first year post-transplantation, using a questionnaire based
evaluation, we had previously reported and found that GI
disorders occur in 33.3% of patients receiving MMF. Of these,
4.7% required dose reduction and 2.8% a MMF discontinuation [12]. Pharmacokinetic (PK) drug monitoring of MPA is
recommended to achieve optimized therapy in individual
patients [13].
In an attempt to reduce the GI-side effects of the drug MMF,
a new formulation of MPA, was synthesized. The new formulation, enteric-coated mycophenolate sodium (EC-MPS),
retards metabolic and absorption profile of MPA compared to
MMF. Therefore, after EC-MPS (Myfortic®, Novartis Pharma,
Basel, Switzerland) intake, the active metabolite MPA is
liberated in the small intestine and so prevents GI side effects.
It has been shown that EC-MPS is well tolerated in kidneytransplant patients with low rates of dose reductions or interruptions. Gastrointestinal adverse events have been responsible for dose reduction or interruption in only 5% of patients
[14].
PK studies in kidney-allograft patients have revealed that
a 720-mg EC-MPS/day dose is equivalent to 1 g MMF/day [15].
Further, it has been found that inter-patient variability of
MPA tmax was dramatically increased for EC-MPS [16]. Initial
pharmacodynamic (PD) studies of IMPDH activity suggest no
significant differences between MMF and EC-MPS in stable
kidney-allograft patients [16].
T. Böhler et al.
Recently, we have validated PD biomarkers of T-cell function for PD monitoring of immunosuppressive drugs [17]. The
aim in this present study was to compare the PD effects
of the two formulations of MPA after conversion of stable
kidney-transplant patients from MMF to EC-MPS.
2. Study design and methods
2.1. Clinical study design
In this single-arm, open-label single-center study we included 10
kidney-transplant patients with stable renal function as indicated by
a serum creatinine level of 145 ± 25 μmol/L, which did not change
significantly throughout the study period. Time after transplantation
at the beginning of the study was 41.9 ± 17.1 month. The patients'
characteristics are summarized in Table 1. All patients received a
standard triple therapy that consisted of tacrolimus (target trough
level: 8–12 ng/mL) and MMF (500 mg b.i.d), with or without steroids.
MMF was given at a lower dose than with cyclosporine A, e.g. 1 g b.i.d,
because of the higher MPA AUC observed in patients treated with
tacrolimus as compared to cyclosporine A [8,9,18].
After the first study visit (baseline) MMF (500 mg b.i.d) was
completely withdrawn and replaced with an equivalent concentration of EC-MPS (360 mg b.i.d). Tacrolimus trough level, C-reactive
protein and pharmacodynamic monitoring were evaluated before,
and at 1, 2, 3, and 6 months after conversion from MMF to EC-MPS.
Anti-HLA antibodies were assessed before and at the end of the
study. None of the patients presented with acute rejection during
this study period, and no specific anti-HLA antibody was detected.
2.2. Lymphocyte function assays
PD effects on lymphocyte function were assessed by percentage
expressions of T-cell proliferation, intracytoplasmic IL-2, and TNF-α
expression, as well as transferin receptor (CD71) and IL-2 receptor
(CD25) expression. These methods are described in detail elsewhere
[16]. Briefly, for the measurement of intracytoplasmic cytokine
expression, undiluted whole blood was stimulated by phorbol
myristate acetate (PMA) and ionomycin for 30 minutes. Cytokine
secretion was blocked by adding brefeldin. After 4 hours of incubation at 37 °C, intracytoplasmic cytokine expression was analyzed
by a three-color FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson)
after the blood had been labeled with monoclonal antibodies, i.e.,
anti-CD3-PerCP, anti-IL-2 PE, and anti-TNF-α FITC antibodies. For
T-cell activation and T-cell proliferation, diluted whole blood
(1:10) were stimulated with concavalin A (sigma) for 3 days.
Thereafter, antigen surface markers were stained using labeled
anti-CD3-PerCP, CD25-FITC, and CD71-PE monoclonal antibodies,
Table 1
Patient demographics and transplant characteristics
N
Age (years)
Sex
Weight (kg)
Time since transplant (month)
MMF dose at baseline (g/d)
EC-MPS dose (mg/d)
Corticosteroids
Yes
No
Serum Creatinine at baseline (μg/dL)
10
52 ± 7.2
Only males
77 ± 15.5
41.9 ± 17.1
1
720
8
2
145 ± 25
Pharmacodynamics of MMF and EC-MPS
771
and were analyzed by flow cytometry. Lymphocyte proliferation
was measured by bivariate flow cytometric analysis using directly
labeled FITC monoclonal antibodies against proliferating nuclear
cell antigen (PCNA) and propidium iodide labeled for DNA content.
For each blood sample, one stimulated sample and one unstimulated sample were analyzed. Three thousand CD3 positive cells of
each sample were analyzed with a flow cytometer. The data are
expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM).
2.3. Determination of lymphocyte subsets
Lymphocyte subsets were determined by routine clinical laboratory
standard flow cytometry and cell-counter techniques.
2.4. Statistical analyses
Variables were expressed as mean ± standard error of the mean, and
were compared by non-parametric Friedman and Wilcoxon tests, A
p-value below 0.05 was considered to be statistically significant.
Figure 2 T-cell activation (mean ± SEM) was determined in
concavalin A-stimulated whole-blood cultures as a percentage of
CD25+ or CD71+ T-cells (CD3+).
3.3. T-lymphocyte activation
3. Results
3.1. Concomitant immunosuppressive therapy
Tacrolimus doses were maintained unchanged during the study
period, and tacrolimus trough levels remained stable throughout
the monitoring period of 6 months, i.e., 8.8 ± 3.0 ng/mL at
baseline, 8.5 ± 2.5 ng/mL at 1 month, 8.7 ± 2.5 ng/mL at 2 months,
8.9 ± 2.0 ng/mL at 3 months, and 6.7 ± 1.5 ng/mL at 6 months
after conversion (p = ns).
In addition to tacrolimus and MMF, eight patients were
receiving steroids at the daily dose of 5 mg (n = 7) or 2.5 mg
(n = 1). Prednisone doses were not changed during the study
period.
3.2. T-cell proliferation
We determined pharmacodynamic parameters before and at 1, 2,
3, and 6 months after conversion from MMF (1 g/d) to EC-MPS
(720 mg/d). We found a trend towards increased T-lymphocyte
(PCNA+/PIhigh) proliferation after conversion from MMF to EC-MPS.
Proliferation of T-lymphocytes increased but did not reach a
statistical significance (4.0 ± 1.6%) from the baseline (6.9± 5.0%)
after 1 month. It then increased to 10.5 ± 9.7% after 2 months and
remained at this level until month 6 after conversion (Fig. 1).
Figure 1 T-cell proliferation (mean ± SEM) was determined in
concavalin A-stimulated whole-blood cultures as a percentage of
PCNA+/PIhigh lymphocytes.
We investigated the effect of MMF and EC-MPS on T-cell
activation by the expression of CD25 and CD71 on CD3+ T-cells.
We found that after conversion from MMF to EC-MPS expression
levels of CD71 were not significantly increased: 13.1 ± 7.3% at
baseline to 22.7 ± 2.9% after 1 month, 26.2 ± 11.2% after
2 months, 25.8 ± 7.1% after 3 months, and 28.8 ± 7.4% after
6 months. Similarly, CD25 expression did not increase significantly: 24.9 ± 7.9% at baseline, 35.0 ± 7.5% after 1 month, 36.2 ±
15.1% after 2 months, 39 ± 11.1% after 3 months, and 36.4 ± 14.6%
after 6 months (Fig. 2). In summary, T-cell activation showed a
trend to increase after conversion from MMF to EC-MPS.
3.4. Cytokine expression in T-lymphocytes
We determined the effect of the conversion from MMF to EC-MPS
on IL-2 and TNF-α expression in CD3+ T-cells. IL-2 expression
exerted no significant changes during the observation period: IL-2
expression was 9.7 ± 4.9% at baseline, 16.4± 11.6% after 1 month,
12.4± 4.1% after 2 months, 20.7± 9.9% after 3 months, and 14.6 ±
11.9% after 6 months. Similarly, TNF-α expression did not change
significantly: TNF-α expression was 13.7 ± 8.1% at baseline,
15.09.5% after 1 month, 17.3± 7.5% after 2 months, 27.0± 15.3%
after 3 months, and 14.2± 9.9% after 6 months (Fig. 3). No trend
Figure 3 IL-2 and TNF-α expression (mean ± SEM) in T-cells
were determined in MPA/Ionomycin-stimulated whole-blood
cultures as a percentage of IL-2+ and TNF-α + T-cells (CD3+).
772
Table 2
Baseline
Month 1
Month 2
Month 3
Month 6
T. Böhler et al.
Lymphocyte subpopulations
Lymphocytes (/mm3)
CD2 (/mm3)
CD3 (/mm3)
CD4 (/mm3)
CD8 (/mm3)
CD19 (/mm3)
NK (/mm3)
1616.7 ± 399,6
1721.4 ± 403.6
1794.2 ± 464.9
1695.3 ± 316.6
1703.0 ± 436.7
1430.0 ± 429.3
1514.0 ± 419.4
1572.4 ± 436.0
1496.5 ± 340.5
1567.4 ± 426.1
1291.5 ± 493.2
1309.3 ± 427.4
1449.4 ± 460.4
1387.5 ± 391.7
1372.8 ± 476.7
720.8 ± 205.9
803.2 ± 254.2
860.2 ± 275.8
803.5 ± 192.4
796.9 ± 218.1
651.7 ± 331.7
655.5 ± 292.3
659.7 ± 290.1
636.9 ± 277.9
728.3 ± 314.8
124.9 ± 35.3
140.7 ± 65.8
165.3 ± 62.3
148.5 ± 52.8
151.1 ± 54.4
126.2 ± 102.3
116.7 ± 91.3
118.4 ± 104.4
107.8 ± 67.8
96.7 ± 87.6
towards an increase or decrease of cytokine expression was
observed.
3.5. Lymphocyte subpopulations
We investigated the effect of the switch from MMF to EC-MPS on
lymphocyte subpopulations. We found no significant changes in
total lymphocyte counts, CD2+ T-/NK-cell counts, CD3+ T-cell
counts, CD4+ T-helper cell counts, CD8+ cytotoxic T-cell counts,
and CD19+ B-cell counts (Table 2).
4. Discussion
This is the first report to investigate the pharmacodynamic
(PD) effects of lymphocyte function during the conversion
from MMF to bioequivalent doses of EC-MPS in stable kidneytransplant patients. Maintenance therapy with tacrolimus
and steroids were not changed. We found that after the
switch to EC-MPS, a 2.6-fold trend towards lower inhibition
(ns) of T-cell proliferation. Further, the expression of the T-cell
activation marker CD71 was 1.7-fold (ns) less suppressed after
1 month on EC-MPS therapy compared to MMF therapy. Similarly T-cell activation marker CD25 expression was increased
up to 1.6-fold (ns) after the switch to EC-MPS treatment. In
contrast, cytokine expression remained nearly unchanged,
apart from a non-significant increase after 3 months, which
returned to baseline values after 6 months.
Patients enrolled in this study were more than one year
posttransplant when the risk of acute rejection was low.
Nevertheless, none of the patients presented with an acute
rejection. In addition, anti-HLA antibodies were assessed
before and 6 months after the study. No donor specific antiHLA antibody was detected. Similarly, no significant infection episode occurred within the study period. At each visit,
C-reactive protein was assessed and its level was always
within the normal range, i.e. b 5 mg/L).
MPA is known for its specific and strong inhibitory effects
on T-cell proliferation and T-cell activation, whereas T-celldependent cytokine expression is not affected. Taking this
“immunosuppressive signature” of MPA into account, we
suggest that our observed trend in the modulation of T-cell
function after a switch from MMF to EC-MPS may be due to
changes in MPA pharmacokinetics. It can be excluded that
the trend towards an increase of T-lymphocyte proliferation
and activation was due to PK interactions of EC-MPS on
tacrolimus drug exposure because we found no change in
tacrolimus trough levels.
Because leukopenia is a known side-effect of MPA we were
interested to compare the effect of MMF and EC-MPS on
lymphocyte subpopulation counts. We found no differences
in lymphocyte subpopulation counts after the switch from
MMF to EC-MPS.
It has been previously shown that the MPA area under the
concentration curve (AUC) was similar in MMF- and EC-MPStreated patients and that MPA tmax of EC-MPS exerts very high
inter-patient variability as compared to MMF [16]. The high
inter-patient PK variability of MPA tmax may also contribute to
the high standard deviation of PD biomarkers observed under
EC-MPS but not MMF therapy (Fig. 1). Infections were not
observed and C-reactive protein levels were not increased
excluding an influence on PD biomarker expression. Interestingly maximal MPA levels (Cmax) were lower and pre-dose MPA
(C0) was higher after conversion to EC-MPS [16]. This
phenomenon is due to the retarded absorption properties of
EC-MPS. As a consequence, PK monitoring using a one timepoint surrogate marker (for example MPA trough levels) cannot reliably estimate MPA drug exposure.
We have performed PD monitoring of lymphocyte functions
at pre-dose and during a follow-up of 6 months after conversion. In respect to the very high inter-patient variability of
tmax for MPA after EC-MPS treatment, one could speculate that
the trend towards lower inhibition of lymphocyte proliferation
and activation by EC-MPS could be caused by differences in PK.
In line with our observation, Budde et al. [16] did not find
significant differences in PD effects between MMF and EC-MPS
using IMPDH activity as the PD biomarker (under the time–
inhibition-effect curve and pre-dose values). Only the minimal
IMPDH activity was increased at 14 days (5.79 ± 3.99) and at
3 months (5.11 ± 3.41) after conversion to EC-MPS therapy
when compared to MMF (4.49 ± 2.17). Similarly Czock et al. [19]
found in patients with progressive IgA nephritis not significantly higher IMPDH activity with EC-MPS as compared to MMF.
It has been also previously demonstrated that inhibition of
IMPDH activity by a single dose MMF exerts a significant correlation with the PD biomarkers of T-cell proliferation and
activation [20].
In a rat-transplant model, Barten et al. [21] have demonstrated that inhibition of lymphocyte function, calculated as
an “under the time–inhibition-effect curve” (AUE0–24 h),
correlated highly with mycophenolate mofetil (MMF) dose,
MPA level, and with histological severities of graft rejection.
However, no data are available to determine if the minimal PD
effect reached within a dosing interval is critical for drug
efficacy.
The main limitations of this study are the small number of
patients included (n = 10) and the absence of pharmacokinetic monitoring of MPA. In conclusion, our pilot study revealed a trend to a lower immunosuppression with EC-MPS as
compared to MMF. Further studies including a higher number
of patients are required to prove PD equivalency of MMF and
EC-MPS in stable renal-allograft patients.
Pharmacodynamics of MMF and EC-MPS
Acknowledgments
T.B. is a recipient of a grant from Novartis, C.C. from Roche,
and S.G. from the Francophone Society of Transplantation.
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Dans cette étude, nous avons trouvé, après le changement du MMF par le MPS, une
tendance à une diminution de la prolifération des lymphocytes T. De plus, l’expression des
marqueurs d’activation des lymphocytes T est moins diminuée après 1 mois de traitement
sous MPS en comparaison au MMF. En revanche, l’expression des cytokines reste inchangée.
Le traitement avec le tacrolimus et les corticostéroïdes n’a pas été modifié.
Les patients inclus dans cette étude sont tous à au moins un an de la greffe et le risque
de rejet aigu est faible. Au cours de l’étude, aucun signe de rejet n’a été constaté, la présence
d’anticorps anti-HLA spécifiques du donneur n’a pas été détecté et aucun épisode d’infection
n’a été constaté.
En tenant compte du fort effet inhibiteur du MPA sur l’activation et la prolifération
des lymphocytes T, nous suggérons que la tendance, que l’on observe sur la modulation des
lymphocytes T après le changement du MMF au MPS, puisse être due au changement de la
pharmacocinétique du MPA. De plus, cette différence ne peut être attribuée à l’interaction de
la pharmacocinétique du MPS sur l’exposition du tacrolimus car son taux résiduel est resté
inchangé tout au long de l’étude.
Nous avons comparé l’effet du MMF et du MPS sur le comptage des sous-populations
lymphocytaires. Nous n’avons observé aucune différence entre les deux.
D’autres études ont utilisé un autre marqueur pharmacodynamique, l’activité de
l’inosine monophosphate déshydrogénase, l’enzyme cible du MPA, pour comparer le MMF et
le MPS. Ils n’ont pas observé de différences entre les deux molécules sur l’activité de
l’IMPDH (151, 215).
Les limitations de cette étude sont le faible nombre de patients inclus et l’absence de
suivie pharmacocinétique du MPA.
En conclusion, notre étude-pilote montre une tendance à une plus faible
immunosuppression sous MPS que sous MMF. D’autres études avec un plus grand nombre de
patients sont nécessaires pour prouver cette équivalence pharmacodynamique entre le MPS et
MMF chez des patients transplantés rénaux stables.
83
6. Comparaison de la prolifération, l’activation et la fonction des
lymphocytes T chez des patients transplantés rénaux de novo recevant du
belatacept ou de la ciclosporine A (étude de phase III)
Belatacept® (LEA29Y) bloque la costimulation en se liant aux ligands de costimulation
(CD80 et CD86) des cellules présentatrices d’antigènes. Il bloque le signal 2 d’activation des
lymphocytes T. C’est une protéine de fusion qui combine une portion extracellulaire du
CTLA4 avec la région constante (fragment Fc) d’une IgG 1 humaine (CTLA4Ig) (41). Il est
administré au long cours (injection IV mensuelle) et est utilisé en substitut des anticalcineurines.
Une première étude de phase II a montré, chez des patients transplantés rénaux, que le
Belatacept est aussi sûr que la ciclosporine en terme d’incidence de rejet aigu et apporte un
bénéfice significatif sur la fonction rénale (42).
Deux nouvelles études de phase III en double-aveugle sont en cours, une pour les reins
standards et une pour les reins marginaux. Dans chaque étude, il y a trois bras, un bras où les
patients reçoivent de la ciclosporine, du MMF et des corticoïdes, un autre bras où les patients
reçoivent une forte dose de belatacept IV, du MMF et des corticoïdes et enfin un bras où les
patients reçoivent une dose plus faible de belatacept, du MMF et des corticoïdes.
Les patients ont eu un suivi pharmacodynamique 3 mois, 6 mois et 12 mois après la greffe. Le
double-aveugle n’a pas encore été levé, aussi l’analyse des résultats PD consiste à comparer
les patients recevant de la ciclosporine à ceux recevant du belatacept quelque soit la dose.
Les premiers résultats montrent une tendance à une plus forte immunosuppression chez les
patients recevant du belatacept avec une plus forte inhibition de l’expression du CD25, CD71
et de la prolifération des lymphocytes T. En revanche, le groupe recevant de la ciclosporine
semble inhiber plus fortement la sécrétion intra-lymphocytaire des cytokines : l’IL-2 et le
TNF-α (Figure 23).
84
Fig. 23. Comparaison de l’expression de l’IL-2, du TNF-α, du CD25, du CD71 et de la
prolifération des lymphocytes T entre des patients recevant de la ciclosporine () et des
patients recevant du belatacept () 3 mois, 6 mois et 12 mois après la greffe.
Le belatacept semble avoir un plus fort effet immunosuppresseur que la ciclosporine sur
l’activation et la prolifération des lymphocytes T.
85
7. Étude pharmacodynamique entre un groupe de patients transplantés
rénaux stables recevant un traitement standard de MPS et de tacrolimus et un
groupe recevant une double dose de MPS et une dose de tacrolimus réduite.
Introduction
La néphrotoxicité induite par les anti-calcineurines est un des facteurs responsables de la
néphropathie chronique d’allogreffe. Une des stratégies thérapeutiques utilisées pour réduire
cette néphrotoxicité est de réduire de façon significative les taux résiduels de tacrolimus tout
en
augmentant
les
doses
d’acide
mycophénolique
(MPA)
pour
assurer
une
immunosuppression efficace.
Le but de cette étude pharmacodynamique était de comparer l’effet sur la prolifération,
l’activation et la fonction lymphocytaire T, ainsi que sur les sous-populations lymphocytaires
de deux régimes immunosuppresseurs : un régime standard associant du tacrolimus et du
MPA à doses standards (groupe I) et un régime associant du tacrolimus à doses réduites et du
MPA à fortes doses (groupe II).
Patients et Méthodes
Vingt-neuf transplantés rénaux ont été inclus dans cette étude. Tous recevaient un traitement
standard comprenant du tacrolimus (taux résiduel entre 8 et 12 ng/ml) et du MPA
[mycophénolate mofétil (MMF), 1g/j ou du mycophénolate sodique (MPS), 720 mg/j] avec
ou sans corticoïdes. 40 (16-87) mois après la transplantation, treize d’entre eux ont gardé le
même régime immunosuppresseur où seul le MMF a été substitué par du MPS à dose
équivalente (720 mg/j) (groupe I). Pour les 16 autres patients, les doses de tacrolimus ont été
diminuées pour obtenir des taux résiduels compris entre 2,5 et 5 ng/ml et le MPA a été délivré
sous forme de MPS à la dose de 1440 mg/j (groupe II). Les doses de corticoïdes n’ont pas été
modifiées.
Les études lymphocytaires ont été effectuées lors de l’inclusion, 1 mois (M1), 2 mois (M2), 3
mois (M3) et 6 mois (M6) plus tard. La mesure de la prolifération lymphocytaire
(PCNA+/ADN+), l’expression de molécules d’activation à la surface des lymphocytes T
comme la chaîne α du récepteur de l’interleukine (IL)-2 (CD25) et le récepteur de la
transferrine (CD71) et la mesure de l’IL-2 et du tumor necrosis factor (TNF)- α intra86
lymphocytaires ont été déterminées par cytométrie en flux à partir de sang total. Le taux de
lymphocytes totaux et les sous-populations lymphocytaires CD2, CD3, CD4, CD8, CD19 et
les cellules NK ont également été mesurés.
Résultats
Lors de l’inclusion, l’âge, la durée depuis la transplantation, le taux résiduel de tacrolimus, la
dose de MPA, et la corticothérapie étaient similaires dans les deux groupes (Tableau 6).
Tableau 6. Caractéristiques des patients
Groupe I (n=13) Groupe II (n=16)
Age (années)
52,2±10,7
48,6±11,6
11 /2
7/9
Temps depuis la transplantation (mois)
45,5±17,7
42,9±19,7
Taux résiduel de tacrolimus (ng/ml)
9,37±3,1
9,41±3,5
1000
1000
0,06±0,02
0,05±0,02
Sexe (M/F)
Dose de MMF (mg/jour)
Dose de corticoïdes (mg/kg/jour)
Après
la
modification
thérapeutique,
les
taux
résiduels
de
tacrolimus
étaient
significativement plus élevés dans le groupe I que dans le groupe II, 8,35 ± 0,85 vs. 4,5 ± 1,6
ng /ml à M1 (p = 0,0008), 8,87 ± 2,5 vs. 4,37 ± 1,7 ng/ml à M2 (p = 0,0003) et 9,26 ± 2,2 vs.
4,3 ± 2,21 ng/ml à M3 (p = 0,0002). Les doses de MPS et de corticoïdes sont restées
inchangées durant le suivi.
Dans l’ensemble, les taux de lymphocytes totaux, de lymphocytes CD2, CD3, CD4, CD8, de
cellules NK, d’IL-2 et de TNF-α intra-lymphocytaires, de CD25, de CD71 et de prolifération
lymphocytaire sont restés inchangés durant les 6 mois dans les groupes I et II (figure 10). Le
taux de CD19 et le rapport CD4/CD8 tendaient à augmenter dans le groupe I, alors qu’ils sont
restés inchangés dans le groupe II. Deux mois après le début de l’étude (M2), les taux de
lymphocytes totaux (2120 ± 240 /mm3 vs 1488 ± 136/mm3), de lymphocytes T CD2 (1880 ±
231 /mm3 vs 1274 ± 123 /mm3), CD3 (1752 ± 240 /mm3 vs 1169 ± 129/mm3), CD8 (790 ±
101 /mm3 vs 519 ± 76/mm3) étaient significativement plus élevés dans le groupe I que dans le
groupe II. En revanche, il n’existait pas de différence significative entre les deux groupes à
M1 et M3.
87
fig. 24 . Présentation des biomarqueurs pharmacodynamique entres le groupe I () recevant
une dose normale de MPS et de FK et le groupe II () recevant une double dose de MPS et
dose réduite de FK
Conclusion
L’utilisation de faibles doses de tacrolimus sous couverture de fortes doses de MPA
n’entraîne pas de modifications significatives de la prolifération, de l’activation et de la
fonction lymphocytaire T, ainsi que des sous-populations lymphocytaires par rapport à un
régime immunosuppresseur associant le tacrolimus et le MPA, tous deux utilisés à des doses
standard.
88
8. Article n°5 : Étude de la fonction lymphocytaire chez des patients
transplantés rénaux stables recevant du mycophénolate mofétil
et des
corticostéroïdes avec ou sans tacrolimus.
Le dysfonctionnement chronique de l’allogreffe rénale est une des causes majeures de perte
tardive du greffon. Différents facteurs peuvent êtres responsables de cette dysfonction
chronique. Parmi eux, il y a le rejet vasculaire chronique, la néphrotoxicité des anticalcineurines, et la glomérulopathie d’allogreffe (216).
Afin de limiter la toxicité des anti-calcineurines, différentes stratégies sont utilisées chez les
patients transplantés rénaux stables. Le remplacement des anti-calcineurines par un inhibiteur
de la mTOR semble donner de bons résultats (217). Mais étant donné les effets secondaires
des inhibiteurs de la mTOR, et leur faible tolérance chez certains patients, une autre
alternative pourrait être l’usage de l’acide mycophénolique avec de faibles doses de
corticostéroïdes, sans anti-calcineurines ou inhibiteurs de la m-TOR (218). Le risque majeur
de cette stratégie est le risque d’augmentation du rejet aigu.
Le but de cette étude est d’analyser la fonction, l’activation et la prolifération des
lymphocytes T chez des patients recevant du MMF avec des corticoïdes et de les comparer
avec les résultats observés chez d’autres patients recevant une thérapie conventionnelle qui
inclut du tacrolimus, du MMF et des corticoïdes.
Les résultats de cette étude ont été publiés: Canivet C., et al., T-cell function in maintenance
renal-transplant patients receiving mycophenolate mofetil and steroids with or without
tacrolimus, Transplantation Proceedings, 2008.
89
T-Cell Function in Maintenance Renal Transplant Patients Receiving
Mycophenolate Mofetil and Steroids With or Without Tacrolimus
C. Canivet, T. Böhler, S. Galvani, N. Therville, R. Salvayre, D. Durand, M. Thomsen, L. Rostaing, and
N. Kamar
ABSTRACT
Nephrotoxicity-sparing protocols, using mycophenolate mofetil (MMF) and steroids
without calcineurin inhibitors (CNIs) or mammalian target rapamycin (mTOR), could be
used to treat maintenance renal transplant patients. However, the risk for acute rejection
seems to be high. The aim of this pharmacodynamic study was to analyze T-cell function,
T-cell activation, and T-cell proliferation among patients receiving MMF and steroids (n ⫽
15) compared with patients receiving immunosuppression with CNI-based therapy including tacrolimus, MMF, and steroids. Our data suggested that among stable maintenance
patients, dual therapy with MMF and steroids might provide a similar reduction in T-cell
proliferation and T-cell activation as that observed among patients on standard immunosuppressive therapy. As expected, intralymphocytic interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-␣) expressions were higher in patients not receiving CNIs.
C
HRONIC RENAL ALLOGRAFT dysfunction is one
of the major causes of late renal allograft loss. Many
factors have been incriminated to be responsible for chronic
allograft dysfunction. Among these are chronic vascular
rejection, calcineurin inhibitor (CNI)-related nephrotoxicity, and transplant glomerulopathy.1 In order to limit CNI
toxicity, many strategies have been used in maintenance
renal transplant patients. Recently, in a randomized prospective study, Stallone et al2 showed that a switch from
CNIs to sirolimus was more effective than a 40% reduction
in CNI dosage to slow the progression of renal allograft
injuries among patients with chronic allograft nephropathy.
Hence, conversion from CNIs to mammalian target rapamycin (mTOR) seems to be a good strategy to prevent
chronic allograft dysfunction. However, because of mTOR
side effects and its poor tolerance by many patients, an
alternative strategy may be the combined use of mycophenolic acid and low-dose steroids, without CNIs or mTOR
inhibitors.3 The main risk of this strategy may be an
increased risk for acute rejection. The aim of this study
was to analyze T-cell function, T-cell activation, and T-cell
proliferation among a group of patients receiving mycophenolate mofetil (MMF) and steroids compared with those
receiving tacrolimus, MMF, and steroids.
PATIENTS AND METHODS
Between May 1, 2006 and June 30, 2006, we included all renal
transplant patients attending our outpatient or inpatient clinics and
receiving MMF and low-dose steroids without CNIs or mTOR
inhibitors in this study. Hence, 15 renal transplant patients (5 men
and 10 women), ranging in age from 43 to 73 years, were included
in this study (group I). Blood samples were obtained the morning
before any immunosuppressive drug intake, ie, 12 hours after the
last immunosuppressive drug intake. The results obtained in these
patients were compared with another group of 15 patients receiving
conventional immunosuppressive therapy including tacrolimus,
MMF, and steroids (group II).
The pharmacodynamic (PD) effects of the 2 immunosuppressive
drug strategies on lymphocyte functions were assessed by the
percentage expressions of T-cell proliferation, intracytoplasmic
interleukin-2 (IL-2), and tumor necrosis factor-alpha (TNF-␣), as
well as transferrin receptor (CD71) and IL-2 chain (CD25) expression. PD effects were determined by fluorescence-activated cell
sorting (FACS) as previously described.4 Briefly, for the measurement of intracytoplasmic cytokine expression, undiluted whole
blood was stimulated by phorbol myristate acetate (PMA) and
ionomycin for 30 minutes. Cytokine secretion was blocked by
adding brefeldin. After 4 hours of incubation at 37°C, intracytoplasmic cytokine expression was analyzed by a 3-color FACS
Calibur flow cytometer (Becton Dickinson) after the blood had
been labeled with monoclonal antibodies, ie, anti-CD3-PerCP,
anti-IL-2 PE, and anti-TNF-␣ fluorescein isothiocyanate (FITC)
From the Department of Nephrology and Multiorgan Transplantation, Toulouse, France.
Address reprint requests to Nassim Kamar, MD, PhD, CHU
Rangueil, 1 Avenue J. Poulhes, TSA 50032, Toulouse 31059,
France. E-mail: [email protected]
0041-1345/08/$–see front matter
doi:10.1016/j.transproceed.2008.06.062
© 2008 by Elsevier Inc. All rights reserved.
360 Park Avenue South, New York, NY 10010-1710
3422
Transplantation Proceedings, 40, 3422–3423 (2008)
T-CELL FUNCTION IN RENAL TRANSPLANT PATIENTS
3423
DISCUSSION
kidney transplant patients. However, 11% of patients included in their study showed acute rejection.5 Grinyo et al6
performed a prospective study in de novo, low immunological risk renal transplant recipients of suboptimal kidneys,
using an immunosuppressive protocol that combined induction therapy using rabbit antithymocyte globulins with a
bitherapy of MMF and steroids. Twenty-four percent of
patients had an acute rejection, and a CNI was added to the
treatment of more than 50% of patients. The authors
concluded that an immunosuppressive regimen with MMF
and steroids, without CNIs, can only be used in a few
patients.6 In the current study, we analyzed T-cell function,
T-cell activation, and T-cell proliferation among a group of
patients receiving combined therapy of MMF and steroids
compared with those receiving standard immunosuppression with tacrolimus, MMF, and steroids. Even though the
time since transplantation and the patient characteristics
were different between the groups, our data suggested that
among stable maintenance patients, a dual therapy of MMF
and steroids might provide a similar reduction in T-cell
proliferation and T-cell activation as that observed among
patients on standard immunosuppressive therapy. In contrast, as expected, intralymphocytic IL-2 and TNF-␣ expressions were higher in patients not receiving CNIs. Such
immunosuppressive regimens, without CNIs, may be safe
and efficient in patients who are at low immunological risk.
This study has some limitations: it is retrospective and it
concerns selected low immunological risk patients. Prospective studies are required to confirm these data, and to assess
the safety of a combination of MMF and steroids, without
CNIs or mTOR inhibitors, in maintenance patients.
Land and coworkers5 have previously reported that MMF
monotherapy may be safe and efficient in maintenance
REFERENCES
antibodies. For assessment of T-cell activation, surface markers
(CD25 and CD71), and T-cell proliferation, diluted whole blood
(1:10) was stimulated with concanavalin A (Sigma) for 3 days.
Thereafter, antigen surface markers stained using labeled antiCD3-PerCP, CD25-FITC, and CD71-PE monoclonal antibodies
were analyzed by flow cytometry. Lymphocyte proliferation was
measured by bivariate flow cytometric analysis using directly labeled FITC monoclonal antibodies against proliferating cell nuclear antigens (PCNA) and propidium iodide labeled for DNA
content. For each blood sample, we analyzed one stimulated and
one unstimulated sample. Three thousand CD3-positive cells in
each sample were analyzed on the flow cytometer. The data are
expressed as mean values ⫾ standard errors of the mean (SEM).
Variables were compared by the nonparametric Mann-Whitney U
test. P ⬍ .05 was considered significant.
RESULTS
Patient characteristics are summarized in Table 1. Patients
from the control group were younger and their time since
transplantation was shorter than those from the study
group. MMF and steroid doses were significantly higher in
the group of patients without tacrolimus. Intralymphocytic
IL-2 expression tended to be higher among group I compared with group II, ie, 22% ⫾ 4% vs 13.3% ⫾ 3% (P ⫽
.06). Intralymphocytic TNF-␣ also tended to be higher in
group I, ie, 25.5% ⫾ 5.3% vs 16.7% ⫾ 3% (P ⫽ .15). T-cell
activation markers, ie, CD25 and CD71, were similar in
both groups: 30% ⫾ 4.5% in group I vs 30% ⫾ 4% in group
II for CD25; and 19.9% ⫾ 3% in group I vs 13.8% ⫾ 2.5%
in group II for CD71. Finally, T-cell proliferation was
similar in both groups: 3.57% ⫾ 0.8% vs 3.5% ⫾ 0.5%.
Table 1. Patient Characteristics
Group I (MMF ⫹ Group II (FK 506 ⫹
Steroids;
MMF ⫹ Steroids;
n ⫽ 15)
n ⫽ 15)
Age (y)
Gender (M/F)
Time since transplantation
(mo)
Serum creatinine level
(␮mol/L)
Tacrolimus dose (mg/kg/d)
Tacrolimus trough level
(ng/mL)
MMF dose (mg/d)
Steroid dose (mg/kg/d)
No. of previous acute
rejections
P
60 ⫾ 2
5/10
108 ⫾ 28
50 ⫾ 2.6
11/4
38.5 ⫾ 4
.006
.06
.07
128 ⫾ 17
146 ⫾ 6
.02
—
—
0.06 ⫾ 0.007
9.36 ⫾ 0.75
—
—
1766 ⫾ 126
0.14 ⫾ 0.04
0
1000
0.06 ⫾ 0.007
1
⬍.001
.002
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and mycophenolate mofetil in cadaveric kidney transplantation:
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Il a été montré que le MMF en monothérapie est sûr et suffisant en traitement de
maintien chez des patients transplantés rénaux stables. Mais, 11% des patients inclus dans
cette étude présentent des signes de rejet aigu (219). Une autre étude prospective, chez des
patients transplantés rénaux de novo ayant un faible risque immunologique, utilise un
protocole qui combine un traitement d’induction à base d’ATG de lapin et une bithérapie de
MMF et de corticoïdes. 24% des patients ont fait un rejet aigu, et des inhibiteurs de la
calcineurine ont été introduits au traitement chez plus de 50% des patients (220).
Dans cette étude, nous avons analysé la fonction, l’activation et la prolifération des
lymphocytes T dans un groupe de patients recevant du MMF et des corticoïdes et comparé ces
résultats avec ceux observé dans un groupe de patients recevant un traitement standard à base
de tacrolimus, MMF et croticoïdes. Même si le temps post-transplantation et les
caractéristiques des patients sont différents, nos résultats suggèrent que, chez des patients
transplantés stables, un traitement en bithérapie de MMF et corticoïdes peut entraîner une
réduction de la prolifération et de l’activation des lymphocytes T comme observé chez des
patients recevant un traitement standard. En revanche, comme attendu, l’expression des
cytokines intra-lymphocytaires IL-2 et TNF-α est plus élevée chez les patients ne recevant
pas d’anti-calcineurines. Un tel traitement immunosuppresseur, sans anti-calcineurines, peut
être sans risques chez des patients ayant un faible risque immunologique.
Les limites de cette étude sont qu’elle est rétrospective, et ne concerne que des patients
ayant un risque immunologique faible. Des études prospectives sont nécessaires pour
confirmer ces résultats.
90
Conclusion générale
91
L’utilisation des traitements immunosuppresseurs a permis à la transplantation d’organes de
devenir un recours thérapeutique chez des patients souffrant d’insuffisance rénale ou
hépatique. Malheureusement, l’utilisation de ces différents traitements n’a pas encore trouvé
de protocole stable en termes de posologie et d’association des différentes drogues. La
balance entre le risque de rejet et les effets secondaires de ces traitements reste un réel
problème.
Aussi de nombreuses méthodes sont utilisées pour pallier ce problème. Une des
méthodes les plus employées est le suivi thérapeutique pharmacocinétique des
immunosuppresseurs. Pour chaque traitement couramment administré, il existe une
corrélation entre la pharmacocinétique et la dose du médicament. Mais cette méthode ne
permet pas de connaître l’effet de l’association de ces traitements sur le système immunitaire
ou sur les cibles qui leur sont propres.
Le suivi thérapeutique pharmacodynamique apporte donc de nouvelles réponses sur le
mécanisme d’action des immunosuppresseurs et leurs effets sur l’organisme. La méthode
utilisée au cours de ce travail de thèse est le dosage, à partir du sang total de patients, de la
prolifération des lymphocytes T, de leur activation et de la sécrétion des cytokines intracytoplasmiques validée par Böhler et coll. (181).
Cette technique nous a permis de déterminer le statut immunitaire chez des patients en
attente de greffe hépatique et montrer que les patients atteints d’une hépatite C ont une
activation de la prolifération lymphocytaire par un agent mitogène plus importante que les
patients atteints d’une autre hépatopathie. Nous avons également montré que la fonction des
lymphocytes T est corrélée avec l’âge du sujet étudié. Ces résultats montrent que la
détermination du statut immunitaire avant une greffe pourrait être un facteur prédictif pour un
rejet post-greffe, et faire varier la dose ou l’association des différents traitements. Des études
post-transplantation sont nécessaires pour mettre en évidence une corrélation entre les
résultats pré-greffe et l’incidence de rejet.
Nous avons utilisé cette méthode afin de tester l’activité immunosuppressive de
différents traitements. Nous avons montré le mécanisme d’inhibition des trois traitements les
plus utilisés en transplantation à l’heure actuelle, le tacrolimus, le mycophénolate mofétil et le
sirolimus et étudié leur courbe d’inhibition en fonction du temps et la corrélation entre leur
pharmacodynamie et pharmacocinétique. Cette méthode nous a également permis d’étudier
l’effet du léflunomide sur la fonction lymphocytaire chez des patients transplantés rénaux
ayant une néphropathie à virus BK. De la même façon, nous avons pu comparer deux
formulations de l’acide mycophénolique en termes d’immunosuppression chez des patients
92
transplantés rénaux stables et constater une tendance vers un plus faible effet
immunosuppresseur de la forme sodique. Enfin nous avons pu étudier les effets
immunosuppresseurs d’une nouvelle molécule actuellement en étude clinique de phase III, le
belatacept, qui possède un effet immunosuppresseur plus important que la ciclosporine.
L’étude de ces différents marqueurs biologiques de l’activation, de la fonction et de la
prolifération des lymphocytes T peut servir au cours du développement de nouvelles
molécules à déterminer leur efficacité et leur mécanisme d’action au niveau du système
immunitaire.
L’essai de nouvelles stratégies thérapeutiques pour éviter l’effet toxique de certaines
molécules en diminuant les doses représente toujours un risque pour la survie du greffon.
Aussi l’application de la mesure des différents marqueurs biologiques pour contrôler l’état de
l’immunosuppression peut être bénéfique. Nous avons utilisé cette méthode dans différentes
études dont le but était de diminuer les doses d’anti-calcineurines afin de diminuer leur effet
néphrotoxique, chez des patients transplantés stables. Cette méthode peut donc permettre de
vérifier la stabilité et le maintien de l’immunosuppression.
Le suivi pharmacodynamique apporte de nouveaux renseignements sur l’efficacité et
le mécanisme d’action des différents traitements utilisés en association ou individuellement.
Mais cette technique nécessite beaucoup de temps, d’argent, et est donc difficilement
applicable en routine clinique d’autant que les temps d’incubation vont jusqu’à 3 jours. De
plus, il n’existe pas à ce jour de méthodes de conservation des échantillons sanguins et ces
derniers doivent êtres analysés dans un délai de 24h après le prélèvement.
Le suivi pharmacodynamique pourrait être un complément d’information pour
l’optimisation des nouveaux traitements immunosuppresseurs.
93
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114
Résumé
La transplantation est une thérapeutique de plus en plus utilisée à l’heure actuelle. Les
traitements immunosuppresseurs permettent une meilleure prévention du risque de rejet. Mais
les immunosuppresseurs ont une fenêtre thérapeutique étroite. Le suivi thérapeutique des
immunosuppresseurs a été mis en place pour essayer de mieux contrôler les effets secondaires
sans augmenter le risque de rejet. Il existe le suivi thérapeutique pharmacocinétique et le suivi
thérapeutique pharmacodynamique.
Au cours de ces travaux, nous avons étudié en cytométrie de flux, la prolifération,
l’expression des marqueurs d’activation CD25 et CD71 et la sécrétion des cytokines intracytoplasmique IL-2 et TNF-α des lymphocytes T, chez des patients en attente de greffe et des
patients greffés rénaux et hépatiques.
Nous avons montré que les patients en attente de greffe hépatique, du fait d’une
hépatite C, ont une prolifération et une activation des lymphocytes T plus importante que les
patients en attente de greffe pour une autre pathologie hépatique. De plus ceux atteints d’une
hépatopathie ont une sécrétion de cytokines plus importante que les personnes saines. Ces
observations pourraient expliquer le risque plus élevé de rejet aigu après transplantation
hépatique chez les patients infectés par le virus de l’hépatite C.
Par la suite, nous avons comparé le statut immunitaire de patients en attente de greffe
rénale (sous dialyse), avec celui de patients transplantés rénaux et celui de volontaires sains
en fonction de leur âge. Dans chaque groupe de patients, nous avons constaté une corrélation
entre l’âge du receveur et la sécrétion de TNF-α.
Nous avons également utilisé l’approche de l’étude pharmacodynamique pour
comparer différents immunosuppresseurs. Nous avons comparé l’effet immunosuppresseur du
léflunomide avec celui du mycophénolate mofétil (MMF) chez des patients transplantés
rénaux présentant une néphropathie à virus BK. Le léflunomide s’est avéré être aussi
immunosuppresseur que le MMF, ce qui suggère que son effet bénéfique dans le traitement de
la néphropathie à virus BK est dû, au moins en partie, à son activité antivirale. Puis nous
avons comparé l’effet des deux formulations de l’acide mycophénolique : le MMF et le
mycophénolate sodique (MPS). Le MPS tend à avoir une activité immunosuppressive
légèrement moins importante que le MMF ; ceci peut-être le reflet des différences
pharmacocinétiques entre les 2 formulations. Enfin, nous avons comparé les facultés
immunosuppressives du belatacept à la ciclosporine A.
L’étude pharmacodynamique des immunosuppresseurs a permis de comparer
l’efficacité de différentes stratégies immunosuppressives visant à diminuer le taux d’anticalcineurines administré chez des patients transplantés afin d’éviter leur effet néphrotoxique
et diminuer le risque de perte de greffon. Nous avons observé que la diminution voir l’arrêt
des anti-calcineurines chez des patients transplantés stables n’entraînait pas d’augmentation
de l’activation, la prolifération et la sécrétion des cytokines des lymphocytes T.
Ce travail a montré l’intérêt d’un suivi pharmacodynamique des immunosuppresseurs
au cours du développement d’une nouvelle molécule mais également pour analyser l’utilité et
l’efficacité d’une nouvelle stratégie immunosuppressive. De plus elle permet de montrer la
variabilité inter-individuelle du statut immunitaire des patients en attente de greffe et permet
d’appréhender le traitement post-greffe.