THESE DE DOCTORAT Michael ESQUERRE

UNIVERSITE PAUL SABATIER – TOULOUSE III
UFR Sciences de la vie
THESE DE DOCTORAT
Discipline : Immunologie
Présentée et soutenue par
Michael ESQUERRE
Le 29 novembre 2007
En vue de l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE III
INFLUENCE DES LYMPHOCYTES T CD4+ CD25+ REGULATEURS
SUR LA DYNAMIQUE DE FORMATION DE LA SYNAPSE
IMMUNOLOGIQUE ENTRE UN LYMPHOCYTE T CD4+ EFFECTEUR
ET UNE CELLULE PRESENTATRICE D’ANTIGENE
Jury
Pr Joost van Meerwijk
Président
Dr Ignacio Anegon
Rapporteur
Dr Claire Hivroz
Rapporteur
Dr Alain Trautmann
Rapporteur
Dr Denis Hudrisier
Examinateur
Pr Salvatore Valitutti
Directeur de Thèse
Au Dr Paulette Recco,
je dédie ce travail
Remerciements
Toulouse le 18 novembre 2007,
Quel difficile exercice que de synthétiser en deux ou trois pages seulement les remerciements que je
voudrais adresser aux différentes personnes que j’ai rencontré et apprécié durant ma vie de thésard
ainsi, qu’aux personnes que je connais et qui m’entoure depuis bien plus longtemps que ça.
Après avoir enfin achevé la version finale de ce manuscrit, je vais tenter de satisfaire à cet exercice de
mon mieux. Toutes mes excuses aux personnes que je pourrais oublier, mes pensées vont vers vous
également. En ce début de soirée de dimanche de novembre, instant pourtant plutôt propice au regret
de l’agréable week-end qui vient de se terminer et à la terreur de la sonnerie stridente du réveil qui
retentira bien trop tôt demain matin, j’espère pourtant que l’inspiration va me gagner…
Je voudrais tout d’abord remercier le Pr Joost van Meerwijk d’avoir accepté d’être le président de mon
jury de thèse. Vous avez été mon chef durant mon DEA et vous êtes également présent à la
conclusion de mon parcours universitaire. Même si nos rapports ont souffert je pense
d’incompréhensions, je tenais à vous dire que j’ai appris beaucoup de choses à vos côtés durant cette
dure année qu’a été le DEA. Merci de m’avoir initié au monde du lymphocyte T régulateur.
Je voudrais remercier également mes trois rapporteurs : Claire Hivroz, Ignacio Anegon et Alain
Trautmann qui, après avoir lu et analysé de manière chirurgicale mon manuscrit, ont tous répondu
présents pour assister à ma soutenance. Veuillez me pardonner Mr Trautmann s’il reste encore
quelques fautes d’accords. J’ai confié mon manuscrit à cinq personnes, à priori sans lacunes
grammaticales déclarées, qui ont successivement traqué sans relâche la moindre faute et coquille.
Un grand merci à toi aussi Denis pour avoir accepté d’être examinateur de ma thèse. Je suis vraiment
heureux que tu sois présent le jour de ma soutenance. Tu as été pour moi le meilleur des enseignants
que j’ai pu rencontré tout au long de mon parcours universitaire, tu m’as donné le goût de
l’immunologie. J’ai pu un peu mieux te connaître durant mon DEA où, en plus de tes grandes qualités
scientifiques, j’ai pu apprécier ton immense gentillesse, ton écoute, et je n’oublierais pas non plus tes
performances à Altissimo !
Ensuite, j’en arrive logiquement à remercier « Il grande capo » alias « Il dottore Salvatore Valitutti ».
Merci de m’avoir accepté dans ton équipe à la fin de mon DEA, de m’avoir fait confiance et de m’avoir
donné les moyens scientifiques et matériels pour développer une thématique nouvelle dans ton
laboratoire. Je me rappelle encore quand tu as écrit le sujet de ma thèse sur un morceau d’enveloppe.
Finalement, après beaucoup d’efforts on est arrivé à en faire quelque chose de tout ce travail qui, je
l’espère, sera bientôt publié. Ces trois années de thèse ont été très formatrices, je pense que j’ai pu
développé mon indépendance scientifique mais aussi, ma capacité à remettre en cause mes résultats
et à penser à faire le contrôle du contôle sans bien sur, oublier les témoins adéquats ! Je pense que
l’on a appris à bien travailler ensemble, et je pense qu’on arrivera à produire de bonnes données
scientifiques durant l’année qui vient. Comment en pensant à Salvatore ne pas penser à Sabina,
merci pour m’avoir initier aux joies de la microscopie confocale, pour m’avoir donné un coup de main
sur certaines manips mais également, pour m’avoir fait découvrir la vraie cuisine Italienne.
Maintenant mes pensées vont vers ma tutrice de monitorat, Cécile alias « la Mama » ! A la fac tu ne
montres que ton côté obscur et oui, moi aussi tu me faisais un peu peur quand j’étais en DEUG et que
tu criais dans l’amphi mais bon, les longues pauses café que tu faisais permettaient de compenser !
Merci de m’avoir aidé dans mon expérience d’enseignement. Merci pour ta bonne humeur au labo, les
crises de fou rire qu’on a pu avoir dans le bureau ou même lors d’une surveillance d’exam ! Enfin,
merci pour ta relecture de cette thèse. Je pense maintenant à la technicienne de choc du CPTP :
Martine Guiraud. Rien ne te fait peur, te jeter sur un pakito, poser en petite tenue au sommet d’une
montagne pour un calendrier ou bien faire une cinétique de calcium avec moi au LSRII ! Merci pour
ton aide au labo et pour ta gentillesse, on a bien rigolé en se racontant des potins tout en cultivant nos
cellules. Tu vas me manquer, je crois que je vais collaborer avec ta nouvelle équipe l’année qui vient.
Merci Eric, pour ces bonnes tranches de rigolades en manip, pour toutes ces pauses café avec
toujours le petit chocolat qui va bien où l’on a pu discuter de sciences et de pleins d’autres choses. Tu
m’as aidé à chaque difficulté que j’ai pu rencontré durant ces trois années de thèse. Tu possèdes de
grandes qualités scientifiques et tu es un collègue précieux. Merci aussi Eric pour avoir pris le temps
de relire et de corriger ma thèse.
Je pense maintenant à celui qui a soutenu sa thèse avec les honneurs il y a maintenant presque deux
mois, j’ai nommé Nico ! Merci pour tout mon cher Nico, mon accolyte au labo et dans les soirées !
Durant tout ce temps où on a travailler ensemble nous avons pu mieux nous connaître, parler de nos
Remerciements
doutes, de notre avenir, mais aussi bien se marrer et je pense au final devenir amis. Merci encore
pour ton soutien durant cette année 2007 qui n’aura pas vraiment été facile pour moi.
Merci également à mon stagiaire de compétition, merci Baptiste pour ta bonne humeur et tes manips,
je pense qu’on a fait une bonne équipe ensemble, tu es arrivé à un moment crucial dans ce travail. Je
crois que tu es encore plus calme que moi…
Merci à toi Florie pour ta joie de vivre au quotidien, c’est un plaisir de travailler avec toi. Je pense
d’ailleurs que l’on va travailler ensemble cette année à venir.
Enfin, après avoir passé en revue les membres toujours présents de l’équipe Valitutti, je n’oublie pas
ceux qu’ils l’ont été, mais qui ne le sont plus. Je pense en premier lieu à mon ancien colocataire de
bureau, mister David, merci pour ton aide lors de mon début de thèse. Tu m’as aidé à m’adapter à ma
nouvelle équipe, à passer du monde de la souris C57BL/6 au monde des cellules humaines. Merci
pour toutes ces discussions. Je pense également à Aurélie, merci pour ton sang chaud Perpignanais
et pour toutes ces discussions où j’ai appris tant de choses, d’ailleurs, depuis que tu es partie, je ne
suis plus au courant de rien. Merci également à toi Séb, tu as pris la place de David à la fois sur le
projet de la FRAP et dans le bureau. Tu es vraiment quelqu’un de brillant. Les discussions vétos à
propos de mon chat me manquent pas mal et en plus, depuis que t’es parti, j’ai plus de gateaux à
16h !
Je pense également aux membres de passage : Iris, la travailleuse acharnée et Leandrito, le plus
sympa de tous les biologistes Chiliens.
J’ai une pensée également pour Christelle et Laurent qui ont partagé le même bureau que moi durant
ma première année de thèse.
J’espère avoir pu vous donner un peu de tout ce que vous m’avez offert.
Je tiens également à remercier Loïc Dupré et toute son équipe, Ronan, Yovan, Gema, Fanny et Julie,
sans oublier Josipa. Merci Loïc pour toutes les discussions que l’on peut avoir dans le bureau, pour
tous tes bons conseils, tu m’as d’ailleurs bien aidé à stucturer la dernière partie de ce manuscrit.
Mes pensées vont également à Abdel Saoudi, merci pour ton aide précieuse et tes conseils
scientifiques avisés. Tu nous as bien épaulés tout au long de ce travail.
Enfin, je tiens à remercier les membres des autres équipes du département Immunologie avec qui j’ai
partagé d’agréables moments. Je pense à l’équipe van Meerwijk, à Thibault et ses drôles de dames.
Merci à Julie T. et Céline pour avoir repris le flambeau de la gestion du café, car comme chacun sait,
au boulot : le café c’est le nerf de la guerre. Mes pensées vont également à Julie R., Ingrid et aussi
Olive. Merci Olive pour ton encadrement, pour ton soutien, ta sympathie et ta disponibilité durant mon
année de DEA. J’ai beaucoup appris grâce à toi. Depuis que tu es parti, Paris Match a déposé le
bilan.
Mes pensées vont également aux membres de l’équipe Guéry, Cyril, Karine avec qui il est toujours
agréable de discuter au moment du repas. Et puis je n’oublie pas Sophie également, dommage que tu
ne sois pas là pour la soutenance.
Merci au membre de l’équipe Lebouteiller, je pense notamment à Julie pour ta bonne humeur et puis
merci aussi pour avoir participé à la relecture de ce manuscrit. Je voudrais remercier Maryse
également et pas que pour ses dons culinaires mais également pour m’avoir aidé avec les PCR
Foxp3 quand j’essayais de savoir si mes Treg étaient bien des Treg !
Mes pensées vont également à l’équipe de Sylvie Guerder où il est toujours agréable d’aller discuter
un peu de sciences ou d’autres choses. Merci Stéphane pour tes mails divertissants et pour les
épisodes d’Heroes.
Je voudrais également remercier les personnes en charge des plateaux techniques, Fatima et Valérie
pour la cytométrie et le tri cellulaire. Merci pour votre diponibilité et votre gentillesse. Vous m’avez bien
aidé pour ces dernières expériences en cinétique de calcium sur le LSRII. Fatima, c’est toujours un
plaisir de discuter avec toi, en plus j’apprends et dès fois même, je t’apprends quelques histoires dont
tu n’as pas encore eu vent. Merci également à Sophie qui a la charge du plateau d’imagerie, merci
pour ta disponibilité et ta gentillesse. Merci à vous toutes de préserver l’intégrité de ce précieux
matériel afin de nous permettre à tous d’avançer dans nos travaux.
Je voudrais également remercier Aline, toujours pleines de douces attentions, quand Nicolas était là
j’étais n°2, mais depuis que Nicolas est parti je pense que je suis passé n°1.
Merci également à Dominique pour ton sérieux et ton efficacité dans le transfert de nos commandes.
Cela nous épargne ainsi beaucoup de travail administratif et nous rend la vie plus simple !
Remerciements
Je voudrais également remercier Yvan, Jacques, Nordine, Joël et Marie qui travaillent dans l’ombre
mais qui permettent à la machine de tourner rond.
Mes pensées vont également à Rémy et Delphine. Rémy on a fait quasiment tout notre parcours
universitaire ensemble. J’ai toujours été impressionné par ta capacité à comprendre si rapidement les
choses, ça ne m’étonne pas que tu travailles maintenant sur des ADN polymérases bizarre. Si je
devais me souvenir de quelque chose de toi, ce serait de ton imparable raisonnement et de ta
capacité à te transformer en Raymond quand tu buvais un verre de trop dans les soirées, j’en rigole
encore.
Merci à toi aussi, Cédric alias Zizouille, le plus grand n°10 du football que le monde est connu après le
vrai Zidane. On a sympathisé durant notre licence et depuis, beaucoup de choses se sont passées.
Tu es quelqu’un que j’estime beaucoup.
Je voudrais témoigner mon affection à Julien, tu es comme un frère pour moi. J’ai vraiment de la
chance de t’avoir rencontré en 1992 au collège du château de l’Hers. Tu as été à mes côtés dans les
bons comme dans les mauvais moments de ma vie. Il y aurait beaucoup trop de choses à raconter,
merci pour tout ce que tu m’apportes.
Merci à tous mes amis : Charlotte, Biggy, Béa, Rom et les autres. C’est grâce à vous que j’arrive à
garder mon équilibre au quotidien, et ma dose d’apéros le dimanche soir. Vous comptez énormément
pour moi.
Je tiens également à remercier ma famille et surtout mes parents, vous m’avez toujours aidé, soutenu
et apporté ce dont j’avais besoin. C’est grâce à vous si aujourd’hui j’en suis arrivé là, merci pour tout.
Je voudrais témoigner mon affection à ma petite sœur Emma, qui n’est plus si petite que ça
maintenant. Merci pour tout ce que tu as fais pour moi.
Enfin, mes plus tendres pensées vont à ma petite Camille, merci de m’aimer autant et d’être comme
tu es. Merci de m’avoir soutenu jusqu’au bout, en relisant plusieurs fois cette thèse (je crois que tu
seras la seule à avoir subi ça). Marcher à tes côtés dans cette grande aventure qu’est la vie est un
privilège. Il n’y a pas de mots pour te dire au combien je t’aime et au combien je tiens à toi.
Sommaire
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
2
RESUME
5
ABSTRACT
6
LISTE DES FIGURES
7
LISTE DES ABREVIATIONS
9
AVANT-PROPOS
10
INTRODUCTION
13
LES LYMPHOCYTES T
14
I. Développement et sélection des lymphocytes T αβ
14
II. Récepteur à l’antigène des lymphocytes T αβ
19
•
Structure du TCR
•
Le complexe TCR/CD3
III. Organisation des gènes du TCR
21
ACTIVATION DES LYMPHOCYTES T
23
I. Sensibilité et spécificité des TCR
24
•
Le modèle du kinetic proof reading
•
Le modèle du serial triggering
II. Activation de la cellule T
28
•
Activation de la cellule T et Valence des TCR
•
Le modèle de « kinetic segregation »
•
Les microdomaines lipidiques
•
Changements conformationnels et engagement des TCR
•
Activation des LT par des super antigènes bactériens
2
Sommaire
SIGNALISATION ET MISE EN PLACE DES FONCTIONS EFFECTRICES DES LT
40
I.
Mise en place de la signalisation et des voies de transduction du signal
II.
Fonctions effectrices des LT :
•
LT CD4+ (TH1, TH2 et TH17)
•
LT CD8+
45
BIOLOGIE ET POTENTIEL THERAPEUTIQUE DES LT CD4+ CD25+ REGULATEURS
I.
Caractérisation, développement et homéostasie des LT régulateurs
(Treg)
II.
52
•
Plus de vingt-cinq ans d’efforts à la recherche du marqueur…
•
Développement et homéostasie du compartiment T régulateur
Mécanismes de suppression
61
•
Nécessité du contact cellulaire pour la suppression in vitro
•
L’implication des cytokines dans la suppression
•
Fonctions physiologiques, physiopathologiques et signalisation du
TGF-β1
•
III.
IV.
Autres mécanismes de suppression
Fonctions physiologiques et physiopathologiques des Treg
•
Tolérance foeto-maternelle
•
Modulation des réponses immunitaires anti-infectieuses
•
Effet délétère sur l’immunité anti-tumorale
Potentiel clinique
70
76
•
Transplantation d’organes et de tissus
•
Pathologies auto-immunes et immuno-inflammatoires
•
Une aide à la thérapie génique
SYNAPSE IMMUNOLOGIQUE ET DYNAMIQUE DES INTERACTIONS LYMPHOCYTAIRES
I.
II.
Architecture de la Synapse Immunologique
•
La synapse immunologique concentrique
•
Diversité des synapses immunologiques
Dynamique à la Synapse et polarisation des lymphocytes T
•
Dynamique de l’interaction lymphocyte T/CPA
•
Polarisation des lymphocytes T
3
82
87
Sommaire
III.
Synapse Immunologique et lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs 92
OBJECTIFS DU TRAVAIL
95
RESULTATS
97
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
102
RESULTATS PRELIMINAIRES
117
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
118
4
Résumé
Michael Esquerré
Influence des lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs sur la dynamique de formation
de la synapse immunologique entre un lymphocyte T CD4+ effecteur et une cellule
présentatrice d’antigène
Directeur de thèse : Pr Salvatore Valitutti
Toulouse, hôpital Purpan, le 29 novembre 2007
RESUME
La rencontre entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice d’antigène (CPA) est un évènement
central dans l’initiation et le développement de la réponse immunitaire adaptative. L’interaction entre
ces deux cellules entraîne de nombreuses réorganisations moléculaires au niveau de l’aire de contact
intercellulaire conduisant à la formation d’une structure dynamique et spécialisée remplissant diverses
fonctions biologiques : la Synapse Immunologique (SI). Cette interaction permet à un lymphocyte T
CD4+ helper (TH) de s’activer et de mettre en place une signalisation intracellulaire nécessaire à la
production de cytokines. Le second aspect crucial de cette interaction consiste en la polarisation de la
machinerie sécrétoire du lymphocyte TH vers la CPA permettant ainsi une activation sélective de la
CPA présentant l’antigène spécifique et donc une amplification sélective de la réponse immunitaire.
Les lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs naturels (Treg) jouent un rôle capital dans le maintien de
la tolérance périphérique au soi, leur absence conduisant au développement de syndromes
lymphoprolifératifs auto-immuns. Les Treg sont également impliqués dans le contrôle des réponses
immunitaires anti-infectieuses et ont un rôle délétère lors des réponses immunitaires anti-tumorales.
Différents mécanismes de régulation impliquant le contact cellulaire ou bien la sécrétion de molécules
effectrices solubles ont à ce jour été décrits.
Mon travail de thèse a été de déterminer si les Treg humains pourraient inhiber les réponses
immunitaires en altérant la polarisation des lymphocytes TH vers les CPA. Afin de répondre à cette
question, nous avons utilisé des approches de microscopie confocale afin de visualiser un Treg et un
lymphocyte TH interagissant simultanément avec une même CPA. Nous avons pu observer que les
Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH (appareil de Golgi et
cytosquelette de tubuline) vers la CPA via la production locale de TGF-β. L’obtention de ces résultats
nous a permis d’identifier un nouveau mécanisme de suppression, qui pourrait permettre de mieux
appréhender l’incroyable potentiel des Treg à réguler finement les réponses immunitaires.
Mots clés : Synapse Immunologique, Lymphocytes T régulateurs, microscopie confocale, TGF-β.
Discipline : Immunologie.
INSERM U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, CHU Purpan, BP 3028, 31024
Toulouse Cedex 3
5
Abstract
Michael Esquerré
Influence of CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes on the dynamic of the
immunological synapse formation between a CD4+ effector T lymphocyte and
an antigen presenting cell
Thesis supervisor: Pr Salvatore Valitutti
Toulouse, Purpan hospital, November 29th 2007
ABSTRACT
The encounter between a T lymphocyte and an antigen presenting cell (APC) is a central event in the
initiation and development of adaptative immune responses. Interaction between these two cells leads
to multiple molecular reorganizations of the intercellular contact site leading to the formation of a
dynamical and specialized structure filling diverse biological functions: the Immunological Synapse
(IS). This interaction enables a CD4+ T helper lymphocyte (TH) to activate and to put into place an
intracellular sustained signaling necessary for cytokine production. The second key feature of this
interaction consists in TH lymphocyte secretory machinery polarization towards APC thereby allowing
a selective activation of the APC presenting the specific antigen and thus a selective amplification of
the immune response. CD4+ CD25+ natural regulatory T lymphocytes (Treg) play a pivotal role in the
maintenance of peripheral self tolerance, their absence leading to the development of autoimmune
lymphoproliferative disorders. Treg are also involved in controlling anti-infectious immune responses
and have a deleterious role during anti-tumoral immune responses. To date, different regulation
mechanisms involving cellular contact or the secretion of soluble effector molecules have been
described.
My thesis work was to determine if human Treg could inhibit immune responses by altering
polarization of TH lymphocytes towards APC. In order to answer this question we used confocal
microscopy approaches so as to visualize a Treg and a TH lymphocyte simultaneously interacting with
a same APC. We were able to observe that Treg inhibit secretory machinery polarization of TH
lymphocytes (Golgi apparatus and tubulin cytoskeleton) towards APC via local TGF-β production.
These results enabled us to identify a novel suppression mechanism that could allow to better
apprehend the incredible potential of Treg to finely regulate immune responses.
Keywords: Immunological Synapse, regulatory T lymphocytes, confocal microscopy, TGF-β.
Discipline: Immunology.
INSERM U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, CHU Purpan, BP 3028, 31024
Toulouse Cedex
6
Liste des figures
Figure 1 Engagement vers le lignage lymphocytaire T
Figure 2 Principales étapes du développement thymique des lymphocytes T
Figure 3 Induction de tolérance centrale et périphérique, remparts face à l’autoimmunité
Figure 4 Architecture moléculaire du complexe TCR/CD3
Figure 5 Diversité combinatoire et jonctionnelle des TCR
Figure 6 Schématisation du modèle de « kinetic proofreading » pour la signalisation du TCR
Figure 7 Le « serial triggering », engagement séquentiel des TCR
Figure 8 Modèle d’hétérodimérisation du TCR
Figure 9 Modèle de pseudodimérisation des TCR
Figure 10 Modèle des TCR multivalents
Figure 11 Modèle de « kinetic segregation »
Figure 12 Comparaison cristallographique des complexes TCR/CMH/SAg (SEB) et TCR CMH/peptide
Figure 13 Voies de transduction du signal en aval du TCR
Figure 14 La voie calcique, signal clé de l’activation lymphocytaire T
Figure 15 Un même précurseur, plusieurs destins
Figure 16 Plusieurs marqueurs pour identifier une même population cellulaire
Figure 17 Développement intra-thymique du lignage T régulateur (Treg)
Figure 17.b Voie de signalisation induite par le TGF-β1
Figure 18 Mécanismes de suppression des Treg
Figure 19 Balance entre lymphocytes TH et Treg : Immunité anti-infectieuse protectrice versus
prévention d’immunopathologie
Figure 20 Les Treg : obstacle majeur à l’immunosurveillance anti-tumorale
Figure 21 Architecture moléculaire de la synapse immunologique concentrique
Figure 22 Diversité des synapses immunologiques
Figure 23 Dynamique de l’interaction lymphocyte T/CPA
Figure 24 Les Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH via un
mécanisme TGF-β dépendant.
Figure 25 Schématisation du potentiel des Treg et du TGF-β à inhiber la sécrétion cytokinique
polarisée au niveau du microenvironnement tumoral
7
Liste des abréviations
ADN
Acide désoxyribonucléique
AIRE
Autoimmune Regulator
APECED
Autoimmune Polyendocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy
ARN
Acide ribonucléique
CDR
Complementary determining regions
CMH
Complexe majeur d’histocompatibilité
CPA
Cellule présentatrice d’antigène
CRAC
Calcium released-activated calcium channels
cTEC
Cortical thymic epithelial cell (cellule épithéliale corticale thymique)
CTL
Cytotoxic T lymphocyte
CTLA-4
Cytotoxic T lymphocyte associated protein-4
DAG
(1,2)Diacylglycérol
DC
Dendritic cell (cellule dendritique)
DN
Double négative
dnTGF-βRII Dominant négatif pour le récepteur de type II au TGF-β
DP
Double positive
EAE
Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale
Erk
Extracellular signal-regulated protein kinases
ERM
Ezrine-Radixine-Moésine
Foxp3
Forkhead box P3
GFP
Green fluorescent protein
GM-CSF
Granulo-Monocytes-Colony Stimulating Factor
GPI
Glycophosphatidylinositol
GVHD
Graft versus host disease (maladie du greffon contre l’hôte)
IDO
Indoleamine 2,3 dioxygenase
IFN
Interferon
Ig
Immunoglobuline
IL
Interleukine
IPEX
Immunedysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X linked
ITAM
Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
KO
Knockout
LAT
Linker for Activation of T cells
LFA-1
Lymphocyte function-associated antigen-1
LPS
Lipopolysaccharide
MAPK
Mitogen-Activated Protein Kinase
MOG
Myelin oligodendrocyte glycoprotein
mTEC
Medullar thymic epithelial cell
MTOC
Microtubule organizing center
NFAT
Nuclear Factor of activated T cells
NFKB
Nuclear Factor-kappa B
8
Liste des abréviations
NK
Natural Killer
NO
Nitric oxyde
NOD
Non obese diabetic
Pi3K
Phosphatidylinositol-3-OH kinase
RAG
Recombination activating gene
SCID
Severe combined immunodeficiency
SI
Synapse immunologique
SMAC
Supra molecular activation cluster
TCR
T cell receptor
TGF
Transforming growth factor
TH
T Helper
TIL
Tumor infiltrating lymphocyte
TLR
Toll like receptor
TNF
Tumor necrosis factor
Treg
Lymphocyte T CD4+ CD25+ régulateur
WASP
Wiskott-Aldrich Syndrom protein
9
AVANT-PROPOS
10
Avant-propos
Le terme immunité (du latin immunis : protégé de…) évoque au premier abord les
mécanismes de défenses que notre organisme développe à l’encontre des microorganismes. La notion de système quant à elle désigne un ensemble d’éléments qui vont
interagir de façon hiérarchisée et intégrée afin d’assurer une fonction. Le système
immunitaire a pour objectif, dans une situation physiologique, de permettre à un organisme
pluricellulaire de maintenir son intégrité, c'est-à-dire de préserver sa cohérence tissulaire et
cellulaire en éliminant ses propres constituants altérés.
Dans un contexte physiopathologique, l’objectif à atteindre est identique. Pour cela un
ensemble de mécanismes cellulaires et moléculaires va se mettre en place afin de préserver
l’intégrité de l’organisme. Ainsi, une infection virale ou bactérienne, l’apparition et le
développement d’une tumeur ou la greffe allogénique d’un organe ou d’un tissu peuvent
conduire à l’activation du système immunitaire.
Un des éléments clé pour le développement de la réponse immunitaire va être la capacité à
distinguer entre, d’une part, les constituants normaux de l’organisme (le soi) qui doivent être
préservés et d’autre part, les agents pathogènes (le non soi) et les constituants altérés de
l’organisme (le soi modifié). Afin d’assurer cette fonction, deux stratégies différentes ont été
développées au cours de l’évolution des êtres vivants. La première ligne de défense va
reposer sur le système immunitaire inné. C’est une réaction immédiate mettant en jeu
différents acteurs moléculaires, cellulaires et tissulaires agissant au niveau local et
systémique. Cette réponse rapide se fait indépendamment de la reconnaissance d’antigènes
spécifiques et sans établissement d’une mémoire. Elle est basée sur la reconnaissance de
motifs moléculaires conservés à la surface des pathogènes, les PAMP (PathogenAssociated Molecular Pattern) par les PRR (Pattern Recognition Receptor) exprimés à la
surface des cellules phagocytaires issues des lignages myéloïdes tels que les
monocytes/macrophages ou les cellules dendritiques. Les cellules NK (Natural Killer) douées
naturellement d’une activité cytotoxique vont, par la reconnaissance de signaux de stress
cellulaire et de danger, participer activement à la réponse innée. Bien que dans certains cas,
cette réponse immunitaire soit suffisante pour l’élimination des agents pathogènes, l’absence
de spécificité antigénique va être le frein de ce type de réponse. C’est pourquoi, il peut être
nécessaire d’activer par le biais de cellules de l’immunité innée des cellules effectrices
appartenant à l’immunité adaptative. La réponse adaptative, seconde ligne de défense est
apparue avec les vertébrés il y a environ 500 millions d’années. Elle repose sur des cellules
d’origines hématopoïétiques, les lymphocytes T et B, portant à leur surface des récepteurs à
l’antigène hautement spécifiques et ayant la capacité de développer en cas de réinfection
par le même pathogène, une mémoire immunitaire à long terme. C’est une réponse plus
lente, nécessitant un processus d’expansion clonale des lymphocytes spécifiques des
antigènes du pathogène. Les lymphocytes B reconnaissent des antigènes entiers ou natifs
11
Avant-propos
grâce à leur récepteur, le BCR (B Cell Receptor) qui est une immunoglobuline de surface.
Les lymphocytes T quant à eux reconnaissent les antigènes sous forme de fragments
peptidiques liés à des molécules du CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité) présentes
à la surface des CPA (Cellules Présentatrices de l’Antigène), cellules de l’immunité innée.
Afin de faire face au très large spectre d’agents pathogènes, au cours du développement
lymphocytaire dans les organes lymphoïdes primaires, les récepteurs aux antigènes sont
générés aléatoirement par recombinaison génique. Cependant, ce processus aléatoire
conduit à l’émergence de clones lymphocytaires potentiellement autoréactifs et donc
dangereux pour l’organisme. Pour palier à cela, des mécanismes de tolérance centrale au
soi sont mis en place afin d’éliminer ces lymphocytes exprimant des récepteurs
autospécifiques. Ces mécanismes d’inactivation vont s’avérer cependant imparfaits et des
lymphocytes T autoréactifs vont, après avoir échappé à cette sélection négative, pouvoir
migrer vers les organes lymphoïdes périphériques et potentiellement déclencher des
pathologies auto-immunes. Afin de prévenir cela, il existe des mécanismes de tolérance
périphérique passifs, mais également actifs dépendant de l’action de lymphocytes T
régulateurs. La population la mieux décrite à ce jour est celle mise en évidence par
Sakaguchi en 1995 : la population régulatrice T CD4+ CD25+ Foxp3+. En plus de son rôle
physiologique dans le contrôle du répertoire auto-immun, cette population est impliquée dans
la modulation des réponses anti-infectieuses, dans la tolérance foeto-maternelle et a un rôle
délétère dans l’immunosurveillance des tumeurs.
Mon travail de thèse a consisté à essayer de mieux comprendre les mécanismes d’action
employés par ces lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs pour contrôler la réponse
immunitaire lors : de l’interaction entre un lymphocyte T CD4+ (LT CD4+) conventionnel et
une cellule présentatrice de l’antigène (CPA), de l’activation de ce lymphocyte T mais
également au cours de la mise en place de ses fonctions effectrices.
12
INTRODUCTION
13
Introduction : Les lymphocytes T
Les lymphocytes T
En plus des fonctions biologiques effectrices intrinsèques mises en œuvre afin d’éliminer les
agents pathogènes, les lymphocytes T αβ s’avèrent cruciaux lors des réponses immunitaires
adaptatives en « orchestrant » et en coordonnant ces réponses. En effet, les lymphocytes T
CD4+ auxiliaires ou TH (T helpers) permettent le développement de la majorité des réponses
immunitaires humorales et, par la production de cytokines modulent l’activité des
phagocytes. Les lymphocytes T αβ sont fortement majoritaires dans l’organisme, il existe
toutefois une population de lymphocytes T γδ présente dans le sang, la peau et les
muqueuses pouvant représenter de 1 à 10% des lymphocytes T totaux. Au cours de cette
étude nous nous sommes intéressés uniquement aux lymphocytes T αβ.
« Ce que l’on tient pour compliqué peut-être expliqué en termes simples, et compris par tous ceux qui
ont su garder leur capacité d’émerveillement. »
Jean-Pierre Revillard
I. Développement et Sélection des Lymphocytes T αβ
L'ontogenèse des lymphocytes T αβ est un long processus qui démarre comme pour toutes
les cellules d’origine hématopoïétique au sein de la moelle osseuse. La cellule initiale est la
cellule souche hématopoïétique (CSH), cellule multipotente proliférant au contact du stroma
médullaire. Cette cellule à l’origine de toutes les cellules sanguines, va progressivement se
différencier dans la moelle osseuse en perdant peu à peu son potentiel au cours d’un
processus appelé, hématopoïèse. Rapidement au cours de ce processus de différenciation,
la cellule peut donner soit un progéniteur myéloïde commun (PMC), soit un progéniteur
lymphoïde commun (PLC). Le PLC, cellule multipotente peut générer trois lignages
lymphoïdes (B, T et NK) suivant les signaux qu’elle intégre. Le choix d’un lignage T conduit
ce PLC à migrer en périphérie et à pénétrer au niveau de la jonction cortico-médullaire
thymique pour y poursuivre son processus de différenciation (Figure 1.). Durant ces
dernières années il a été suggéré que cet engagement vers le lignage T est un évènement
intrathymique qui se réalise après engagement du récepteur Notch1 avec son ligand
thymique Delta-1 L (von Boehmer et al. 2003). En effet, des souris déficientes pour Notch1,
générées par un « knockout » conditionnel dans les précurseurs lymphoïdes précoces, ne
possèdent pas de cellules pro-T mais disposent d’une quantité accrue de cellules pro-B et de
cellules B matures. En absence de Notch-1 le choix du lignage se fait « par défaut » et des
cellules B sont retrouvées dans le thymus (Wilson et al. 2001). Cette phase de différenciation
14
Introduction : Les lymphocytes T
en cellule pro-T permet de constituer un stock de thymocytes immatures. Ces thymocytes en
développement vont progressivement migrer du cortex à la médulla en subissant une
sélection drastique, en effet seulement 2% d’entre eux sortiront du thymus pour constituer le
pool périphérique de lymphocytes T matures.
Figure 1. Au cours de l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en
progéniteur lymphoïde commun 2 (PLC 2), cellule pivot dans le choix des lignages lymphoïdes. Une
partie du pool de PLC 2 migre au niveau thymique et s’engage dans le développement T après interaction
entre le récepteur Notch1 à la surface des précurseurs et son ligand Delta-1 L à la surface du stroma
thymique.
Cette sélection s’opère via deux processus, la sélection positive tout d’abord, puis la
sélection négative. Le développement lymphocytaire T va être instrumenté par l’expression
successive et ordonnée de différents marqueurs de surface dont les corécepteurs CD4 et
CD8 (Cluster of Differentiation). Sur la base de l’expression de ces corécepteurs il est
d’ailleurs possible de fractionner la maturation des thymocytes en trois étapes principales
(Figure 2). Tout d’abord, les thymocytes sont à un stade CD4- CD8- appelé double négatif
(Beals et al.), population représentant entre 1 et 5% des thymocytes totaux. Sur la base de
l’expression des marqueurs CD25 et CD44, quatre stades différents de thymocytes peuvent
être observés, de DN1 à DN4 (Godfrey et al. 1993). Durant les stades DN2 et DN3, ils
expriment la machinerie moléculaire nécessaire au réarrangement des gènes V, D et J
codant la chaîne β du TCR. Il s’agit notamment des enzymes de recombinaisons RAG1
(Mombaerts et al. 1992) et RAG2 (Shinkai et al. 1992; Shinkai et al. 1993). Si ce processus
de recombinaison génique est productif, la chaîne β fonctionnelle peut s’apparier alors avec
un substitut de chaîne α, la pré-chaîne α (pTα) pour former à la surface des thymocytes le
complexe pré-TCR (Saint-Ruf et al. 1994; von Boehmer 2005). Afin de pouvoir signaler
activement, le pré-TCR ne peut pas être exprimé seul à la membrane, il faut qu’il soit associé
à d’autres molécules cruciales pour les évènements de signalisation proximale, les
15
Introduction : Les lymphocytes T
molécules faisant partie du complexe CD3 (von Boehmer and Fehling 1997). L’initiation de la
transduction du signal par ce complexe permet de lever le blocage au stade DN3 et réprimer
l’expression des gènes codant les enzymes RAG1 et RAG2 conduisant ainsi à l’exclusion
allélique du locus β non réarrangé. Le stade DN4 est associé à la perte du marqueur CD25
puis la co-expression des marqueurs CD4 et CD8 effectué en parallèle d’une prolifération
cellulaire intense. Après 6 à 8 cycles de divisions, la répression du pré-TCR marque le début
de la deuxième étape de maturation des thymocytes, le stade double positif (Alam et al.), soit
80 à 90% des thymocytes totaux (Sebzda et al. 1999). A partir de là, vont débuter les
recombinaisons géniques au niveau du locus de la chaîne α du TCR, concernant les
segments V et J. Un réarrangement fonctionnel va permettre l’appariement des chaînes α et
β du TCR et donc son expression à la surface des cellules DP.
Figure 2. Schéma résumant, d’après des données obtenues à partir de modèles murins, le processus de
+
maturation intra-thymique des précurseurs T ayant pour objectif la génération de lymphocytes T CD4 et
+
T CD8 matures. Durant leur développement aux stades double négatif et double positif, les thymocytes
vont subir un remodelage génique afin d’exprimer un TCR αβ fonctionnel. Le passage au stade simple
positif sera marqué par une sélection positive puis négative des cellules, basée sur les caractéristiques
de leur TCR (restriction, spécificité et affinité).
L’expression du TCR αβ mature à la surface des thymocytes marque le début de la première
sélection des thymocytes : la sélection positive. Ce TCR généré aléatoirement, pour être
sélectionné positivement doit être capable de reconnaître des peptides antigéniques
présentés dans un contexte de CMH du soi.
Le paramètre affinité du TCR vis-à-vis des complexes CMH du soi / peptide antigénique
aboutira à une élimination de près de 90% des thymocytes DP incapables de les
reconnaître. Cette majorité de cellules mourra donc par « négligence » étant dans
l’incapacité d’intégrer les signaux de survie nécessaires par leur TCR. La sélection positive
décrite dans les années 70 (Zinkernagel and Doherty 1974; Bevan 1977; Fink and Bevan
16
Introduction : Les lymphocytes T
1978; Zinkernagel et al. 1978) a lieu dans la partie corticale du thymus par les cTEC
présentant des antigènes du soi (cellules épithéliales corticales thymiques) (Benoist and
Mathis 1989). Plus récemment, une analyse en temps réel par microscopie bi-photonique a
permis de visualiser les contacts entre les thymocytes en développement subissant la
sélection positive et le stroma thymique (Bousso et al. 2002).
Suite à cela, les thymocytes migrent vers la partie basale du thymus au sein de la médulla
où ils subissent la sélection négative. L’objectif étant cette fois d’éliminer les cellules ayant
une trop forte affinité pour les complexes CMH/peptide antigénique du soi. En effet, ces
thymocytes ayant un TCR potentiellement autoréactif pourraient, une fois sortis du thymus
représenter un danger pour l’organisme.
Des travaux utilisant des souris RelB-/- ont montré que l’absence de sélection négative due à
un thymus désorganisé et une atrophie médullaire a pour conséquence l’émergence d’autoimmunité périphérique multi-organes (Weih et al. 1995). D’où l’importance capitale de cette
induction de tolérance centrale des thymocytes, mise en lumière il y a déjà plus de vingt
ans par Polly Matzinger (Matzinger et al. 1984). Depuis, deux mécanismes de sélection
négative ont été décrits. Si un thymocyte autoréactif reconnaît un peptide du soi présenté par
une CPA médullaire (en majorité des cellules dendritiques (DC)), il subira alors une délétion
clonale et sera donc éliminé par apoptose (Page et al. 1996) (figure 3). Une étude
quantitative et cinétique des thymocytes sélectionnés positivement montre qu’entre la moitié
et les deux tiers d’entre eux sont ainsi éliminés (van Meerwijk et al. 1997).
En revanche, la reconnaissance par un thymocyte d’un peptide du soi à la surface d’une
mTec (cellule médullaire épithéliale thymique) aboutira à son inactivation fonctionnelle :
l’anergie. En effet, les mTec expriment de manière ectopique au niveau du thymus des
antigènes caractéristiques d’oganes périphériques (foie, rein). Cette expression est sous le
contrôle de la protéine AIRE (Autoimmune Regulator) régulant l’expression d’une importante
quantité de gènes (Anderson et al. 2002). La déficience de AIRE aussi bien chez des souris
AIRE-/- que chez des patients atteints d’APECED (Autoimmune PolyEndocrinopathy
Candidiasis Ectodermal Dystrophy), pathologie autosomique récessive monogénique,
conduit à des symptômes auto-immuns similaires (Villasenor et al. 2005).
Malgré l’apparente perfection de cette machinerie thymique, des lymphocytes T
potentiellement auto-réactifs et donc dangereux pour l’organisme échappent à cette double
sélection et émergent dans la circulation sanguine ainsi que dans les tissus lymphoïdes
périphériques. Certains antigènes tissulaires ne seraient pas exprimés via AIRE ou a des
niveaux insuffisants pour induire une sélection négative (Klein et al. 2000). Ce défaut
thymique peut-être considéré comme une conséquence évolutionniste permettant de
maximiser la taille du répertoire T en périphérie, conséquence à double tranchant pour
l’organisme, bénéfique dans la lutte contre les pathogènes mais délétère pour la
17
Introduction : Les lymphocytes T
préservation de son intégrité. Heureusement, des mécanismes de tolérance périphérique
au soi existent et ont été décrits (Walker and Abbas 2002; Redmond and Sherman 2005). Il y
a tout d’abord des mécanismes de types « passifs » : ignorance, induction d’apoptose ou
d’anergie. L’induction de tolérance périphérique qualifiée « d’active » est réalisée par les
lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs (Figure 3.).
Figure 3. Schématisation des processus de sélection thymique. Après avoir réarrangé les chaînes α et β
du TCR les thymocytes subissent une première sélection, la sélection positive. La restriction au CMH du
soi conditionne la survie des thymocytes. La sélection négative permet ensuite d’éliminer les thymocytes
ayant une trop forte autospécificité, la tolérance centrale s’opère par induction d’apoptose (délétion
clonale) ou bien par inactivation fonctionnelle (anergie). Une fois la périphérie atteinte, une partie des LT
+
+
potentiellement autoréactifs est contrôlée par les LT CD4 CD25 régulateurs, mécanisme « actif » et
majeur de la tolérance périphérique. La tolérance périphérique pourra également s’opérer par des
mécanismes qualifiés de passifs. En effet, la séquestration de certains antigènes tissulaires au sein de
domaines immunoprivilégiés peut empêcher l’activation de ces clones T autospécifiques.
Les thymocytes ayant survécu à cette sélection impitoyable sortent sous la forme de
lymphocytes T simple positif (SP) dits naïfs (car n’ayant jamais été en contact avec
l’antigène dont ils sont spécifiques). Les thymocytes possédant un TCR restreint par le CMH
de classe II se développent en lymphocytes T CD4+ (Berg et al. 1989), ceux possédant un
TCR restreint par le CMH de classe I se développent en lymphocytes T CD8+ (Teh et al.
1988). Une fois sortie du thymus, ces lymphocytes T vont, par voie systémique, circuler
continuellement entre les différents organes lymphoïdes secondaires dans l’attente de
18
Introduction : Les lymphocytes T
rencontrer leur antigène. C’est d’ailleurs dans ces organes que, par exemple dans le cadre
d’une viro-infection, une cellule dendritique présentant un peptide viral va activer le
lymphocyte T naïf et spécifique de ce peptide antigénique. L’activation de ce lymphocyte T
lui permettra de proliférer, de se différencier et d’acquérir ses fonctions effectrices.
II. Récepteur à l’antigène des lymphocytes T αβ
La rencontre entre un lymphocyte T et une CPA et donc, l’interaction privilégiée entre le TCR
et le complexe CMH/peptide spécifique va permettre l’activation et l’expansion clonale du
lymphocyte T (Davis et al. 1998). La cellule T via son TCR (hétérodimère glycosylé
polymorphe) accumule des informations quantitatives et qualitatives sur cet antigène,
l’objectif étant ensuite de relayer ces informations à l’intérieur de la cellule. Cependant,
l’absence de domaines intracellulaires pour le TCR va nécessiter l’association et le transfert
d’informations de ce récepteur aux molécules CD3, protéines non polymorphes dotées
d’importants domaines intracellulaires de signalisation. Le complexe TCR/CD3 ainsi formé
va pouvoir induire les voies de transduction du signal proximales et précoces permettant
ainsi l’activation de la cellule T (Clevers et al. 1988).
Structure du TCR :
Le TCR est composé de deux chaînes transmembranaires polypeptidiques glycosylées α et
β. Ces glycoprotéines de type I appartiennent à la superfamille des immunoglobulines (Ig).
Chaque chaîne est composée d’un domaine extracellulaire amino-terminal contenant une
région variable (V), une région constante (C) ainsi qu’une région charnière (Figure 4.). De
proximal en distal font suite, un domaine transmembranaire hydrophobe composé de 5 à 12
acides aminés chargés positivement (favorisant la stabilité du complexe TCR/CD3) ainsi que
d’un court domaine cytoplasmique. L’association des deux chaînes α et β se fait par
l’intermédiaire d’un pont di-sulfure (Garcia et al. 1996; Schumacher 2002).
L’ensemble des régions variables (Vα et Vβ) ainsi réunies forme le site de reconnaissance à
l’antigène. Chaque région variable possède trois régions hypervariables appelées CDR
(Complementary Determining Region) (Chothia et al. 1988) par homologie aux CDR
identifiés sur les régions variables des immunoglobulines. Les régions CDR1 et CDR2
permettent la liaison aux molécules de CMH, le CDR3 se liant préférentiellement au peptide
antigénique (Jorgensen et al. 1992; Sant'Angelo et al. 1996).
Le complexe TCR/CD3 :
Le complexe CD3 peut-être qualifié de plateforme de transduction du signal associé à
l’hétérodimère αβ. Il est composé des sous-unités polypeptidiques non polymorphes δ, ε, γ et
19
Introduction : Les lymphocytes T
ζ qui vont s’associer de manière non covalente, afin de former les hétérodimères CD3δε,
CD3γε ainsi que l’homodimère CD3ζζ (Schumacher 2002; Rudolph et al. 2006). A l’exception
du domaine CD3ζ, toutes les sous-unités CD3 possèdent une portion transmembranaire
chargée négativement qui va permettre l’association avec le TCR et surtout favoriser la
stabilité du complexe CD3/TCR (Koning et al. 1990; Manolios et al. 1991).
En réponse à l’engagement du TCR par le complexe CMH/peptide, les portions
cytoplasmiques des molécules CD3 permettent l’initiation de la signalisation grâce à leurs
motifs ITAM (Immunoreceptor tyrosines-based activation motifs : YxxL(X)6-8YxxL) (Figure 4).
Figure 4. Organisation spatiale du complexe TCR/CD3. Le TCR constitué de deux chaînes α (gris) et β
(violet) a pour fonction principale la reconnaissance du complexe CMH/peptide antigénique spécifique.
Cette reconnaissance permet de recueillir des informations qualitatives et quantitatives qui seront
traduites en cascade par des voies de signalisation intracellulaire induites par les molécules CD3. En
effet, seules les molécules CD3δε, CD3γε et CD3ζζ vont pouvoir transduire ces signaux grâce à leurs
larges domaines cytoplasmiques portant des motifs ITAMs.
Les molécules CD3γ, CD3δ et CD3ε possèdent chacun un motif ITAM, chaque molécule
CD3ζ possédant trois motifs ITAM. La phosphorylation des tyrosines de ces motifs ITAM va
permettre le recrutement de protéines de signalisation importantes (Samelson et al. 1985).
L’assemblage du complexe s’effectue dans le réticulum endoplasmique par des mécanismes
rigoureusement contrôlés. La chaîne α du TCR s’associe dans un premier temps à
20
Introduction : Les lymphocytes T
l’hétérodimère CD3δε, permettant ainsi l’interaction entre l’hétérodimère CD3γε et la chaîne β
du TCR. Les deux trimères ainsi formés s’associent pour former l’hexamère suivant
TCRαβ/CD3γε/CD3δε. Cet hexamère va enfin s’associer avec l’homodimère CD3ζζ pour
former un complexe TCR/CD3 fonctionnel qui pourra être
exprimé à la surface du
lymphocyte T (Alarcon et al. 1988; Huppa and Ploegh 1997).
La stoechiométrie du complexe TCR/CD3 a longtemps été source de débats, mais il semble
aujourd’hui établi qu’un seul hétérodimère TCR αβ s’associe avec un seul hexamère CD3.
Les étapes d’assemblages résultant de la formation d’une interface à trois hélices
transmembranaires impliquent un résidu basique du TCR et une paire de résidus acides des
dimères CD3 (Call et al. 2002; Call and Wucherpfennig 2005; Kuhns et al. 2006).
III. Organisation des gènes du TCR
Afin de se prémunir au mieux face à l’immense diversité des agents pathogènes, l’organisme
a eu pour unique solution de générer aléatoirement la spécificité des TCR pour les peptides
antigéniques. De cette façon, la taille et la diversité du répertoire des cellules T naïves qui
vont émerger du thymus vers la périphérie sont maximisées.
Le réarrangement des gènes codant pour les chaînes α et β est réalisé au cours du
développement intrathymique des lymphocytes T. Les processus de recombinaison génique
employés vont être très similaires à ceux utilisés pour les réarrangements des chaînes
lourdes et légères des immunoglobulines au cours de la lymphopoïèse B. Chez l’homme, les
loci α et β sont composés, dans leur configuration germinale de segments V (Variable), J
(Joining) et C (Constant) pour la chaîne α et V, D (Diversity), J et C pour la chaîne β.
Figure 5. Réarrangements des segments de gène codant les chaînes α et β du TCR. La chaîne β est la
première à être réarrangée, d’abord les segments D et J, puis le segment V sera réarrangé. Un
réarrangement productif permettra d’initier le réarrangement de la chaîne α. Des mécanismes
enzymatiques additionnels permettront d’accroître la variabilité du répertoire des TCR.
21
Introduction : Les lymphocytes T
Les gènes de la chaîne β se réarrangent en premier. On observe tout d’abord l’association
d’un segment D avec un segment J, puis un segment V est réarrangé avec le segment DJ
précédemment obtenu (Figure 5.). Un réarrangement productif de la chaîne β permet son
association avec la chaîne pTα ainsi que l’expression à la surface des thymocytes DN (cf.
Développement et Sélection des lymphocytes Tαβ). Suite à cela, le réarrangement des
gènes codant la chaîne α se déroulera de façon similaire. Par ces mécanismes, la
multiplicité des segments de gènes permet d’établir une importante diversité combinatoire et
jonctionnelle (Arden et al. 1995).
Avec toujours pour objectif d’augmenter cette diversité, des mécanismes enzymatiques
additionnels vont intervenir. L’exonucléase (élimination aléatoire de nucléotides) ou la
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) (ajout aléatoire de nucléotides) favorisent
l’obtention d’un répertoire de TCR encore plus vaste. Il est estimé à plus de 1013 le nombre
de TCR pouvant être sélectionnés au cours du développement thymique. Des approches
expérimentales pour évaluer cette diversité en périphérie ont donné les résultats suivants :
2x106 TCR chez la souris et 2x107 TCR chez l’homme (Nikolich-Zugich et al. 2004).
22
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Activation des lymphocytes T
Le pré-requis pour l’activation T, comme introduit plus haut, est conditionné par l’interaction
productive entre d’une part un lymphocyte T et d’autre part une cellule présentatrice
d’antigène. Lors de ce contact cellulaire, il va y avoir reconnaissance par le TCR de la cellule
T du complexe CMH/peptide porté par la CPA. Cette interaction moléculaire va permettre
l’induction de réponses immunitaires adaptatives hautement spécifiques. L’étude des
paramètres contrôlant positivement ou négativement cette interaction cellulaire est donc d’un
grand intérêt. De nombreuses équipes de recherche travaillent sur cette problématique qui,
malgré toutes les avancées obtenues lors des dernières décennies, suscite encore de
nombreuses interrogations. Au premier abord cette interaction semble simple, cependant
plusieurs obstacles importants existent.
En effet, la mesure de l’affinité entre le TCR et le complexe CMH/peptide a révélé une faible
affinité de liaison avec une constante de dissociation comprise entre 10-4 et 10-7 M (Weber et
al. 1992; Alam et al. 1996). L’analyse par technologie BIAcore a permis de mesurer la demivie d’association entre le TCR et son ligand, cette demi-vie n’étant que de quelques
secondes (Matsui et al. 1994; Davis et al. 1998). Ces études quantitatives mettent en lumière
un paradoxe : comment avec des paramètres cinétiques si défavorables (faible affinité et
demi-vie d’association rapide) l’interaction TCR/CMH/peptide peut-elle engendrer une
réponse moléculaire de signalisation aussi importante et sophistiquée ?
De plus, un autre point négatif va être le faible nombre de complexes CMH/peptides
spécifiques d’un TCR présent à la surface d’une CPA. La majorité des molécules de CMH à
la surface de la CPA exprimeront des peptides du soi issus du catabolisme de protéines
intracellulaires ou provenant du milieu extracellulaire. Toutefois, entre 60 et 200 complexes
CMH/peptide antigénique spécifique à la surface d’une CPA suffisent à déclencher une
réponse lymphocytaire T (environ 0,03% des complexes CMH/peptide exprimés à la
membrane plasmique d’une CPA) (Demotz et al. 1990).
Le lymphocyte T va donc devoir scanner la surface de la CPA à la recherche de son ligand
antigénique. La probabilité que les complexes CMH/peptique spécifique se trouvent dans la
zone initiale de contact entre ces deux cellules est relativement faible. L’initiation de la
transduction du signal en aval du TCR est donc due à une interaction moléculaire hautement
sensible (une faible quantité de ligand devant engendrer une forte réponse) et spécifique
(très peu de ligands spécifiques parmi un océan de ligands non spécifiques). Tous ces
éléments réunis soulèvent donc une nouvelle interrogation sur les mécanismes développés
par la cellule T afin d’assurer une détection efficace de faibles concentrations antigéniques.
23
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Un paramètre compliquant également l’interaction TCR/CMH/peptide est la taille réduite du
TCR par rapport aux autres molécules membranaires, le complexe TCR/CMH ne mesurant
environ que 15 nm (Garcia et al. 1996). La taille réduite du TCR ne va pas être un atout pour
interagir avec son ligand sachant que d’autres molécules membranaires comme la
phosphatase CD45 ont une taille de 45 nm (Cyster et al. 1991). Cela suggère que des
réarrangements moléculaires membranaires à l’aire de contact cellule T/CPA doivent
s’opérer.
Un dernier point rendant encore plus complexe la mécanistique de cette interaction est la
nécessité de la soutenance de la signalisation, pour l’activation et la mise en place des
fonctions effectrices des lymphocytes T (Goldsmith and Weiss 1988; Valitutti et al. 1995;
Iezzi et al. 1998).
Tous ces éléments sur la mécanistique d’activation des lymphocytes T ont soulevé de
nombreuses questions. Afin d’essayer d’y répondre différents modèles ont été proposés.
I. Sensibilité et spécificité des TCR
Le modèle du « Kinetic Proofreading » (McKeithan 1995)
Le modèle de « kinetic proofreading » a été à l’origine proposé par Hopfield pour expliquer la
redoutable efficacité lors des processus de réplication de l’ADN et de transcription/traduction
conduisant à la synthèse protéique (Hopfield 1974). S’appuyant sur ce concept, c’est en
1995 que McKeithan transpose le modèle du « kinetic proofreading » aux voies de
signalisation induites en aval du TCR (McKeithan 1995). Les bases de ce modèle reposent
sur la notion de temps d’interaction entre le TCR et son ligand. Il explique tout d’abord dans
son travail, que l’interaction entre le TCR et son ligand ne se fait pas parallèlement à
l’activation de la cellule T mais nécessite un certain temps pour engendrer cette réponse. Ce
délai se justifie biologiquement par la nécessité d’étapes successives de phosphorylations
sur des tyrosines essentielles à la mise en place de voies de signalisation productives. Ceci
permet de comprendre qu’une interaction entre un TCR et un complexe CMH-peptide non
spécifique ayant un taux de dissociation très rapide ainsi qu’un temps d’interaction très court
ne peut conduire qu’à l’obtention d’un signal abortif. Dans les mêmes concentrations
antigéniques, l’interaction TCR-CMH/peptide spécifique plus stable pourra générer un signal
d’activation.
La schématisation du modèle est la suivante (Figure 6.) : l’interaction TCR/CMH/peptide
spécifique ou non spécifique forme un complexe (C0). Ce complexe pouvant à tout moment
être dissocié, est converti en une série d’intermédiaires (Ci) avec pour but d’obtenir un
complexe actif (CN) qui permet d’induire la réponse biologique. Chaque étape est nécessaire
24
Introduction : Activation des Lymphocytes T
et consomme de l’énergie car elle implique des processus enzymatiques de phosphorylation
sur tyrosines. Toutefois chacun des intermédiaires peut-être dissocié et donc chaque étape
peut-être réversible. Dans le cas de la signalisation du TCR, des phosphatases permettront
le processus inverse en induisant un retour à l’état basal pour chacun des intermédiaires
réactionnels.
Pour des complexes TCR/CMH/peptide non spécifique, le taux de dissociation est
suffisamment important pour empêcher la formation du complexe actif (CN).
Figure 6. Schématisation du modèle de « kinetic proofreading » adapté à la transduction du signal en aval
du TCR. Le complexe C0 formé entre le TCR d’une part et le complexe CMH/peptide d’autre part va subir N
modifications afin de produire le complexe actif CN seul capable d’induire la signalisation. Chaque étape
est réversible, la dissociation du complexe entraînant un retour des intermédiaires à leur état basal.
Ce modèle proposé paraît donc intéressant car il permettrait théoriquement d’expliquer la
haute sélectivité du TCR. En effet, la transduction du signal ne peut être mise en place que
si l’interaction TCR/CMH-peptide est suffisamment spécifique pour durer assez longtemps
afin que le complexe actif CN se forme. Depuis, de nombreux travaux utilisant des variants
peptidiques induisant soit un signal inhibiteur (peptide antagoniste) soit un signal partiel
(peptide antagoniste partiel) ont aidé à mieux comprendre les mécanismes d’engagement du
TCR. Dans le cas des variants « peptidiques altérés » ou APL (Altered Peptide Ligand) qui
ont une affinité de liaison plus faible, il y aura stimulation du TCR mais absence de
signalisation soutenue permettant l’obtention du complexe actif. Un peptide antagoniste
induira une rapide dissociation du complexe TCR/CMH/peptide, l’interaction sera donc non
productive (Lyons et al. 1996). Ainsi, avec ce modèle prenant en compte surtout les aspects
sélectifs et affins de l’interaction, une faible concentration de complexes CMH/peptide de
haute affinité sera plus efficace qu’une forte concentration de CMH/peptide de basse affinité.
Ce modèle met donc en avant l’affinité d’interaction comme paramètre crucial conditionnant
le temps d’interaction entre le TCR et son ligand pour activer la signalisation cellulaire.
25
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Cependant, ce modèle ne permet pas de déterminer la durée d’interaction suffisante pour
induire une réponse biologique.
En 1996, Rabinowitz a apporté une nouvelle pierre au modèle du « kinetic proofreading » en
proposant le modèle de « kinetic discrimination » (Rabinowitz et al. 1996). Il propose que
l’utilisation d’un peptide antagoniste en plus de ne pas aboutir au travers de la cascade
d’intermédiaires au complexe actif CN va avoir un effet inhibiteur sur l’activation de la cellule
T. Une des zones d’ombre de ce modèle de « kinetic proofreading » réside dans
l’identification moléculaire des intermédiaires réactionnels. Récemment une équipe a montré
suite à la stimulation d’un lymphocyte T par un peptide agoniste, un changement
conformationnel (détecté par l’utilisation de l’anticorps APA1/1) au niveau de la chaîne CD3ε
non observable après stimulation par un peptide antagoniste (Risueno et al. 2005). Pourraiton identifier ce changement de conformation lié à la pleine activation du lymphocyte T
comme un des intermédiaires réactionnels du « kinetic proofreading » ?
Ce modèle pourrait prendre toute sa dimension biologique au cours de la sélection thymique
où l’affinité de l’interaction TCR/CMH/peptide conditionne le devenir des thymocytes en
développement (Alam et al. 1996).
Le modèle du « Serial Triggering » (Valitutti, 1995)
La sensibilité de détection de l’antigène est permise pour les lymphocytes B par une haute
affinité de liaison entre leur récepteur (BCR : B Cell Receptor) et l’antigène spécifique. Le
paradoxe des lymphocytes T est d’assurer une haute sensibilité de détection avec une faible
affinité d’interaction. En effet, des lymphocytes TH (T helpers) ou T auxiliaires sont capables
de s’activer, de proliférer ainsi que de produire des cytokines en réponse à une CPA
présentant entre 50 et 100 complexes CMH/peptide spécifique (Demotz et al. 1990). Des
études plus récentes ont montré qu’un seul complexe CMH/peptide est capable d’induire une
signalisation calcique dans un lymphocyte T CD4+ (Irvine et al. 2002) et que trois complexes
CMH/peptide sont capables d’engendrer la réponse cytotoxique des CTL (Cytotoxic T
Lymphocyte) (Purbhoo et al. 2004). Ces résultats suggèrent que l’activation T va se dérouler
au niveau d’une zone de contact privilégiée où peu de complexes CMH/peptide spécifique
au milieu d’une masse de complexes CMH/peptide non spécifique pourraient permettre la
pleine activation du lymphocyte T. Le rôle de ce site de contact entre le lymphocyte T et la
CPA dans l’induction de la signalisation a été documenté par plusieurs travaux
morphologiques (Donnadieu et al. 1994; Valitutti et al. 1995; Wulfing et al. 1997). Les
résultats obtenus ont permis de comprendre que les lymphocytes T n’étaient pas passifs
dans la reconnaissance du ligand antigénique mais scannaient activement la CPA à la
recherche du complexe CMH/peptide spécifique grâce notamment au cytosquelette d’actine
26
Introduction : Activation des Lymphocytes T
(Valitutti et al. 1995). Il a également été montré que l’internalisation et le recyclage du TCR
faisaient suite à l’interaction du TCR avec son ligand spécifique (Padovan et al. 1993).
S’appuyant sur ces éléments, en 1995 Valitutti et al. ont proposé un nouveau concept
d’activation des lymphocytes T : le « serial triggering » ou engagement en série des TCR. Ce
concept a permis d’expliquer le mécanisme sous-jacent au fait que seulement un petit
nombre de complexes CMH/peptide spécifique liant avec une faible affinité le TCR, peuvent
pleinement activer un lymphocyte T (Valitutti and Lanzavecchia 1997). En effet, dans ce
travail les auteurs ont pu observer que lors d’un contact lymphocyte T/CPA aboutissant à la
mise en place d’une signalisation soutenue, le nombre de TCR engagés était supérieur au
nombre de complexes CMH/peptide spécifique. Ce modèle se base donc sur le fait que
grâce à un taux de dissociation entre le TCR et son ligand assez important, un complexe
CMH/peptide après dissociation d’un premier TCR peut engager séquentiellement un
deuxième TCR (Figure 7.). Ce modèle exige une dynamique moléculaire importante au
niveau du site de contact entre la cellule T et la CPA, notamment par l’apport régulier de
nouveaux TCR à engager afin de maintenir la signalisation soutenue. Le temps d’interaction
TCR/CMH/peptide doit être assez long pour induire un signal tout en étant assez court pour
permettre la dissociation et l’engagement rapide d’un nouveau TCR afin de soutenir la
signalisation. Le résultat de cet engagement en série des TCR peut-être quantifié
expérimentalement en mesurant l’internalisation des TCR qui va varier proportionnellement à
la concentration en complexes CMH/peptide spécifique présentés par la CPA (Valitutti and
Lanzavecchia 1997; Coombs et al. 2002).
Figure 7. Modèle d’engagement en série des TCR ou « serial triggering ». Un seul complexe CMH/peptide
spécifique peut engager séquentiellement plusieurs TCR durant l’interaction prolongée entre le
lymphocyte T et la CPA. L’engagement d’un TCR va permettre le recrutement de protéines de
signalisation et la mise en place des voies de transduction du signal. Puis le TCR engagé se libère de
l’interaction avec le complexe CMH/peptide qui est alors libre de pouvoir engager un nouveau TCR. Les
TCR engagés (en bleu) sont finalement internalisés.
27
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Un peptide agoniste sera donc optimal dans ce modèle pour l’activation d’un lymphocyte T
au contraire d’un peptide antagoniste qui occupera un TCR sans permettre l’induction de la
signalisation. Le « serial triggering » permet donc de mieux appréhender les effets inhibiteurs
des peptides antagonistes, car lorsque ces derniers ont engagé des TCR, ces TCR ne sont
plus disponibles pour lier des peptides agonistes. D’autres études, par l’utilisation de variants
peptidiques dont le taux de dissociation est diminué ou augmenté par rapport au peptide
agoniste de référence, ont mieux documenté les conséquences de la spécificité de l’antigène
sur l’activation T (Kalergis et al. 2001). En 1998, Hudrisier et al. ont montré l’importance de la
fréquence de l’engagement en série des TCR pour la réponse fonctionnelle des CTL. En
effet, la liaison covalente donc permanente entre le TCR et le complexe CMH/peptide abolit
la signalisation soutenue dans les lymphocytes T (Hudrisier et al. 1998).
Le « serial triggering » est donc un modèle intéressant permettant de comprendre comment,
avec si peu de ligands antigéniques spécifiques à leur surface et une faible affinité de liaison
de ces ligands avec le TCR les interactions lymphocyte T/CPA peuvent être aussi
productives. De plus dans ce modèle, la cinétique d’engagement des TCR doit être optimale
pour pouvoir induire la signalisation soutenue, exigeant donc un peptide agoniste hautement
spécifique. Cet autre aspect du modèle permet donc de comprendre la haute spécificité des
réponses T in vivo résultat d’une sélection drastique pour la CPA offrant la stimulation
optimale.
Il serait tentant ainsi de spéculer sur l’existence de deux stratégies différentes pour la
reconnaissance antigénique entre BCR et TCR. Le BCR serait plutôt sélectionné sur le
paramètre affinité, l’interaction la plus affine étant la plus productive, alors que le TCR serait
plus finement sélectionné pour une cinétique d’engagement de son ligand optimale.
II. Activation de la Cellule T
Activation de la Cellule T et Valence des TCR
La nécessité de la multimérisation des TCR pour permettre l’activation des lymphocytes T
est un dogme qui a récemment été remis en question. Cette théorie a été établie suite au
constat que l’utilisation d’anticorps anti-CD3, afin d’activer une cellule T, était très efficace du
fait de leur potentiel à agréger ou « cross-linker » les TCR (Kappler et al. 1983). Plus tard
des travaux ont supporté ce prérequis de multimérisation en montrant que l’induction des
réponses calciques dans les lymphocytes T nécessite l’utilisation de multimères solubles de
complexes CMH/peptide (Boniface et al. 1998).
Plusieurs évidences remettent toutefois en discussion cette notion de multimérisation des
TCR pour l’activation des lymphocytes T. En effet, les complexes CMH/peptides spécifiques
28
Introduction : Activation des Lymphocytes T
dans des conditions physiologiques sont à l’état monomérique et leur densité à la surface de
la CPA est très faible rendant la probabilité d’engagement simultané de plusieurs TCR et
donc d’agrégation de ces TCR quasi-nulle. Allant dans ce sens là, il a été montré qu’un seul
ligand antigénique permettait d’induire la réponse cytotoxique des CTL (Sykulev et al. 1996).
D’autres données morphologiques indiquent qu’un seul complexe TCR/CMH/peptide est
capable d’induire la mobilisation de calcium intra-cellulaire et donc la signalisation soutenue
au sein d’un lymphocyte T CD4+ (Irvine et al. 2002). Ces travaux ont permis de souligner
l’importance du co-récepteur CD4 dans l’engagement du TCR avec son ligand. Ces résultats
ont été confirmés en 1998 par Delon et al., démontrant le rôle important du corécepteur CD8
pour des lymphocytes T CD8+ adhérents activés par des complexes CMH/peptide
monomériques à l’état soluble (Delon et al. 1998). L’induction de la signalisation observée
est similaire à celle obtenue en traitant par des anticorps anti-CD3.
La somme de ces résultats expérimentaux a donc conduit à l’établissement de trois modèles
d’activation des lymphocytes prenant en compte la valence des TCR ainsi que l’influence
des corécepteurs.
Le modèle d’hétérodimérisation du TCR :
Ce modèle a été initialement proposé pour les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ postulant
l’hétérodimérisation du TCR avec le corécepteur CD4 ou CD8 lors de l’activation par des
monomères de complexe CMH/peptide (Figure 8.). Ces corécepteurs étant associés à la
protéine tyrosine kinase Lck (Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) cela permet la
phosphorylation des chaînes CD3 associées au TCR et donc d’initier la transduction du
signal.
Malgré l’importance du corécepteur CD8 dans la stabilité de l’interaction entre le TCR et le
complexe CMH/peptide (Luescher et al. 1995), le paramètre crucial à prendre en compte
pour valider ce modèle est l’état d’adhérence des cellules T à leur cible pour des
lymphocytes T CD8+ ou bien à une CPA pour des lymphocytes T CD4+ (Delon et al. 1998;
Irvine et al. 2002). En effet, en suspension, les lymphocytes T ne peuvent être activés par
des ligands monomériques (Boniface et al. 1998).
L’adhérence à une CPA ou bien à un substrat de fibronectine provoque une diminution du
seuil d’activation des cellules T en entraînant notamment une augmentation du calcium
intracellulaire, une phosphorylation de Lck, pyk2, de la paxilline ainsi qu’une activation de la
voie des MAPkinases suite à l’engagement des intégrines (Doucey et al. 2003;
Randriamampita et al. 2003; Trautmann and Randriamampita 2003).
29
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Figure 8. Modèle d’hétérodimérisation du TCR. Dans ce modèle, des monomères de complexe
CMH/peptide spécifique peuvent activer une cellule T grâce aux corécepteurs CD4 ou CD8 associés au
TCR. L’association de ces corécepteurs à la protéine tyrosine kinase Lck va permettre l’initiation de la
transduction du signal en aval du TCR en permettant la phosphorylation des molécules CD3.
L’ensemble de ces éléments permet donc de réconcilier ces différents travaux sur le
potentiel de monomères de complexe CMH/peptide à activer des lymphocytes T.
Le modèle de pseudodimérisation du TCR :
Ce second modèle a été proposé suite à plusieurs constatations. En premier lieu, le rapport
entre le nombre de complexes CMH/peptide spécifiques et le nombre de complexes
CMH/peptide du soi ou « endogène », est situé entre 10-3 et 10-4. De plus, ces complexes
CMH/peptide du soi ont une affinité pour le TCR seulement dix fois plus faible sans pour
autant engendrer un signal au sein du lymphocyte T (Boniface et al. 1998). Récemment, des
approches expérimentales utilisant de la microscopie à fluorescence à trois dimensions ont
permis, en marquant des complexes de CMH/peptide (I-E(k)/peptide) avec de la
phycoérythrine, de montrer qu’un seul complexe était suffisant pour initier l’activation de la
cellule T (Irvine et al. 2002). En 2005, Krogsgaard et al. ont montré que le recrutement ou
l’absence de recrutement de complexes CMH/peptide du soi au niveau de l’aire de contact
entre lymphocyte T et CPA avait un impact positif ou négatif sur la réponse induite par le
complexe CMH/peptide spécifique (Krogsgaard and Davis 2005).
Le postulat de ce modèle de pseudodimérisation repose donc sur le fait que lors de
l’interaction entre un TCR (TCR1) et un complexe CMH/peptide agoniste, un autre TCR
(TCR2) interagissant avec un complexe CMH/peptide du soi peut lier via son co-récepteur
CD4 ce premier TCR (TCR1) (Figure 9.). Il en résulte alors la formation d’un pseudodimère
(TCR1/ligand agoniste/TCR2/ligand endogène) qui, notamment grâce aux molécules CD4
30
Introduction : Activation des Lymphocytes T
associées aux deux TCR, va pouvoir efficacement initier la transduction du signal ; les
corécepteurs CD4 apportant la protéine tyrosine kinase majeure Lck qui va phosphoryler les
molécules CD3. Le corécepteur déjà décrit comme essentiel dans l’initiation de la
signalisation (Irvine et al. 2002) va prendre toute sa dimension avec ce modèle où, en plus
de jouer un rôle fonctionnel au niveau de la transduction du signal, il stabilise physiquement
ce pseudodimère (Krogsgaard et al. 2005).
Ce modèle laisse à penser également que lors de la sélection thymique le but à atteindre est
double. En effet, il ne suffirait alors pas de sélectionner les lymphocytes T sur la base de la
reconnaissance du non-soi, mais de les sélectionner également sur la capacité du TCR à
utiliser des complexes CMH/peptide du soi pour permettre une sensibilité maximale de la
cellule T (Stefanova et al. 2002).
Il est tentant également de considérer ce modèle comme un mécanisme moléculaire
participant au « serial triggering » et n’empêchant pas cet engagement en série des TCR
même avec des ligands de haute affinité. La durée d’interaction importante entre le TCR et
ses ligands serait alors compensée par la capacité à lier un TCR2.
Figure 9. Modèle de pseudodimérisation des TCR. Lors de l’interaction entre un TCR1 et son ligand
agoniste, un TCR2 interagissant avec un ligand endogène va pouvoir lier ce complexe grâce à son
corécepteur CD4. Le pseudodimère ainsi formé permet d’améliorer la sensibilité de la cellule T.
L’initiation de la transduction du signal sera ainsi favorisée par le co-recrutement des protéines tyrosines
kinases Lck associées aux corécepteurs CD4 des TCR1 et TCR2.
Le modèle des TCR multivalents :
Ce troisième modèle proposé par Alarcon et al. en 2006 complète en quelque sorte les deux
précédents modèles en étudiant plus finement la sensibilité des lymphocytes T et donc leur
capacité à discriminer et intégrer différentes concentrations antigéniques.
D’anciens travaux utilisant des souris transgéniques exprimant deux hétérodimères de TCR
αβ discernables, après immunoprécipitation des complexes TCR/CD3, ont montré que ces
complexes étaient monovalents (Punt et al. 1994). En 2002, une autre équipe a apporté de
nouvelles données confirmant ces premiers éléments dans un système de traduction in vitro
des complexes TCR/CD3 en copurifiant ensuite ces protéines après les avoir produites (Call
31
Introduction : Activation des Lymphocytes T
et al. 2002). Cependant, l’arrivée de nouvelles techniques comme la FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfert) a permis, sans altérer l’intégrité membranaire de la cellule T,
de pouvoir observer deux hétérodimères TCR αβ au sein d’un même complexe TCR/CD3
(Fernandez-Miguel et al. 1999). En complément de ces approches de FRET, des techniques
de microscopie électronique ont pu également montrer la co-existence à la surface de
lymphocytes T murins et humains de complexes TCR/CD3 monovalents et multivalents
(Schamel et al. 2005).
Alarcon et al. ont réconcilié en 2006 ces résultats divergents sur la stoechiométrie du
complexe TCR/CD3 en se basant sur un différentiel de sensibilité aux détergents (digitonine)
entre
les
complexes
monovalents
et
multivalents.
Contrairement
aux
complexes
monovalents, les complexes multivalents sensibles à la déplétion en cholestérol seraient
détruits par l’utilisation de détergents trop forts. Ces auteurs ont donc proposé qu’à de faibles
concentrations antigéniques, la détection se ferait grâce aux complexes multivalents,
l’augmentation de l’avidité compensant la faible concentration en ligands agonistes. A
l’inverse, à de fortes concentrations en antigènes, les complexes multivalents étant saturés,
ce serait les complexes monovalents qui assureraient la réponse (Figure 10.) (Alarcon et al.
2006).
Cela permettrait au lymphocyte T d’être le plus résolutif possible face à la stimulation
antigénique, aussi bien pour des faibles que pour des fortes concentrations en antigène, afin
de pouvoir au mieux adapter et traduire sa réponse par un ajustement de l’intensité de la
signalisation intra-cellulaire.
32
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Figure 10. Modèle des TCR multivalents. (A) Pour de faibles concentrations en antigènes les complexes
TCR/CD3 multivalents sont mis en jeu. (B) Des concentrations en antigènes moyennes saturent les
complexes TCR/CD3 multivalents. (C) A de fortes concentrations en ligands agonistes, les complexes
TCR/CD3 monovalents sont engagés. (D) Des concentrations encore plus fortes en antigènes induisent la
saturation de l’ensemble des complexes, la réponse de la cellule T est alors maximale.
Le modèle de « kinetic segregation »
Ce modèle est né il y a maintenant un tout petit peu plus de dix ans sur la base de
différentes observations. Il postule que l’initiation de la signalisation est due à une
réorganisation géographique des protéines transmembranaires au niveau de la zone de
contact entre un lymphocyte T et une CPA (Davis and van der Merwe 1996; Davis and van
der Merwe 2006).
Tout d’abord, cette réorganisation est basée sur les différences de taille entre, d’une part le
TCR et les molécules accessoires, et d’autre part, les grandes molécules qui les entourent
comme les phosphatases CD45, CD43 ou CD148 ayant une taille trois fois plus importante.
Ces grandes molécules sont exclues de la zone privilégiée de contact où s’initie la
transduction du signal (Cyster et al. 1991; Leupin et al. 2000; Lin and Weiss 2003). En plus
d’être exclues, ces grosses molécules (notamment la protéine CD45) vont avoir un impact
fonctionnel direct sur la signalisation. CD45 est la phosphatase la plus abondante au sein
33
Introduction : Activation des Lymphocytes T
des lymphocytes T. Il a été montré que pour la lignée murine de lymphomes T BW5147, elle
assure plus de 90% de l’activité tyrosine phosphatase transmembranaire (Mustelin et al.
1989). Elle posséde en effet plusieurs fonctions, premièrement, elle assure le maintien de
Lck sous sa forme active (par déphosphorylation de sa tyrosine inhibitrice). Elle va ensuite
avoir une fonction inhibitrice sur l’activation du TCR en déphosphorylant CD3ζ (Furukawa et
al. 1994), ZAP-70 ainsi que la tyrosine activatrice de Lck (D'Oro et al. 1996).
Il a également été documenté que les protéines tyrosines kinases sont constitutivement
activées dans les cellules T non stimulées. En effet, le traitement de lymphocytes T par du
pervanadate
(inhibiteur
des
phosphatases)
permet
de
reproduire
la
signalisation
normalement induite lors de l’interaction entre le TCR et son ligand spécifique. Dans un
modèle expérimental utilisant des cellules Jurkat, il a même été montré que ce traitement
permet d’induire la production d’IL-2 (reflet d’une activation complète de la cellule) (Secrist et
al. 1993). La somme de ces données expérimentales montre qu’il existe un équilibre entre
kinases et phosphatases au sein des lymphocytes T. Le subtil déplacement de cet équilibre
assure une fine modulation de l’activation des cellules T.
A l’opposé des grandes molécules qui sont exclues de la zone privilégiée d’interaction entre
lymphocyte T et CPA, lors de cette réorganisation membranaire, des molécules accessoires
de plus petite taille comme le CD2 sont recrutées dans cette zone. Les complexes
TCR/CMH et CD2/CD58 ayant la même taille (15 nm), CD2 pourrait alors jouer un rôle dans
la reconnaissance antigénique en permettant un rapprochement entre les membranes du
lymphocyte T et de la CPA (Davis and van der Merwe 2006).
En reprenant tous ces observations, Davis et van der Merwe ont donc proposé le modèle de
« kinetic segregation ».
A l’état de repos, c'est-à-dire en absence de stimulation antigénique, les protéines
transmembranaires des lymphocytes T diffusent de manière aléatoire dans la membrane. Il y
a alors équilibre entre phosphorylations et déphosphorylations. Lors de la rencontre entre un
lymphocyte T et une CPA lui présentant son ligand antigénique spécifique il y a alors
réorganisation des molécules de surface qui vont ségréger suivant leur taille. Cela va
permettre de créer des zones de contact privilégiées contenant les complexes TCR/CD3 où
il y aura un enrichissement en kinases (CD2, CD28) ainsi qu’une exclusion des
phosphatases (CD45), facteurs favorables à la reconnaissance de l’antigène et à l’initiation
de la signalisation induite par le TCR. L’activation des complexes TCR/CD3 permettra le
recrutement de la tyrosine kinase ZAP-70 qui assurera la mise en place séquentielle des
voies de transduction du signal (Figure 11.).
34
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Figure 11. Modèle de « kinetic segregation ». (a) La cellule T est au repos, les molécules
transmembranaires diffusent librement, il y a équilibre entre phosphatases et kinases. (b-d) Les TCR sont
engagés par les complexes CMH/peptide, il y a alors réorganisation spatiale des molécules de surface
déplaçant l’équilibre entre phosphatases et kinases permettant ainsi l’induction de la signalisation.
Ce modèle postule donc que l’activation de la cellule T ainsi que la signalisation sont
maintenues tant que ces zones privilégiées existent. Lorsque le TCR ou les molécules
accessoires quittent ces zones, il y a alors arrêt de la signalisation. La demi-vie d’interaction
entre TCR/CMH/peptide apparaît donc comme le paramètre crucial pour la modulation de
l’activation du lymphocyte T. Une courte durée d’interaction entre le TCR et son ligand
conduirait à un signal insuffisant pour permettre l’activation de la cellule T (Davis and van der
Merwe 2006).
Les microdomaines lipidiques
La membrane plasmique d’une cellule eucaryote contient bien plus de types de lipides
différents que ceux nécessaires à la formation d’une simple bicouche lipidique (Bretscher
1973). Ce constat a donc soulevé une question importante sur la fonction biologique de cette
diversité lipidique pour la cellule. Cependant durant des années, l’idée que cette diversité
lipidique pourrait permettre l’organisation de la membrane plasmique en régions jouant des
rôles différents dans la physiologie cellulaire n’a pas réellement suscité d’intérêt au sein de la
communauté scientifique. Le changement dans la considération du potentiel de ces
microdomaines est apparu avec l’essor de la biophysique des lipides et l’utilisation de
détergents permettant une extraction différentielle des lipides. Cela a permis de mettre en
évidence de manière indirecte l’existence de microdomaines lipidiques ou « rafts » associés
latéralement. Ils ont été biochimiquement identifiés comme étant une phase lipidique
insoluble dans des détergents non ioniques à 4°C. Les rafts sont des domaines de faible
35
Introduction : Activation des Lymphocytes T
taille avec un diamètre généralement inférieur à 70 nm. Ils sont enrichis en sphingolipides
(glycosphingolipides et sphingomyéline) et en cholestérol (Simons and Ikonen 1997). De
nombreux travaux ont mis en lumière l’importance des rafts dans de multiples processus
biologiques comme la mise en place des voies de transduction du signal, l’adhérence
cellulaire, la migration cellulaire et l’organisation du cytosquelette (processus d’endocytose et
d’exocytose) (Munro 2003). Il a de plus été montré que ces rafts ont également de
l’importance dans des situations physiopathologiques. Ils constituent un lieu privilégié pour
l’entrée dans la cellule de pathogènes viraux et bactériens, ils participent également à
l’assemblage des particules virales (Suomalainen 2002). Dans la maladie d’Alzheimer, les
rafts sont le lieu de formation des plaques amyloïdes (Ehehalt et al. 2003).
Partant de là, de nombreux groupes ont suspecté un rôle des « rafts » dans l’activation des
lymphocytes T et la mise en place des voies de transduction du signal en aval du TCR.
L’insolubilité des rafts a favorisé l’étude des protéines qu’ils contiennent. Ainsi il a pu être
montré que certaines protéines sont présentes de façon constitutive alors que d’autres
rejoindront les rafts après avoir subi des modifications post-traductionnelles : palmitoylation
ou ajout d’une ancre GPI (glycophosphatidylinositol). Les molécules CD4 (Fragoso et al.
2003; Balamuth et al. 2004) et CD8 (Arcaro et al. 2000) subiront ainsi une palmitoylation.
Les protéines Lck (Kabouridis et al. 1997) et LAT (Zhang et al. 1998) sont au contraire
constitutivement présentes au niveau des « rafts ». La présence de LAT dans les « rafts »
est d’ailleurs essentielle à sa fonction. Des lymphocytes T non stimulés ont une membrane
plasmique composée d’environ 10% de rafts, cette proportion augmentera suite à la
stimulation antigénique. Après stimulation par des anticorps anti-CD3, on peut observer par
des approches en microscopie à fluorescence une colocalisation des TCR et des « rafts » à
la surface de cellule T. L’engagement des TCR avec les complexes CMH/peptide spécifique
provoque une agrégation des « rafts ». Ces régions apparaissent également plus riches en
protéines de signalisation comme LAT, Lck et ZAP-70. Il a été également montré que la
phosphatase CD45 est exclue des rafts après engagement du TCR (Janes et al. 1999). La
molécule de costimulation CD28 va aussi être recrutée au niveau des rafts après stimulation
(Sadra et al. 2004). L’ensemble de ces éléments souligne l’importance des « rafts » comme
microdomaines privilégiés dans la mise en place de la signalisation des cellules T. D’autres
travaux ont dans ce sens montré que l’intégrité des « rafts » était un pré-requis à l’activation
du lymphocyte T (Xavier et al. 1998) ainsi qu’à la formation de la synapse immunologique
(Burack et al. 2002).
L’existence des « rafts » est toutefois contestée par certains, du fait d’une part de la
démonstration seulement indirecte de leur présence (après extraction par des détergents) et
d’autre part de la difficulté de pouvoir les observer à la surface de cellules vivantes (Munro
2003).
36
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Changements conformationnels et engagement des TCR
La mécanistique de transmission de l’information depuis le site de liaison du TCR au
complexe CMH/peptide jusqu’aux motifs ITAM, éléments clé dans le déclenchement de la
signalisation a été étudié et plusieurs modèles ont été proposés. En 1989, le groupe de
Janeway a avancé que des changements de conformation s’opéraient au niveau de
l’hétérodimère αβ du TCR (Rojo et al. 1989). En 2002, un travail utilisant des approches de
cristallographie a amené de nouvelles précisions sur ce phénomène en montrant qu’après
stimulation antigénique seules les régions CDR sont modifiées (Reiser et al. 2002).
Des changements au niveau de la conformation de la partie intracytoplasmique de la sousunité CD3ε ont été identifiés avec comme conséquence la fixation de la protéine adaptatrice
Nck (Gil et al. 2002). D’autres travaux ont précisé que ce changement conformationnel
s’opère en fonction de la nature du peptide antigénique : un peptide agoniste l’induira au
contraire d’un peptide agoniste partiel (Risueno et al. 2005). Il faut nuancer néanmoins
l’importance de ce changement conformationnel sur la biologie du lymphocyte T, car il a été
montré que l’inhibition de l’interaction Nck/CD3ε n’affecte pas l’engagement productif du
TCR avec son ligand (Szymczak et al. 2005).
Activation des lymphocytes T par des super antigènes bactériens
Les super antigènes (Shi and Massague) constituent une large famille de toxines
bactériennes qui possède des propriétés immunostimulatrices pouvant conduire au
développement de pathologies. Un SAg donné peut activer une large fraction de
lymphocytes T : entre 5 et 20% du répertoire T. Le groupe de SAg le plus connu est la
famille des toxines pyrogéniques qui incluent : les entérotoxines de staphylocoques (SE)A
jusqu’à (SE)I (excepté (SE)F), le TSST-1 (staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1), les
SAg de streptocoques (SSA) ainsi que les exotoxines pyrogéniques de streptocoque
((SPE)A-C et F) (Li et al. 1999). Cette famille de SAg bactériens représente les substances
les plus pyrogènes connues et ils sont tous capables d’induire un syndrome de choc toxique
létal. De plus, les entérotoxines de staphylocoques sont caractérisées par leur potentiel à
induire des diarrhées et par leurs propriétés émétiques. Les toxines de streptocoques ne
causent pas de problèmes entériques mais présentent une toxicité cardiaque.
Pour activer des cellules T, les SAg bactériens n’ont pas besoin de subir tout un processus
d’apprêtement par les CPA comme les antigènes peptidiques « classiques ». Ils peuvent
directement se lier aux molécules de CMH de classe II présentes à la surface de ces
cellules. Une fois fixé sur la CPA ils pourront activer une cellule T en liant la région variable
de la chaîne β du TCR dont ils sont spécifiques (Li et al. 1999) (Figure 12.).
37
Introduction : Activation des Lymphocytes T
Figure 12. Le peptide antigénique « classique » se loge au niveau de la poche à peptide des molécules de
CMH de classe II, alors que le SAg (SEB) va se fixer sur la chaine α de la molécule de CMH de classe II. Le
SAg pourra alors lier la portion Vβ du TCR dont il est spécifique, avec pour finalité la stimulation du TCR
et l’activation du lymphocyte T.
L’utilisation d’un ou plusieurs SAg chargés sur des CPA permettra donc une activation
polyclonale des lymphocytes T. Cette propriété autorise donc in vitro une étude plus
« physiologique » (nécessité de l’interaction CMH de classe II dépendante avec la CPA) et
approfondie (étude de la synapse immunologique) des paramètres d’activation et de la
biologie des lymphocytes T humains que celles réalisées en utilisant par exemple des
anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (Molon et al. 2005; Veler et al. 2007).
Les SAg endogènes vont avoir un impact sur le développement intra-thymique en induisant
la délétion clonale de pans entier du répertoire lymphocytaire T. Les sous-populations de
lymphocytes T ayant un Vβ spécifique du ou des SAg endogènes seront éliminées au stade
double positif CD4+ CD8+ (MacDonald et al. 1988; Pullen et al. 1991). Cela peut également
prévenir d’une réinfection par une souche de virus produisant ces mêmes SAg, si ce virus
utilise des cellules immunitaires au cours de son processus infectieux (Golovkina et al.
1992). Cette caractéristique des SAg offre un outil unique pour étudier in vivo dans des
modèles murins le devenir des cellules T réactives au cours du développement intrathymique.
En 2007, Ardern-Jones M. et al. ont apporté des preuves quant au rôle potentiel que les SAg
pourraient jouer en pathologie humaine, dans les dermatites atopiques (après infection par le
staphylocoque). Ils pourraient amplifier la réponse immunitaire T CD4+ spécifique et
38
Introduction : Activation des Lymphocytes T
l’inflammation associée au niveau du tissu infecté. La présentation des SAg aux lymphocytes
T serait assurée par des cellules épithéliales (kératinocytes) (Ardern-Jones et al. 2007).
En jouant sur le potentiel des SAg à pouvoir activer de larges populations de lymphocytes T,
de nombreuses équipes travaillent sur l’utilisation thérapeutique de ces toxines notamment
dans les immunothérapies antitumorales. L’injection de conjugués chimiques entre le SAg
SEA et des anticorps monoclonaux anti-C215 ou C242 (antigènes d’un carcinome du colon)
permet d’induire une destruction T dépendante de ces cellules tumorales. Cette cytotoxicité
est CMH-II indépendante et ne requiert pas de CTL spécifiques des antigènes tumoraux,
aspect intéressant vu leur faible fréquence au niveau du site de la tumeur (Dohlsten et al.
1991).
39
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des
lymphocytes T
La reconnaissance par le TCR d’un complexe CMH/peptide spécifique induit une
transduction du signal au sein du lymphocyte T. Des éléments proximaux de signalisation
vont tout d’abord entrer en jeu (recrutement et activation de protéines tyrosines kinases et de
protéines adaptatrices), puis des éléments plus distaux de signalisation permettront la mise
en place des différentes voies de signalisation existantes en aval du TCR. Ces voies de
signalisation auront pour finalité d’activer plusieurs facteurs de transcription qui décideront
de la réponse de la cellule T : prolifération, différenciation, production de cytokines ou encore
mise en place du potentiel cytotoxique. C’est donc ces évènements qui conditionneront la
mise en place et la spécificité des fonctions effectrices des lymphocytes T.
Ce chapitre a pour objectif de présenter les principales voies de signalisation en aval du TCR
ainsi que les fonctions effectrices des lymphocytes T, conséquences biologiques de cette
fine et calibrée mécanistique intracellulaire.
I. Mise en place de la signalisation et des voies de transduction du signal
La signalisation mise en place suite à l’interaction du TCR avec son ligand spécifique peutêtre divisée séquentiellement en trois phases. Tout d’abord, les évènements proximaux de
signalisation correspondent à l’activation et au recrutement rapide de protéines tyrosines
kinases comme Lck et Fyn (des Src kinases) qui vont phosphoryler les tyrosines des motifs
ITAM présents au niveau des domaines intra-cytoplasmiques des chaînes du complexe
CD3. Les tyrosines des motifs ITAM ainsi phosphorylées vont pouvoir recruter la protéine
tyrosine kinase ZAP-70 via ses deux domaines SH2 (Src homology 2) (van Oers et al. 1994).
La protéine ZAP-70 à son tour phosphorylée par Lck, peut alors phosphoryler son substrat,
la protéine adaptatrice LAT (Linker for Activation of T cells), molécule pivot dans la mise en
place et la connexion des différentes voies de transduction du signal, évènements distaux de
la signalisation (Zhang et al. 1998).
Les voies de signalisation suivantes sont mises en place suite à l’engagement du TCR : la
voie de la PLCγ1, la voie de la PKCθ, la voie des MAPKinases et la voie de la Pi3K (Figure
13.). Finalement, cette mécanistique moléculaire va permettre l’activation de facteurs de
transcription comme : NFAT, NFKB et AP-1 (c-Fos complexé à c-Jun) initiant ainsi
l’expression sélective de gènes codant des cytokines, des récepteurs, etc.
40
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
La voie de la PLCγ1
Il existe deux isoformes de la PLCγ : la PLCγ1 et la PLCγ2. L’isoforme le plus exprimé dans
les lymphocytes T est la PLCγ1. Une fois recrutée au niveau de LAT, puis phosphorylée par
la kinase Itk (la ZAP-70 peut participer également à sa phosphorylation), elle hydrolyse le
phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PiP2). Cette hydrolyse conduit à la formation de deux
seconds messagers : l’inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) et le diacylglycérol (Bacchetta et al.)
qui vont à leur tour initier trois voies de transduction du signal :
-
La voie calcique.
-
La voie de la PKCθ (le DAG induisant un changement de
conformation de la PKCθ nécessaire à son activation).
-
La voie des MAPKinases où le DAG active RasGRP qui est une
protéine activatrice de Ras. RasGRP permet de lier le TCR et la
PLCγ1 à la voie de signalisation Ras/ERK (Ebinu et al. 2000).
Figure 13. Représentation schématique des voies de transduction du signal mises en place suite à
l’engagement du TCR. Quatre principales voies sont observables, chacune identifiée par une couleur
différente : la voie Ca2+/calcineurine en violet, la voie de la PKCθ en orange, la voie Ras/Erk en vert et la
voie Vav-1/Jun en bleu. Toutes les protéines adaptatrices sont en marron. Toutes ces voies de
signalisation convergent vers le noyau de la cellule T où des facteurs de transcription vont pouvoir
induire l’expression de certains gènes (interleukine 2, etc).
41
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
La voie calcique
La variation de la concentration en calcium intracellulaire est un paramètre qui va permettre
d’évaluer l’état d’activation d’un lymphocyte T. En effet, suite à l’interaction du TCR avec le
complexe CMH/peptide spécifique il y a augmentation de la concentration en calcium
intracellulaire. Cela va être la conséquence de la fixation de l’IP3 sur des récepteurs présents
à la surface du réticulum endoplasmique. Cette interaction va permettre le relargage des
stocks de calcium réticulaires dans le cytoplasme. L’augmentation temporaire du calcium
intracellulaire va ouvrir des canaux calciques au niveau de la membrane du lymphocyte T,
les CRAC (Calcium Release Activated calcium Chanel). L’ouverture des CRAC va permettre
une entrée de calcium depuis le milieu extracellulaire permettant ainsi d’assurer une
concentration intracellulaire en calcium élevée continue. L’ouverture de ces canaux va
permettre également de reconstituer les stocks de calcium intracellulaire. Le calcium
relargué va alors se fixer sur la calmoduline, ce qui permet l’activation de la calcineurine. La
calcineurine est une phosphatase qui assure la déphosphorylation du facteur de transcription
NFAT.
Sous
forme
phosphorylée
NFAT
a
une
localisation
cytoplasmique,
sa
déphosphorylation permet sa translocation nucléaire. NFAT induit l’expression de multiples
gènes dont celui codant l’IL-2 (Feske et al. 2001; Lewis 2001) (Figure 14.).
Figure 14. Représentation schématique de la voie calcique. La fixation de l’IP3 sur son récepteur va
permettre le relargage cytoplasmique de calcium conduisant à l’ouverture des CRAC. Après activation de
la calcineurine, la déphosphorylation de NFAT va permettre sa translocation nucléaire.
42
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
Pour induire correctement la production de cytokines, la concentration élevée en calcium doit
être maintenue, un arrêt précoce du flux calcique va l’inhiber et induire l’exportation de NFAT
vers le cytoplasme (Valitutti et al. 1995). Dans les gènes dont l’expression est régulée via la
voie calcique, certains vont conditionner la mobilité et la forme de la cellule T. En effet un
lymphocyte T mobile présente une forme étirée. Lorsqu’il trouve une CPA lui présentant le
complexe CMH/peptide spécifique agoniste, la cellule T va alors s’immobiliser et s’arrondir,
ce phénomène est qualifié de « stop signal ». L’immobilisation du lymphocyte T est précédée
par une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire. Si le flux calcique est
artificiellement diminué alors il y a une inhibition du « stop signal » (Donnadieu et al. 1994).
La voie de la PKCθ
Il existe de nombreux isoformes de la PKC, mais seulement l’isoforme PKCθ est recruté
suite à l’engagement productif du TCR au niveau de la zone d’interaction entre le lymphocyte
T et la CPA (Monks et al. 1997). Plus précisément, ce recrutement se fait au niveau des
« rafts » membranaires (Bi et al. 2001). Le DAG mais aussi Lck qui phosphoryle une tyrosine
de la PKCθ va favoriser son activation ainsi que son recrutement au niveau des « rafts »
membranaires.
Une fois activée, la PKCθ va activer Ikk qui à son tour, assure la phosphorylation de IκB. A
l’état non phosphorylé IκB forme un complexe stable avec le facteur de transcription NFκb.
Le complexe IκB/NFκB assure la séquestration cytoplasmique de NFκB. La phosphorylation
de IκB va induire la création d’un site de reconnaissance pour les ubiquitine-ligases. Cela va
entraîner l’ubiquitination de cette protéine ainsi que sa dégradation au niveau du protéasome
(Isakov and Altman 2002). NFκB se retrouve alors sous forme libre, ce qui va révéler un site
de localisation nucléaire entraînant sa translocation dans le noyau de la cellule T (Figure
13.).
Cette voie de signalisation est importante dans le processus de différenciation TH1/TH2. En
effet, l’absence de la PKCθ empêche le développement des lymphocytes TH2 alors que la
différenciation vers un phénotype de type TH1 n’est pas altérée (Marsland et al. 2004).
La voie des MAPKinases
La voie de signalisation des MAPKinases est très ancienne et très conservée au cours de
l’évolution. Utilisée de façon ubiquitaire dans l’organisme, elle permet de transcrire en signal
interprétable par la cellule, des stimuli d’ordres physiologiques ou pharmacologiques reçus
au travers de récepteurs, mais également des stress physiques que la cellule peut subir. Il
existe trois groupes de MAPKinases chez les mammifères : Erk 1 et 2 (Extra-cellular signalRegulated protein Kinases) MAPK, les p38MAPK et les JNK (c-Jun NH2-terminal Kinases).
43
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
L’activation des différentes MAPKinases résulte de l’enchaînement d’une cascade de
phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine. Les MAPKinases sont phosphorylées
par des MAPKinases kinases (MAPKK) qui elles-mêmes sont phosphorylées par des
MAPKinases kinases kinases (MAPKKK). Tout cela ayant pour objectif une translocation
nucléaire des MAPKinases.
Dans les lymphocytes T, suite à l’engagement du TCR avec son ligand spécifique et après
phosphorylation (Tyr 171, 191 et 226) la protéine LAT peut lier la protéine adaptatrice Grb2
(Zhang et al. 2000). Cette dernière recrute la GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor)
Sos ce qui permet l’activation de la GTPase Ras. Ras active ensuite la MAPKKK Raf-1. Raf1 phosphoryle à son tour Erk 1 et 2. Une fois phosphorylées, Erk 1 et 2 peuvent pénétrer
dans le noyau et phosphoryler différents facteurs de transcription comme Elk-1 qui assurera
l’activation de c-Fos (Treisman 1996; Rincon 2001).
En parallèle, la protéine Vav est phosphorylée et recrutée au niveau de SLP-76 (Figure 13.).
Vav permet l’activation de la Rho GTPase Rac. De là part une cascade de phosphorylation
qui induit la phosphorylation de JNK. JNK peut alors phosphoryler c-Jun, qui pourra
s’associer à c-Fos pour former le complexe AP-1.
Les MAPkinases ont également une influence dans la différenciation TH1/TH2 notamment les
p38MAPK (Dong et al. 2002). L’imidazole, inhibiteur pharmacologique des p38MAPK bloque
de façon dose-dépendante la production d’IFN-γ dans les lymphocytes TH1 mais n’a aucun
effet sur la production d’IL-4 des lymphocytes TH2 (Rincon et al. 1998).
La voie de la Pi3K (phosphaditylinositol-3-OH kinase)
La Pi3K est composée d’une sous-unité catalytique de 110 Kda (p110) et d’une sous-unité
régulatrice de 85 Kda (p85). Après engagement du TCR, la Pi3k est rapidement activée et
recrutée au niveau membranaire (Harriague and Bismuth 2002). L’activation de la Pi3K
produit du phosphatidylinositol-3-phosphate (PiP), du phosphatidylinositol-3,4-phosphate
(PiP2) ainsi que du phosphatidylinositol-3,4,5-phosphate (PiP3). Ces lipides membranaires
permettent le recrutement à la membrane plasmique de plusieurs protéines à domaines PH
(Pleckstrin Homology). Ces protéines à domaine PH sont impliquées dans les processus de
croissance et de survie cellulaire, mais également, dans la réorganisation du cytosquelette
d’actine (GTPases de la famille de Rho : Rac, Rho et CDc42). Il y a également activation de
Tec kinases qui vont permettre d’activer la PLCγ1 et donc de créer une connexion entre la
voie de la Pi3K et la voie calcique (Ward and Cantrell 2001).
Une des conséquences de l’activation de la Pi3K est d’induire le recrutement à la membrane
plasmique de Akt, connue également sous le nom de PKB (protéine kinase B), ce qui induit
un changement de conformation de Akt. Akt/PKB va avoir plusieurs fonctions au sein du
lymphocyte T, il peut stimuler les facteurs de transcription E2F qui ont une implication
44
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
importante dans le contrôle du cycle cellulaire. Toujours au niveau du cycle cellulaire, Akt
peut phosphoryler FoxO1 (impliqué dans l’arrêt du cycle cellulaire), ce qui induit son export
nucléaire (Fabre et al. 2005). Akt peut également phosphoryler et inactiver GSK3 (Glycogen
Synthase Kinase-3), facteur responsable de l’export nucléaire de NFAT (Beals et al. 1997).
De cette façon Akt peut intervenir dans la régulation de la production cytokinique.
Des études récentes semblent montrer l’importance biologique de la voie de la Pi3K/Akt
dans l’effet suppresseur et la biologie des lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs (Treg). En
effet, le statut d’activation de cette voie de signalisation pourrait conditionner la sensibilité
des lymphocytes T effecteurs à la régulation médiée par les Treg. Quand la voie Pi3K/Akt
serait hyperactive dans les cellules T effectrices, ces cellules seraient alors résistantes à la
suppression induite par les Treg. En 2007, Wohlfert E. et Clark R. postulent également que
ce constat pourrait peut-être expliquer que des anormalités au niveau de cette voie de
transduction du signal soient détectables parallèlement à des manifestations auto-immunes
(Wohlfert and Clark 2007). Dans un modèle murin, il a également été montré que la
proportion de Treg dans la rate et dans les ganglions lymphatiques de souris présentant une
forme inactive de la sous-unité p110δ de la Pi3k est considérablement réduite en dépit d’une
sélection intra-thymique des Treg augmentée. Les Treg isolés à partir de ces souris
présentent des fonctions suppressives atténuées lors de tests fonctionnels in vitro et
n’assurent pas une protection contre la colite expérimentale lors d’expériences in vivo de
transferts adoptifs de lymphocytes T (Patton et al. 2006).
Une autre implication de la voie de la Pi3k a été apportée par l’étude de la phosphatase
lipidique PTEN. La délétion ciblée de PTEN régule l’homéostasie périphérique des Treg in
vivo et permet une meilleure expansion de ces cellules ex vivo en réponse à l’IL-2 (Walsh et
al. 2006).
II. Fonctions effectrices des lymphocytes T
Après avoir terminé leur développement intrathymique, les lymphocytes Tαβ rejoignent les
organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions lymphatiques) et circulent continuellement
entre ces différents organes en absence d’infection. La migration de ces cellules vers les
zones T des organes lymphoïdes secondaires leur permet de pouvoir rencontrer et
potentiellement interagir avec des cellules dendritiques (DC), CPA pouvant leur présenter un
complexe CMH/peptide spécifique. La reconnaissance d’un peptide antigénique dans un
contexte de CMH de classe II permettra à un lymphocyte T CD4+ de s’activer, de proliférer
(expansion clonale) et après différenciation, d’acquérir ses fonctions effectrices. Il pourra
alors se différencier en deux types de lymphocytes T auxiliaires ou T « helpers » (TH) : TH1
ou bien TH2. Le lignage TH1 sera plus impliqué dans les réponses contre les pathogènes
intracellulaires (virus, bactéries…), le profil de sécrétion cytokinique sera de type pro45
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
inflammatoire (IL-2, IFN-γ, TNF-α, lymphotoxine ou TNF-β…). Les cellules TH1 agiront
notamment sur les CPA en augmentant leur capacité de phagocytose, leur production de
médiateurs pro-inflammatoires ainsi que leur aptitude à présenter et à activer des
lymphocytes T naïfs. Les lymphocytes TH2 seront quant à eux plutôt impliqués dans les
réponses contre les pathogènes extracellulaires (parasitoses…) avec le profil cytokinique
suivant : IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13. Les lymphocytes TH2 participeront activement aux
réponses allergiques, ils pourront activer dans un cadre physiopathologique les éosinophiles
via l’IL-5 et l’IL-13 (importance dans le rejet de greffe). Grâce à l’IL-10, l’IL-4 et l’IL-13, ils
auront un effet inhibiteur sur les réponses pro-inflammatoires. Ces deux populations de TH
vont par leur sécrétion de cytokines s’inhiber mutuellement favorisant ainsi leur propre
développement (O'Garra 1998).
Des travaux récents ont permis de mettre en évidence une nouvelle population de
lymphocytes T CD4+ distincte des TH1 et des TH2, les TH17, révélant ainsi une plus grande
complexité dans le choix des lignages TH. Ces cellules produisant de l’IL-17 ont été
découvertes grâce à la découverte d’une nouvelle cytokine : l’IL-23 (Reiner 2007; Weaver et
al. 2007).
En parallèle, après migration dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T
CD8+ reconnaîtront les peptides antigéniques dans un contexte de CMH de classe I. La
reconnaissance du ligand spécifique à la surface d’une CPA permettra l’activation de ces
cellules et leur différenciation en CTL. Les CTL auront comme fonction d’éliminer les cellules
infectées ou les cellules cancéreuses.
Les lymphocytes T CD4+ (TH1, TH2 et TH17)
La division des lymphocytes Tαβ en deux sous-populations sur la base des marqueurs CD4
et CD8 est une notion acquise depuis le début des années 1970. Cependant durant ces
années là, des données semblaient montrer que dans la population lymphocytaire T CD4+, il
y avait une hétérogénéité (Marrack and Kappler 1975). Il faudra attendre une décennie de
plus pour que cela soit clairement mis en évidence. En effet c’est en 1986 que Mosmann et
al. montrent dans un modèle murin que les lymphocytes T CD4+ peuvent être divisés sur la
base de leur profil de sécrétion cytokinique en deux sous-populations, les lymphocytes TH1
et TH2 (Mosmann et al. 1986).
Ces deux types de lymphocytes TH dérivent d’un précurseur commun, sécrétant de l’IL-2
mais ne sécrétant ni IL-4, ni IFN-γ. La stimulation via son TCR conduit ce précurseur à se
différencier en lymphocyte TH0 produisant à la fois des cytokines de type 1 et de type 2. La
différenciation en lymphocytes TH1 ou TH2 dépendra ensuite de facteurs environnementaux
comme les cytokines. L’IL-12 est essentielle au développement, à la prolifération et à
46
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
l’expression génique des lymphocytes TH1, c’est une cytokine hétérodimérique de 75 kDa
composée de deux sous-unités p35 et p40. Elle est typiquement sécrétée par des DC
activées via leur TLR (Toll Like Receptor) qui ont été exposées à des ligands tels que du
LPS ou des motifs CpG (Reiner 2007). L’IL-12 peut-être également sécrétée par des DC et
des macrophages en réponse à un parasitisme par des procaryotes ou des eucaryotes
intracellulaires ainsi que par certains virus (Hsieh et al. 1993). Le rôle de l’IL-12 dans la
polarisation et le développement de la réponse TH1 est renforcé par son action répressive
sur l’expression du facteur de transcription Gata-3, régulateur clé du développement TH2
(Ouyang et al. 1998). L’IFN-γ est la cytokine TH1 par excellence. En effet, la signalisation
induite en aval de son récepteur va permettre d’activer via STAT1 le facteur de transcription
T-bet requis pour la polarisation TH1 (Afkarian et al. 2002) (Figure 15.). L’IL-4 est, quant à
elle, la cytokine qui va permettre l’orientation vers un phénotype TH2. La principale source
d’IL-4 semble être les lymphocytes T CD4+ eux-mêmes, mais elle peut être également
produite par les mastocytes, les basophiles et les cellules NKT (Natural Killer T) (Le Gros et
al. 1990; Noben-Trauth et al. 2000). La signalisation induite par l’IL-4 promeut via STAT6 la
transcription de gènes spécifiques TH2, dont le facteur de transcription clé dans la
polarisation TH2 : Gata-3 (équivalent de T-bet pour les TH1) (Figure 15.). En effet, des souris
déficientes pour l’IL-4 ne développent pas de réponse TH2 (Kuhn et al. 1991).
Les lymphocytes TH sont appelés « helpers » ou auxiliaires car ils permettent d’aider au
développement de la réponse lymphocytaire B notamment en participant à la commutation
isotypique. Les TH1 vont, via la sécrétion d’IFN-γ permettre la commutation en
immunoglobulines G2a (IgG2a), qui fixeront le complément. Les TH2 par leur sécrétion de
cytokines favorisent la commutation en IgE et IgG1, ces Ig produites par les lymphocytes B
vont être impliquées dans les réponses atopiques ainsi que dans les réponses allergiques.
L’importance des TH2 dans les réponses allergiques se justifie donc par leur capacité à
activer la production des IgE par les lymphocytes B. Ces IgE une fois sécrétées induisent la
dégranulation des mastocytes conduisant à un relargage d’histamine.
Récemment, de nouvelles données ont suggéré que le choix de lignage pour les
lymphocytes T CD4+ « helpers » n’était pas aussi binaire que celui décrit jusqu’à présent. Au
grand débat sur les mécanismes de la différenciation TH1/TH2 s’ajoute un degré de
complexité supplémentaire avec la découverte d’une nouvelle sous-population de
lymphocytes T CD4+ « helpers » : les lymphocytes TH17 (Dong 2006; Weaver et al. 2007).
Leur découverte est due à la mise en lumière de nouvelles cytokines comme l’IL-17 et l’IL23, mais également due à l’attribution de nouveaux rôles joués par des cytokines
pléïotropiques telles que le TGF-β ou l’IL-6. Dès 2005, des études ont suggéré que les TH17
ne seraient pas un variant des lignées TH1 ou TH2, mais bien un lignage à part entière. En
47
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
effet, en absence d’IL-4, d’IFN-γ et indépendamment des facteurs de transcription STAT1 et
STAT6, on a différenciation de précurseurs naïfs en lymphocytes TH17 (Harrington et al.
2005; Park et al. 2005). D’autres équipes ont rapidement montré que l’IL-23, bien
qu’importante dans le maintien des réponses TH17 (protection de l’hôte dans les réponses
contre un pathogène bactérien), n’était pas critique pour l’induction du lignage TH17. Il
apparaît plutôt que ce soit la combinaison d’IL-6 et de TGF-β qui soit cruciale dans le
développement d’une réponse TH17 (Bettelli et al. 2006; Mangan et al. 2006). De plus,
l’identité cellulaire de cette population a été confirmée par la découverte d’un facteur de
transcription spécifique : RORγt, dont l’expression est inductible par la combinaison d’IL-6 et
de TGF-β (Ivanov et al. 2006). Les TH17 ont en plus de leur rôle dans la protection de l’hôte
contre les pathogènes une importance fonctionnelle au niveau des manifestations d’autoimmunité. En effet, une souris déficiente pour RORγt ou bien pour l’IL-6 présente une
absence de cellules TH17 infiltrant les tissus périphériques et une atténuation du
développement de pathologies auto-immunes (Ivanov et al. 2006). Une notion intéressante
mise en lumière par Bettelli et al. est qu’il y aurait, en fonction de la quantité de TGF-β et
d’IL-6 présente dans le microenvironnement, une différenciation des précurseurs T CD4+ soit
en Ti-Treg (TGF-β induced Treg, néo-conversion de lymphocytes T CD4+ CD25- Foxp3- en
lymphocytes T CD4+ CD25+ Foxp3+ régulateurs) si la concentration en TGF-β est supérieure,
soit en lymphocytes TH17 effecteurs si la concentration en IL-6 est plus importante. Il y aurait
un développement réciproque et une balance entre les lymphocytes T effecteurs et T
régulateurs. En situation physiologique, le TGF-β prépondérant, favoriserait la génération de
Treg afin d’assurer la tolérance périphérique au soi, alors que dans une situation
physiopathologique et inflammatoire, l’IL-6 produit par les cellules de l’immunité innée
favoriserait plutôt le développement d’effecteurs afin d’assurer une réponse optimale (Bettelli
et al. 2006) (Figure 15.). Récemment, Mucida et al. ont identifié un métabolite de la vitamine
A, l’acide rétinoïque comme régulateur clé de la polarisation TGF-β dépendante des
réponses immunes. L’acide rétinoïque serait en effet capable d’inhiber l’induction proinflammatoire via l’IL-6 de cellules effectrices TH17 et de promouvoir la différenciation en
Treg des précurseurs T (Mucida et al. 2007).
La compréhension du choix initial de lignage effecteur pour une cellule T CD4+ naïve a été
rendue plus complexe avec la découverte du nouveau lignage TH17. Il est donc imaginable à
l’heure actuelle que l’intégration de signaux pour l’engagement vers un lignage peut encore
gagner en complexité et en plasticité, avec notamment la division asymétrique des cellules T
précurseurs. En effet, suivant le type de pathogène et la qualité de l’interaction avec la CPA,
une même cellule T pourrait alors répartir de manière asymétrique les protéines impliquées
48
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
dans la signalisation, dans le choix des lignages (etc) assurant ainsi une modulation rapide
et adaptée de la réponse immunitaire adaptative (Chang et al. 2007).
Figure 15. La différenciation des lymphocytes T « helpers » est un processus initié par l’interaction entre
une cellule dendritique et un précurseur T naïf au niveau d’un ganglion lymphatique. De cette interaction
va en résulter une prolifération et une différenciation de la cellule T naïve. Le choix du lignage est
conditionné par la stimulation cytokinique. Chaque sous-population de T « helpers » (TH1 (T-bet), TH2
(Gata-3) et TH17 (RORγt)) possède sa propre signature moléculaire et développe des fonctions
protectrices et pathogéniques différentes. Les Ti-Treg, auront quand à eux pour rôle de réguler
négativement
les
réponses
immunes
afin
notamment
d’éviter
l’apparition
de
lésions
immunopathologiques. Lors d’une infection par un pathogène, les lymphocytes T « helpers » matures
vont pour une partie, aller migrer au niveau des follicules B du ganglion lymphatique afin d’induire la
commutation isotypique des immunoglobulines. L’autre partie migre hors du ganglion, les lymphocytes T
« helpers » matures vont ainsi pouvoir infiltrer les tissus infectés et mettre en œuvre leurs fonctions
effectrices.
Les lymphocytes T CD8+
Le développement d’une réponse T CD8+ cytotoxique est nécessaire pour l’organisme afin
de pouvoir contrôler de nombreuses infections virales et bactériennes. Lors de la rencontre
entre une cellule T CD8+ naïve et une CPA lui présentant le peptide spécifique agoniste dans
un contexte de CMH de classe I, il y a activation et différenciation du lymphocyte T CD8+.
49
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
Les lymphocytes TH1 apporteront grâce à la production d’IL-2, l’aide nécessaire à la
différenciation en CTL (Bevan 2004). Une fois différenciées en CTL, ces cellules seront
armées pour mettre en œuvre leur potentiel cytotoxique.
Un travail récent réalisé par Boissonnas et al. utilisant des approches de microscopie biphotonique intra-vitale a permis de visualiser in vivo l’infiltration de tumeurs solides par des
CTL spécifiques d’antigènes tumoraux ou TIL (TIL, Tumor Infiltrating Lymphocytes) ainsi que
l’élimination des cellules cancéreuses par ces même CTL (Boissonnas et al. 2007).
Les mécanismes par lesquels les CTL exercent leur cytotoxicité sont multiples. Ils peuvent
sécréter des cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα ou l’IFN-γ qui, relarguées à
proximité des cellules cibles vont pouvoir entraîner leur mort. Dans le cadre de l’immunité
antitumorale, la sécrétion d’IFN-γ par les CTL est très importante, car cette cytokine va
notamment avoir des effets anti-angiogéniques ainsi que des effets cytostatiques sur la
prolifération des cellules cancéreuses cibles (Dunn et al. 2006).
Le mécanisme clé dans l’action cytotoxique des CTL est la voie perforine/granzyme
dépendante du flux calcique. La rencontre de la cellule portant l’antigène spécifique va
induire la polarisation rapide de la machinerie lytique du CTL vers cette cellule cible (Yannelli
et al. 1986). Cette polarisation rapide et efficace peut se faire en absence d’une
réorganisation moléculaire typique d’une synapse immunologique mature à la zone de
contact CTL/cellule cible, on parle alors de synapse lytique car seule l’activité cytotoxique est
présente (Faroudi et al. 2003; Wiedemann et al. 2006). La polarisation de la machinerie
lytique va conduire à la sécrétion de deux types de granules lytiques : la perforine et les
granzymes. Il a été proposé que la perforine induisait la mort des cellules cibles en créant
des pores dans leurs membranes plasmiques (Henkart and Henkart 1982). Un peu plus tard,
il a été montré qu’il existait une homologie de séquence entre la perforine et la protéine C9
du complément, qui est connue pour former des pores dans les membranes cellulaires
(Tschopp et al. 1986). En plus de la fonction lytique de la perforine, il y a également
altération de la cellule cible par le relargage de sérines protéases appelées les granzymes
(Lowin et al. 1995). Après avoir pu facilement pénétrer dans la cellule cible grâce à la
présence de pores membranaires réalisés par la perforine, les granzymes induisent
l’apoptose rapide de cette cellule (Heusel et al. 1994). Il existe deux types de granzymes, les
granzymes A et B. Les granzymes A induisent un processus apoptotique au sein de la
cellule cible via une voie indépendante des caspases (Beresford et al. 2001) alors que les
granzymes B utilisent une voie dépendante des caspases (Sutton et al. 2003). D’autres
protéines sont également présentes dans les granules lytiques des CTL comme par exemple
la granulysine qui détériore les membranes bactériennes (Stenger et al. 1998) et qui peut in
vitro avoir des propriétés pro-apoptotiques sur des lignées de cellules tumorales (Wang et al.
2000).
50
Introduction : Signalisation et mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
Un autre mécanisme cytotoxique utilisé par les CTL est la voie Fas/Fas-L (Fas-Ligand), voie
indépendante du flux calcique (Ostergaard et al. 1987). Fas-L est très peu présent à l’état
basal dans les CTL, son expression à la surface des CTL augmente par néosynthèse
quelques heures après stimulation du TCR, la cytotoxicité via cette voie sera alors optimale à
ce moment là. La stimulation du récepteur Fas (récepteur de mort appartenant à la
superfamille des récepteurs au TNF) situé sur la cellule cible par Fas-L induit l’activation de
la caspase 8 qui va ensuite induire la cascade d’activation des caspases et donc l’apoptose
de la cellule (Scaffidi et al. 1998).
Il existe donc deux mécanismes par lesquels les CTL induisent la lyse d’une cellule infectée
ou tumorale, cependant l’utilisation de la voie perforine/granzyme est la plus utilisée du fait
de sa rapidité de mise en place et de sa terrible efficacité.
« The true sign of intelligence is not knowledge but imagination »
Albert Einstein
51
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+
régulateurs
Une des grandes interrogations en immunologie depuis les cinquante dernières années est
de comprendre comment le système immunitaire arrive si finement à discriminer entre le soi
et le non soi, empêchant ainsi le développement de réponses auto-immunes tout en
permettant une immunité efficace contre les pathogènes (viraux, bactériens…) ou contre les
tumeurs (soi modifié).
La fin des années 1960 a marqué le début de travaux visant à suggérer l’existence d’un
mécanisme d’induction de tolérance au soi (Sakaguchi 2004). En 1969 Nishizuka et al.
montrent dans un modèle murin de thymectomie néonatale réalisée à trois jours après la
naissance que l’absence de thymus conduit à des anomalies ovariennes qui peuvent être
prévenues par la greffe d’un thymus provenant d’un animal histocompatible (Nishizuka and
Sakakura 1969). Une thymectomie plus tardive n’aura aucun effet sur les ovaires de la
souris. Plus tard, en 1981, des travaux de transferts de splénocytes (provenant d’animaux
histocompatibles) sur des souris thymectomisées trois jours après la naissance ont montré
une correction des anomalies induites par l’ablation du thymus, ce qui a suggéré l’existence
d’une sous-population de cellules T suppressives qui aurait pour rôle de contrôler en
périphérie le compartiment lymphocytaire T autospécifique (Taguchi and Nishizuka 1981).
Entre temps, de nombreuses équipes de chercheurs ont essayé dans différents modèles de
mieux caractériser, phénotyper et isoler cette sous-population lymphocytaire suppressive.
Elles ont rencontré de nombreuses difficultés ainsi qu’un scepticisme d’une partie de la
communauté scientifique allant jusqu’à remettre en cause l’existence même d’une telle souspopulation de lymphocytes T ayant des propriétés régulatrices du fait du manque de
marqueurs réellement spécifiques et du flou autour de leurs mécanismes d’action.
I. Caractérisation, développement et homéostasie des lymphocytes T
régulateurs (Treg)
Plus de vingt-cinq ans d’efforts à la recherche du marqueur…
Au début des années 1980, Sakaguchi et al. ont amené de nouvelles évidences dans la
caractérisation de cette population lymphocytaire suppressive. Toujours en utilisant le
modèle murin de thymectomie néonatale, ils ont montré que le transfert de splénocytes
pouvait prévenir le développement d’une ovarite auto-immune chez la souris en montrant
que la population cellulaire responsable de la protection pouvait être restreinte par le
phénotype suivant : T CD4+ CD5high (ou Lyt-1high) (Sakaguchi et al. 1982). CD5 est une
52
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
glycoprotéine transmembranaire exprimée à un haut niveau dans les lymphocytes T matures
et ligand potentiel de CD72. Peu de temps après, le même groupe a affiné ces résultats en
démontrant qu’après déplétion des cellules T CD4+ CD5high (par une combinaison d’anticorps
anti-CD8 et anti-CD5 associée à du complément) et injection de la fraction résiduelle CD4+
CD5- provenant de souris BALB/C WT (Wild Type, sauvage) à des souris BALB/C nude
(nu/nu), il y a développement chez ces animaux de pathologies auto-immunes multi-organes.
L’injection du compartiment T CD4+ CD5high prévient le développement de ces pathologies
auto-immunes (Sakaguchi et al. 1985). Suivant cette logique, l’effort de recherche s’est
concentré sur la capacité à pouvoir mieux disséquer cette population régulatrice du
compartiment effecteur autologue, de nombreux marqueurs ont donc été proposés afin de
mieux l’identifier. CD45RB (protéine tyrosine phosphatase exprimée par la quasi-totalité des
cellules d’origines hématopoïétiques) a été proposé par Powrie et al. en 1990. Ils ont montré
que l’injection de la sous-population T CD4+ CD45RBhigh à des rats congéniques athymiques
induisait le développement de pathologies auto-immunes multi-organes et une perte de
poids alors que le transfert adoptif de la fraction cellulaire T CD4+ CD45RBlow n’était pas
pathogénique, les animaux continuaient à gagner du poids normalement. Ils ont de plus mis
en évidence que la co-injection de 2/3 de lymphocytes T CD4+ CD45RBhigh et de 1/3 de
lymphocytes T CD4+ CD45RBlow prévenait du développement de pathologies autoimmmunes, confirmant ainsi le potentiel régulateur de la population cellulaire T CD4+
CD45RBlow (Powrie and Mason 1990; Powrie and Mason 1990). Même quantitativement
minoritaire, la population T CD4+ CD45RBlow est capable de contrôler la population effectrice
T CD4+ CD45RBhigh. Parallèlement aux travaux de Powrie et al., RT6.1+ (exprimé sur la
majorité des cellules T matures de rat et ayant une activité d’ADP ribosylation) a été mis en
évidence comme marqueur de la population régulatrice par McKeever et al. dans un modèle
proche des précédents (McKeever et al. 1990).
En 1993, Powrie et al. ainsi que Morrissey et al. ont montré indépendamment que le transfert
de lymphocytes T CD4+ CD45RBhigh issus de souris BALB/C WT à des souris BALB/C SCID
(severe combined immunodeficiency) induisait le développement d’une pathologie
inflammatoire et auto-immune au niveau des muqueuses intestinales, l’IBD (Inflammatory
Bowel Disease). L’injection de la fraction autologue T CD4+ CD45RBlow ou bien la coinjection des fractions T CD4+ CD45RBhigh et T CD4+ CD45RBlow n’induit pas l’IBD (Morrissey
et al. 1993; Powrie et al. 1993). L’inconvénient principal de ces marqueurs est qu’ils
englobent encore des populations cellulaires trop importantes pour permettre vraiment
d’identifier précisément la population T régulatrice des populations T effectrices (les
lymphocytes T CD4+ CD45RBlow représentent entre 25 et 30% des lymphocytes T CD4+
totaux chez une souris naïve) (Figure 16.) (Sakaguchi 2004).
53
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Mais c’est en 1995 qu’un grand pas est franchi avec la découverte que le marqueur de
surface CD25 (chaîne α du récepteur à l’IL-2) permet réellement de différencier, au moins
fonctionnellement, la population de lymphocytes T CD4+ régulateurs des autres populations
T. En effet, le compartiment T CD4+ CD25+ régulateur (Treg) qui constitue entre 5 et 10%
des lymphocytes T CD4+ totaux chez une souris naïve ainsi que chez l’homme constitue une
population cellulaire prévenant le développement de pathologies auto-immunes dans des
modèles de transferts adoptifs comme ceux décrits précédemment (Sakaguchi et al. 1995).
Figure 16. Trente ans de travaux pour établir ce phénotype non exhaustif des lymphocytes T CD4+ CD25+
régulateurs naturels. CD5 a été le marqueur initial permettant de découvrir qu’au sein des lymphocytes T
+
CD4 circulants, il existait une population effectrice et une population douée de propriétés suppressives
capable de contrôler le compartiment T potentiellement auto-réactif. C’est en 1995 qu’un grand pas est
franchi avec le marqueur CD25 qui permet d’identifier plus précisément la population régulatrice de la
+
population effectrice, en restreignant ce compartiment entre 5 et 10% des lymphocytes T CD4 totaux.
Quelques années plus tard, un nouveau tournant est marqué par la caractérisation du facteur de
transcription Foxp3 permettant précisément d’identifier les Treg. Très récemment d’autres marqueurs :
CD127 et FR4 semblent permettre une spécificité aussi bonne que Foxp3 pour l’identification des Treg
avec l’avantage d’être des marqueurs de surface. En effet, l’identification de bons marqueurs de surface
pour isoler les Treg est un grand enjeu clinique, vu le potentiel de ces cellules dans diverses approches
d’immunothérapies ou autres stratégies thérapeutiques visant par exemple à les inhiber (cancers).
54
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Un autre grand pas dans l’identification des Treg a été franchi avec la découverte de Foxp3,
facteur de transcription clé dans le développement et la fonction des Treg (Sakaguchi 2004;
Fontenot and Rudensky 2005; Zheng and Rudensky 2007). Foxp3 appartient à la grande
famille des facteurs de transcription possédant un domaine « winged helix-forkhead »
(Forkhead box ou Fox) de liaison à l’ADN. Ces protéines ont été classées par analyse
phylogénétique en utilisant le préfixe Fox et en y ajoutant un numéro permettant son
identification.
Tout a commencé en 1982 avec une étude de report de cas clinique portant sur un patient
dont dix-sept enfants de sexe masculin dans la famille sont morts durant la première année
de vie permettant de mettre en évidence un syndrome jusque là inconnu. Les données
obtenues à partir de huit de ces patients a permis d’établir le tableau clinique suivant :
diarrhées, diabète de type 1, anémie hémolytique, poussées d’eczéma, réponses antivirales
exagérées, le tout combiné avec des évidences de manifestations auto-immunes conduisant
à la destruction des glandes endocrines, comme la thyroïde (présence d’auto-anticorps chez
un patient). L’évaluation fonctionnelle du système immunitaire chez ces patients a révélé des
anomalies dans le fonctionnement du compartiment T (Powell et al. 1982). De plus, chez ces
patients, le niveau des IgE circulantes peut-être très élevé et associé à une augmentation
des éosinophiles, évidences indiquant une déviation du répertoire T CD4+ vers un lignage
TH2 (Chatila et al. 2000).
Tout cela a donc permis de décrire un nouveau syndrome auto-immun lymphoprolifératif,
L’IPEX
(Immune
dysregulation
polyendocrinopathy
enteropathy-X-linked
syndrom),
syndrome dépendant d’une mutation récessive située sur le chromosome X. Il faudra
attendre 2001 pour qu’une mutation dans le gène codant pour le facteur de transcription
Foxp3 soit identifiée comme cause du développement de l’IPEX (Bennett et al. 2001; Wildin
et al. 2002). Une mutation de Foxp3 peut induire également un syndrome auto-immun
apparenté : XLAAD (X-linked autoimmunity-allergic disregulation syndrom) (Chatila 2005).
En parallèle de ces données obtenues chez l’homme, un modèle de souris scurfy présentant
des mutations perte de fonctions situées sur le chromosome X dans le gène codant pour le
facteur de transcription Foxp3 et développant un syndrome auto-immun lymphoprolifératif
apparenté à l’IPEX sur le plan clinique a permis de mieux comprendre l’importance de Foxp3
pour le système immunitaire. Les souris scurfy mâles meurent aux environs de trois à quatre
semaines de vie suite à l’apparition de pathologies auto-immunes multi-organes avec
présence de forts infiltrats lymphocytaires (Godfrey et al. 1991; Brunkow et al. 2001; Wildin
et al. 2001; Lin et al. 2005). Des souris femelles hétérozygotes pour la mutation ou bien des
patientes de sexe féminin hétérozygotes pour la mutation ne développent aucun symptômes
ce qui indique que les cellules T exprimant Foxp3 sont capables d’empêcher le
développement de manifestations auto-immunes et donc de contrôler le développement des
55
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
réponses immunitaires auto-spécifiques. Ces observations ont permis d’associer ces
mutations de Foxp3 à une absence de Treg fonctionnels aussi bien chez les patients IPEX
que chez les souris scurfy (Zheng and Rudensky 2007).
Des travaux récents du groupe de Roncarolo ont permis de préciser un peu l’impact de cette
mutation pour la population de Treg chez des patients IPEX. En effet, dans le modèle murin
Scurfy les mutations touchants Foxp3 conduisent à une absence de Treg (CD4+ CD25high),
directement responsable du développement de pathologies auto-immunes létales, indiquant
ainsi l’importance de Foxp3 dans le développement des Treg. Au contraire chez les patients
IPEX, le nombre de cellules T CD4+ CD25high en périphérie est identique à celui obtenu à
partir de prélèvements de donneurs sains. Des tests fonctionnels in vitro montrent que les
lymphocytes T CD4+ CD25high de ces patients IPEX (Foxp3- ou Foxp3+) ont une altération
importante de leur potentiel suppresseur sur des effecteurs T autologues. De plus l’étude
fonctionnelle in vitro des PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) de ces patients IPEX
montre également des anomalies. Ces données indiquent que chez les patients IPEX, les
diverses mutations pouvant toucher Foxp3 conduisent à des anomalies biologiques
hétérogènes mais pas à un défaut dans le développement des Treg (Bacchetta et al. 2006;
Le Bras and Geha 2006).
En 2007, Lahl et al. ont de manière élégante montré que la déplétion des Treg in vivo dans
une souris nouveau-né est suffisante pour conduire au développement de symptômes
équivalents à ceux observés chez une souris Scurfy (splénomégalie, lymphoadénopathie,
diabète de type 1 et une sévère inflammation cutanée). Pour cela, ils ont généré une souche
de souris DEREG (Depletion of regulatory T cell) exprimant un récepteur à la toxine
diphtérique (DTR) couplé à la GFP (Green Fluorescent Protein), le tout sous le contrôle du
locus génique de Foxp3. Cela permet de visualiser de manière précise à la fois la présence
de Treg par un double marquage en cytométrie en flux (Foxp3/GFP) ainsi que leur déplétion
après injection aux animaux de toxine diphtérique (absence de cellules Foxp3+ GFP+) (Lahl
et al. 2007).
Le facteur de transcription Foxp3 est donc le marqueur qui a permis d’identifier de manière
précise les Treg. Cependant, au vu du très large potentiel que ces cellules pourraient avoir
en clinique humaine, il est important de pouvoir trouver d’autres marqueurs de surface afin
de pouvoir les isoler sans avoir une population effectrice contaminante trop importante au
sein de la fraction cellulaire triée.
De nombreux autres marqueurs de surface ont donc été proposés par différents groupes afin
de mieux discriminer les Treg des T conventionnels tels que GITR, CTLA-4, CD62L, CD27
(…) (Godfrey et al. 2004; Ruprecht et al. 2005; Sakaguchi 2005). L’inconvénient de ces
molécules de surface est que leur niveau d’expression sur des lymphocytes T
56
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
conventionnels peut-être identique après activation au niveau constitutif observé sur des
Treg ; cela rend donc l’isolement de la population Treg plus délicate en particulier chez
l’homme. L’expression de Foxp3, peut chez l’homme également augmenter de façon
transitoire dans des lymphocytes T conventionnels activés. Toutefois, le niveau d’expression
de Foxp3 atteint sera toujours inférieur à celui observé dans des Treg (Walker et al. 2003;
Gavin et al. 2006). Foxp3 assure un contrôle et une régulation transcriptionnelle sur le
niveau d’expression de ces marqueurs (Sakaguchi 2005).
Toujours en quête d’un nouveau marqueur de surface et de façon plus anecdotique
Baecher-Allan et al. ont montré que le niveau d’expression des molécules de CMH de classe
II sur des lymphocytes T CD4+ CD25+ humains permettait d’identifier les Treg des T
effecteurs (Baecher-Allan et al. 2006).
Mais c’est durant l’année 2006, qu’un nouveau pas important dans la discrimination des Treg
a été franchi avec deux groupes qui ont parallèlement mis en évidence que les Treg CD4+
CD25+ Foxp3+ étaient CD127low alors que les lymphocytes T effecteurs activés (CD25+) ou
non activés (CD25-) étaient CD127high. CD127 est la chaîne α du récepteur à l’IL-7, le faible
niveau d’expression de CD127 pourrait indiquer que contrairement aux autres souspopulations lymphocytaires T, les Treg n’ont pas de besoins spécifiques en IL-7 in vivo pour
se maintenir en périphérie (contrairement à l’IL-2, d’où le niveau d’expression de CD25 très
élevé). Chez l’homme, à partir de prélèvements sanguins chez des donneurs sains, la
proportion de lymphocytes T CD4+ CD25+ CD127low est de 6,35 ± 0,26% des lymphocytes T
CD4+ périphériques totaux, 2,05 ± 0,14% expriment le marqueur de cellules naïves CD45RA
(Seddiki et al. 2006). Dans la population T CD4+ CD25+, il y a une très forte corrélation entre
l’expression de Foxp3 et la faible expression de CD127 (CD127low). Des analyses
moléculaires par CHiP (puces à ADN) suggèrent que le promoteur du gène codant pour
CD127 est une cible pour le facteur de transcription Foxp3. De plus la surexpression de
Foxp3 dans une souris transgénique conduit à une population de cellules exprimant de
manière homogène CD127low et possédant des propriétés suppressives (Liu et al. 2006). A la
fois les cellules T effectrices/mémoires et naïves CD4+ CD25+ CD127low présentent des
propriétés suppressives lors de tests fonctionnels in vitro au contraire des cellules T CD4+
CD25+ CD127high qui ne possèdent aucune activité suppressive.
CD127 est donc au final un très bon marqueur de surface permettant d’identifier et d’isoler
en combinaison avec CD25 des populations pures de Treg chez des individus sains ou bien
chez des patients atteints de diabète de type 1 (Liu et al. 2006) pour des études in vitro ou
pour d’éventuelles stratégies immunothérapeutiques.
Plus récemment en 2007, le groupe de Sakaguchi a identifié chez la souris un nouveau
marqueur de surface FR4 (Folate Receptor 4) qui est un sous-type de récepteur à l’acide
folique exprimé fortement et constitutivement sur les Treg CD4+ CD25+ CD127low Foxp3+. Ce
57
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
marqueur permet aussi de distinguer entre Treg (CD4+ CD25+ FR4high) et T conventionnels
activés (CD4+ CD25+ FR4low). L’élimination in vivo chez la souris des lymphocytes T CD4+
FR4high avec des anticorps déplétants conduit suivant la dose administrée soit, à forte dose
au développement de pathologies auto-immunes soit, à faible dose et si la souris porte une
tumeur à une régression de la masse tumorale. Les Treg humains expriment également un
homologue du FR4 murin. La surexpression rétrovirale de Foxp3 dans des lymphocytes T
CD4+ conduit à un phénotype FR4high suggérant ainsi que Foxp3 contrôle le niveau
d’expression de FR4 (Yamaguchi et al. 2007).
Développement et homéostasie du compartiment T régulateur :
Les lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs (Treg) naturels sont générés dans le thymus
comme un lignage séparé et sortent différenciés de cet organe lymphoïde primaire (Fontenot
and Rudensky 2005). Ce processus de différenciation débute lors de l’induction de
l’expression de Foxp3 dans une sous-population de thymocytes ayant un TCR αβ avec une
affinité accrue pour les complexes CMH/peptides du soi (Jordan et al. 2001; Apostolou et al.
2002). Cette affinité accrue pour les complexes CMH/peptides autologues permettra aux
Treg matures d’exercer leur fonction physiologique : la tolérance périphérique au soi et la
prévention du développement de manifestations auto-immunes. En plus de cette affinité du
TCR plus importante, la signalisation au travers de la chaîne commune des récepteurs aux
cytokines (γc) ainsi que la costimulation via CD28 facilite l’induction de l’expression de Foxp3
dans les thymocytes (Kim and Rudensky 2006) (Figure 17.). Les thymocytes Foxp3+
possèdent une activité suppressive comme les Treg matures (Zheng and Rudensky 2007).
Une étude récente utilisant des souris Foxp3-GFP, réalisée en insérant la séquence codant
pour la GFP dans le locus de Foxp3 a révélé la présence de thymocytes DP Foxp3+ et a de
plus confirmé l’importance de ce facteur de transcription dans la spécification du lignage
régulateurs (Fontenot et al. 2005). Comme évoqué plus haut, Foxp3 va activer ou réprimer
l’expression de certains gènes au cours du développement avec entre autre une forte
expression de CD25 (CD25high) et une faible expression de CD127 (CD127low). Une analyse
génomique récente par Zheng et al. a permis d’identifier des sites de liaison pour Foxp3 sur
approximativement 700 gènes. L’analyse des cellules T Foxp3+ montre que Foxp3 peut agir
à la fois comme un activateur ou un répresseur transcriptionnel. Ces travaux confirment le
statut de Foxp3 comme responsable de l’établissement intra-thymique du lignage régulateur
et des propriétés prolifératives et fonctionnelles des Treg en périphérie (Zheng et al. 2007).
Après être sorties du thymus, les Treg sont anergiques et ne prolifèrent qu’en présence d’IL2 exocrine sécrétée par les populations T effectrices. L’IL-2 est une cytokine produite
rapidement après activation des cellules T au niveau des ganglions lymphatiques drainant le
58
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
site de l’infection ou de l’inflammation. En induisant la prolifération des Treg dès l’initiation de
la réponse immunitaire, l’IL-2 favorise la mise en place d’une réponse suppressive effective
dans les plus brefs délais (avec pour but de contrôler la réponse effectrice et éviter
l’apparition de lésions immunopathologiques). Il a récemment été montré in vivo que lors de
l’immunisation d’une souris par un antigène donné il y a expansion des Treg (FR4high Foxp3+)
de façon antigène spécifique (Yamaguchi et al. 2007). L’expression importante de CD25
(CD25high) donne un avantage prolifératif aux Treg par rapport aux lymphocytes T effecteurs.
Figure 17. La différenciation des Treg est un processus intra-thymique effectué tout au long de la vie d’un
individu où de nouveaux émigrants thymiques reconstituent le pool périphérique de Treg. La
spécification du lignage régulateur est réalisée après induction de Foxp3 dans les thymocytes. Cette
induction de Foxp3 semble multifactorielle, d’une part la haute affinité et le caractère autospécifique du
TCR va être un facteur important. De plus la costimulation via CD28 et la signalisation au travers des
récepteurs aux cytokines ainsi que d’autres récepteurs à ce jour inconnus ont un rôle important dans
l’induction de Foxp3. L’expression de Foxp3 dans les thymocytes va entraîner l’activation et la répression
high
de plusieurs centaines de gènes, ce qui va permettre entre autre d’aboutir au phénotype CD25
low
CD127
. L’IL-2 exocrine produite par les cellules T périphériques permet de maintenir et d’amplifier le
pool de Treg périphériques. L’IL-2 n’est toutefois pas requise pour le développement intra-thymique des
Treg.
59
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Une approche utilisant des souris Foxp3-GFP possédant une déficience soit en IL-2, soit en
CD25 (IL-2Rα-/-) a permis de montrer que l’IL-2 n’est pas impliquée dans le développement
intra-thymique des Treg mais que cette cytokine est cruciale in vivo pour le maintien et
l’homéostasie périphérique des Treg (Fontenot et al. 2005).
Une étude complémentaire réalisée chez l’homme a montré que l’IL-2 régule positivement et
spécifiquement dans les Treg l’expression de Foxp3 et que cette régulation implique la
liaison des protéines STAT3 et STAT5 sur le premier intron du gène codant pour Foxp3
(Zorn et al. 2006).
L’IL-7 est au contraire une cytokine communément produite localement sur le site de
l’inflammation assurant une survie ainsi qu’une prolifération accrue des cellules T effectrices.
Le faible niveau d’expression de CD127 sur les Treg apparaît donc comme logique ; en effet,
si les Treg étaient capables d’entrer en compétition avec les lymphocytes T effecteurs pour
l’IL-7 produit sur le site de l’inflammation, cela aurait alors un effet contreproductif sur le
déroulement de la réponse immunitaire.
Une autre cytokine qui semble importante dans l’homéostasie périphérique des Treg est
l’IFN-γ dont l’action sur la réponse immunitaire semble dépendre du contexte. L’IFN-γ a en
effet des fonctions paradoxales, en favorisant d’une part le développement d’une réponse
pro-inflammatoire de type TH1 et d’autres part en permettant aux Treg de contrôler le
déroulement des réponses immunes (Wood et al. 2007). L’équipe de Kathryn Wood a
proposé en 2005 un modèle où les Treg produisaient rapidement et seulement de manière
transitoire de l’IFN-γ, crucial pour leur fonction in vivo. Cette production d’IFN-γ par les Treg
peut de plus créer un micro-environnement suppressif induisant une inhibition de l’activation
et de la prolifération des cellules T effectrices et ce, en influençant la fonction des APC en
induisant l’enzyme iNOS (inducible nitric oxide synthase), l’enzyme HO-1 (heme oxygenase1) ou bien l’enzyme IDO (indoleamine-2,3-dioxygénase) induisant le catabolisme du
tryptophane (Sawitzki et al. 2005; Wood and Sawitzki 2006).
Enfin, la cytokine clé impliquée dans le maintien en périphérie et la mise en place des
fonctions effectrices des Treg est le TGF-β (transforming growth factor-β). Il existe plusieurs
isoformes du TGF-β : le TGF-β1, le TGF-β2 et le TGF-β3. Le TGF-β1 est l’isoforme ayant
une activité immunologique, les autres jouant plutôt un rôle au cours de l’embryogenèse ou
bien lors des processus de myogenèse. Le TGF-β est une cytokine pléïotropique (la plupart
des cellules possèdent un récepteur au TGF-β) très conservée au cours de l’évolution
possédant un effet immunosuppresseur prononcé. En effet, une souris exprimant un
dominant négatif du récepteur de type II au TGF-β (dnTGF-βRII) exprimé sous le contrôle
d’un promoteur T spécifique et donc possédant des cellules T incapables de répondre à
60
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
cette cytokine va développer des pathologies auto-immunes. Cela démontre, l’importance
cruciale du TGF-β dans l’homéostasie du compartiment T (Gorelik and Flavell 2000).
En 2005, Marie et al. ont montré que le TGF-β1 était critique pour l’homéostasie et l’activité
régulatrice du pool de Treg périphérique mais non requis pour le développement intrathymique de ces cellules. En effet, des souris TGF-β1-/- âgées de 8 à 10 jours (phénotype
létal à 3 semaines de vie) présentent une réduction significative du nombre de Treg en
périphérie mais un nombre inchangé de thymocytes Foxp3+ au sein du thymus. Ils ont de
plus montré en utilisant un modèle murin dnTGF-βRII que l’abrogation de la signalisation
TGF-β dépendante dans les Treg induit une diminution à la fois du niveau d’expression de
Foxp3 mais également de l’activité suppressive (Marie et al. 2005).
De plus, durant ces dernières années il a été largement documenté que le TGF-β1 associé à
une stimulation du TCR permettait in vitro chez l’homme et la souris la conversion de
lymphocytes naïfs T CD4+ CD25- Foxp3- en lymphocytes T CD4+ CD25+ Foxp3+ régulateurs
(Rao et al. 2005). Cette néoconversion de T effecteurs en Treg ou Ti-Treg (TGF-β induced
Treg) permet d’obtenir des cellules présentant une activité suppressive in vitro mais
également in vivo après transferts adoptifs dans des modèles murins (Chen et al. 2003;
Fantini et al. 2004; Fantini et al. 2007; Luo et al. 2007). Ces Ti-Treg transférés in vivo chez la
souris persistent dans l’organisme assurant ainsi une fonction régulatrice à long terme chez
l’animal (Selvaraj and Geiger 2007). Le groupe de Schevach a récemment montré que la
présence d’IL-2 semble être un paramètre important pour réaliser cette néoconversion en TiTreg induite par le TGF-β (Davidson et al. 2007).
Coombes et al. ont montré cette conversion in vivo chez la souris en identifiant une
population de DC CD103+ présente au niveau des ganglions lymphatiques mésentériques et
possédant le potentiel d’induire (après stimulation antigénique au niveau intestinal) des Treg
Foxp3+. Cette induction in vivo de Treg par les DC CD103+ est dépendante du TGF-β et de
l’acide rétinoïque (Coombes et al. 2007).
II. Mécanismes de suppression
Trouver « Le » mécanisme d’action des Treg a été un aussi grand challenge durant les dix
dernières années que celui axé sur l’identification d’un marqueur spécifique. Cependant
après avoir abordé cette question par de multiples systèmes expérimentaux in vitro et in
vivo, il ne semble pas qu’il y ait un mécanisme d’action principal, mais plusieurs mécanismes
d’action différents mis en place suivant le contexte et la fonction cellulaire régulée
(prolifération, production de cytokines…). Il est de plus imaginable que in vivo la régulation
61
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
s’opère différemment suivant le type de réponse immunitaire à réguler en utilisant des
combinaisons de plusieurs mécanismes (Figure 18.). Ce chapitre aura pour but d’évoquer de
façon non exhaustive les différents mécanismes de régulation connus à ce jour.
Il y a maintenant une accumulation d’évidences montrant que les Treg CD4+ CD25+ Foxp3+
naturels inhibent l’activation et/ou l’expansion de différentes cellules immunitaires. Il a tout
d’abord été montré par Sakaguchi et al. que les Treg inhibaient in vivo l’activation et
l’expansion des lymphocytes T CD4+ effecteurs. En effet, la déplétion en Treg conduit au
développement de pathologies auto-immunes T CD4+ dépendantes pouvant être corrigées
par transfert adoptif de Treg (Sakaguchi et al. 1995). Depuis cette approche expérimentale a
été étendue à de nombreux modèles de pathologies auto-immunes chez la souris
(Sakaguchi 2004). Des études in vitro ont montré que les Treg supprimaient efficacement
l’activation, prolifération et/ou production de cytokines de lymphocytes T CD4+ ou T CD8+
aussi bien dans des systèmes avec des CPA que dans des systèmes sans CPA, avec des
stimulations polyclonales de type CD3/CD28 (Thornton and Shevach 1998; Piccirillo and
Shevach 2001; Godfrey et al. 2004; Game et al. 2005). In vivo, il a été récemment observé
par des approches de microscopie biphotonique intravitale que les Treg peuvent bloquer
l’exocytose des granules lytiques des CTL (Mempel et al. 2006).
Les Treg sont également capables d’inhiber les lymphocytes B à plusieurs niveaux. Ils
peuvent inhiber leur prolifération, la production d’immunoglobuline ainsi que la commutation
isotypique (Lim et al. 2005; Miyara and Sakaguchi 2007). L’aptitude des Treg à inhiber les
cellules NK (Natural Killer) et les cellules NKT (Natural Killer T) a été également documentée
(Azuma et al. 2003; Ghiringhelli et al. 2005). Les Treg peuvent également moduler la
maturation des DC (Misra et al. 2004).
La suppression induite par les Treg peut se faire sur des cellules T naïves, effectrices ou
bien mémoires. Cependant leur potentiel régulateur sur l’activation ou bien la réponse
proliférative est plus efficace sur des populations lymphocytaires T naïves (Levings et al.
2001; Suvas et al. 2003).
Nécessité du contact cellulaire pour la suppression in vitro
Cette notion de contact cellulaire dans la suppression a été introduite avec des expériences
de suppression in vitro, qui sont maintenant devenues des méthodes classiques pour
évaluer le potentiel suppresseur d’une population de Treg. Dans ces expériences de
coculture les Treg inhibent la prolifération et la production de cytokines de cellules T CD4+
répondeuses après stimulation via le TCR de ces populations (en présence ou en absence
de CPA). La présence d’une membrane semiperméable séparant les deux populations
62
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
cellulaires inhibe la suppression réalisée par les Treg (humaines et murines) (Thornton and
Shevach 1998; von Boehmer 2005).
Plusieurs molécules semblent impliquées dans cette suppression dépendante du contact
cellulaire : CTLA-4 (ou CD152), LAG3 (Lymphocyte-activation gene 3) ainsi que les
molécules CD80 et CD86 présentes sur les CPA (Sakaguchi 2004).
Les Treg expriment de manière constitutive CTLA-4 au contraire des cellules T naïves qui ne
l’expriment que tardivement après activation. Il a de plus été montré que l’activation des Treg
induisait une augmentation du niveau d’expression de CTLA-4 (Sakaguchi 2004). En
étudiant séparément la fonction biologique de CTLA-4, il apparaît alors évident de
l’importance de cette molécule dans la fonction suppressive in vitro et in vivo des Treg. En
effet le blocage de CTLA-4 chez la souris conduit au développement de pathologies autoimmunes multi-organes (Sakaguchi 2004). De plus, des études génomiques chez l’homme
ont montré que l’altération quantitative de la forme transmembranaire ou bien soluble de
CTLA-4 conduisait à une destruction auto-immune des tissus (Ueda et al. 2003).
Le blocage de CTLA-4 lors de tests de suppression in vitro par des anticorps monoclonaux
anti-CTLA-4 ou bien en utilisant des CTLA-4 Fab (Fragment antigen binding) inhibe l’activité
suppressive des Treg (von Boehmer 2005) quand les Treg sont isolés à partir de souris WT
et les Tresp à partir de souris CTLA-4-/-. Il a également été montré que l’expression forcée de
Foxp3 dans des cellules T naïves augmentait l’expression de CTLA-4, suggérant ainsi que
l’expression de CTLA-4 est régulée positivement par ce facteur de transcription (Hori et al.
2003). CTLA-4 présent sur les Treg va pouvoir agir de plusieurs manières dans l’induction de
mécanismes régulateurs. Tout d’abord il est possible que CTLA-4 présent à la surface des
Treg puisse interagir avec les molécules accessoires CD80 et CD86 à la surface de la CPA
cela permettant de transduire un signal de costimulation (en plus de l’activation via le TCR)
aux Treg nécessaire à la mise en place de leur activité suppressive (Miyara and Sakaguchi
2007). Ensuite des travaux ont montré que CTLA-4 exprimé à la surface des Treg pouvait
interagir avec les molécules CD80 et CD86 des DC afin d’induire l’expression de IDO,
enzyme responsable du catabolisme du tryptophane. Le catabolisme du tryptophane va
conduire à la synthèse de métabolites toxiques comme les kynurénines, de plus la déplétion
locale du milieu extracellulaire en tryptophane va pénaliser la prolifération cellulaire
(Grohmann et al. 2002; Fallarino et al. 2003). Au final l’induction d’IDO au sein des DC par
les Treg va créer un micro-environnement tolérogénique propice à la conversion de cellules
T CD4+ naïves en Treg et pour les cellules T CD8+ à une internalisation des chaînes ζ du
TCR induisant une altération des fonctions effectrices et notamment de la fonction
cytotoxique (Fallarino et al. 2006).
LAG3 également connue sous l’appellation de CD223 est une molécule d’adhérence
associée à CD4 qui se lie avec les molécules de CMH de classe II présentes à la surface
63
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
d’une CPA. LAG3 est exprimée à la surface des Treg après activation, l’injection à des souris
d’anticorps bloquants anti-LAG3 inhibe l’activité suppressive des Treg in vivo. De plus, des
Treg isolés à partir de souris LAG3-/- présentent une activité régulatrice altérée lors de tests
fonctionnels in vitro. Le fait que LAG3 puisse se lier aux molécules de CMH de classe II
pourrait expliquer le potentiel des Treg à inhiber différentes populations de cellules
immunitaires (DC, macrophages, lymphocytes T activés chez l’homme, lymphocytes B).
Cependant le rôle précis de LAG3 dans la biologie des Treg reste encore à préciser, car
contrairement aux souris CTLA-4-/- ou TGF-β-/-, les souris LAG3-/- ne développent aucunes
manifestations auto-immunes (Huang et al. 2004).
L’implication des cytokines dans la suppression
En contraste apparent avec les données expérimentales indiquant la nécessité d’un contact
cellulaire pour que les Treg puissent mettre en place leur activité régulatrice, de nombreux
travaux mettent en avant le rôle crucial de la sécrétion des cytokines suivantes par les Treg :
l’IL-10 et le TGF-β. Ces cytokines aux propriétés immunosuppressives et anti-inflammatoires
connues vont directement ou indirectement contribuer à la régulation par la mise en place
d’un environnement dit tolérogène.
Plusieurs modèles expérimentaux in vivo supportent le rôle de l’IL-10, surtout des modèles
de pathologie ayant une composante inflammatoire importante. Par exemple l’IL-10 est
requise dans le contrôle de la colite par les Treg CD4+ CD25+ CD45RBlow, en effet des Treg
isolés à partir de souris IL10-/- ne peuvent pas prévenir cette pathologie (Annacker et al.
2001). Kingsley et al. ont montré que l’IL-10 était impliquée dans l’inhibition par les Treg du
rejet de greffes de peau, l’administration d’anticorps anti-IL-10 bloquants accélère le rejet
(Kingsley et al. 2002). Il a récemment été montré que les Treg infiltrant la lamina propria
intestinale ou le système nerveux central peuvent respectivement inhiber le développement
de la colite et de l’EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) par une sécrétion
locale d’IL-10. De plus, après analyse des différents pools de Treg, il apparaît que les Treg
infiltrant l’intestin produisent de l’IL-10 au contraire des Treg spléniques, ces données
suggérant peut-être que l’environnement influence le profil de sécrétion des Treg et les
fonctions effectrices suppressives mises en place (McGeachy et al. 2005; Uhlig et al. 2006).
Un autre argument en faveur de cette théorie est que l’addition d’anticorps bloquants anti-IL10 et/ou anti-TGF-β n’inhibe pas l’activité suppressive des Treg sur la prolifération de Tresp
lors de tests classiques de suppression in vitro (Piccirillo et al. 2002; Sakaguchi 2004; von
Boehmer 2005).
64
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
La cytokine tenant tout de même un rôle majeur dans la biologie des Treg est le TGF-β. En
effet, cette molécule intervient à la fois dans l’homéostasie de ces cellules ainsi que dans la
régulation de nombreuses fonctions effectrices et ce pour différents types cellulaires.
Le TGF-β pourrait être seulement produit par les Treg (présence intra-cellulaire d’importante
quantité d’ARNm du TGF-β et détection de la sécrétion de cette cytokine en ELISA) ou bien
les Treg en plus de produire leur propre TGF-β, pourraient également induire la production
de TGF-β par les CPA afin d’établir un micro-environnement suppressif (von Boehmer 2005).
Des données du groupe de Powrie montrent que des Treg isolés à partir de souris TGF-β1-/sont capables d’inhiber la colite mais que la co-injection de ces Treg TGF-β1-/- avec un
anticorps bloquant anti-TGF-β inhibe la prévention de la colite suggérant ainsi que dans ce
modèle de colite les Treg induisent la production de TGF-β via d’autres cellules. Au cours de
ce même travail ils ont constaté que des cellules T CD4+ CD45RBhigh effectrices exprimant
un dnTGF-βRII échappent au contrôle des Treg in vivo dans la prévention de la colite,
démontrant ainsi que les cellules T CD4+ CD45RBhigh effectrices sont la cible directe du TGFβ (Fahlen et al. 2005).
Soutenant ces travaux, Mempel et al. ont montré en 2006 par des approches
morphologiques (microscopie biphotonique et confocale) en utilisant des CTL exprimant un
dnTGF-βRII que les Treg pouvaient réguler la fonction cytotoxique des CTL via un
mécanisme TGF-β dépendant en inhibant de manière réversible l’exocytose des granules
lytiques. Les CTL non régulés tuent en moyenne 6,6 fois plus vite leurs cibles que les CTL
régulés. Ils ont constaté également en mesurant le niveau des ARNm que les productions
d’IFN-γ, de granzymes A et B, de perforine et de FasL par les CTL n’étaient pas altérées en
présence de Treg. Cet élégant travail a permis d’attribuer un rôle précis au TGF-β dans la
régulation des CTL (Mempel et al. 2006). Auparavant, une autre équipe avait déjà
documenté la capacité des Treg à inhiber de manière TGF-β dépendante les fonctions
effectrices des CTL sur la lyse de cellules tumorales in vivo. Cette inhibition in vivo de la
fonction lytique n’affectait pas la prolifération ou bien la production d’IFN-γ des CTL (Chen et
al. 2005).
Il a également été montré que la production de TGF-β par les Treg inhibait la cytotoxicité des
cellules NK et diminuait le niveau d’expression du récepteur activateur NKG2D à leur surface
(Ghiringhelli et al. 2005).
Des Treg TGF-β-/- sont toutefois capables d’inhiber la prolifération de cellules T CD4+
conventionnelles lors de tests classiques de suppression in vitro (Piccirillo et al. 2002).
65
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Fonctions physiologiques, physiopathologiques et signalisation du TGF-β
Le TGF-β (Transforming Growth Factor-β), molécule de nature polypeptidique, est connu
pour assurer des fonctions pléïotropiques dans le cadre de la réponse immunitaire mais
également plus largement au cours de nombreux processus biologiques (différenciation
cellulaire, prolifération, survie, etc). C’est une cytokine impliquée de façon critique dans le
développement de multiples organes et tissus, aussi bien chez les organismes invertébrés
que chez les organismes vertébrés. Ces observations illustrent le fait que les voies de
signalisation induites par le TGF-β sont des voies anciennes et conservées au cours de
l’évolution (Shi and Massague 2003; Rubtsov and Rudensky 2007). Il existe chez les
mammifères trois isoformes du TGF-β : les TGF-β1, TGF-β2 et TGF-β3. Le TGF-β1 est
préférentiellement exprimé et produit par les cellules d’origine hématopoïétique. Les deux
autres isoformes du TGF-β sont produits dans des concentrations relativement faibles et
n’ont pas de rôle connu sur le système immunitaire (Rubtsov and Rudensky 2007). Le TGFβ1 est une cytokine immunosuppressive remplissant une fonction capitale dans la
préservation de l’intégrité de l’organisme. Une souris déficiente en TGF-β1 ne présente pas
d’anomalités lors du développement embryonnaire et fœtal. Cependant, aux environs de la
fin de la troisième semaine après la naissance, ces animaux développent un syndrome autoimmun multi-organes associé à un fort niveau d’inflammation conduisant à la destruction
progressive des organes et des tissus puis à la mort des souris (Shull et al. 1992). Le TGFβ1 peut agir à la fois de manière paracrine et autocrine. Les macrophages, les cellules
dendritiques, les cellules T ainsi que d’autres cellules immunitaires peuvent être à la fois les
sources de TGF-β1 et les cibles de cette cytokine (Letterio and Roberts 1998). De plus, les
cellules stromales des organes lymphoïdes primaires, secondaires et tertiaires (incluant les
cellules épithéliales et les fibroblastes) peuvent également produire du TGF-β1. La
manipulation du microenvironnement stromal afin de favoriser la production de TGF-β1
pourrait être une solution thérapeutique dans le traitement des pathologies inflammatoires
chroniques (Filer et al. 2006).
Cette capacité à être sécrété par de nombreux types cellulaires permet de comprendre le
rôle capital du TGF-β1 dans l’homéostasie du système immunitaire mais rend, de ce fait,
difficile l’étude et la compréhension de sa mécanistique d’action in vivo. Bien que la
régulation de l’expression du gène codant le TGF-β1 ne soit pas encore complètement
connue, des séquences consensus de liaison aux facteurs de transcription NF-κB et AP1 ont
été décrites sur le promoteur de ce gène (Rubtsov and Rudensky 2007). Après engagement
productif du TCR, il y a induction de l’expression de TGF-β1 au sein de lymphocytes T. En
1986, le groupe de Fauci a été le premier à décrire que le TGF-β produit par des
lymphocytes T activés permet un rétrocontrôle négatif sur leur prolifération (Kehrl et al.
66
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
1986). De plus, il a été décrit que le TGF-β1 lui-même peut induire la transcription du gène
codant le TGF-β1 (Rubtsov and Rudensky 2007). La quantité de mRNA TGF-β1 présent
dans une cellule ne reflète pas forcément la quantité de protéine qui sera produite. En effet,
des modifications post-transcriptionnelles ainsi que des étapes de maturations rendent plus
complexe la biosynthèse de cette cytokine. Le TGF-β1 est produit sous une forme latente
associé de façon non covalente à un polypeptide : LAP (latency associated peptide). Tant
que le TGF-β1 est associé à LAP, il ne peut pas interagir avec son récepteur (la sous-unité
TGF-βRII) (Figure 17.b). Les mécanismes permettant le clivage protéolytique assurant la
libération du TGF-β1 ne sont pas encore complètement connus. Des facteurs extracellulaires
sont impliqués comme la thrombospondine-1 dont l’action dans l’activation du TGF-β1 a été
décrite in vivo (Crawford et al. 1998). Des travaux suggèrent également l’action de protéines
appartenant la famille des intégrines dans le clivage du complexe LAP/TGF-β1 (Munger et
al. 1999; Annes et al. 2004). La forme active du TGF-β1 est homodimèrique, elle est
stabilisée par des interactions hydrophobes ainsi que par la présence d’un pont disulfure qui
lie les deux monomères ensembles (Rubtsov and Rudensky 2007).
Une fois lié à son récepteur, le TGF-β1 active la voie des protéines de type Smad (Smothers against decapentaplegic). Les Smad peuvent être classés en trois catégories : les
Smad régulés par les récepteurs au TGF-β1 (Smad 2 et Smad 3), les SMAD servant de
comédiateurs (Smad 4) ainsi que les Smad possédant une fonction inhibitrice sur la voie de
signalisation induite par le TGF-β1 (Smad 7) (Figure 17.b). Des travaux ont montré qu’une
fois fixé sur son récepteur, le TGF-β1 active et réprime rapidement plusieurs centaines de
gènes dans la cellule cible (Shi and Massague 2003). En plus d’agir sur les protéines de type
Smad, le TGF-β1 peut moduler d’autres voies de signalisation tels que la voie de la Pi3K, la
voie de ERK, la voie des MAPKinases, la voie des Rho GTPases, etc. (Derynck et al. 2001).
Dans un cadre tumoral le TGF-β1 peut à la fois jouer un rôle antitumoral (en freinant les
processus de prolifération cellulaire, en favorisant la stabilité génomique, etc.) ainsi qu’un
rôle protumoral (en favorisant les processus de néoangiogenèse, en diminuant
l’immunosurveillance, etc.). Lors du développement d’une tumeur cancéreuse du stade
prénéoplasique aux stades métastatiques avancés, il n’est pas, à l’heure actuelle, clairement
établi à quel moment l’effet du TGF-β1 sur les cellules tumorales va changer (Dumont and
Arteaga 2003).
67
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Figure 17.b Voie de signalisation induite par la fixation d’un homodimère de TGF-β1 sur la sous-unité II du
récepteur au TGF-β. Une fois sous forme active (libéré du polypeptide associé LAP), le TGF-β1 se fixe sur
la sous-unité TGF-βRII qui s’associe ensuite avec la sous-unité TGF-βRI. Une fois le complexe formé, il y a
autophosphorylation du récepteur qui peut ainsi recruter les protéines Smad 2 et Smad 3. Une fois
phosphorylés Smad 2/3 s’associent à Smad 4. Le complexe protéique ainsi formé subit une translocation
nucléaire afin de cibler un gène parmi plusieurs centaines de cibles potentielles. Smad 7 est une protéine
inhibitrice agissant en amont sur l’activation de Smad 2/3.
Autres mécanismes de suppression
De récents travaux ont documenté la capacité des Treg Foxp3+ à lyser les cellules effectrices
afin de pouvoir contrôler le développement de la réponse immunitaire. Cette cytotoxicité
serait médiée par la sécrétion de perforine et de granzymes A et B et toucherait les cellules
T effectrices, les monocytes et les DCs, cellules clé dans l’amplification de la réponse
immunitaire (Grossman et al. 2004; Gondek et al. 2005; Zhao et al. 2006). Toutefois ce
mécanisme apparaît encore à ce jour anecdotique dans l’activité de régulation globale
réalisée par les Treg.
68
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Figure 18. Mécanismes de suppression exercés par les Treg Foxp3+. De multiples mécanismes
moléculaires et cellulaires ont été à ce jour décrits afin d’essayer d’expliquer comment les Treg peuvent
contrôler le développement des réponses immunitaires. (a) Influence du contact cellulaire, rôle de
l’interaction CTLA-4 et des molécules de co-stimulation CD80/CD86 sur la CPA ; interaction entre LAG3 et
les molécules de CMH de classe II. (b) sécrétion de cytokines immunosuppressives : IL-10 et TGF-β. (c)
Induction d’IDO via CTLA-4 dans les DC. (d) Cytotoxicité des Treg sur les cellules T effectrices et sur les
CPA. (e) Il existe sûrement d’autres mécanismes moléculaires et cellulaires non identifiés à ce jour.
L’activité suppressive des Treg repose donc sur une combinaison de mécanismes différents mis en place
suivant le type de réponse et de cellules immunitaires à réguler.
L’ensemble de ces données suggère que l’implication des cytokines dans les fonctions
suppressives des Treg dépend du type cellulaire régulé, du contexte physiopathologique
mais surtout de la fonction cellulaire régulée. En effet, vu le nombre de fonctions cellulaires
et de types cellulaires régulés différents, il apparaît alors logique que les Treg disposent de
différents mécanismes d’actions (Figure 18.) et non d’un mécanisme unique afin de pouvoir
contrôler finement la réponse immunitaire.
De plus, il est maintenant bien démontré que l’induction de l’activité suppressive des Treg
requiert une stimulation antigénique via le TCR et que donc leur activation se fait de manière
antigène spécifique. Cependant la suppression réalisée par les Treg se fait de manière
antigène non spécifique bien qu’exercée dans le micro-environnement proche de la CPA
présentant l’antigène spécifique. Cela pourrait expliquer la capacité des Treg à réguler une
69
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
réponse immunitaire de manière antigène spécifique in vivo sans pour autant avoir d’impact
négatif sur le déroulement d’une autre réponse (Joffre et al. 2004; Yamaguchi et al. 2007).
III. Fonctions physiologiques et physiopathologiques des Treg
Les parties précédentes ont permis de mettre en avant le rôle crucial des Treg dans
l’homéostasie générale de l’organisme grâce à leur fonction physiologique principale : le
maintien de la tolérance périphérique au soi. Il existe d’autres situations physiologiques ou
physiopathologiques dans lesquelles les Treg vont jouer un rôle important. Ce rôle peut-être
positif dans le cadre de la tolérance foeto-maternelle ou lors de la modulation des réponses
anti-infectieuses mais il peut être également néfaste dans le cadre de l’immunosurveillance
anti-tumorale.
Tolérance fœto-maternelle
La grossesse pourrait sur un plan immunologique se décrire comme une greffe semiallogénique naturelle. En effet, durant la phase de gestation du fœtus, le système
immunitaire maternel doit s’adapter et relever un challenge important pour pouvoir tolérer la
présence de non soi dans l’organisme, ce non soi correspondant aux alloantigènes paternels
(Tafuri et al. 1995). Les agressions du système immunitaire maternel dirigées contre le fœtus
sont inhibées par différents mécanismes visant à neutraliser localement les cellules
immunitaires réactives contre les alloantigènes du fœtus. Tout d’abord, il y a établissement
d’une barrière physique : la barrière transplacentaire constituant une interface sélective entre
la mère et le fœtus. Au niveau de cet interface, il y a expression de la molécule de CMH de
classe I non classique : HLA-G qui inhibe l’activation des cellules NK. De plus, les cellules
trophoblastiques expriment la molécule FasL ce qui leur confère le potentiel d’induire
l’apoptose des lymphocytes T allospécifiques maternels (Aluvihare et al. 2005). Malgré leur
efficacité, tous ces mécanismes ont toutefois une action restreinte à un niveau local. Leur
seule présence n’explique donc pas la capacité à assurer de manière prolongée une
tolérance systémique aux alloantigènes paternels.
En 2004, Aluvihare et al. ont montré dans un modèle murin que durant la période de
gestation, il y avait de manière alloantigène indépendante une expansion systémique du pool
périphérique de Treg maternels. Leur fonction, en plus de supprimer les réponses autoimmunes, consiste à inhiber les réponses allogéniques dirigées contre le fœtus. Leur
absence conduit à un avortement chez la souris, avortement correspondant à un rejet
immunologique du fœtus (Aluvihare et al. 2004).
Une autre équipe a montré parallèlement chez la souris que lors de l’administration d’un
traitement à base d’E2 (17-beta estradiol) ou bien durant la période physiologique de
70
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
gestation (période au cours de laquelle le niveau systémique des estrogènes est élevé), il y a
augmentation du niveau d’expression de Foxp3 et expansion du pool périphérique de Treg.
Ces données expliquent donc l’augmentation du nombre de Treg circulants durant la
grossesse et de plus, permettent de mieux comprendre le rôle protecteur de l’E2 sur le
développement de pathologies auto-immunes (Polanczyk et al. 2004).
Enfin, des travaux plus anciens ont montré que le traitement de souris gestantes avec un
inhibiteur pharmacologique d’IDO conduit à un avortement dû à un rejet immunologique du
fœtus (Munn et al. 1998). A l’époque, l’action d’IDO n’a pas été reliée à l’activité régulatrice
des Treg, mais il est envisageable que la fonction protectrice des Treg durant la grossesse
soit due au moins en partie à l’induction d’IDO par les Treg au niveau des cellules
trophoblastiques et des CPA.
Modulation des réponses immunitaires anti-infectieuses
Lors d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, le système immunitaire met en place
différents mécanismes effecteurs : la production de cytokines pro-inflammatoires, la
production de chimiokines permettant le recrutement de cellules immunitaires sur le lieu de
l’infection et finalement l’activation de cellules cytotoxiques comme les CTL et les NK qui
vont pouvoir lyser les cellules infectées. Bien que ces mécanismes soient cruciaux pour
limiter la propagation de l’agent pathogène dans l’organisme ainsi que pour éliminer le
pathogène de l’organisme, ils doivent être drastiquement contrôlés afin d’éviter tout risque
d’hyper-inflammation et de dommages tissulaires collatéraux. En effet, il est possible que
lors de la réponse immunitaire adaptative contre les antigènes du pathogène il y ait
génération d’une réaction immunitaire dite croisée ou « cross-réactive » contre des
antigènes du soi aboutissant alors au développement de pathologies auto-immunes. C’est
pour palier à cela que le système immunitaire aurait développé des mécanismes
suppresseurs afin de préserver l’homéostasie de l’organisme. Il a tout d’abord été décrit des
mécanismes de régulation consistant en la production de cytokines anti-inflammatoires par
les cellules de l’immunité innée. Plus récemment, l’implication de l’immunité adaptative a été
largement documentée dans différents modèles infectieux avec le rôle capital que jouent les
Treg Foxp3+ (Mills 2004). La plupart des infections où les Treg ont un rôle protecteur
important sont des cas d’infections chroniques (Belkaid and Rouse 2005). L’isolation de Treg
à partir de patients atteints d’une infection chronique par Helicobacter pylori, montrent que
ces cellules régulatrices sont capables d’inhiber des réponses cellulaires T spécifiques des
antigènes bactériens mais pas des réponses cellulaires T spécifiques d’autres antigènes
(Lundgren et al. 2003).
Un exemple bien documenté à ce jour est le cas de l’infection gastro-intestinale bactérienne
par Helicobacter hepaticus qui va causer une inflammation intestinale. Le transfert de
71
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
cellules T CD4+ isolées à partir d’une souris IL-10-/- infectée par Helicobacter hepaticus dans
une souris RAG-/- infectée par cette même bactérie va permettre un excellent contrôle de
l’infection, mais cela va également augmenter l’inflammation intestinale et induire l’apparition
d’une colite inflammatoire. Le transfert de lymphocytes T CD4+ totaux isolés à partir d’une
souris WT infectée par Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- également infectée
par la même bactérie va permettre d’induire une réponse immunitaire contre le pathogène
moins importante, mais en évitant le développement de la colite. Les auteurs de ce travail
ont donc montré l’importance de la génération d’un pool de Treg antigène spécifique qui va
moduler la réponse immunitaire anti-bactérienne via un mécanisme dépendant de l’IL-10
(Kullberg et al. 2002).
D’autres modèles infectieux où l’action suppressive des Treg dans le contrôle de la réponse
inflammatoire ont depuis été décrits, c’est le cas des infections par Pneumocystis carinii, par
Candida albicans, par Leishmania major, par le virus de l’hépatite C, par le virus de l’herpès
(…) (Belkaid and Rouse 2005).
Une autre conséquence de la modulation des réponses anti-infectieuses par les Treg va être
d’augmenter la survie de l’agent infectieux dans l’organisme et dans certains cas, cela va
même favoriser une persistance à long terme de l’agent pathogène. Cette persistance à long
terme va créer un nouvel état d’homéostasie pour l’organisme, ce qui est illustré par le
modèle murin d’infection par Leishmania major. En 2002, Yasmina Belkaid et al. ont montré
que la persistance de Leishmania major au niveau de la peau de souris C57BL/6 après
résolution de la phase « aigüe » de l’infection était due à l’action endogène des lymphocytes
T CD4+ CD25+ régulateurs. Au cours du processus infectieux, les Treg s’accumulent au
niveau du derme des souris infectées et inhibent via des mécanismes à la fois dépendants et
indépendants de l’IL-10 les réponses effectrices des lymphocytes T CD4+ CD25conventionnels visant à éliminer le parasite. Cependant, l’activité suppressive des Treg ne se
fait pas que pour assurer la survie du pathogène, cela permet également au système
immunitaire (du fait de la persistance des antigènes parasitaires en périphérie) de mettre en
place une mémoire immunitaire efficace en cas de réinfection par le même pathogène. En
effet, des souris IL-10-/- infectées par Leishmania major développent une réponse
immunitaire permettant l’élimination de la totalité de la charge parasitaire mais ne permettant
pas la mise en place d’une mémoire immunitaire capable de protéger l’animal en cas de
réinfection (Belkaid et al. 2002). Le groupe de Yasmina Belkaid a depuis montré en 2006
dans ce modèle d’infection parasitaire que c’était la chimiokine CCR5 qui était responsable
du recrutement des Treg au niveau du derme infectieux (Yurchenko et al. 2006). Ils ont de
plus montré, après avoir réalisé des tests fonctionnels ex vivo, que la majorité des Treg
recrutés au niveau du derme de souris infectées par Leishmania major étaient spécifiques
des antigènes du parasite (Suffia et al. 2006).
72
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Figure 19. Modulation des réponses anti-infectieuses par les lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
(Treg). Lors de la mise en place de la réponse immunitaire adaptative contre un agent pathogène, des
Treg sont recrutés au niveau du tissu infecté grâce à la chimiokine CCR5 et ils modulent la réponse proinflammatoire des lymphocytes T effecteurs (réponses de type TH1 ou TH2 suivant le type de pathogène)
via des mécanismes dépendants et indépendants de l’IL-10. Cette modulation est pour l’organisme
doublement avantageuse, car elle va permettre d’éviter l’apparition de dommages tissulaires collatéraux
et de plus, la persistance périphérique des antigènes du pathogène va favoriser le développement de la
mémoire immunitaire.
Les Treg sont donc capables de réguler l’amplitude des réponses immunitaires effectrices,
évitant ainsi l’apparition de lésions tissulaires immunopathologiques au dépend toutefois d’un
contrôle total de l’infection. La question qui reste encore ouverte est de savoir si au cours de
l’évolution, les agents infectieux ont développé des moyens afin de manipuler les populations
de Treg endogènes favorisant ainsi leur survie dans l’organisme (Belkaid et al. 2006).
Effet délétère sur l’immunité anti-tumorale :
Les pathologies infectieuses et inflammatoires sont induites par des organismes exogènes
(virus, bactéries, parasites…). Les cancers au contraire sont des pathologies inflammatoires
qui vont être induites suite à des divisions anarchiques et non contrôlées de cellules du soi.
73
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
Du fait de l’origine endogène des tumeurs, générer une immunité anti-tumorale efficace est
un processus délicat car cela pourrait conduire à la mise en place d’une réponse autoimmune. Heureusement, les antigènes tumoraux ne sont pas tous des antigènes du soi mais
possèdent des caractéristiques propres (antigènes EBV dans certains lymphomes, des
formes mutées de p53 dans certains carcinomes épithéliaux, etc), le terme de soi modifié est
alors employé afin de les désigner. Malgré les efforts du système immunitaire à mettre en
place une réponse immunitaire antitumorale, la régression spontanée d’une tumeur établie
est un évènement très rare. En effet, les tumeurs ont développé de nombreux mécanismes
d’évasion au système immunitaire notamment en générant un micro-environnement
suppresseur grâce à la production de cytokines aux propriétés immunosuppressives : l’IL-10
(Salazar-Onfray 1999; Curiel 2007) et le TGF-β (Li et al. 2006; Liu et al. 2007). Les tumeurs
sont également capables de sécréter des facteurs de croissance endothéliaux comme le
VEGF (Vascular endothelial growth factor) qui permet d’induire des processus de néoangiogenèse favorisant ainsi la croissance tumorale. D’autre part, le VEGF sécrété
localement par les cellules tumorales inhibe la maturation des DC affectant ainsi l’activation
locale des lymphocytes T (Gabrilovich et al. 1996).
Toutefois,
des
travaux
récents
semblent
montrer
que
l’obstacle
majeur
à
l’immunosurveillance antitumorale et à la mise en place de stratégies d’immunothérapies
anti-tumorale efficaces est due à l’immunosuppression réalisée par les Treg (Zou 2006). De
nombreux travaux ont à ce jour démontré in vivo dans des modèles murins le rôle délétère
des Treg dans l’immunité antitumorale (Zou 2006). L’élimination sélective des Treg par
l’injection d’anticorps déplétants anti-CD25, anti-FR4 (etc) favorise une diminution de la
croissance tumorale et le rejet de la tumeur (Zou 2006; Yamaguchi et al. 2007). Les Treg
infiltrent massivement les tumeurs solides et leur nombre est considérablement augmenté au
niveau des ganglions lymphatiques drainant ces sites tumoraux. L’expansion périphérique du
pool de Treg se fait indépendamment du thymus au niveau des organes lymphoïdes
secondaires et ne requiert pas de prolifération cellulaire. Il s’agirait majoritairement d’une
conversion de lymphocytes T CD4+ CD25- Foxp3- en Treg CD4+ CD25- Foxp3+ induite de
manière active par la tumeur (Valzasina et al. 2006). Toujours chez la souris, en 2007 Liu et
al. ont montré que c’était le TGF-β produit par les cellules tumorales qui induisait cette
conversion de lymphocytes T CD4+ CD25- Foxp3- effecteurs en Treg CD4+ CD25+ Foxp3+. Ils
ont de plus montré que le traitement des souris avec un anticorps bloquant anti-TGF-β
permettait d’inhiber ce processus de conversion et d’induire une immunité anti-tumorale
efficace (Liu et al. 2007). En plus de la fonction jouée par le TGF-β dans l’induction de Treg,
le groupe de Zitvogel a montré que lors d’une réponse immunitaire anti-tumorale (après
transferts adoptifs des différents types cellulaires dans une souris nude), le TGF-β produit
74
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
par les Treg et fixé à leur surface permettait d’inhiber les fonctions effectrices et cytotoxiques
des NK sur la lyse des cellules tumorales (Ghiringhelli et al. 2005).
Figure 20. Les lymphocytes T CD4+ CD25+ Foxp3+ régulateurs (Treg) constituent un rempart majeur à la
mise en place des réponses immunitaires anti-tumorales, qui pourraient permettre l’élimination des
tumeurs notamment grâce à l’action cytotoxique des cellules NK et des CTL. Au niveau du
microenvironnement tumoral, la source de TGF-β va être double. Il est produit par les Treg avec comme
conséquence : l’induction d’un effet suppresseur sur les fonctions cytolytiques des NK et des CTL. Il
peut-être également produit directement par la tumeur elle-même, aboutissant ainsi à la conversion de
+
lymphocytes TH CD4 CD25 Foxp3 en Treg. La production de VEGF par les cellules tumorales va bloquer
le processus de maturation des DC.
Parallèlement, le groupe de Von Boehmer a montré dans un modèle tumoral murin que les
Treg inhibent in vivo la cytotoxicité des CTL via la production de TGF-β (Figure 20.). En effet,
le transfert de CTL exprimant un dnTGF-βRII et donc étant insensibles à la signalisation
induite par le TGF-β résistent à la suppression réalisée par les Treg. Le rétablissement de la
cytotoxicité est associé dans ce modèle à un rejet de la tumeur (Chen et al. 2005).
Supportant ces travaux réalisés avec des modèles tumoraux murins, l’impact des Treg sur
l’immunité anti-tumorale chez des patients atteints de cancer est maintenant bien documenté
(Zou 2006; Curiel 2007). En 2001, Woo et al. ont observé pour la première fois que des
patients atteints de cancers des poumons et de cancers ovariens présentaient un nombre
75
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
supérieur de Treg par rapport à celui observé chez des patients sains (Woo et al. 2001).
Depuis, de nombreux types de cancers où la fréquence des Treg dans le sang périphérique
est supérieure à celle observée chez un donneur sain ont été référencés : cancer du sein,
cancer colorectal, cancer oesophagien, mélanomes, cancer pancréatique, leucémies (etc).
Cette liste continue de s’agrandir au fil des différentes investigations cliniques qui semblent
toutes indiquer que ces Treg possédant des propriétés suppressives in vitro sont un obstacle
majeur à une réponse immunitaire antitumorale efficace chez ces patients (Zou 2006).
Arriver à mieux comprendre les mécanismes d’actions employés par les Treg dans
l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales apparaît donc comme un enjeu crucial
dans la mise en place de stratégies thérapeutiques anticancéreuses (Curiel 2007). L’IL-2 est
une cytokine assurant la prolifération des lymphocytes T, elle est utilisée en thérapeutique
humaine notamment chez des patients atteints de tumeurs rénales ou de mélanomes afin de
favoriser les réponses immunitaires anti-tumorales. La dose d’IL-2 administrée est un
paramètre très important à prendre en compte. A hautes doses, l’IL-2 va favoriser
l’expansion des Treg chez ces patients et de ce fait la progression de la tumeur
(Ahmadzadeh and Rosenberg 2006). L’expression constitutive et forte de CD25 (chaîne α du
récepteur à l’IL-2) à la surface des Treg par rapport aux lymphocytes T conventionnels va
leur donner un avantage prolifératif.
L’établissement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber de manière sélective les Treg
spécifiques d’antigènes tumoraux permettrait donc d’induire une réponse immunitaire contre
les tumeurs efficace sans pour autant risquer le développement de pathologies autoimmunes dues à une rupture de tolérance (Curiel 2007).
IV. Potentiel Clinique
L’incroyable potentiel des Treg naturels à contrôler finement la mise en place et le
déroulement de la réponse immunitaire a conduit de nombreux groupes à établir des
modèles expérimentaux de thérapie cellulaire. L’objectif de ce chapitre sera de donner
quelques exemples non exhaustifs du potentiel que pourraient avoir ces cellules en clinique
humaine.
Transplantation d’organes et de tissus :
Afin de traiter l’état lésionnel irréversible d’un organe, la transplantation est à ce jour la
solution thérapeutique la mieux adaptée. Cependant l’alloréponse déclenchée par le
système immunitaire du receveur vis-à-vis du greffon est un obstacle majeur au succès de
cette thérapie. De nombreuses molécules ciblant les populations cellulaires responsables de
76
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
ce rejet ont donc été développées pour favoriser l’acceptation de l’organe ou du tissu greffé.
Le principal défaut des drogues immunosuppressives ou bien des anticorps monoclonaux
disponibles en clinique humaine (alemtuzumab (anti-CD52), OKT3 (anti-CD3ε), etc) réside
dans la difficulté d’un ciblage spécifique des populations lymphocytaires alloréactives et
l’induction d’effets iatrogènes néfastes sur l’immunité des patients transplantés. L’effort de
recherche a permis de mettre au point de nouvelles molécules plus adaptées aux différents
types de greffes (contrôle du rejet chronique, etc) améliorant ainsi la qualité de vie des
patients. Malgré cela de nombreuses barrières existent encore pour permettre d’induire pour
un organe greffé un état de tolérance à long terme sans altérer la fonction immunitaire du
receveur et plus généralement l’homéostasie de l’organisme. Ayant cet objectif, de
nombreuses équipes de recherches ont travaillé sur des thérapies alternatives visant à
manipuler le système immunitaire du receveur : les thérapies géniques ainsi que les
thérapies cellulaires.
Les thérapies géniques se basant sur le potentiel immunorégulateur des Treg consisteraient
à réaliser ex vivo des transferts de gènes codant pour des protéines qui permettraient de
conférer une activité régulatrice à des cellules T effectrices. De bons candidats seraient par
exemple les gènes codant des cytokines immunosuppressives comme l’IL-10 et le TGF-β.
Une autre stratégie intéressante serait de forcer l’expression ectopique de Foxp3 dans des
cellules T pathogéniques du receveur, spécifiques pour les alloantigènes du donneur. Cela
permettrait la génération stable de cellules T antigène-spécifique autologues possédant une
activité suppressive (Roncarolo and Battaglia 2007).
Les thérapies visant à manipuler les cellules du système immunitaire pour induire un état de
tolérance ainsi que les thérapies cellulaires consistant à manipuler et/ou amplifier certaines
sous-populations immunitaires ex vivo telles que les DC ou des populations lymphocytaires
T régulatrices (les Treg naturels, les lymphocytes TR1 ou bien des populations de
lymphocytes T CD8+ CD45RClow régulateurs) sont très prometteuses en clinique humaine.
De nombreuses stratégies thérapeutiques réalisées dans des modèles animaux et ayant
pour but de faire émerger le compartiment lymphocytaire régulateur ont été développées.
Une approche intéressante et solide est celle proposée par le groupe de Waldmann qui a
montré que l’injection d’anticorps non déplétants (seul ou en combinaison) et dirigés contre
des molécules de surface des lymphocytes T (CD4, CD8, CD40L) permet d’induire un état
de tolérance vis-à-vis de greffes d’organes ou de tissus allogéniques (Qin et al. 1990;
Waldmann and Cobbold 1998).
Guillonneau et al. ont très récemment apporté la démonstration dans un modèle d’allogreffe
cardiaque chez le rat, que le blocage de la voie de costimulation CD40-CD40L permet de
faire émerger une population de lymphocytes T CD8+ CD45RClow régulateurs allospécifiques
capables d’assurer un état de tolérance à long terme vis-à-vis du transplant. Cette population
77
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
cellulaire va via la production d’IFN-γ induire l’expression d’IDO dans les cellules
endothéliales du cœur greffé, permettant d’installer localement un environnement tolérogène
favorisant l’acceptation de l’allogreffe (Guillonneau et al. 2007).
En clinique humaine, il existe une corrélation entre l’acceptation d’une allogreffe et la
fréquence des lymphocytes T CD4+ Foxp3+ chez des patients greffés, comme dans le cas
des allogreffes médullaires où le nombre de cellules T régulatrices du donneur est de bon
pronostic par rapport au développement de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD, Graft
versus host disease) (Rezvani et al. 2006). Partant de ces observations, il serait très
intéressant d’essayer de transférer en clinique les modèles animaux de thérapie cellulaire
développés pour la transplantation d’organe ou de tissus, la plupart basés sur le transfert
adoptif de Treg isolés à partir d’animaux histocompatibles avec le receveur (Kang et al.
2007).Il a été en effet maintenant bien documenté dans des modèles murins que l’utilisation
de Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ fraîchement isolés, amplifiés in vitro de manière polyclonale ou
bien pré-activés in vitro avec les alloantigènes du donneur permettent la tolérance à long
terme d’une allogreffe médullaire en évitant l’apparition de GVHD (Cohen et al. 2002; Joffre
et al. 2004; Hanash and Levy 2005). Il est de plus envisageable d’utiliser des thérapies
combinant l’administration de rapamycine avec un transfert adoptif de Treg autologues
amplifiés ex vivo. La rapamycine est une drogue immunosuppressive ciblant mTOR
(mammalian target of rapamycin) et bloquant l’expansion des cellules T effectrices sans
altérer l’expansion ni la fonction suppressive des Treg. Cela a été démontré in vivo chez la
souris (Battaglia et al. 2005), in vitro chez l’homme (Battaglia et al. 2006) mais aussi chez
des patients ayant reçu une allogreffe rénale (Segundo et al. 2006).
Pathologies auto-immunes et immuno-inflammatoires :
De nombreuses études précliniques réalisées dans des modèles animaux ont montré que le
transfert adoptif de Treg est capable de prévenir le développement de pathologies autoimmunes ou immuno-inflammatoires telles que : le diabète de type 1, l’EAE, l’arthrite
rhumatoïde, etc (Roncarolo and Battaglia 2007). Les travaux montrant que le transfert
adoptif de Treg peut corriger une pathologie auto-immune active et déjà établie sont plus
rares (Mottet et al. 2003; Tang et al. 2004; Tarbell et al. 2007). Le groupe de Powrie a
montré en 2003 que l’injection de Treg polyclonaux dans le traitement d’une pathologie
inflammatoire intestinale déjà établie (modèle murin de l’IBD) permettait d’éliminer les
infiltrats lymphocytaires pathogéniques au niveau de la lamina propria intestinale et de
rétablir une architecture intestinale physiologique (Mottet et al. 2003). Après expansion ex
vivo de Treg stimulés par des DC autologues présentant des antigènes des îlots
pancréatiques, Tarbell et al. ont montré que l’injection de ces Treg antigène-spécifique
permettait de corriger un diabète auto-immun déjà établi dans une souris NOD (Non-obese
78
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
diabetic) de treize semaines. Les souris traitées avec succès possèdent toujours des cellules
T diabétogéniques mais elles présentent parallèlement un nombre accru de cellules Foxp3+
au niveau des ganglions lymphatiques drainant le pancréas (Tarbell et al. 2007).
Un travail très récent du groupe de Kuchroo a montré que le traitement de pathologies autoimmunes à l’aide de Treg générés ex vivo devait être associé à un contrôle de l’inflammation
tissulaire locale. En effet, en utilisant un modèle murin d’EAE ils ont montré qu’au pic de la
pathologie, les Treg spécifiques du peptide MOG35-55 étaient capables d’inhiber des
lymphocytes T effecteurs de même spécificité isolés à partir de la rate mais incapables
d’inhiber ces mêmes effecteurs lymphocytaires isolés à partir du système nerveux central.
L’importante production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF) par ces lymphocytes T
effecteurs recrutés au niveau du système nerveux central des animaux malades inhibe
l’activité suppressive des Treg (Korn et al. 2007).
L’ensemble de ces éléments semble indiquer que le traitement de pathologies auto-immunes
chez l’homme par la mise en place de thérapies cellulaires utilisant des Treg pourrait être
possible. L’utilisation de Treg polyclonaux semblant fonctionner dans des animaux
lymphopéniques où l’expansion de ces cellules est possible et où un pool suffisant de Treg
ayant une spécificité pour les auto-antigènes d’intérêt sera constitué. Cependant dans un
hôte immunocompétent, les travaux actuels semblent indiquer la nécessité d’injecter des
Treg ayant une spécificité antigénique pour les auto-antigènes d’intérêt. Cela rend donc plus
complexe la mise en place de protocoles cliniques de thérapie cellulaire chez des patients
atteints de pathologies auto-immunes ou immuno-inflammatoires.
Une aide à la thérapie génique :
Certaines pathologies génétiques orphelines présentent au niveau du tableau clinique des
manifestations auto-immunes impliquant un défaut fonctionnel des Treg. C’est le cas du
syndrome IPEX, du syndrome de Wiskott-Aldrich et de l’APS type 2 (Autoimmune
polyglandular syndrom type 2) (Roncarolo and Battaglia 2007). Récemment Marangoni et al.
ont montré que la protéine WAS (WASP, Wiskott-Aldrich syndrom protein) est très
importante dans l’expansion et la fonction suppressive des Treg. En effet, un défaut de
WASP aussi bien chez des souris WAS-/-, que chez des patients WAS entraîne une
altération de la capacité des Treg à inhiber la prolifération de lymphocytes T effecteurs in
vitro ainsi qu’à produire du TGF-β après engagement du TCR (Marangoni et al. 2007). Les
patients atteints du syndrome auto-immun lymphoprolifératif (ALPS,
Autoimmune
lymphoproliferative syndrom) présentent une augmentation du nombre de lymphocytes T
périphériques mais paradoxalement un nombre réduit de Treg, élément pouvant peut-être
expliquer cette dérégulation de l’homéostasie du compartiment T (Bleesing et al. 2001).
L’ensemble de ces données suggère qu’en accompagnement de thérapies géniques
79
Introduction : Biologie et Potentiel Thérapeutique des Lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
correctives, l’injection de Treg pourrait être bénéfique dans la prise en charge thérapeutique
de ces patients afin d’atténuer l’auto-immunité générée dans ces syndromes. Une autre
utilisation potentielle des Treg dans l’accompagnement des thérapies géniques correctives
pour le traitement des myopathies a été proposée en 2003 par le groupe de Davoust. Dans
un modèle murin de transfert de gènes dans des cellules musculaires, ils ont montré de
manière élégante que la néo-expression d’une protéine HA (influenza hemagglutinin)
absente de l’organisme de ces souris conduisait à l’établissement d’une forte réponse
immunitaire aboutissant au rejet des fibres musculaires transduites. En co-injectant à la
souris des Treg exprimant un TCR transgénique spécifique pour la protéine HA avec les
cellules musculaires exprimant le transgène, ils ont pu permettre l’installation durable des
cellules musculaires transduites au sein du tissu musculaire de l’animal (Gross et al. 2003).
Malgré tous ces modèles prometteurs, il reste encore des barrières à franchir avant de
pouvoir mettre au point des protocoles thérapeutiques en clinique humaine, notamment sur
l’isolement et l’expansion des Treg du receveur. En effet, un des gros risques est d’isoler et
d’amplifier des lymphocytes T CD4+ effecteurs contaminants dans la population triée. La
découverte récente du marqueur de surface CD127 permettant de bien séparer les
populations effectrices (CD127high) et régulatrices (CD127low) va permettre d’améliorer la
spécificité des procédures de tri cellulaire. De plus, la culture des fractions triées avec de la
rapamycine pourra assurer l’obtention post-culture d’une population cellulaire encore plus
pure. L’expansion in vitro des Treg humains a été durant longtemps un facteur limitant aussi
bien dans leur étude fondamentale (due à la faible fréquence de Treg dans le sang
périphérique humain) que dans le design de protocoles cliniques. Depuis 2004, cet aspect là
a été en partie résolu grâce au travail de Godfrey et al. qui ont réussi à amplifier de manière
très importante des populations de Treg qui maintiennent leur potentiel suppresseur à long
terme (Godfrey et al. 2004). Toutefois, la possibilité d’amplifier ex vivo des Treg humains
antigène-spécifique (ayant une spécificité autre que pour des alloantigènes) reste encore à
être précisée. Les essais cliniques de thérapie cellulaire les plus imminents (allogreffe
médullaire) utiliseront des Treg amplifiés de manière polyclonale (Roncarolo and Battaglia
2007).
80
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
Synapse immunologique et dynamique des interactions
lymphocytaires
Le développement et le maintien d’une réponse immunitaire adaptative sont des processus
physiopathologiques complexes qui impliquent un trafic intense et finement régulé des
cellules immunitaires dans l’organisme, au travers des différents tissus lymphoïdes jusqu’au
site de l’infection et/ou de l’inflammation. Durant toutes ces étapes de migration, les
différents types de cellules immunitaires doivent interagir et communiquer ensemble afin
d’induire l’activation et l’expansion clonale des populations lymphocytaires spécifiques pour
les antigènes d’intérêt, la mise en place des fonctions lymphocytaires effectrices, la
production de médiateurs solubles, etc. Pour mieux comprendre comment les réponses
immunitaires sont à la fois induites et régulées, il apparaît donc capital de se concentrer sur
la description, mais également sur la compréhension mécanistique de la finalité de ces
contacts intercellulaires.
Du fait de son rôle clé dans le déroulement et l’articulation de la réponse immunitaire
adaptative, l’interaction la plus étudiée et la mieux définie à ce jour est l’interaction entre un
lymphocyte Tαβ et une CPA. Le but de cette interaction est l’activation du lymphocyte T qui
va reconnaître via son TCR, les complexes CMH/peptides spécifiques à la surface de la CPA
(cf. chapitre « Activation des lymphocytes T »). La zone de contact entre ces deux types
cellulaires est appelée : synapse immunologique (SI). Le terme « synapse » a d’abord été
utilisé en biologie pour décrire la jonction entre deux neurones ou, entre un neurone et un
autre type cellulaire. La synapse a pour but l’échange privilégié d’informations entre deux
cellules. L’idée que le contact productif entre un lymphocyte T et une CPA (activation du
lymphocyte T) puisse se dérouler suivant ce concept a été proposée en 1984 par Norcross
(Norcross 1984). En effet, le système immunitaire tout comme le système nerveux est une
structure devant être capable d’échanger des informations complexes et devant faire preuve
d’une incroyable plasticité afin de s’adapter aux différentes stimulations rencontrées. De
plus, afin d’augmenter leur efficacité, ces deux systèmes biologiques sont capables
« d’apprendre » des stimuli reçus en les intégrant sous forme de mémoire.
En 1987, Kupfer et al. ont montré, en utilisant des approches d’immunofluorescences et
après l’avoir précédemment démontré avec des cellules NK et des CTL, que les lymphocytes
TH polarisent leur appareil de Golgi et leur MTOC (Microtubule organisation center) vers la
zone de contact avec la CPA présentant l’antigène spécifique (Kupfer et al. 1987; Kupfer and
Singer 1989).
Mais il faudra attendre une dizaine d’années et le développement de nouvelles techniques
d’imagerie pour pouvoir visualiser de façon précise ce domaine spécialisé de contact qu’est
81
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
la synapse immunologique. L’observation morphologique de l’aire de contact entre un
lymphocyte T et une CPA lors du processus de reconnaissance antigénique a permis de
constater que des réarrangements moléculaires sont effectués grâce au recrutement de
nombreuses molécules de surfaces et de signalisation (Monks et al. 1998). L’interaction
productive de ces molécules va contrôler l’activation et l’induction des fonctions effectrices
de la cellule T (Grakoui et al. 1999).
A l’heure actuelle, grâce aux nombreux travaux réalisés sur l’étude de la SI, le concept
décrivant la SI comme une structure figée est dépassé. C’est au contraire une structure
dynamique permettant par exemple à un lymphocyte TH d’interagir simultanément avec
plusieurs CPA pour sélectionner la CPA offrant le meilleur stimulus antigénique afin
d’assurer une amplification sélective de la réponse immunitaire (Depoil et al. 2005). De plus,
un lymphocyte TH peut successivement former, détruire puis reformer plusieurs SI afin de
collecter et d’accumuler des signaux jusqu’à atteindre un état d’activation suffisant à la mise
en place de ses fonctions effectrices (Faroudi et al. 2003). Cela a été d’ailleurs récemment
confirmé in vivo chez la souris par une élégante approche de microscopie bi-photonique où
au niveau des ganglions lymphatiques, une même cellule T va pouvoir engager de manière
antigène spécifique successivement plusieurs DC différentes. Au fur et à mesure des
interactions, le lymphocyte T va collecter et intégrer les signaux reçus afin de s’activer
pleinement et de mettre en place son programme de différenciation (expression de CD25,
production d’IFN-γ) (Celli et al. 2005).
Il serait donc plus juste aujourd’hui de parler de « synapses immunologiques » que de
« synapse immunologique » du fait de leur diversité structurale et fonctionnelle (Trautmann
and Valitutti 2003).
I. Architecture de la synapse immunologique
La synapse immunologique concentrique :
La formation de la SI mature est un évènement qui est réalisé dans les trente minutes
suivant l’engagement productif du TCR avec le complexe CMH/peptide spécifique. C’est le
groupe de Kupfer qui a démontré en 1998 que lors de la formation de la SI, il y avait une
ségrégation ainsi qu’une réorganisation spatiale des molécules au niveau de l’aire de contact
entre un lymphocyte T CD4+ et une CPA (lymphocyte B dans cette étude). Ces
réarrangements structuraux aboutissent donc à la formation de zones distinctes au niveau
de la synapse, les SMAC (supra molecular activation cluster). Ils ont ainsi montré que les
TCR se regroupent au centre de la synapse immunologique dans une zone appelée cSMAC
(central SMAC) tandis que la protéine accessoire LFA-1 se localise autour du cSMAC dans
une zone appelée pSMAC (peripheral SMAC) (Monks et al. 1998).
82
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
Depuis, d’autres travaux ont confirmé et étendu ce travail en décrivant plus précisément les
trois zones structurant la synapse immunologique dite concentrique : le cSMAC, le pSMAC
et le dSMAC (distal SMAC) (Figure 21.).
Le cSMAC est le cœur de la synapse, il regroupe les effecteurs principaux de la transduction
du signal impliqués dans l’activation du lymphocyte T : le TCR, les corécepteurs CD4 et
CD8, la molécule de costimulation CD28, la molécule CD2, la PKCθ, Lck, Fyn, etc. (Huppa
and Davis 2003).
Le pSMAC est la zone qui entoure directement le cSMAC, elle est enrichie en molécules
d’adhérence comme LFA-1 et en taline (protéine de liaison à l’actine) (Monks et al. 1998;
Grakoui et al. 1999).
La troisième et la plus externe des zones composant la synapse immunologique est appelée
le dSMAC. Elle regroupe des grosses protéines qui vont être exclues du centre de l’aire de
contact à cause de leur grande taille. C’est le cas des protéines CD43, CD45 et CD148
(Leupin et al. 2000; Delon et al. 2001).
Figure 21. La synapse immunologique dite concentrique est organisée spatialement en trois zones. La
zone centrale, le cSMAC contient les TCR, les molécules de costimulation (…). Cette zone va permettre
l’initiation de la signalisation intracellulaire en aval du TCR. Le pSMAC contient la protéine d’adhérence
LFA-1 et la taline qui permettent l’ancrage au cytosquelette d’actine. Le dSMAC zone la plus externe de la
synapse regroupe de grandes molécules telles que les phosphatases CD45 et CD148.
83
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
L’organisation structurée de ces SMAC favorise l’engagement simultané de nombreuses
molécules de surface qui autorisent la mise en place de différentes voies de signalisation
contrôlant ainsi l’activation et la mise en place des fonctions effectrices des lymphocytes T
(Anton van der Merwe et al. 2000). Le centre névralgique de la signalisation intracellulaire va
se situer au niveau du cSMAC en aval des TCR où des molécules comme Lck, ZAP-70 et
PKC-θ colocalisent avec une aire importante de phosphorylation sur tyrosine (Monks et al.
1998; Muller et al. 1999; Lee et al. 2002). Parallèlement à ce recrutement massif de
protéines de signalisation il y a une restructuration du cytosquelette d’actine et polarisation
de la machinerie sécrétoire (appareil de Golgi et MTOC) du lymphocyte T vers la CPA
(Kupfer et al. 1987; Kupfer and Singer 1989; Billadeau et al. 2007).
Burack et al. ont montré que les microdomaines lipidiques s’accumulent rapidement à la
synapse immunologique au niveau du cSMAC lors du processus de reconnaissance
antigénique et que de plus cette accumulation se faisait indépendamment de la costimulation
induite par la molécule CD28 (Burack et al. 2002).
Le terme de synapse mature a donc été longtemps associé à la SI concentrique, pourtant de
récents et nombreux travaux semblent plutôt démontrer que ce concept est inexact. Lors de
la reconnaissance antigénique, la structure qui va précéder la synapse mature est également
une synapse où des informations importantes vont être échangées. Il a en effet été bien
documenté que l’initiation de la signalisation va précéder la formation de la synapse
immunologique mature (Lee et al. 2002).
De plus la SI concentrique est formée lors d’une stimulation antigénique optimale des
cellules T, une concentration en antigène plus faible ou la stimulation par des peptides
altérés conduit à une ségrégation et réorganisation moléculaire incomplètes. C’est pourquoi
il n’existe pas une seule et unique forme de SI, mais une diversité de SI à l’image de la
diversité des interactions lymphocytaires (Trautmann and Valitutti 2003; Brossard et al. 2005;
Friedl et al. 2005).
Diversité des synapses immunologiques :
D’après Friedl et al., il serait possible de décrire cinq types de SI : la synapse monocentrique
ou stable (décrite plus haut), la synapse sécrétrice, la synapse multicentrique, la synapse
non ségrégée ainsi que la synapse dynamique (Friedl et al. 2005) (Figure 22.).
•
La synapse immunologique sécrétrice :
Elle pourrait être décrite comme une variante de la SI mature complètement réorganisée
remplissant des fonctions lymphocytaires effectrices telles que la sécrétion de cytokines.
84
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
Elle est formée par les CTL, les TH et les cellules NK au niveau de l’aire de contact avec la
cellule cible (Friedl et al. 2005). Les lymphocytes T CD4+ activés (TH) ainsi que les CTL
(Stinchcombe et al. 2001) possèdent des granules cytoplasmiques qui contiennent des
médiateurs solubles pour la sécrétion et/ou des récepteurs transmembranaires qui sont
adressés à la membrane. Les CTL sont capables d’engager une cellule cible en présence
d’une faible densité de complexes CMH/peptide à la surface de cette cellule. Lors de cet
engagement, le CTL polarise sa machinerie sécrétoire vers la cellule cible afin de délivrer
ses granules lytiques (Faroudi et al. 2003). Il a été précisément analysé que 3 à 10
complexes CMH/peptide spécifique suffisent à un CTL pour induire l’apoptose de la cellule
cible (Purbhoo et al. 2004). Récemment le groupe de Valitutti a montré que les CTL en
présence de plusieurs cellules cibles, établissent des synapses avec la cible offrant la
meilleure stimulation antigénique. Cette synapse activatrice va se poursuivre même après la
mort de la cellule cible. Durant cette activation, le CTL peut polariser ses granules lytiques
vers différentes cellules cibles sans tenir compte de leurs potentiel antigénique permettant
ainsi un efficacité lytique maximale (Wiedemann et al. 2006). L’assemblage de la synapse
sécrétrice est proche de celui la SI concentrique, dans le cSMAC à côté de la partie
enrichies en TCR il va y avoir formation d’un domaine sécrétoire colocalisant avec la
machinerie sécrétoire du lymphocyte T. Les lymphocytes TH vont présenter des vésicules
polarisées vers la CPA, contenant des cytokines comme l’IL-2, l’IL-4, l’IL-5 et l’IFN-γ (Kupfer
et al. 1991; Reichert et al. 2001; Depoil et al. 2005).
•
La synapse immunologique multicentrique :
Au cours du processus de reconnaissance antigénique il peut y avoir une interruption dans la
mécanistique moléculaire nécessaire à la formation de la SI mature ou concentrique. Cette
interruption conduit à la formation d’une SI « immature ». De plus, en 2005, Brossard et al.
ont montré que la SI formée entre un lymphocyte TH et une cellule dendritique mature offrant
des complexes CMH/peptides spécifiques n’est pas concentrique mais multicentrique. En
effet, au niveau de l’aire de contact, plusieurs agrégats de complexes TCR/CD3 se forment
et colocalisent avec des enrichissements de la molécule accessoire LFA-1. Ces agrégats
sont dynamiques, ils peuvent soit fusionner soit se fractionner au cours de l’interaction,
données indiquant que la formation de la SI mature concentrique n’est pas la seule issue
possible même dans le cadre d’un contact cellulaire prolongé dans de bonnes conditions de
stimulation antigénique (Brossard et al. 2005). Il a été également montré que les thymocytes
forment préférentiellement des structures synaptiques multifocales durant les processus de
sélection intra-thymique (Richie et al. 2002).
85
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
•
La synapse immunologique non ségrégée :
Si le processus de ségrégation est arrêté avant que les molécules du TCR soient, même
partiellement agrégées, et avant que les protéines de la signalisation soient enrichies à
l’interface cellule T/CPA, le TCR et les molécules de signalisation restent distribués de
manière diffuse à l’aire de contact. Cette situation est retrouvée dans au moins quatre types
de synapses immunologiques. En effet, ce phénomène est observable quand un lymphocyte
T interagit avec une CPA ne présentant pas d’antigène spécifique, situation physiologique au
niveau des ganglions lymphatiques (Revy et al. 2001). De plus pour les lymphocytes T CD8+
naïfs, il a été documenté qu’ils pouvaient être activés et qu’ils pouvaient proliférer après
génération d’une synapse non ségrégée (O'Keefe et al. 2004).
Enfin, une SI transitoire induisant un signal fort via le TCR peut-être formée durant quelques
minutes sans avoir le temps de réaliser un processus de réorganisation moléculaire complet
(absence de cSMAC et de pSMAC) (Lee et al. 2002).
Figure 22. Diversité des Synapses Immunologique. (a) la SI mature ou concentrique. (b) la synapse
sécrétoire (CTL ou TH). (c) la synapse multicentrique. (d) la synapse non ségrégée. (e) la synapse
dynamique.
86
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
•
La synapse immunologique dynamique :
L’interaction entre un lymphocyte T et une CPA est une interaction très dynamique, le
lymphocyte T se déplace sur la CPA afin de mettre en place une signalisation productive.
D’abord observé in vitro, cela a été confirmé in vivo par des approches de microscopie biphotonique intra-vitale (Bousso and Robey 2004). En effet, l’étude des cellules T dans leur
environnement a permis de montrer que les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ « scannent » la
CPA pour les complexes CMH/peptide spécifique (Mempel et al. 2004).
En 2005, M. Dustin a documenté la capacité des lymphocytes à migrer durant l’intégration du
signal avec le concept d’Hemi-synapse (HS) asymétrique. Cette structure pourrait avoir un
rôle dans la tolérance et l’activation des lymphocytes T (Dustin 2005).
II. Dynamique à la synapse et polarisation des lymphocytes T
Dynamique de l’interaction lymphocyte T/CPA
L’interaction entre une cellule T et une CPA présentant des complexes CMH/peptide
spécifique à sa surface va pouvoir être décomposée en cinq phases (Figure 23.).
La première phase correspond à l’initiation du contact, le lymphocyte T « scanne » la
surface de la CPA à la recherche de l’antigène. La reconnaissance de l’antigène induit un
arrêt de la cellule T, c’est le « stop signal » (Donnadieu et al. 1994).
La seconde phase concrétise cette interaction avec la formation de la SI et la mise en place
de la signalisation intracellulaire. Une SI immature se forme tout d’abord avec un
enrichissement central de la molécule LFA-1 entourée par un anneau de TCR (Grakoui et al.
1999).
La troisième phase se déroule dans les cinq à trente minutes suite au contact initial. Les
processus de réorganisation moléculaire et de ségrégation se poursuivent pour, dans des
conditions de stimulation antigénique maximales, atteindre le stade de SI mature. Cela
implique donc la ségrégation sous forme de cSMAC, pSMAC et dSMAC, avec le recrutement
des molécules essentielles à la signalisation au niveau du cSMAC. Durant cette phase, le
lymphocyte T polarise sa machinerie sécrétoire (MTOC et appareil de Golgi) vers la CPA
(Kupfer and Singer 1989).
La quatrième phase est caractérisée par l’internalisation des TCR au niveau du cSMAC au
sein de vésicules intra-cytoplasmiques. Cette phase permet d’initier une modulation négative
du signal. Cela souligne donc le rôle biologique crucial que la SI joue dans le contrôle de
l’activation T (Lee et al. 2003).
Enfin la cinquième phase correspond à une dissolution de la SI et à un détachement de la
cellule T. Il est toutefois difficile de déterminer si la résolution de la SI est la conséquence ou
87
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
la cause de la rupture de l’interaction lymphocyte T/CPA. Il est intéressant de noter que dans
cette phase tardive de l’interaction de nombreux évènements contribuent à cette
déstructuration de la SI : internalisation des TCR, diminution du niveau d’expression de LFA1, augmentation du niveau d’expression de CTLA-4, redistribution des phosphatases, etc.
Figure 23. L’interaction entre un lymphocyte T et une CPA (DC mature, lymphocyte B activé, etc) est un
processus hautement dynamique. Dès lors que le lymphocyte T initie le contact, il « scanne » la surface
de la CPA à la recherche des complexes CMH/peptides spécifiques. Si la CPA présente l’antigène
d’intérêt, alors le lymphocyte T s’arrête et forme un contact stable avec la CPA aboutissant à la formation
d’une SI. Cette SI sera mature dans des conditions optimales de stimulation. Cette interaction contrôle
finement l’activation du lymphocyte T qui, une fois pleinement activé pourra se détacher et étant plus
sensible à des stimuli chimiotactiques, migrer par exemple sur le site de l’infection et/ou de
l’inflammation afin de développer ses fonctions effectrices.
Plusieurs facteurs influencent la qualité et la durabilité de l’interaction lymphocyte T/CPA.
Un des premiers facteurs va être le type de CPA, DC, monocytes/macrophages ou
lymphocytes B. La maturation des DC favorise le processus de présentation antigénique
avec une augmentation du niveau d’expression des molécules de CMH et des molécules de
costimulation. De la même façon, un lymphocyte B activé aura un niveau d’expression des
molécules de CMH à la membrane augmenté. Ainsi des DC matures pourront activer
pleinement des lymphocytes T naïfs alors que des DC immatures interagissant avec ces
88
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
mêmes cellules T ne permettront pas la formation d’une SI mature. Benvenuti et al. ont
montré que le statut de maturation d’un DC va déterminer pour la DC l’adhésion, la formation
de la SI et la durée de l’interaction réalisée avec une cellule T naïve (Benvenuti et al. 2004).
L’état d’activation des lymphocytes T va également conditionner l’interaction lymphocyte
T/CPA. Au niveau d’un ganglion lymphatique, les cellules T CD4+ ou T CD8+ naïves vont
réaliser en premier lieu des interactions de courtes durées avec les DC (Hugues et al. 2004;
Mempel et al. 2004). Un état d’activation partiel de la cellule T favorise des contacts plus
stables et plus longs alors que des lymphocytes T complètement activés vont multiplier les
contacts avec les CPA d’une façon plus dynamique et plus courte (Mempel et al. 2004; Miller
et al. 2004).
Un autre élément déterminant est la quantité mais également la qualité de l’antigène. La
durée de l’interaction entre un lymphocyte T et une DC augmente proportionnellement à la
dose croissante d’antigène présente au niveau du ganglion lymphatique (Bousso and Robey
2003). In vitro il a précédemment été montré que l’intensité et la durée de la signalisation
sont corrélables avec la concentration en complexes CMH/peptides agonistes (Wulfing et al.
1997). De plus, Grakoui et al. ont montré qu’un peptide antagoniste est incapable d’induire la
formation d’une SI (Grakoui et al. 1999).
Enfin le paramètre extrinsèque à l’interaction lymphocyte T/CPA mais qui va cependant
moduler la dynamique de ce contact est le milieu environnant. En effet, les cellules
immunitaires sont bien plus mobiles dans des environnements en trois dimensions avec un
support matriciel tels que des ganglions lymphatiques in vivo ou bien ex vivo sur des fibres
de collagène qu’elles ne le sont dans des environnement à deux dimensions tel que les
cultures cellulaires classiques in vitro (Bousso and Robey 2004; Miller et al. 2004).
Polarisation des Lymphocytes T
Un rôle biologique important attribué à la SI au cours de la réponse immunitaire adaptative
est la capacité des lymphocytes T à rapidement repositionner leur machinerie sécrétoire
(appareil de Golgi et MTOC) à la SI (Kupfer and Singer 1989; Huse et al. 2007). Ce
processus de polarisation de la machinerie sécrétoire est hautement dynamique, en effet des
CTL peuvent polariser simultanément leurs granules lytiques vers plusieurs cibles en
dissociant spatialement d’une part synapse(s) lytique(s) et d’autre part synapse activatrice
qui est réalisée sur la cellule cible offrant la meilleure stimulation antigénique (Wiedemann et
al. 2006).
Pour les lymphocytes TH la polarisation de la machinerie sécrétoire assure une sécrétion
polarisée de certaines cytokines à la SI (Kupfer et al. 1991; Reichert et al. 2001; Depoil et al.
2005; Huse et al. 2006). La sécrétion polarisée de cytokines à la SI permet d’activer
spécifiquement la CPA présentant l’antigène d’intérêt, ce qui a été illustré en 2005 par
89
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
Okada et al. en visualisant morphologiquement des interactions lymphocytes TH/lymphocytes
B (Okada et al. 2005). Il a de plus été documenté par Depoil et al. qu’un lymphocyte TH en
présence de deux CPA offrant pour l’une, une forte concentration en antigène et pour l’autre,
une faible concentration en antigène est capable de se repolariser vers la CPA offrant le
meilleur stimulus antigénique (Depoil et al. 2005). Un lymphocyte TH formant une SI avec la
CPA offrant une faible concentration en antigène peut donc repolariser sa machinerie
sécrétoire ainsi que remodeler sa SI avec la plateforme de signalisation associée vers la
CPA offrant la forte concentration en antigène.
La prise en compte de ces différentes observations suggère que lors d’une réponse
immunitaire adaptative, un lymphocyte TH peut délivrer son aide de manière spécifique, en
repolarisant sa machinerie sécrétoire vers la CPA offrant le meilleur stimulus antigénique
assurant ainsi une amplification sélective de la réponse immunitaire.
Le groupe de Mark M. Davis a documenté plus en détail ce phénomène de sécrétion
cytokinique polarisée en utilisant différentes techniques incluant de l’imagerie sur cellules
vivantes, sur cellules fixées ainsi que des tests fonctionnels de sécrétion sur un support
solide. Ils ont montré que certaines cytokines comme l’IL-2 et l’IFN-γ sont sécrétées de
manière directionnelle au travers de la SI sécrétrice alors que d’autres médiateurs solubles
comme
le
TNF
et
la
chimiokine
CCL3
(MIP-1α)
sont
relargués
de
manière
multidirectionnelle. Ces données suggèrent donc que certaines cytokines doivent être
sécrétées vers la CPA afin d’assurer une communication intercellulaire privilégiée et
spécifique alors que d’autres cytokines sont relarguées de façon multidirectionnelle afin de
promouvoir un état inflammatoire ou bien d’induire un gradient de chimiokines au niveau par
exemple d’un tissu infecté (Huse et al. 2006).
Molon et al. ont montré que lors de la formation d’un conjugué entre un lymphocyte T et une
CPA présentant l’antigène, il y a recrutement des récepteurs aux chimiokines de la cellule T
au niveau de la SI. La séquestration de ces récepteurs induit une insensibilité des
lymphocytes T à un gradient chimiotactique exogène, favorisant ainsi une interaction stable
et productive (augmentation de la réponse proliférative et de la production cytokinique). Ce
travail souligne donc l’importance capitale de la polarisation des lymphocytes T dans
l’orchestration de la communication intercellulaire via des médiateurs solubles au cours du
développement et du maintient de la réponse immunitaire (Molon et al. 2005).
Utilisant des patients ayant une déficience génétique pour les récepteurs à l’IFN-γ (IFN-γR1,
IFN-γR2)
conduisant
notamment
à
une
succeptibilité
accrue
aux
infections
mycobactériennes, le groupe de Claire Hivroz a souligné la nécessité de cette
communication privilégiée entre un lymphocyte T et une CPA au cours d’une réponse
immunitaire anti-infectieuse. Des tests fonctionnels in vitro utilisant les lymphocytes T CD4+
90
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
et les DC de ces patients montrent en effet une altération dans cette communication
intercellulaire qui est sûrement un des facteurs favorisant la sensibilité accrue de ces
patients aux infections mycobactériennes. Ils ont observé que l’expression du récepteur à
l’IFN-γ aussi bien sur les cellules T que sur les DC était nécessaire à la sécrétion d’IL-12 par
les DC. Confirmant dans ce travail la polarisation de l’IFN-γ à la SI entre le lymphocyte T et la
CPA, ils apportent des éléments fonctionnels sur la nécessité de la sécrétion polarisée de
l’IFN-γ afin de pouvoir activer spécifiquement la CPA présentant l’antigène d’intérêt et ainsi
permettre le développement d’une réponse immunitaire anti-infectieuse efficace (Miro et al.
2006).
Radoja et al. ont étudié dans des modèles tumoraux murins les causes du défaut de la mise
en place de la fonction lytique des TIL CD8+ (Tumor infiltrating lymphocytes). Immédiatement
après isolement, les TIL CD8+ ne sont pas capables de lyser des cellules tumorales in vitro
même s’ils expriment des marqueurs d’activation et possèdent des granules lytiques
(perforine et granzyme). Les tests fonctionnels in vitro de ces TIL fraîchement isolés
montrent qu’ils présentent une signalisation via le TCR normale (mobilisation des stocks
intra-cellulaire de calcium, mise en place de la voie des MAPKinases, etc) en dépit d’une
fonction lytique non fonctionnelle. L’étude morphologique de ces cellules montre que lors de
la formation d’un conjugué entre un de ces TIL et une cellule tumorale, il n’y a pas de
polarisation du MTOC à la SI et donc absence du relargage polarisé des granules lytiques
vers la cellule cible. Cette étude montre que la polarisation de la machinerie sécrétoire des
CTL n’est pas régulée par la transduction du signal induite via le TCR. La cytotoxicité de ces
TIL est toutefois rapidement retrouvée après une courte période de culture in vitro, les
cellules peuvent à nouveau polariser leur machinerie sécrétoire vers la cellule cible indiquant
la présence d’un inhibiteur de la polarisation du MTOC présent au niveau du
microenvironnement tumoral. Cette molécule inhibitrice est dégradée par le protéasome lors
de la culture in vitro de ces TIL (Radoja et al. 2001).
L’ensemble de ces observations indique l’importance fonctionnelle au cours de la réponse
immunitaire de la polarisation des lymphocytes T suite à l’interaction avec une autre cellule.
La polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH assure une communication
ciblée avec les autres cellules immunitaires permettant ainsi : une fine modulation
quantitative (CPA présentant les peptides immunodominants et à de fortes concentrations
favorisées) mais aussi qualitative (spécificité antigénique) du développement de la réponse
immunitaire. Pour les CTL, la polarisation de la machinerie sécrétoire permet une lyse ciblée
sans induire des dommages tissulaires collatéraux.
Les mécanismes contrôlant cette polarisation n’altèrent pas la signalisation calcique
soutenue des lymphocytes T (Radoja et al. 2001; Depoil et al. 2005). De plus Depoil et al.
91
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
ont montré en 2005 que, lorsqu’un lymphocyte TH repolarise sa machinerie sécrétoire vers la
CPA offrant le meilleur stimulus antigénique, il continu à mobiliser le calcium intracellulaire
de manière identique durant tout le processus de repolarisation (Depoil et al. 2005).
Les mécanismes moléculaires précis contrôlant la polarisation des lymphocytes T restent
encore à être investigués.
III. Synapse immunologique et lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs
En dépit d’un nombre impressionnant de travaux concernant les lymphocytes T CD4+ CD25+
régulateurs afin d’essayer de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de
suppression mis en place in vivo par ces cellules pour réguler les réponses immunitaires, de
nombreuses interrogations restent présentes. La plupart des études in vivo permettent de
décrire de manière intégrée l’action de ces cellules régulatrices dans des modèles murins
infectieux, auto-immuns, immuno-inflammatoires ou bien de thérapies cellulaires en
identifiant suivant les modèles l’implication d’une molécule particulière (IL-10, TGF-β, etc).
Cependant ces modèles ne permettent pas d’analyser réellement la dynamique de
fonctionnement de ces cellules au contact avec d’autres types cellulaires. Les tests de
suppression in vitro sont très intéressants pour identifier fonctionnellement les Treg mais ne
reflètent pas le mode d’action physiologique des Treg in vivo.
Ces dernières années, les progrès des techniques d’imagerie, notamment ceux de la
microscopie intravitale biphotonique (permettant d’étudier les lymphocytes T in situ)
combinés aux progrès permettant l’amplification ex vivo de Treg ont permis de visualiser la
fonction suppressive des Treg.
La visualisation par « time-lapse video microscopy » d’un test de suppression in vitro dans
un système cellulaire murin (TCR transgénique DO11.10) a permis de mettre en évidence
que la présence de Treg n’altére pas les phases initiales (visualisation après 102 minutes)
de l’activation TCR dépendante des lymphocytes T effecteurs autologues. En effet, lorsqu’un
Treg et un lymphocyte T effecteur engagent de manière antigène spécifique une même CPA,
les deux cellules s’activent via leur TCR et mobilisent leurs stocks intracellulaires de calcium.
Cette observation indique que la régulation réalisée par les Treg n’affecte pas, du moins
directement, la signalisation TCR dépendante des lymphocytes T effecteurs autologues
(Tang and Krummel 2006).
Toujours in vitro chez la souris, Sumoza-Toledo et al. ont observé en microscopie confocale
que les Treg inhibent le recrutement de la PKCθ à la SI de lymphocytes T naïfs autologues
interagissant simultanément avec la même CPA (Sumoza-Toledo et al. 2006).
92
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
Des études de microscopie biphotonique intravitale réalisées en parallèle par les groupes de
Dustin et de Bluestone ont permis de visualiser dans des modèles murins la fonction
suppressive des Treg in vivo. Ces travaux ont porté sur la visualisation de l’impact des Treg
sur les phases initiales d’activation de lymphocytes T CD4+ naïfs au niveau d’un ganglion
lymphatique. En marquant les Treg avec un composé fluorescent (type CFSE) et les T CD4+
avec un autre composé fluorescent, ils ont pu suivre après injection de manière
indépendante les deux populations cellulaires. Les résultats obtenus lors de ces études
semblent démontrer que les Treg inhibent les processus de prolifération cellulaire et de
différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en les empêchant de former des conjugués
stables avec les DC présentes au sein du ganglion lymphatique. En absence de Treg les
lymphocytes T CD4+ forment des conjugués stables et durables avec les DC afin de pouvoir
s’activer pleinement (Tadokoro et al. 2006; Tang et al. 2006).
Toujours par des approches de microscopie biphotonique intravitale sur des ganglions
lymphatiques de souris anesthésiées, le groupe de H. von Adrian a visualisé l’interaction
entre des CTL et des cellules cibles en présence ou en absence de Treg. Ils ont pu montré
qu’en absence de Treg, les CTL lysent les cellules cibles 6,6 fois plus vite qu’en présence de
Treg. La présence de Treg n’altère pas les fonctions effectrices (production de molécules
effectrices et de granules lytiques) des CTL, ni leur capacité à former des SI avec les cellules
cibles ou bien, leur capacité à proliférer. Seule l’exocytose des granules lytiques des CTL est
altérée de manière réversible par les Treg. Utilisant des CTL exprimant un dnTGF-βRII, ils
ont de plus pu montré que l’inhibition du relargage des granules lytiques des CTL par les
Treg était contrôlée par le TGF-β (Mempel et al. 2006).
L’ensemble de ces observations suggère que les Treg peuvent réguler les réponses
immunitaires à de multiples niveaux et que les différents mécanismes décrits à ce jour ne
sont pas forcément contradictoires, mais dépendent plutôt du contexte physiologique ou
physiopathologique, du système expérimental ainsi que du type cellulaire à réguler.
L’étude morphologique de la fonction suppressive des Treg permettra de finement disséquer
la dynamique et l’impact fonctionnel de ces cellules sur les nombreux processus cellulaires
effecteurs mis en place par les cellules du système immunitaire.
Il est aujourd’hui possible de visualiser in vivo par des approches de microscopie intra-vitale
la dynamique des lymphocytes T au niveau des tissus périphériques. La fonction des
lymphocytes T CD8+ mémoires (Mazo et al. 2005) ou l’activation des cellules NK au niveau
hépatique (Geissmann et al. 2005) ont pu être ainsi observées.
Il serait donc intéressant de pouvoir visualiser in vivo l’activité suppressive des Treg dans les
tissus périphériques, afin de voir par quels mécanismes les Treg vont réguler les phases
effectrices plus tardives de la réponse immunitaire, notamment la régulation de
93
Introduction : Synapse Immunologique et dynamique des interactions lymphocytaires
l’inflammation, la régulation locale de la charge en agents pathogènes dans des modèles
infectieux, etc.
94
OBJECTIFS DU TRAVAIL
95
Objectifs du travail
La réponse immunitaire est architecturée autour de multiples interactions cellulaires, qui vont
avoir pour fonction de réguler positivement ou négativement cette réponse biologique de
l’organisme. Lors du processus de reconnaissance antigénique, que ce soit au niveau des
phases précoces d’activation ou bien lors des phases effectrices plus tardives, une
interaction cruciale dans l’amplification sélective de la réponse immunitaire est celle réalisée
entre un lymphocyte TH et une CPA (DC ou lymphocyte B) présentant des complexes
CMH/peptide spécifiques. A l’aire de contact entre le lymphocyte TH et la CPA, des
phénomènes de réorganisation et de ségrégation moléculaire vont s’opérer afin de pouvoir
former une plateforme de communication intercellulaire : la synapse immunologique (SI). La
SI s’organise autour de l’interaction TCR/CMH/peptide et permet au lymphocyte T de
s’activer afin notamment de pouvoir produire des médiateurs solubles effecteurs (cytokines
et chimiokines). Durant cette interaction privilégiée, le lymphocyte TH polarise sa machinerie
sécrétoire (MTOC et appareil de Golgi) contenant entre autres des cytokines (IL-2, IL-4, IFNγ, etc) vers la CPA afin de pouvoir l’activer en retour (Kupfer and Singer 1989; Depoil et al.
2005; Okada et al. 2005; Huse et al. 2006). La SI devient alors synapse sécrétrice et permet
d’établir une communication spécifique entre les deux cellules. Ainsi l’activation de la CPA a
pour diverses conséquences : l’augmentation des molécules de CMH, des molécules
accessoires comme ICAM-1 (CD54) et la production de médiateurs pro-inflammatoires
solubles (IL-1, IL-6, TNF, etc) (Okada et al. 2005).
Dans ce travail, nous avons essayé de déterminer si les lymphocytes T CD4+ CD25+
CD127low Foxp3+ régulateurs (Treg) connus pour leur incroyable potentiel à réguler les
réponses immunitaires pourraient, en interagissant avec des conjugués lymphocyte TH/CPA,
altérer la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes T CD4+ effecteurs vers la
CPA et donc par ce mécanisme, inhiber une étape capitale dans le développement de la
réponse immunitaire adaptative. Afin de répondre à cette question, nous avons mis en place
plusieurs méthodes dans le laboratoire, tout d’abord pour isoler des Treg à partir du sang
périphérique humain de donneurs sains, puis pour les amplifier polyclonalement in vitro afin
de disposer d’un nombre suffisant de cellules. La fraction T CD4+ conventionnelle autologue
est cultivée in vitro parallèlement afin d’obtenir des lymphocytes TH permettant d’étudier
l’impact des Treg sur des cellules T effectrices et non des cellules T naïves.
Post-expansion, les Treg sont caractérisés phénotypiquement et fonctionnellement. Suite à
cela, nous avons visualisé par des approches de microscopie confocale en utilisant différents
marqueurs de la machinerie sécrétoire et en se concentrant sur des conjugués où un Treg et
un lymphocyte TH interagissent simultanément avec une même CPA (DC autologue ou
cellule B.EBV, chargées avec un cocktail de super antigènes bactériens), l’effet des Treg sur
la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH vers la CPA.
96
RESULTATS
97
Résultats
Human Regulatory T cells inhibit polarization of T helper cells towards antigen
presenting cells via a TGF-β dependent mechanism
Michael Esquerré, Baptiste Tauzin, Martine Guiraud, Sabina Müller, Abdelhadi Saoudi and
Salvatore Valitutti
PNAS (2007), under review
La reconnaissance à la surface d’une CPA de complexes CMH/peptide spécifiques par un
lymphocyte T CD4+ va induire une interaction prolongée conduisant à l’établissement d’une
signalisation intracellulaire soutenue, une mobilisation des stocks intracellulaire de calcium,
le tout permettant la production active de cytokines (Valitutti et al. 1995).
Parallèlement aux évènements de réorganisation moléculaire transmembranaire et au
recrutement de protéines de signalisation, lors de la formation de la SI avec une CPA, un
lymphocyte T CD4+ ou TH polarise rapidement sa machinerie sécrétoire vers la CPA. La
machinerie sécrétoire, composée du MTOC et de l’appareil de Golgi se localise ainsi sous le
cSMAC et permet l’accumulation de certaines cytokines (IFN-γ, IL-4, etc) à la SI (Kupfer et
al. 1991; Depoil et al. 2005; Huse et al. 2007). La SI devient alors sécrétrice et le lymphocyte
TH peut donc ainsi sécréter certaines de ces cytokines de manière polarisée vers la CPA
avec laquelle il interagit, assurant ainsi une amplification antigène spécifique de la réponse
immunitaire (Friedl et al. 2005; Okada et al. 2005). D’autres médiateurs aux propriétés
chimiotactiques seront au contraire relargués de manière multidirectionnelle (Huse et al.
2006).
L’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH mettrait donc
un frein important dans le développement de la réponse immunitaire adaptative. Les Treg
sont connus pour assurer physiologiquement la tolérance périphérique au soi ou bien lors
d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, d’éviter par une modulation fine de la réponse
immunitaire, un excès d’inflammation qui pourrait induire l’apparition de lésions
immunopathologiques (Sakaguchi 2004; Belkaid and Rouse 2005).
Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail à évaluer dans un système
cellulaire humain l’impact que les Treg pourraient avoir sur la polarisation des lymphocytes T
CD4+ effecteurs lors de la formation de la SI.
Dans un premier temps, nous avons mis au point divers protocoles expérimentaux afin
d’isoler des Treg à partir du sang périphérique humain issu de donneurs sains puis de les
amplifier in vitro afin de disposer d’un nombre suffisant de cellules afin de pouvoir réaliser
ultérieurement des expériences de morphologies. Les Treg ont été isolés par tri cellulaire
magnétique sur les marqueurs CD4 et CD25 à partir des PBMC (Peripheral blood
mononuclear cells, cellules mononuclées du sang périphérique) totaux. La fraction cellulaire
98
Résultats
positive contient une population cellulaire T CD4+ C25+/high enrichie en Treg, la pureté
obtenue en routine est ≥ à 94% de cellules CD4+ CD25+. La fraction négative contenant des
lymphocytes T CD4+ CD25- conventionnels est également collectée afin de pouvoir disposer
du compartiment T CD4+ effecteur autologue. Après tri, les cellules T CD4+ CD25+/high sont
phénotypées en cytométrie en flux sur les marqueurs CD127 et Foxp3 afin d’évaluer le
pourcentage de Treg dans la fraction cellulaire triée (≥ à 90% de cellules Foxp3+ CD127low).
La fréquence des Treg dans le sang périphérique humain est de l’ordre de 0,5 à 2% des
PBMC et de 2 à 5% des lymphocytes T CD4+ totaux circulants suivant les individus. Le
nombre de Treg humain obtenus après tri a donc été un facteur limitant pendant longtemps.
En 2004, Godfrey et al. ont développé une méthode de culture permettant une forte
expansion de la population initiale de Treg obtenue après tri sans perte du potentiel
suppresseur (Godfrey et al. 2004). Nous avons donc adapté cette méthode d’expansion
polyclonale utilisant de grosses billes magnétiques (4,5 μm de diamètre) recouvertes
d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Post-culture nous avons phénotypé par cytométrie en flux
(sur les marqueurs Foxp3 et CD127) puis testé l’activité suppressive de nos lignées
cellulaires T CD4+ CD25+/high avec un test classique in vitro d’inhibition de la prolifération des
cellules T CD4+ effectrices autologues (amplifiées parallèlement dans les mêmes conditions
de culture afin d’avoir des lymphocytes T effecteurs). Post-culture, les cellules T CD4+
CD25+/high présentent les marqueurs phénotypiques des Treg et suppriment la prolifération
des cellules T CD4+ effectrices ou TH (dans des systèmes avec ou sans CPA). Après avoir
caractérisé les populations cellulaires amplifiées, nous avons utilisé ces lymphocytes T afin,
de visualiser l’impact des Treg sur la formation de la SI via l’utilisation de microscopie
confocale.
Les lymphocytes TH ont été cocultivés avec des CPA, soit des cellules immortalisées de la
lignée B-EBV (lymphocyte B transformé par le virus d’Epstein-Barr) soit des DC matures
autologues en présence ou en absence de Treg. Afin d’activer polyclonalement les cellules
T, les CPA ont été au préalable chargées avec un cocktail de superantigènes bactériens
(SEE, SEB et TSST-1). Après 2h30 de coculture, les échantillons ont été fixés,
perméabilisés puis marqués par immunofluorescence pour visualiser l’accumulation d’IFN-γ
à la SI des lymphocytes TH (comme marqueur de la machinerie sécrétoire). En se
concentrant sur les images montrant un Treg et un lymphocyte TH interagissant
simultanément avec la même CPA, nous avons donc quantifié le pourcentage de
lymphocytes TH présentant une accumulation d’IFN-γ à la SI (sur un nombre important de
cellules en conjugués). De façon intéressante, nous avons pu observer que la présence de
Treg inhibe fortement la polarisation de l’IFN-γ à la SI (formée entre le lymphocyte TH et la
CPA). Afin de quantifier plus précisément cet effet des Treg, nous avons mesuré grâce au
99
Résultats
logiciel Zeiss sur chaque image de microscopie confocale la distance entre la SI et
l’accumulation d’IFN-γ. Cette méthode précise d’analyse montre une augmentation
significative de cette distance en présence de Treg confirmant ainsi les observations
précédentes.
Parallèlement, nous avons pu constater par des approches de cytométrie en flux qu’après
2h30 de coculture, la présence de Treg altère seulement partiellement la production d’IFN-γ
des lymphocytes TH. Afin d’évaluer si cet effet était dû à un défaut d’engagement productif du
TCR des lymphocytes TH en présence de Treg, nous avons mesuré en cytométrie en flux la
mobilisation des stocks intracellulaires de calcium des lymphocytes TH ainsi que leur
capacité à former des conjugués avec des CPA chargées avec le cocktail de superantigènes
bactériens. Ces deux paramètres apparaissent similaires en présence ou en absence de
Treg, confirmant ainsi des données in vitro obtenues par un autre groupe utilisant des
cellules murines (Tang and Krummel 2006).
Afin d’étendre ces résultats, nous avons visualisé d’autres marqueurs de la machinerie
sécrétoire (appareil de Golgi et MTOC). Nous avons pu confirmer les résultats obtenus
précédemment à 2h30 de coculture. Toutefois, lors de la formation de la SI, la machinerie
sécrétoire se polarise rapidement et reste polarisée de façon soutenue.
La production d’IFN-γ par les lymphocytes TH nécessite une signalisation soutenue, son
accumulation ne peut donc pas être visualisée après quelques minutes d’interaction.
L’utilisation de ces marqueurs a permis de constater que la polarisation de la machinerie
sécrétoire après 15 minutes de coculture n’est pas altérée en présence de Treg. Ces
données suggèrent donc que les Treg nécessitent un temps d’interaction prolongé afin de
pouvoir s’activer pour exercer leur effet inhibiteur sur la polarisation de la machinerie
sécrétoire. Nous avons pu montrer cela en réalisant des expériences où les Treg ont été
cultivés au préalable durant 2h30 avec des CPA, avant de rajouter pour une période de 15
minutes les lymphocytes TH.
Le TGF-β est une cytokine clé dans l’activité suppressive des Treg (Mempel et al. 2006;
Miyara and Sakaguchi 2007). Nous avons donc voulu évaluer si l’altération de la polarisation
de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH à la SI pourrait être médiée par le TGF-β.
Pour cela nous avons visualisé comme précédemment par microscopie confocale après
2h30 de coculture l’accumulation de l’IFN-γ à la SI des lymphocytes TH en présence ou en
absence de Treg en rajoutant dans la culture soit un anticorps bloquant anti-TGF-β soit, un
anticorps de contrôle isotypique. Le blocage du TGF-β altère fortement l’effet inhibiteur des
Treg sur la polarisation des lymphocytes TH.
Nous avons de plus testé l’effet de TGF-β1 recombinant soluble sur la polarisation de la
machinerie sécrétoire d’une population clonale de lymphocytes TH1 cocultivée avec des CPA
100
Résultats
leur présentant le peptide spécifique. Le TGF-β1 soluble reproduit l’effet inhibiteur des Treg
sur la polarisation des lymphocytes TH. Ces données confortent donc le rôle clé de cette
cytokine dans l’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire des TH et de
l’activation de la CPA qui en résulte.
L’ensemble de ces données nous a permis d’identifier un nouveau mécanisme d’action
employé par les Treg dans le contrôle de la réponse immunitaire adaptative.
En produisant du TGF-β, les Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des
lymphocytes TH interagissant simultanément avec la même CPA affectant ainsi l’activation
de la CPA qui résulte normalement de cette interaction.
101
Biological Sciences: Immunology
Human regulatory T cells inhibit polarization of T helper cells towards
antigen presenting cells via a TGF-β dependent mechanism
*
*
*
*
*
Michael Esquerré , Baptiste Tauzin , Martine Guiraud , Sabina Müller , Abdelhadi Saoudi
*,†
and Salvatore Valitutti
*
INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Section Dynamique
moléculaire des interactions lymphocytaires, Toulouse, F-31300 France;
†
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Toulouse, F-31400 France;
Correspondence should be addressed to:
Salvatore Valitutti, INSERM U563,
Institut Claude de Préval,
CHU Purpan, 31059 Toulouse Cedex 3, France
Phone (33) 562 74 83 66
FAX (33) 562 74 45 58
E-mail [email protected]
Number of pages: 16
Number of figures: 5
Number of words in the abstract: 151
Number of total characters: 46525
1
Abstract
The molecular mechanisms used by regulatory T cells (Treg) to inhibit the effector phase of
adaptive immune responses are still elusive. In the present work we investigated the
possibility that Treg may interfere with a basic biological function of T helper cells (TH):
polarization of secretory machinery for dedicated help delivery.
To address this question we visualized by confocal microscopy different parameters of
activation in TH and Treg cells interacting simultaneously with individual APC. Our results
show that in the presence of Treg the re-orientation of TH secretory machinery towards APC
was strongly inhibited, while in TH cells conjugated with APC [Ca2+]i increase was
unaffected. Blocking of TGF-β completely reverted Treg induced inhibition of TH
polarization.
Our results identify a novel mechanism by which Treg inhibit effector T cells. TGF-β
produced by adjacent Treg interferes with polarization of TH secretory machinery towards
APC, thus affecting a crucial step of TH-mediated amplification of the immune-response.
2
Introduction
Naturally arising CD4+ CD25+ regulatory T cells (Treg) play a pivotal role in the maintenance
of peripheral self-tolerance. Deficiency of this suppressive T cell subset results in the
development of autoimmune lympho-proliferative disorders in mouse models and in human
patients (1). Treg are also implicated in controlling immune responses against infectious
agents and have been shown to be detrimental for anti-tumor immunity (2, 3).
Treg employ different strategies to inhibit immune responses. Among these, an important
mechanism involves TGF-β, which is a central cytokine in the homeostasis of the immunesystem (4, 5). Effector T cells in which the response to TGF-β is abrogated are resistant to
Treg suppression (6, 7).
While the role of Treg in controlling the amplitude and duration of immune responses has
been thoroughly documented and several effector molecules have been identified (8), the
mechanisms by which Treg interfere with the early activation steps of other cells of the
immune system are still elusive. In particular it is not clear whether and how Treg may
interfere with the signaling leading to biological responses in effector cells such as TH during
their interaction with cognate APC.
Two key features define TH activation and effector function. The first feature is that TH form
prolonged conjugates with APC and undergo sustained signaling that is required for induction
of cytokine production (9, 10). The second feature is that TH polarize secretory machinery
towards APC and selectively activate cognate APC (11, 12).
While T cell activation is a slow process resulting from sustained TCR engagement and
triggering (9, 10, 13), T cell polarization is a rapid and adaptable phenomenon. T cell
interacting simultaneously with APC offering different antigenic stimuli rapidly re-model
immunological synapses and adjust polarization of Golgi apparatus (14, 15). This mechanism
ensuring an exquisite specificity to help delivery may be instrumental to orchestrate and
amplify adaptive immune responses.
In the present work we investigated the impact that Treg may have on rapid polarization
responses and on sustained signaling in autologous human TH cells.
We report that while productive TCR engagement in TH/APC conjugates was unaffected by
the presence of adjacent Treg, TH polarization response towards APC was impaired via a
TGF-β dependent mechanism.
By showing that Treg interfere with dedicated help delivery, our results identify a novel
mechanism by which Treg affect adaptive immune responses.
3
Results
Isolation, expansion and characterization of human Treg
Typical CD4+ CD25+ T cells purification from peripheral blood is shown in Figure S1A.
Freshly isolated CD4+ CD25+ T cells were mainly Foxp3+ (Fig. S1B) and CD127-/lo (Fig.
S1C) as described (16, 17). CD4+ CD25+ T cells were expanded using beads coated with antiCD3 and anti-CD28 antibodies (Fig. S1D). After expansion CD4+ CD25+ remained mainly
Foxp3+ and CD127-/lo (Fig. S1E). CD4+ CD25- TH cells were obtained from the CD4+ fraction
of PBMC after sorting of CD25+ T cells and were expanded in parallel; they remained Foxp3and CD127high (Fig. S1F). To test the suppressive potential of CD4+ CD25+ T cells, TH cells
loaded with CFSE were stimulated by anti-CD3/CD28 mAb coated beads and co-cultured
either in the presence or in the absence of CD4+ CD25+ T cells at different cell-cell ratios. As
shown in Figure S1G and S1H, in vitro expanded CD4+ CD25+ T cells efficiently suppressed
the proliferative response of autologous CD4+ CD25- T cells (18).
Having characterized the regulatory function of in vitro expanded CD4+ CD25+ T cells (Treg)
we used these cells to study their impact on the dynamics of TH interaction with APC in all
the further experiments described in this study.
Polarization of TH secretory machinery is impaired in the presence of Treg
A key function of TH cells is the rapid and selective polarization of secretory machinery
towards the APC (12, 14, 15, 19, 20). To investigate whether Treg may affect this basic
function of TH cells, we visualized intra-cellular IFN-γ in TH cells conjugated either with
EBV-transformed-B (EBV-B) cells or with autologous mature DC pulsed with a cocktail of
bacterial super-antigens.
Stimulation of human T lymphocytes with a cocktail of bacterial super-antigens induces early
TCR signaling similar to that observed in antigen-stimulated T cells (20) and M. Esquerré
(unpublished observation).
Following 2h30 of incubation (a time sufficient to activate TH for IFN-γ production) (21) cells
were stained with anti-IFN-γ mAb. T cell/APC conjugates were visualized using confocal
microscopy.
Images depicting three-cell conjugates in which one APC simultaneously interacted with a TH
and a Treg were registered. Conjugated TH cells were scored for IFN-γ accumulation beneath
the cell-cell contact site (14).
4
In the absence of Treg a major fraction of TH conjugated with APC exhibited polarized IFN-γ
towards the APC (both EBV-B cells and autologous DC) in agreement with previously
reported data (12, 14, 15) (Fig. 1). Interestingly, in the presence of Treg a profound inhibition
of IFN-γ polarization was observed in TH cells interacting with EBV-B cells as well as DC
(Fig. 1). To further quantify this inhibitory effect we measured in individual TH/APC
conjugates the distance between IFN-γ accumulation and the center of the IS using the Profile
function of the Zeiss software. This analysis showed that the distance between IFN-γ intracellular accumulation and the IS was significantly increased in the presence of Treg (Fig. 4A
and B).
To investigate whether Treg could affect IFN-γ production by TH during the 2h30 co-culture
we measured intra-cellular IFN-γ by FACS analysis. As shown in Figure S2, 2h30 co-culture
with Treg resulted only in a partial reduction of IFN-γ production in TH cells.
To define whether Treg could affect later phases of TH cell activation by super-antigen pulsed
APC, we investigated their impact on TH cell proliferation and IFN-γ production after 72
hours co-culture. As shown in Figure S3, both IFN-γ production and TH cell proliferation
were strongly inhibited in the presence of Treg.
Taken together these results highlight a dual mechanism used by Treg to interfere with the
effector function of TH cells. While at later times Treg block TH cell proliferation and
cytokine production, during the first few hours of cell-cell interaction they only reduce IFN-γ
production. Yet by affecting polarization towards APC they avoid dedicated help delivery.
Treg acquire their inhibitory potential in a time-dependent fashion
Activation for IFN-γ production requires a sustained signaling and cannot be detected after a
few minutes of cell-cell conjugation (21). Yet TH cell polarization is a very rapid phenomenon
accomplished within a few minutes after TH/APC encounter (14, 15). To determine whether
Treg could affect swift polarization responses we investigated the effect of Treg on the
polarization of additional markers of the secretory machinery such as tubulin cytoskeleton and
Golgi apparatus that are known to re-locate very rapidly towards the TH/APC contact site (14,
15).
TH/APC were co-cultured for either 15 minutes or 2h30 (either in the presence or in the
absence of Treg) conjugates were stained with either anti-β tubulin mAb or with a rabbit
polyclonal Ab against the GM130 protein (to visualize Golgi apparatus). Images depicting
three-cell conjugates in which one APC simultaneously interacted with a TH and a Treg were
5
registered. Conjugated TH cells were scored for MTOC (Microtubule Organization Center) or
Golgi apparatus polarization.
As shown in Figure 2 and 4, in the absence of Treg, a large fraction of TH cells polarized
tubulin cytoskeleton and Golgi apparatus towards super-antigen pulsed EBV-B cells both at
early and at late times after conjugation (Fig. 2C, 2D, 4C and 4D). This result further supports
the notion that TH rapidly polarize towards APC and stay polarized for a sustained time (12,
14, 15). Interestingly, while 15 minutes after conjugation, polarization of the secretory
machinery was unaffected in the presence of Treg (Fig. 2A, 2C and 4C), at 2h30, polarization
of both tubulin cytoskeleton and Golgi apparatus were impaired (Fig. 2B, 2D and 4D).
In a recent study Sumoza-Toledo et al. investigated the effect of murine Treg on CD4+ T cells
immunological synapse (IS) formation. They found that while synaptic PKCθ recruitment was
altered in T cells in the presence of Treg, polarization of MTOC towards APC was unaffected
(22). However, in this study polarization of tubulin cytoskeleton was investigated only at
short time after conjugate formation. Therefore our results extend these previous observations.
Our results indicate that the inhibitory effect of Treg on TH polarization is only observed after
a sustained interaction with APC. This delayed effect may be due to a time delay required for
Treg activation. Alternatively, Treg may need to condition APC so that interaction of
conditioned APC with TH results in a failure of effector cells to polarize.
To address these questions, we first investigated whether pre-activation of Treg may result in
a rapid inhibition of polarization responses in TH cells. To this purpose, EBV-B cells were
either cultured alone or co-cultured with Treg for 2h30. TH cells were then added to the
culture for an additional 15 minutes. In these conditions, a profound effect of Treg on the
polarization of TH Golgi apparatus was observed in three-cell conjugates even though the cells
were co-cultured for only 15 minutes (Fig 3A, 3B and S4E). In TH/APC conjugates without
Treg a moderate inhibition of TH polarization was observed (S4E). Together these results
suggest that pre-activation of Treg may elicit the secretion of a soluble factor acting in a
paracrine fashion.
Next we investigated whether APC could be conditioned during interaction with Treg by
measuring polarization responses in TH interacting with chemically fixed APC either in the
presence or in the absence of Treg. Figure S5A and S5B show that, in these conditions, Treg
exhibited an inhibitory effect on TH polarization. These results suggest that in our cell system
the APC mainly play the role of cellular platforms for TH/Treg encounter and are not
implicated in mediating the observed Treg inhibition.
6
Taken together these results indicated that the observed delay in the inhibitory effect of Treg
was due to the time required for Treg activation to elicit regulatory function.
TGF-β mediates Treg induced inhibition of TH polarization
It has been shown that Treg inhibit TH and CTL effector function via a mechanism that
requires functional TGF-β signaling in effector cells (6, 7, 23). We investigated the possibility
that TGF-β may mediate the observed inhibitory effect on TH polarization response.
We included in our experimental approach a blocking mAb against TGF-β. Conjugated TH
cells were scored for IFN-γ polarization. As shown in Figure 3C, 3D and 4F, anti-TGF-β mAb
alone did not affect the polarization of TH cells. Conversely, addition of the anti-TGF-β mAb
to the cultures containing Treg markedly reverted the inhibitory effect exerted by Treg. The
anti-TGF-β used in this study did not reverse suppression of proliferation and IFN-γ
production in 72 hours cultures while, in control experiments, this blocking antibody inhibited
TGF-β1 mediated induction of Foxp3 expression (data not shown).
To investigate whether TGF-β could affect polarization of secretory machinery also in antigen
specific T cells, cloned TH1 cells were conjugated with MHC-matched EBV-B cells (pulsed
with the antigenic peptide) in the presence of 20 ng/ml soluble TGF-β1. As shown in Figure
4, treatment with soluble TGF-β1 resulted in a clear inhibition of T cell polarization towards
cognate APC, thus further supporting the role of this cytokine in affecting dedicated help
delivery. Moreover the addition of TGF-β1 to the cultures inhibited TH induced increase of
CD40 and ICAM-1 expression on the surface of APC (Fig. S6), indicating that TGF-β affects
the TH mediated activation of the APC.
Taken together the above results indicate that Treg inhibit polarization in TH cells via a TGFβ dependent mechanism.
Treg do not interfere with [Ca
2+
]i increase in TH cells conjugated with APC
We next investigated whether the observed effect of Treg on TH polarization could be
2+
mediated by an effect on sustained signaling in TH cells. To this end we investigated [Ca ]i
increase in TH cells at different time points after conjugation with APC pulsed with different
concentrations of super-antigens (either in the presence of bystander Treg or of bystander TH,
as a control). As shown in Fig. 5A Treg did not exert a major effect on TH/APC conjugation.
In addition, the fraction of conjugated TH cells undergoing calcium mobilization and the
7
2+
intensity of [Ca ]i increase in conjugated TH cells were unaffected (Fig. 5A). Pre-incubation
of Treg with APC for 2h30 did not affect the number of TH/APC conjugates nor the fraction
of conjugated TH cells undergoing calcium mobilization (Fig. 5B).
Taken together these results indicate that Treg mediated inhibition of TH polarization is not
mediated by an inhibition of productive TCR engagement.
Discussion
Although the suppressive role of Treg in controlling immune responses has been thoroughly
investigated, the molecular mechanisms employed by Treg to control the activation of the
different cells of the immune system are still elusive. In particular how Treg may affect the
biological function of effector T cells is still an unresolved question. In the present work we
provide a first stepping-stone to address this challenging question. Using Treg isolated from
human peripheral blood and expanded in culture we investigated whether and how these cells
may affect TH cell polarization towards APC. Our results show that Treg inhibit polarization
of TH cells towards APC via a TGF-β dependent mechanism.
A key function of TH cells is their capacity to rapidly polarize their secretory machinery
towards APC. This may allow TH cells to provide dedicated help to other actors of the
immune-response such as B lymphocytes or macrophages (11, 12, 24). Via this mechanism
immune cells that display the strongest antigenic stimulus for T cells can be selectively
activated, resulting in a progressive amelioration of specific immune-responses (11, 14, 15).
Our results, by showing that Treg rapidly inhibit TH polarization shed a new light on the
biology of these cells. We show that in addition to other previously described mechanisms
employed by Treg to inhibit adaptive immune responses (8), TGF-β1 inhibits polarization
responses and thus affects APC activation induced by TH cells.
Our morphological quantifications of three-cell conjugates in which one APC was
simultaneously in contact with one Treg and one TH show that, although the proximity
between Treg and TH facilitates inhibition (Fig. S4E), a direct contact between Treg and
regulated cells is not required (Fig. S7). This observation is in agreement with previously
reported studies based on two-photon microscopy approaches in which it was shown that Treg
do not need to enter in contact with TH to deliver their inhibitory signals (25, 26). In addition,
the observation that anti-TGF-β blocking antibody reverts Treg inhibition of TH polarization
and that soluble TGF-β1 mimics this Treg inhibitory effect, contributes to support a model of
8
Treg function in which Treg act (independently of cell-cell contact) via the secretion of
soluble mediators.
Nevertheless, it should be noted that in our study (and also in the above mentioned previous
studies (25, 26)) undetected short-lived contacts between Treg and regulated T cells could
contribute to the observed inhibition.
These observations are in apparent contrast with several studies showing that in vitro
suppression by Treg of T cell proliferation and cytokine production in long term co-cultures
requires cell-cell contact and is normally independent of soluble factors (27). We also found
that, in similar experimental conditions, our expanded Treg suppress in vitro TH proliferation
and IFN-γ production in a TGF-β independent fashion (data not shown). Conversely and
interestingly when the same expanded Treg population were used in short time co-cultures in
which TH polarization towards the APC was investigated, the Treg inhibition was TGF-β
dependent. Thus our results extend previous data by highlighting a dual mechanism of Treg
mediated suppression: on one hand Treg control TH polarization, on the other they affect
proliferation processes.
It is tempting to speculate that while the inhibition of TH polarization (our novel finding) is
under the direct control of TGF-β, the previously described inhibition of TH proliferation by
Treg may be dependent on additional mechanisms.
A recent in vivo study demonstrated a central role for TGF-β1 in controlling differentiation of
TH cells and induction of inflammatory disease (28). Our in vitro observations are compatible
with this recent study: we suggest that in the course of an in vivo response, the effect of TGFβ on TH polarization may be instrumental in fine tuning APC activation to avoid an
uncontrolled amplification of the immune response leading to immunopathological lesions.
Our study also addresses the question of whether Treg may affect TH/APC conjugation and
TCR sustained signaling. We show that TH undergo conjugate formation and sustained
signaling when interacting with the APC in the presence of Treg. This indicates that in our
system Treg do not interfere with the early steps of TH activation but rather they affect downstream pathways. Accordingly, it has been recently shown, using in vitro time lapse videomicroscopy, that [Ca2+]i increase at the single-cell level in murine T cells conjugated with
APC is not affected by Treg (29). Taken together our results and those published results
indicate that regulation does not directly affect TCR signaling.
Previous studies investigated the role of Treg in inhibiting the stop signal in vivo in naïve
murine T cells. They showed that in the presence of Treg the length of T cell/APC
9
interactions were reduced (25, 26). Our present results are not in contrast with those previous
findings. Indeed in our experimental approach in vitro expanded human CD4+ T cells were
conjugated by centrifugation with APC to measure the extent of calcium responses by FACS
analysis. Therefore, our experimental approach did not address the question of whether Treg
affect the length of the stop signal in migrating TH cells.
Moreover we also observed that the addition of TGF-β1 to the cultures inhibited TH induced
augmentation of ICAM-1 expression on the surface of APC (Fig. S6), suggesting that in the
course of an immune-response our presently described mechanism may contribute to alter the
stability of T cell/APC conjugates in agreement with the previous studies.
In conclusion, our results unveil an unknown strategy employed by Treg to interfere with the
development and sustenance of adaptive immune responses.
While the inhibitory effect of Treg on the activation of naïve T cells to become effectors has
been thoroughly documented, much less is known about the mechanisms by which Treg may
efficiently outcompete the TH mediated amplification of immune responses.
Here we show that Treg can suppress this pivotal TH cell function via a dual mechanism.
During initial interaction with TH cells, by impairing dedicated help delivery, Treg affect a
crucial early step of the TH dependent immune-response. At later time points Treg block TH
expansion and cytokine production, thus extinguishing TH effector function.
It is tempting to speculate that since Treg are found both in secondary lymphoid organs and in
peripheral tissues they might be equipped with different inhibitory mechanisms to ensure
different levels of suppression.
The combination of complementary strategies to abort an ongoing effector immune-response
can be instrumental for the exquisite efficiency of Treg biological function.
10
Material and methods
T cells and APC
T cells were isolated from the whole blood of healthy donors (Centre de Transfusion
Sanguine, CHU Purpan, Toulouse). The CD4+ CD25+ enriched T cell fraction was sorted from
PBMC using magnetic separation (Miltenyi Biotec, France). CD4+ T cells were isolated by
negative depletion followed by positive selection using anti-CD25 coated beads. Two cellular
fractions were obtained, the CD4+ CD25- fraction and the CD4+ CD25+ fraction. Cell purity
was assessed by FACS analysis (Facscan, Becton Dickinson) using PE-labeled anti-CD25
mAb (clone M-A251, BD Pharmingen, San Diego, CA) and FITC-labeled anti-CD4 mAb
(clone RPA-T4, BD Pharmingen). CD4+ CD25+ fractions were routinely 91% to 98% pure.
Cells were assessed for CD127 expression using PE-labeled anti-CD127 mAb (clone R34.34,
Immunotech) and/or for Foxp3 using FITC-labeled anti-Foxp3 mAb (clone PCH101,
eBioscience).
Dendritic cells (DC) were derived from autologous PBMC. Adherent monocytes were
cultured in RPMI 10% FCS supplemented with IL-4 (1000 IU/ml) and GM-CSF (50 ng/ml,
both from R&D Systems) (30). The percentage of CD11c+ cells in monocyte-derived DCs
was checked by FACS after 15 days of culture and was routinely 90% pure. Epstein-Barr
virus (EBV)-transformed B cells (LG2) were cultured as described (9).
T cell expansion
Freshly isolated T cell populations were cultured and expanded in RPMI 1640, 5% human
serum, IL-2 (150 IU/ml) in the presence of anti-CD3/CD28 mAb-coated Dynabeads
(Invitrogen, France). For CD4+ CD25+ T cells, IL-15 (5 ng/ml, from R&D Systems) was
added to the culture medium. Bead : cell ratio was 2:1 for the CD4+ CD25+ T cells and 1:1 for
the CD4+ CD25- T cells (31).
Suppression assay
5x104 of CFSE -loaded CD4+ CD25- cells per well were cultured in 96 U bottom plates with
CD4+ CD25+ T cells at different ratios. Cells were stimulated with CD3/CD28 mAb-coated
beads (18). Cells were co-cultured for 72h, CD4+ CD25- cell proliferation was measured by
FACS analysis.
11
Confocal microscopy
EBV-B cells or DC were pulsed with a cocktail of bacterial super-antigens (TSST-1, SEE,
SEB, 100 ng/ml, Toxin Technology) for 1 hr at 37°C. During the last 15 minutes, cells were
loaded with 0,5 μM CMTMR-Orange (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands). The
super-antigens not bound to APC were removed by washing. In some experiments APC
loaded with CMTMR-Orange were fixed with 1% paraformaldehyde before pulsing with
super-antigens. In parallel, CD4+ CD25+ Treg were loaded with 0,5 μM CMFDA-green
(Molecular Probes) for 15 minutes at 37°C. 105 of each T cell subset and 2x105 APC were
conjugated as described (14). At different time points after conjugation, cells were fixed and
permeabilized either with 0,1% Triton X-100 (for GM130 staining) or with 0,1% saponin for
(IFN-γ and tubulin staining) as described (14). The following primary antibodies were used:
anti-GM130 (either rabbit polyclonal Ab, kind gift of A. De Matteis, Istituto Mario Negri
Sud, Italy or mouse mAb, clone 35, from BD Pharmingen); anti-IFN-γ monoclonal Ab (clone
B27, BD Pharmingen); anti-β tubulin mAb (clone TUB 2.1, Sigma, Saint Louis). Primary Ab
were followed by either goat anti-mouse or goat-anti rabbit polyclonal Ab labeled with
Alexafluor 633 (Molecular Probes). In some experiments anti-TGF-β mAb (clone 2G7) (32)
or isotype control Ab (BD Pharmingen) were added to the culture medium. In some
experiments a DRB1*0101-restricted TH1 cell clone (6396p5.1.2) specific for the measles
virus fusion protein peptide F254-268 and DR matched EBV-B cells were used. Cells were
co-cultured either in the presence or in the absence of 20 ng/ml recombinant human TGF-β1
(from R&D Systems). The samples were mounted and examined using a Zeiss LSM 510 (Carl
Zeiss, Jena, Germany) confocal microscope with a 63 Plan-Apochromat objective (1.4 oil),
electronic zoom 3, as described (14). Snapshots depicting overlapping of DIC images with
green, red and blue fluorescence are unprocessed images. In snapshots depicting green, red
and blue fluorescence only, background subtraction and color saturation was applied to the
whole image using Adobe Photoshop software.
2+
Measurement of [Ca
] i.
2+
[Ca ]i was measured in TH cells conjugated with APC as described (9).
12
Acknowledgements
We thank Denis Hudrisier and Iris Caramalho for discussion and critical reading of the
manuscript and Isabelle Bernard for technical assistance. This work was supported by grants
from la Ligue contre le Cancer “Equipe labellisée 2007”. The authors have no competing
financial interests.
13
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
Sakaguchi, S. (2005) Nat Immunol 6, 345-52.
Zou, W. (2006) Nat Rev Immunol 6, 295-307.
Wang, H. Y., Lee, D. A., Peng, G., Guo, Z., Li, Y., Kiniwa, Y., Shevach, E. M. & Wang, R. F.
(2004) Immunity 20, 107-18.
Marie, J. C., Letterio, J. J., Gavin, M. & Rudensky, A. Y. (2005) J Exp Med 201, 1061-7.
Gorelik, L. & Flavell, R. A. (2000) Immunity 12, 171-81.
Fahlen, L., Read, S., Gorelik, L., Hurst, S. D., Coffman, R. L., Flavell, R. A. & Powrie, F.
(2005) J Exp Med 201, 737-46.
Chen, M. L., Pittet, M. J., Gorelik, L., Flavell, R. A., Weissleder, R., von Boehmer, H. &
Khazaie, K. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 419-24.
von Boehmer, H. (2005) Nat Immunol 6, 338-44.
Valitutti, S., Dessing, M., Aktories, K., Gallati, H. & Lanzavecchia, A. (1995) J Exp Med 181,
577-84.
Goldsmith, M. A. & Weiss, A. (1988) Science 240, 1029-31.
Okada, T., Miller, M. J., Parker, I., Krummel, M. F., Neighbors, M., Hartley, S. B., O'Garra, A.,
Cahalan, M. D. & Cyster, J. G. (2005) PLoS Biol 3, e150.
Kupfer, A. & Singer, S. J. (1989) Annu Rev Immunol 7, 309-37.
Huppa, J. B., Gleimer, M., Sumen, C. & Davis, M. M. (2003) Nat Immunol 4, 749-55.
Depoil, D., Zaru, R., Guiraud, M., Chauveau, A., Harriague, J., Bismuth, G., Utzny, C., Muller,
S. & Valitutti, S. (2005) Immunity 22, 185-94.
Huse, M., Klein, L. O., Girvin, A. T., Faraj, J. M., Li, Q. J., Kuhns, M. S. & Davis, M. M. (2007)
Immunity 27, 76-88.
Seddiki, N., Santner-Nanan, B., Martinson, J., Zaunders, J., Sasson, S., Landay, A., Solomon,
M., Selby, W., Alexander, S. I., Nanan, R., Kelleher, A. & Fazekas de St Groth, B. (2006) J
Exp Med 203, 1693-700.
Liu, W., Putnam, A. L., Xu-Yu, Z., Szot, G. L., Lee, M. R., Zhu, S., Gottlieb, P. A., Kapranov,
P., Gingeras, T. R., Fazekas de St Groth, B., Clayberger, C., Soper, D. M., Ziegler, S. F. &
Bluestone, J. A. (2006) J Exp Med 203, 1701-11.
Game, D. S., Hernandez-Fuentes, M. P. & Lechler, R. I. (2005) Am J Transplant 5, 454-64.
Valitutti, S., Muller, S., Dessing, M. & Lanzavecchia, A. (1996) Eur J Immunol 26, 2012-6.
Das, V., Nal, B., Dujeancourt, A., Thoulouze, M. I., Galli, T., Roux, P., Dautry-Varsat, A. &
Alcover, A. (2004) Immunity 20, 577-88.
Faroudi, M., Zaru, R., Paulet, P., Muller, S. & Valitutti, S. (2003) J Immunol 171, 1128-32.
Sumoza-Toledo, A., Eaton, A. D. & Sarukhan, A. (2006) J Immunol 176, 5779-87.
Mempel, T. R., Pittet, M. J., Khazaie, K., Weninger, W., Weissleder, R., von Boehmer, H. &
von Andrian, U. H. (2006) Immunity 25, 129-41.
Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A. & Unanue, E. R. (1997) Proc Natl Acad
Sci U S A 94, 3909-13.
Tang, Q., Adams, J. Y., Tooley, A. J., Bi, M., Fife, B. T., Serra, P., Santamaria, P., Locksley,
R. M., Krummel, M. F. & Bluestone, J. A. (2006) Nat Immunol 7, 83-92.
Tadokoro, C. E., Shakhar, G., Shen, S., Ding, Y., Lino, A. C., Maraver, A., Lafaille, J. J. &
Dustin, M. L. (2006) J Exp Med 203, 505-11.
Piccirillo, C. A., Letterio, J. J., Thornton, A. M., McHugh, R. S., Mamura, M., Mizuhara, H. &
Shevach, E. M. (2002) J Exp Med 196, 237-46.
Li, M. O., Wan, Y. Y. & Flavell, R. A. (2007) Immunity 26, 579-91.
Tang, Q. & Krummel, M. F. (2006) Curr Opin Immunol 18, 496-502.
Sallusto, F. & Lanzavecchia, A. (1994) J Exp Med 179, 1109-18.
Godfrey, W. R., Ge, Y. G., Spoden, D. J., Levine, B. L., June, C. H., Blazar, B. R. & Porter, S.
B. (2004) Blood 104, 453-61.
Arteaga, C. L., Hurd, S. D., Winnier, A. R., Johnson, M. D., Fendly, B. M. & Forbes, J. T.
(1993) J Clin Invest 92, 2569-76.
14
Figure legends
Figure 1. Treg inhibit polarization of IFN-γ towards APC. (A, B): EBV-B cells (red, A) or
mature autologous DC (red, B) were conjugated with either TH alone (unstained a, c,) or
together with Treg (green b, d) at 1:1:1 ratio. After 2h30 incubation at 37°C, cells were
stained for IFN-γ. (B): White arrows indicate IFN-γ accumulation; white circles mark T cell
contour. (C, D): Quantification of TH IFN-γ polarization towards EBV-B cells (C) or towards
DC (D) by visual inspection. In (C) 72 three-cell conjugates plus Treg and 75 conjugates
without Treg were scored. In (D) 43 conjugates plus Treg and 46 conjugates without Treg
were scored. The histograms represent the mean +/- SD values of three independent
experiments using cells from 3 different donors. Statistical significance of difference between
groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test using the GraphPad Prism software.
*** p < 0.001.
Figure 2. Inhibition of secretory machinery polarization occurs in a time-dependent fashion.
EBV-B cells were conjugated with TH for different times either in the presence or in the
absence of Treg. (A, B): EBV-B cells (red) were conjugated with TH (unstained) in the
presence of Treg (green) at 1:1:1 ratio. After 15 minutes incubation at 37°C (A) or 2h30
incubation at 37°C (B), cells were stained for either GM130 (Aa and Ba) or tubulin (Ab and
Bb). White arrows indicate localization of MTOC or GM130; white circles mark T cell
contour. (C, D): Quantification of TH GM130 and tubulin polarization towards APC after 15
minutes incubation (C) or after 2h30 incubation (D). In (C) 66 three-cell conjugates plus Treg
and 85 conjugates without Treg were scored for GM130; 60 three-cell conjugates plus Treg
and 63 conjugates without Treg were scored for tubulin. In (D) 82 three-cell conjugates plus
Treg and 60 conjugates without Treg were scored for GM130; 88 three-cell conjugates plus
Treg and 91 conjugates without Treg were scored for tubulin. The histograms represent the
mean and SD values of three independent experiments using cells from 3 different donors.
Statistical significance of differences between groups was evaluated by an unpaired Student’s
t-Test using the GraphPad Prism software, **p<0.01.
Figure 3. Inhibition of polarized IFN-γ secretion in TH cells is mediated by TGF-β
production. (A): EBV-B cells (red) were either kept in culture alone (a, c) or conjugated with
Treg (green b, d) for 2h30. TH (unstained) were added for an additional 15 minutes at 1:1:1
ratio. Cells were stained for GM130. White arrows indicate GM130 localization; white circles
15
mark T cell contour. (B): Quantification of TH GM130 polarization towards APC in the
culture conditions described in (A). A total of 48 three-cell conjugates (plus Treg) and 48
conjugates (without Treg) were scored. (C): EBV-B cells (red) were conjugated with either
TH alone (unstained a, d) or with TH plus Treg (green b, c, e, f) at 1:1:1 ratio. After 2h30
incubation at 37°C, cells were stained for IFN-γ. In a, d, c, f, cells were treated with anti-TGFβ mAb at time zero of conjugate formation. In b and e, cells were treated with an isotype
control Ab. White arrows indicate IFN-γ accumulation; white circles mark T cell contour.
(D): Quantification of TH IFN-γ polarization towards APC in the culture conditions described
in (C). 44 conjugates TH alone plus anti-TGF-β Ab, 43 conjugates TH plus Treg plus the
isotype control Ab and 41 conjugates TH plus Treg and plus anti-TGF-β Ab were scored. The
histograms represent the mean and SD values of three independent experiments using cells
from 3 different donors. Statistical significance of differences between groups was evaluated
by an unpaired Student’s t-Test using the GraphPad Prism software, ***p<0.001.
Figure 4. Exogenous TGF-β1 inhibits polarization of antigen specific T cells. (A): Peptidepulsed EBV-B cells (red) were conjugated with either 6396p5.1.2 cells in the absence (a, c) or
in the presence of 20 ng/ml TGF-β (b, d). After 2h30 incubation at 37°C, cells were stained
for IFN-γ (green) (B): Distances of IFN-γ from the center of the T cell/APC contact site were
measured using the Profile function of the Zeiss software. Each dot in the figures corresponds
to a TH/APC conjugate
90 conjugates plus TGF-β and 81 conjugates without TGF-β were scored. Statistical
significance of differences between groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test
using the GraphPad Prism software. *** p < 0.001.
Figure 5. Sustained [Ca2+]i increase in TH cells is unaffected in the presence of Treg. Indo-1
loaded TH cells were conjugated with EBV-B cells in the presence of either unstained TH or
unstained Treg. The following cellular ratio was used 1:1:1 (TH Indo-1+ : APC : Treg or
control TH). (A): APC were either unpulsed or pulsed with 100 ng/ml, 10 ng/ml or 1 ng/ml
super-antigens. Upper panel: Percentage of Indo-1 loaded TH cells in conjugate at the
indicated time points. Lower panel left: Percentage of TH in conjugate that exhibit [Ca2+]i
increase. Lower panel right: Mean fluorescence intensity of 405/530 emission ratio in TH cells
at different time points after conjugate formation. (B): APC pulsed with either 100 ng/ml or 1
16
ng/ml super-antigens were pre-cultured with Treg or control TH for 2h30. Indo-1 loaded TH
were conjugated at the ratio 1:1:1 (TH Indo-1+ : APC : Treg or control TH). Upper panels:
Percentage of Indo-1 loaded TH cells in conjugate. Lower panels: Percentage of TH in
conjugate that exhibit [Ca2+]i increase.
Data are from 3 independent experiments performed using cells from two different donors.
Bars represent standard deviation to the mean. Statistical significance of difference between
groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test using the GraphPad Prism software. * p
< 0.05.
17
Figure 1.
b
a
DC
IFN-γ
DC
IFN-γ
Treg
b
C
D
EBV.B cell
100
***
75
50
25
0
d
c
d
***
75
50
25
+
Tr
eg
0
-T
re
g
c
DC
100
Tr
eg
EBV.B cell
IFN-γ
Treg
+ Treg
+
EBV.B cell
IFN-γ
- Treg
-T
re
g
+ Treg
conjugated TH cells producing IFN-γ (%)
- Treg
a
polarized
unpolarized
B
conjugated TH cells producing IFN-γ (%)
A
Esquerré et al.
B
polarized
unpolarized
2h30
EBV.B cell
GM130
Treg
C
D
15 min
100
2h30
100
**
50
25
0
GM 130
tubulin
-T
re
g
Tr
eg
+
-T
re
g
Tr
eg
+
-T
re
g
b
25
0
tubulin
b
50
Tr
eg
EBV.B cell
tubulin
Treg
75
+
EBV.B cell
tubulin
Treg
75
-T
re
g
a
a
conjugated TH cells (%)
**
Tr
eg
15 min
EBV.B cell
GM130
Treg
+
A
conjugated TH cells (%)
Figure 2.
GM 130
Esquerré et al.
Figure 3.
preincubation + Treg
EBV.B cell
GM130
Treg
Preincubation -/+ Treg
a
a
b
conjugated TH cells (%)
100
***
- Treg
Ab anti-TGF-β
+ Treg
isotype control Ab
+ Treg
Ab anti-TGF-β
EBV.B cell
IFN-γ
EBV.B cell
IFN-γ
Treg
EBV.B cell
IFN-γ
Treg
75
50
a
25
polarized
unpolarized
D
b
c
conjugated TH cells producing IFN-γ (%)
preincubation - Treg
EBV.B cell
GM130
C
100
***
75
50
25
0
A
b
+
f
-T
re
g
e
Tr
eg
d
+
+
PC
d
(A
c
A
PC
on
ly
Tr
eg
)
+
+
TH
TH
0
***
an
+
is
tiot
TG
yp
F+
e
Tr
β
co
eg
nt
ro
+
A
lA
b
b
an
ti
-T
G
Fβ
B
A
Esquerré et al.
c
d
7
6
5
4
3
2
1
1
0
Fβ
b
8
TG
a
EBV.B cell
IFN-γ
9
+
EBV.B cell
IFN-γ
***
10
1
+ TGF-β1
Fβ
- TGF-β1
-T
G
B
A
distance between IS and IFN-γ accumulation ( μm)
Figure 4.
Esquerré et al.
Figure 5.
20.0
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
60
time (min) 120
10000
0
0
60
time (min)
5.0
2.5
50
40
30
20
10
0
eg
Tr
d
ne
ai
st
un
un
st
ai
nd
ed
80
70
60
50
40
30
20
10
0
eg
60
90
Tr
70
eg
TH
eg
Tr
d
ne
ai
st
un
80
100
d
20000
7.5
ne
30000
10.0
ai
40000
12.5
TH
50000
15.0
Conjugated TH cells fluxing calcium (%)
60000
17.5
st
10
70000
20.0
un
20
80000
90
Tr
30
1 ng/ml -Treg
1 ng/ml +Treg
10 ng/ml -Treg
10 ng/ml +Treg
100 ng/ml -Treg
100 ng/ml +Treg
Unpulsed APC
90000
100
d
40
100
ne
50
10
ai
60
1
st
70
100
TH
80
120
10
22.5
0.0
un
90
1
25.0
0.0
un
st
ai
nd
ed
60
100
Conjugated TH cells fluxing calcium (%)
10
1 ng/ml pulsed APC
TH indo-1 + - APC conjugates (%)
22.5
un
st
ai
nd
ed
Conjugated TH cells fluxing calcium (%)
0
1
1 ng/ml -Treg
1 ng/ml +Treg
10 ng/ml -Treg
10 ng/ml +Treg
100 ng/ml -Treg
100 ng/ml +Treg
Unpulsed APC
0
25.0
TH
*
100
0
T indo-1 + - APC conjugates (%)
+
unpulsed APC + indo-1 TH + unstained TH
time (min)
[SAg] ng/ml
100 ng/ml pulsed APC
B
pulsed APC + indo-1+ TH + unstained TH
pulsed APC + indo-1+TH + unstained Treg
un
st
ai
nd
ed
37.5
35.0
32.5
30.0
27.5
25.0
22.5
20.0
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
405/530 Mean Fluorescence Intensities ratio
TH indo-1 + - APC conjugates (%)
A
120
Esquerré et al.
Supplementary figure legend
Figure S1. Phenotypical and functional characterization of CD4+CD25+ T cell subset
from human peripheral blood. (A): CD4+ CD25+ T cells were isolated using magnetic
separation. A typical cellular purification is shown. (B): Freshly isolated CD4+ CD25+ T
cells are mainly Foxp3+ (C): Freshly isolated CD4+ CD25+ T cells are CD127-/lo. Bold
histogram: CD4+ CD25+ T cells, gray histogram CD4+ CD25- T cells. (D): In vitro
expansion of CD4+ CD25+ T cells; the yellow rectangle indicates the time window in
which the expanded CD4+ CD25+ T cells were used for experiments. Autologous CD4+
CD25- T cells were expanded in parallel and used at the same times. All the experiments
were performed using in vitro expanded CD4+ CD25- and CD4+ CD25+ T cells at least 14
days after beginning of the culture. (E): In vitro expanded CD4+ CD25+ T cells are
mainly Foxp3+ and CD127-/lo. (F): In vitro expanded CD4+ CD25- T cells are mainly
Foxp3- and CD127high. (G): Proliferation of CD4+ CD25- T cells in the presence of
expanded CD4+ CD25+ T cells. A 72h CFSE suppression assay is shown: CD4+ CD25- T
cells were either alone (bold histogram) or in the presence of Treg (1:1 ratio, gray
histogram). (H): Proliferation of CD4+ CD25- T cells in the presence of CD4+ CD25+ T
cells at different cell:cell ratios. Data are from 3 independent experiments performed in
triplicate using cells from three different donors. Histogram bars represent standard
deviation to the mean.
Figure S2. Treg partially inhibit IFN-γ production by TH cells during a short time coculture. EBV-B cells (either unpulsed or pulsed with super-antigens) were conjugated
with either TH alone or with Treg (loaded with CFSE) at 2:1:1 ratio. After 2h30
incubation at 37°C, cells were stained with anti-IFN-γ mAb followed by a PE-labelled
secondary Ab. Treg were excluded from the analysis on the basis of CFSE green
fluorescence. APC were excluded using FSC/SSC criteria. Data are from 3 independent
experiments performed in duplicates using cells from two different donors. Statistical
significance of differences between groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test
using the GraphPad Prism software, *p<0.05.
Figure S3. Treg inhibit proliferation and IFN-γ production in TH stimulated by superantigen pulsed APC. CFSE -loaded CD4+ CD25- TH cells were cultured with unpulsed or
super-antigen pulsed irradiated DC. Unstained CD4+ CD25+ Treg or CD4+ CD25- TH
cells (as control) were added at different ratios. Cells were co-cultured for 72h. (A and
B) CD4+ CD25- TH cell proliferation was measured by FACS analysis. (C and D) Culture
supernatants were harvested and IFN-γ production was measured by ELISA.
Data are from 3 (with Treg) and 2 (with TH as control) independent experiments
performed in duplicates using cells from three different donors.
Figure S4. Statistical analysis of morphological data. Distances of IFN-γ (A, B, F)
GM130 (C,D,E) and MTOC (C, D) from the center of the T cell/APC contact site were
measured using the Profile function of the Zeiss software. Each dot in the figures
corresponds to a TH/APC conjugate (A, B): Distance in µm of IFN-γ accumulation from
IS in TH cells in conjugation with either EBV-B cells (A) or autolougous mature DC (B)
either in the absence or in the presence of Treg. (C, D): Distance in µm of MTOC and
GM130 from IS. TH cells were in contact with EBV-B cells for 15 minutes (C) or 2h30
(D) either in the absence or in the presence of Treg. (E): Distance in µm of GM130 from
IS in TH cells conjugated with EBV-B for 15 minutes. EBV-B cells were either untreated
or previously co-cultured with Treg for 2h30. In the samples in which Treg were present
measurements were performed by randomly selecting in the same slides either TH/APC
conjugates without Treg (indicated in the figure as +Treg (TH/APC)) or three-cell
conjugates containing TH, APC and Treg (indicated in the figure as +Treg). (F): Distance
in µm of IFN-γ accumulation from IS in TH cells conjugated with EBV-B for 2h30 either
in the presence or in the absence of Treg. Either anti-TGF-β Ab or isotype control Ab
were added to the cultures at the time of conjugate formation as indicated. Statistical
significance of differences between groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test
using the GraphPad Prism software, *p<0,05, ***p<0.001.
Figure S5. APC are not implicated in mediating Treg inhibition. (A): Paraformaldehyde
fixed EBV-B cells (red) were conjugated with either TH alone (unstained a, c) or together
with Treg (green b, d) at 1:1:1 ratio. After 2h30 incubation at 37°C, cells were stained for
IFN-γ (blue). (B): Distances of IFN-γ from the center of the T cell/APC contact site were
measured using the Profile function of the Zeiss software. Each dot in the figures
corresponds to a TH cell/APC conjugate
A total of 45 conjugates plus Treg and 40 conjugates without Treg were scored.
Statistical significance of difference between groups was evaluated by an unpaired
Student’s t-Test using the GraphPad Prism software. *** p < 0.001.
Figure S6. TH cell induced APC activation is inhibited by TGF-β1. EBV-B cells either
unpulsed or super-antigen pulsed were cultured with TH cells either in the presence or in
the absence of 20 ng/ml TGF-β1 at 1:1 ratio. After overnight co-culture, CD40 and
ICAM-1 expression was measured by FACS analysis on EBV-B cells. (A) Measurement
of CD40 expression in three independent experiments each one performed in duplicate.
(B) Measurement of ICAM-1 expression in three independent experiments each one
performed in duplicate. Symbols indicate the independent experiments. Data are
expressed as fold increase of unpulsed APC cultured with TH. Statistical significance of
difference between groups was evaluated by an unpaired Student’s t-Test using the
GraphPad Prism software. ** p < 0.01; *** p < 0.001.
Figure S7. Contact between Treg and TH cells is not required for inhibition of TH
polarization. Distance in µm of IFN-γ accumulation from IS in TH cells in conjugation
with either autologous mature DC (A) or EBV-B cell (B) in the presence of Treg. Treg
were either in contact with TH cells or with the APC but not with TH.
Online supplemental material
Measurement of IFN-γ production by FACS analysis
IFN-γ production in TH cells was measured by FACS analysis as previously described
(20).
Suppression assay with super-antigen pulsed APC
CFSE -loaded CD4+ CD25- TH cells (5x104 per well) were cultured in 96 U bottom plates
with unpulsed or super-antigen pulsed irradiated DC. Unstained CD4+ CD25+ Treg or
CD4+ CD25- TH cells (as a control) were added at different ratios. Cells were co-cultured
for 72h, CD4+ CD25- TH cell proliferation was measured by FACS analysis. Culture
supernatants were harvested and IFN-γ secretion was measured by ELISA (9).
Measurement of CD40 and ICAM-1 expression.
EBV-B cells either unpulsed or pulsed with 100 ng/ml super-antigens were loaded with
CMFDA-green (Invitrogen) and cultured with TH cells either in the presence or in the
absence of 20 ng/ml TGF-β1 at 1:1 ratio. After overnight co-culture, CD40 and ICAM-1
expression were measured by FACS analysis on EBV-B cells stained with anti-CD40 or
anti-ICAM-1 (CD54) PE-labeled antibodies (clone 5C3 and clone HA58, BD
Pharmingen).
Figure S1.
A
C
B
98,86
90,41
9,59
number of cells
0,00
CD4
CD25
1,14
Foxp3
CD4
CD127
E
D
F
90
3,90
24,84
83,32
80
1,29
fold expansion
70
60
50
40
30
20
10
15
20
25
time in culture (d)
G
30
H
100
number of cells
proliferating cells (%)
0:1
1:1
Foxp3
Foxp3
75
50
25
2:
1
1:
1
0
CFSE
0,
5:
1
5
0:
1
0
CD127
0
66,78
CD127
10
ratio CD4+ CD25+ : CD4+ CD25-
Esquerré et al.
Figure S2.
Esquerré et al.
Figure S3.
A
B
0:1 Treg : TH CFSE+
1:1 Treg : TH CFSE+
number of cells
number of cells
0:1 TH : TH CFSE+
1:1 TH : TH CFSE+
CFSE
CFSE
C
D
6
5.5
5.0
4.5
[IFN- γ ] (ng/mL)
[IFN- γ ] (ng/mL)
5
4
3
2
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
1
0.5
2:
1
1:
1
0,
5:
1
0:
1
un
pu
ls
ed
D
TH
C
ce
lls
on
ly
Treg : TH CFSE+
2:
1
1:
1
0,
5:
1
0.0
0:
1
un
pu
ls
ed
D
TH
C
ce
lls
on
ly
0
TH : TH CFSE+
Esquerré et al.
tubulin
tubulin
***
E
5
4
3
2
1
D
GM130
F
***
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
9
*
***
re
g
6
distance between IS and GM130 (μm)
7
Tr
eg
GM130
+T
Tr
eg
-T
re
g
Tr
eg
*
8
7
6
5
4
3
2
1
0
distance between IS and IFN-γ accumulation (μm)
an
tiTG
(is
Fot
-T
β)
yp
re
g
e
co
nt
+
+
ro
Tr
Tr
eg
lA
eg
(T
b)
(A
H/
AP
b
an
C
)
tiTG
Fβ)
b
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
(A
0
-T
re
g
8
-T
re
g
0
Tr
eg
1
+
2
+
3
-T
re
g
4
+
5
Tr
eg
6
distance between IS and secretory machinery (μm)
7
-T
re
g
Tr
eg
***
+
***
distance between IS and secretory machinery (μm)
+
C
+
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Tr
eg
8
+
B
-T
re
g
distance between IS and IFN-γ accumulation (μm)
A
-T
re
g
distance between IS and IFN-γ accumulation (μm)
Figure S4.
***
*
***
Esquerré et al.
Figure S5.
B
+ Treg
c
b
d
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Tr
eg
a
8.0
+
EBV.B cell
IFN-γ
Treg
EBV.B cell
IFN-γ
***
8.5
distance between IS and IFN- γ accumulation (μ m)
- Treg
-T
re
g
A
Esquerré et al.
+
TH
1.10
1.05
1.00
1
1.15
TG
Fβ
1.20
+
1.25
TH
1.30
+
1.35
PC
1.40
TH
1.45
fold increase of CD54 (ICAM-1) MFI on APC surface
1.50
+
1
1.55
PC
TG
Fβ
TH
**
A
+
+
1.60
pu
ls
ed
PC
PC
1.65
A
A
A
A
pu
ls
ed
pu
ls
ed
pu
ls
ed
fold increase of CD40 MFI on APC surface
Figure S6.
B
2.50
***
2.25
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
Esquerré et al.
7
6
5
4
3
2
1
0
co
nt
ac
t
B
no
8
co
nt
ac
t
10
H
9
distance between IS and IFN-γ accumulation (μ m)
DC
Tr
eg
/T
co
nt
ac
t
co
nt
ac
t
distance between IS and IFN-γ accumulation (μ m)
A
no
H
Tr
eg
/T
Figure S7.
B-EBV
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Esquerré et al.
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
102
Discussion générale et Perspectives
Discussion
La fonction suppressive des Treg a dans son ensemble été largement documentée. Par
l’utilisation de modèles in vitro et in vivo, de nombreux mécanismes ont été décrits (Miyara
and Sakaguchi 2007). Il semble à l’heure actuelle qu’il n’existe pas un seul et unique
mécanisme suppresseur, mais différentes stratégies de régulation afin que les Treg puissent
intervenir sur différents types cellulaires, lors de situations physiopathologiques variées ainsi
qu’à des temps différents au cours du développement de la réponse immunitaire (Cf chapitre
« Biologie et potentiel thérapeutique des lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs :
Mécanismes de suppression »). Il a été en effet bien établit dans de nombreux modèles que
les Treg peuvent réguler les phases initiales d’activation des cellules immunitaires et donc,
les phases précoces de la réponse immunitaire (Miyara and Sakaguchi 2007; Roncarolo and
Battaglia 2007). Ainsi, les études réalisées en microscopie biphotonique intravitale utilisent
des cellules T naïves et consistent à regarder l’effet des Treg sur l’activation de lymphocytes
T naïfs interagissant avec des DC au niveau ganglionnaire (Tadokoro et al. 2006; Tang et al.
2006). La régulation des cellules T naïves par les Treg est donc bien mieux documentée que
la régulation des lymphocytes T effecteurs ou TH, qui sont des cellules déjà activées « prêtes
à agir » et qui vont notamment se localiser in vivo au niveau des tissus infectieux et/ou
inflammatoire. L’impact suppresseur des Treg sur une réponse immunitaire déjà bien établie
a été ponctuellement documenté. Le groupe de Powrie a montré dans un modèle murin de
colite inflammatoire que l’injection de Treg pouvait inhiber l’action des infiltrats cellulaires T
pathogéniques et permettre de traiter ainsi la pathologie (Mottet et al. 2003).
Ce type d’approche in vivo permet d’obtenir des données intégrées par rapport à une
situation physiopathologique donnée (pathologies auto-immunes, transplantation d’organes
ou de tissus allogéniques, etc.). Toutefois, on ne peut pas avoir dans ces modèles in vivo,
une idée précise de la dynamique d’interaction entre les différentes cellules immunitaires
(lymphocytes TH, CTL, NK, Treg, CPA, etc.) présentes sur le site de l’infection et/ou de
l’inflammation.
La régulation par les Treg des phases effectrices de la réponse immunitaire, au niveau
tissulaire, soulève encore de nombreuses questions notamment sur les mécanismes
cellulaires et moléculaires employés. Actuellement la plupart des modèles de travail in vivo,
permettent de manière intégrée l’identification d’un mécanisme (induction d’IDO, etc.) ou
bien d’un médiateur soluble (IL-10, TGF-β, etc.). Ils ne permettent toutefois pas d’avoir une
idée précise des interactions cellulaires réalisées au cours du déroulement de la réponse
immunitaire.
Nous avons donc au travers de ce travail voulu essayer d’apporter quelques éléments de
réponse sur l’impact que les Treg pourraient avoir sur la qualité et la dynamique de
l’interaction entre un lymphocyte T CD4+ effecteur et une CPA. Pour cela, nous avons isolé à
103
Discussion générale et Perspectives
partir du sang périphérique humain des lymphocytes T CD4+ CD25- conventionnels en
parallèle de lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs. Les deux populations lymphocytaires
ont ensuite été cultivées et amplifiées de manière polyclonale in vitro afin d’obtenir d’une
part, un nombre suffisant de Treg et d’autre part, des lymphocytes TH déjà activés donc des
cellules T effectrices et non des cellules T naïves. Pour certaines expériences, afin de se
rapprocher d’une interaction plus « physiologique », des DC autologues ont été générées à
partir des monocytes circulants.
Nous avons ensuite réalisé des cocultures et après différents temps, nous avons visualisé
par microscopie confocale la qualité de l’interaction TH/CPA, en présence ou en absence de
Treg. Nous nous sommes notamment concentrés sur des Treg et des lymphocytes TH
interagissant simultanément avec la même CPA.
Nos résultats montrent que les Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des
lymphocytes TH vers les CPA via la production de TGF-β (Figure 24 : schématisation des
résultats obtenus).
La polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH à la SI est une fonction
biologique effectrice clé dans l’aide apportée par les lymphocytes TH aux autres cellules
immunitaires et dans l’amplification sélective de la réponse immunitaire. Cela permet aux
lymphocytes TH d’activer rapidement les CPA (lymphocytes B, DC, etc) et ce, de manière
extrêmement dynamique en se repolarisant vers la CPA offrant le stimulus antigénique
optimal (Depoil et al. 2005; Okada et al. 2005; Huse et al. 2006; Huse et al. 2007).
De manière intégrée, cette fonction effectrice des lymphocytes TH permet d’améliorer
progressivement la qualité et la spécificité de la réponse immunitaire.
L’observation des échantillons fixés par microscopie confocale semble montrer que l’effet
inhibiteur des Treg sur la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH est
maximal, dans le cas où les Treg et les TH interagissent simultanément avec la même CPA.
La visualisation dans la coculture Treg/TH/CPA de conjugués formés seulement par
l’interaction entre une CPA et un lymphocyte TH ne permet pas d’observer une inhibition
aussi marquée. Il est cependant impossible d’exclure qu’au cours de la coculture il n’y ait pas
eu une interaction avec un Treg qui se soit ensuite détacher de la CPA. Nous n’avons
toutefois, au cours de nos observations, pas eu d’évidences quant à la nécessité d’un
contact direct entre les Treg et les lymphocytes TH.
La proximité des trois types cellulaires semble néanmoins importante. Nous avons pu en
effet montré que les Treg doivent s’activer et donc former une SI avec la CPA pour pouvoir
mettre en place leur effet inhibiteur sur la polarisation de la machinerie sécrétoire des
lymphocytes TH. En effet, des expériences réalisées en cinétique ont montré : qu’après 15
minutes de coculture (temps suffisant pour qu’un lymphocyte TH polarise sa machinerie
sécrétoire) l’effet inhibiteur des Treg sur la polarisation des lymphocytes TH n’est pas
104
Discussion générale et Perspectives
détectable alors qu’il est parfaitement observable après 2h30 de coculture et d’interaction
cellulaire. L’obtention de ces données a posé une interrogation sur le mécanisme sousjacent à cet effet suppresseur. En effet, le temps requis pour que les Treg puissent inhiber la
polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH pourrait être dû : au temps
nécessaire à l’activation de ces cellules ou bien, au temps nécessaire au conditionnement
des CPA par les Treg. L’effet des Treg pourrait donc être le résultat d’une action directe sur
les lymphocytes TH ou d’une action indirecte impliquant une régulation de la CPA. Afin de
répondre à cette question, nous avons réalisé des cocultures où les CPA ont été fixées (avec
du paraformaldéhyde 1%) conservant ainsi uniquement la capacité à activer des
lymphocytes T. Nous avons ainsi pu constater que l’effet des Treg sur la polarisation de la
machinerie sécrétoire des lymphocytes TH n’est pas dû à un conditionnement préalable des
CPA par les Treg, mais à une action directe des Treg sur les lymphocytes TH. Afin de
complètement répondre à la question posée, nous avons pré-incubé durant 2h30 des Treg et
des CPA, puis nous avons ajouté à la coculture des lymphocytes TH durant 15 minutes. La
pré-incubation des Treg avec les CPA permet d’observer l’inhibition de la polarisation de la
machinerie sécrétoire après seulement 15 minutes d’interaction entre lymphocytes TH et
CPA. La durée d’interaction requise pour que les Treg puissent altérer la polarisation de la
machinerie sécrétoire des lymphocytes TH reflète donc le temps nécessaire pour leur
activation.
Les travaux utilisant des approches de microscopie biphotonique intravitale chez la souris
confortent nos résultats concernant la non nécessité d’un contact direct Treg/TH (Tadokoro et
al. 2006; Tang et al. 2006). Cependant, ces travaux mettent en évidence que les Treg
altèrent la stabilité des conjugués entre une cellule T naïve et une DC, inhibant ainsi le
« stop signal ». Nous avons au contraire observé que la présence de Treg n’altère pas la
formation des conjugués, ni la mobilisation des stocks intra-cellulaire de calcium des
lymphocytes TH interagissant avec une CPA. Cette différence de résultat entre ces deux
travaux et notre travail peut s’expliquer de plusieurs manières. Tout d’abord, les systèmes
cellulaires que nous avons utilisés sont différents (lymphocytes T CD4+ activés humains par
rapport à des lymphocytes T CD4+ naïfs murins). De plus nous avons mesuré ces
paramètres dans des cultures in vitro en deux dimensions par une technique de cytométrie
en flux, alors qu’ils ont utilisé de la microscopie biphotonique pour visualiser in vivo des
interactions en trois dimensions au niveau d’un ganglion lymphatique.
Néanmoins, nous avons pu observer dans d’autres expériences que lors de la coculture de
lymphocytes TH et de CPA il y avait, en présence de Treg, une inhibition de l’augmentation
du niveau d’expression de la molécule accessoire ICAM-1 qui est normalement induite par
les lymphocytes TH en absence de Treg. ICAM-1 est une molécule d’adhérence importante
favorisant la stabilité des interactions lymphocytes T/CPA. L’augmentation de son niveau
105
Discussion générale et Perspectives
d’expression est le reflet d’une activation de la CPA grâce à la sécrétion polarisée d’IFN-γ
par les lymphocytes TH (il est en effet possible de reproduire cette augmentation du niveau
d’expression de ICAM-1 en traitant des CPA avec de l’IFN-γ recombinant soluble). Il est alors
possible d’imaginer que lors d’une réponse immunitaire, l’inhibition par les Treg de
l’augmentation TH-dépendante du niveau d’expression de la molécule ICAM-1 pourrait altérer
le « stop signal » ainsi que la durée de l’interaction lymphocyte T/CPA, même si cela n’est
pas détectable avec les expériences que nous avons réalisées.
Nous avons également montré que l’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire
des lymphocytes TH par les Treg se fait via la production de TGF-β. En effet, l’addition
d’anticorps anti-TGF-β bloquant à des cocultures Treg/TH/CPA réverse cet effet suppresseur.
Le TGF-β est donc le médiateur clé de cette inhibition de la polarisation des lymphocytes TH
par les Treg. Cela est de plus confirmé par le fait que l’ajout de TGF-β1 recombinant soluble
à une coculture TH/CPA permet de mimer l’action suppressive des Treg sur la polarisation de
la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH. Le temps nécessaire à la mise en place de cet
effet suppresseur dans les cocultures Treg/TH/CPA reflète donc la durée du processus
permettant la sécrétion de TGF-β.
Ces résultats obtenus dans des cocultures in vitro peuvent apparaître en contradiction avec
la littérature qui décrit que l’inhibition de la prolifération et de la production de cytokines des
lymphocytes T CD4+ conventionnels par des Treg nécessite un contact cellulaire et se fait
indépendamment de facteurs solubles (IL-10 et TGF-β). Cependant, en réalisant des
cocultures in vitro à long terme (72h) dans notre système cellulaire, nous avons pu confirmer
les résultats décrits dans la littérature. L’inhibition de la prolifération des lymphocytes TH par
les Treg est effective même après traitement des cultures par un anticorps anti-TGF-β
bloquant.
L’ensemble de ces résultats souligne donc une dualité mécanistique dans l’action des
Treg. D’une part, lors des phases précoces d’interaction cellulaire (co-culture de 2h30), les
Treg inhibent la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH via un
mécanisme dépendant du TGF-β (Figure 24.). D’autre part, durant les phases tardives
d’interaction cellulaire (co-culture de 72h), ils inhibent la prolifération des lymphocytes TH
ainsi que leur production de cytokines, mécanisme n’impliquant pas le TGF-β.
En extrapolant nos résultats in vitro à une réponse immunitaire, il est tentant d’imaginer qu’in
vivo les Treg pourraient ainsi agir rapidement sur des microenvironnements spécifiques au
niveau d’un tissu, en inhibant l’activation par les lymphocytes TH des CPA avec lesquelles ils
interagissent, tout en permettant l’activation d’autres CPA. Cela autoriserait alors une
régulation fine des phases effectrices de la réponse immunitaire et un contrôle précis du
niveau inflammatoire tissulaire. Cette régulation serait de plus rapidement mise en place
106
Discussion générale et Perspectives
après infiltration du tissu infecté et/ou inflammé par les Treg et les différentes cellules
immunitaires effectrices. L’effet suppresseur des Treg ne se ferait alors pas directement de
manière antigène-spécifique. Les CPA présentant les peptides d’intérêt lors d’une réponse
immunitaire serviraient de plateforme de rencontre entre les Treg et les TH présentant un
TCR spécifique pour un des peptides antigéniques d’intérêt. Par la production de médiateurs
solubles ou par la mise en place de mécanismes moléculaires suppresseurs, les Treg
pourraient ainsi favoriser la mise en place d’un environnement immunosuppresseur autour
de cette CPA. Un tel fonctionnement autoriserait également un petit nombre de Treg à
contrôler efficacement un plus grand nombre de cellules T effectrices et plus largement, de
cellules immunitaires effectrices. Il est enfin imaginable que, parallèlement à cet effet
suppresseur concernant l’inhibtion de la polarisation des lymphocytes TH vers les CPA, les
Treg puissent mettre en place via d’autres mécanismes moléculaires une régulation plus
tardive mais également plus ambitieuse concernant l’inhibition transcriptionnelle de la
prolifération et/ou de la production cytokinique des lymphocytes TH. Cette dualité
mécanistique pourrait expliquer la retoudable efficacité des Treg à contrôler le
développement de la réponse immunitaire effectrice à différents stades.
Le groupe de Kuchroo a très récemment démontré in vivo dans un modèle d’EAE qu’il était
nécessaire de contrôler le niveau inflammatoire tissulaire afin d’obtenir une régulation des
cellules T effectrices par les Treg (Korn et al. 2007). En effet, un niveau inflammatoire
tissulaire trop important inhibe l’activité suppressive des Treg. Il est donc tentant d’imaginer
que, par l’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH, et
donc, par l’inhibition de la sécrétion polarisée de cytokines pro-inflammatoires vers les CPA,
les Treg pourraient empêcher l’activation des CPA tissulaires et donc limiter leur production
de cytokines pro-inflammatoires tels que l’IL-1 ou l’IL-6. Au cours de la réponse immunitaire
effectrice, les Treg réguleraient donc rapidement par ce mécanisme l’augmentation du
niveau inflammatoire tissulaire local. Cela permettrait alors aux Treg de contrôler
efficacement et plus tardivement, au niveau tissulaire, les lymphocytes T effecteurs en
mettant en place des mécanismes permettant l’inhibition de leur prolifération et de leur
production cytokinique.
107
Discussion générale et Perspectives
Figure 24. Schématisation des résultats. Durant les premières heures de contact (environ 2h30), les Treg
s’activent grâce à la reconnaissance des SAg bactériens (SEE, TSST-1 et SEB) chargés sur les molécules
de CMH de classe II de la CPA. Cela leur permet de produire du TGF-β. Le TGF-β ainsi produit inhibe la
polarisation de la machinerie sécrétoire du lymphocyte TH interagissant avec la même CPA. La
2+
mobilisation des stocks intracellulaires de calcium ([Ca ]i) et donc la transduction du signal sous
contrôle direct du TCR du lymphocyte TH n’est pas altérée par la présence des Treg durant cette période.
L’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire induit une inhibition de la sécrétion polarisée
des cytokines comme l’IFN-γ et bloque ainsi l’activation de la CPA par le lymphocyte TH. Cela va entre
autre avoir pour conséquence l’inhibition de l’augmentation du niveau d’expression de la molécule
d’adhésion ICAM-1 à la surface de la CPA.
108
Discussion générale et Perspectives
Perspectives
Ce chapitre va décrire deux types de perspectives à ce travail. Dans un premier temps, nous
nous concentrerons sur les perspectives s’inscrivant dans la continuité directe du travail
présenté, comme par exemple la visualisation de la régulation de la polarisation de la
machinerie sécrétoire en temps réel ou bien l’investigation des mécanismes moléculaires
sous-jacents. Dans un deuxième temps, nous présenterons un nouveau projet s’attachant à
l’implication du mécanisme d’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire des
lymphocytes T par les Treg dans les mécanismes d’échappement tumoraux.
•
Perspectives directes au projet :
Visualisation de la régulation de la polarisation de la machinerie sécrétoire en temps réel
L’utilisation de techniques de « time-lapse video microscopy » permettrait de visualiser en
temps réel sur des co-cultures in vitro « la régulation » réalisée par les Treg lors de
l’interaction entre un lymphocyte TH et une CPA (cellule B-EBV ou DC mature autologue).
Ces approches permettraient l’observation de plusieurs paramètres. Tout d’abord, il serait
intéressant d’étudier le comportement migratoire et la capacité des lymphocytes TH à former
des conjugués avec des CPA en présence de Treg. Il a en effet été montré qu’in vivo des
cellules T CD4+ naïves murines en présence de Treg ne peuvent pas former de conjugués
stables avec des DC (Tadokoro et al. 2006; Tang et al. 2006; Tang and Krummel 2006).
Cependant, il n’est pas encore connu si la dynamique d’interaction entre des cellules T CD4+
effectrices déjà activées et des CPA est affectée par les Treg. Il serait donc intéressant par
des approches de « time-lapse video microscopy » d’observer la dynamique de la formation
de la SI de lymphocytes TH vivants interagissant simultanément avec des CPA et des Treg.
La mobilisation des stocks intra-cellulaire de calcium des lymphocytes TH pourrait être
parallèlement suivie en chargeant les cellules avec une sonde : le Fluo-4 (Depoil et al. 2005).
Par des approches similaires, en utilisant des sondes marquant l’appareil de Golgi et le
cytosquelette de tubuline, il serait également possible d’évaluer en temps réel la polarisation
de la machinerie sécrétoire de lymphocytes TH interagissant avec des CPA en présence de
Treg.
Visualisation et étude du rôle de CTLA-4 dans la dynamique d’interaction Treg/TH/CPA
CTLA-4 (CD152) est une molécule cruciale dans l’homéostasie du système immunitaire et
plus généralement de l’organisme. La déficience ou l’altération de CTLA-4 provoque de
façon similaire dans des modèles murins, ainsi que chez des patients, une destruction autoimmune des tissus (Ueda et al. 2003; Sakaguchi 2004). Il a de plus été montré que le
blocage de CTLA-4 lors de tests de suppression in vitro inhibe l’activité suppressive des Treg
109
Discussion générale et Perspectives
(von Boehmer 2005). Il serait donc intéressant d’évaluer l’implication de CTLA-4 sur
l’inhibition par les Treg de la polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH.
Pour analyser cela, nous pourrions traiter des co-cultures Treg/TH/CPA avec un anticorps
monoclonal bloquant anti-CTLA-4 ou bien avec des CTLA-4 Fab. Après 2h30 de co-culture,
nous pourrions visualiser et quantifier par microscopie confocale sur les échantillons fixés la
polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes TH interagissant avec une CPA.
Les résultats obtenus permettraient de déterminer l’implication de la molécule CTLA-4 dans
l’activation des Treg par les CPA et potentiellement la nécessité de cette molécule pour
induire une activation complète des Treg afin qu’ils puissent produire du TGF-β. En effet,
Miyara et Sakaguchi ont récemment suggéré que les molécules CTLA-4 exprimés par les
Treg pourraient interagir avec les molécules CD80 et CD86 à la surface de la CPA,
permettant ainsi de transduire un signal de costimulation (en plus de l’activation via le TCR)
requis pour la mise en place de leur activité suppressive (Miyara and Sakaguchi 2007).
Il serait donc intéressant dans notre système cellulaire, de visualiser par microscopie
confocale si la molécule CTLA-4 va être recrutée à la SI formée entre un Treg et une CPA et,
dans le cas où elle serait recrutée, d’étudier la cinétique de son recrutement à la synapse. Il
serait de plus intéressant d’évaluer l’effet du blocage de CTLA-4 sur la formation de la SI et
sur la stabilité des conjugués Treg/CPA, ainsi que la conséquence sur l’activation des Treg
(mobilisation calcique). Cela pourrait être réalisé de deux manières différentes : par
microscopie confocale sur échantillons fixés (visualisation des molécules caractéristiques de
la SI) ou bien par « time-lapse video microscopy » sur cellules vivantes en chargeant les
Treg avec du Fluo-4 et en les mettant en présence de CPA. Ces paramètres concernant la
mobilisation calcique et la formation des conjugués Treg/CPA pourraient être mesurés à
l’échelle d’une population cellulaire par cytométrie en flux en complément des approches
précédentes.
Enfin, pour aller encore plus loin dans l’exploration de l’implication de CTLA-4 dans l’activité
suppressive des Treg, nous pourrions essayer de visualiser par microscopie confocale
l’induction de l’enzyme IDO dans des DC interagissant avec des Treg. Ainsi nous pourrions
étudier, en fixant les échantillons à différents temps post-culture, la cinétique d’induction
d’IDO dans les DC. Cela permettrait de déterminer si l’inhibition de la polarisation de la
machinerie sécrétoire des lymphocytes TH se fait ou non parallèlement à l’induction d’IDO.
Ces données permettraient de disséquer plus finement la cinétique de mise en place des
mécanismes suppresseurs des Treg.
Identification de la mécanistique moléculaire
Il a récemment été postulé que le statut d’activation de la voie Pi3K/Akt dans les
lymphocytes T effecteurs est un facteur déterminant dans la sensibilité à la suppression
110
Discussion générale et Perspectives
réalisée par les Treg. Des lymphocytes T effecteurs ayant la voie de signalisation Pi3K/Akt
hyperactive sont résistants à l’activité suppressive des Treg (Wohlfert and Clark 2007). Des
lymphocytes T effecteurs étant résistants à la signalisation induite par le TGF-β du fait de
l’expression d’un dnTGF-βRII sont également résistants à l’activité suppressive des Treg
(Fahlen et al. 2005; Mempel et al. 2006).
Le groupe de Georges Bismuth a également montré en 2002 que la Pi3K était recrutée à la
SI entre un lymphocyte T CD4+ et une CPA. Ils ont de plus mis en évidence que l’inhibition
spécifique de la Pi3K n’entraîne ni une altération dans la formation des conjugués, ni une
altération dans la signalisation intracellulaire soutenue (phosphorylations sur tyrosine et
mobilisation des stocks intracellulaires de calcium) (Harriague and Bismuth 2002).
En prenant en compte l’ensemble de ces données, il serait intéressant de réaliser des cocultures Treg/TH/CPA ou TH/CPA, puis de fixer à différents temps les échantillons, les
perméabiliser et réaliser un marquage afin de visualiser par microscopie confocale la Pi3K
(sous-unité p85 ou p110). Nous pourrions ainsi quantifier le recrutement de la Pi3K à la SI
des lymphocytes TH interagissant avec une CPA en présence de Treg.
Dans le cas où les Treg inhiberaient le recrutement de la Pi3K à la SI des lymphocytes TH, il
serait intéressant d’évaluer par microscopie confocale si cette inhibition peut-être corrélée
avec l’inhibition de la polarisation de la machinerie sécrétoire. De plus l’effet du TGF-β sur le
recrutement de la Pi3K à la SI formée entre un lymphocyte TH et une CPA pourrait être tester
en absence de Treg avec l’utilisation de TGF-β1 soluble. Cette approche pourrait de plus
être complétée en traitant des cocultures Treg/TH/CPA avec un anticorps monoclonal
bloquant anti-TGF-β (2G7).
Une approche fonctionnelle intéressante pourra consister à inhiber la phosphatase PTEN
dans des lignées de lymphocytes TH grâce à des siRNA (small interfering RNA) afin de
pouvoir hyperactiver la Pi3K et rendre donc ces cellules résistantes à l’activité régulatrice
des Treg (confirmation par un test classique de suppression in vitro). La coculture de
lymphocytes TH transfectés par des siRNA dirigés contre PTEN avec des Treg et des CPA,
suivie de l’évaluation par microscopie confocale de l’effet des Treg sur la polarisation de la
machinerie sécrétoire de ces lymphocytes TH transfectés, permettra de déterminer si
l’hyperactivation de la Pi3K confère également une résistance à cet effet suppresseur.
111
Discussion générale et Perspectives
•
Inhibition de la polarisation et de la sécrétion cytokinique polarisée des cellules
T effectrices par les Treg : mécanisme potentiellement délétère sur les
réponses immunitaires anti-tumorales
Il est maintenant clairement montré que les Treg exercent un effet néfaste sur
l’immunosurveillance antitumorale. Cependant, les mécanismes impliqués dans la régulation
des cellules T effectrices restent encore peu connus. Nous voudrions, au travers de ce
travail, essayer de déterminer quel importance le mécanisme d’inhibition de la polarisation
des lymphocytes T effecteurs vers les CPA par les Treg que nous avons décrit pourrait jouer
dans l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales. Il a été bien documenté que les
Treg infiltrent les sites tumoraux ainsi que les ganglions lymphatiques drainant le site de la
tumeur solide (Zou 2006). De plus, le rôle du TGF-β dans l’homéostasie ainsi que dans la
fonction des Treg au niveau du microenvironnement tumoral a été bien établit, aussi bien
pour le TGF-β produit par les Treg que le TGF-β produit directement par les cellules
tumorales (Zou 2006; Liu et al. 2007).
De plus, il a été documenté que l’IFN-γ est un coordinateur central dans le développement
des réponses immunitaires anti-tumorales (Kaplan et al. 1998; Dunn et al. 2006). La fixation
de l’IFN-γ sur son récepteur à la surface de la cellule tumorale active la voie de transduction
du signal JAK/STAT et notamment permet la phosphorylation du facteur de transcription
STAT1. Cette phosphorylation de STAT1 (STAT1-P) induit son homodimérisation suivie de
sa translocation nucléaire. Une fois dans le noyau, STAT1-P peut activer, mais également
réprimer, l’expression de nombreux gènes.
L’IFN-γ permet donc, par ses propriétés cytostatiques et antiangiogéniques, de mettre un
frein à la croissance tumorale. Parallèlement, l’IFN-γ augmente l’expression à la surface des
cellules tumorales des molécules du CMH de classe I et de classe II et des molécules
d’adhérence. L’IFN-γ favorise ainsi l’élimination des cellules tumorales par les TIL (CTL et
cellules NK) (Dunn et al. 2006). Soulignant l’importance de cette cytokine dans
l’immunosurveillance antitumorale, des souris IFN-γ-/- présentent une fréquence plus élevée
d’adénocarcinomes pulmonaires, de lymphomes, etc. (Street et al. 2002; Mitra-Kaushik et al.
2004; Dunn et al. 2006). Des souris STAT1-/- présentent quant à elles une forte
augmentation de la fréquence de développement spontané de tumeurs, ainsi qu’une forte
prolifération des cellules tumorales. Des mélanomes présentant une ou plusieurs anomalies
dans la voie de signalisation JAK/STAT ont également une prolifération accrue. Le traitement
de ces cellules par de l’IFN-γ n’induit pas d’inhibition de la croissance tumorale comme pour
des mélanomes ayant une voie de signalisation JAK/STAT normale (Pansky et al. 2000;
Reich and Liu 2006).
112
Discussion générale et Perspectives
L’ensemble de ces éléments indique qu’il serait intéressant d’évaluer l’impact des Treg dans
un contexte tumoral sur la sécrétion polarisée des cytokines aussi bien en utilisant des
lymphocytes TH, que des CTL comme cellules T effectrices. En effet, les lymphocytes TH1 et
les CTL sont deux types de cellules T effectrices ayant la capacité à produire de l’IFN-γ sur le
site de la tumeur. La sécrétion polarisée d’IFN-γ par les lymphocytes TH aura pour
conséquence d’activer sélectivement les CPA présentes au niveau du microenvironnement
tumoral. L’effet des lymphocytes TH sur les cellules tumorales sera donc un effet indirect. Cet
effet aura une grande importance pour contrebalancer la stratégie de nombreuses tumeurs
qui essayent d’installer un environnement tolérogène afin d’inhiber le développement de la
réponse immunitaire. La sécrétion polarisée d’IFN-γ par des CTL spécifiques d’antigènes
tumoraux se fera directement vers les cellules tumorales lors de leur interaction. Nous
utiliserons comme modèle tumoral deux lignées de mélanomes : la lignée D10 et la lignée
HBL.
1. Sécrétion polarisée et sécrétion « bystander » d’IFN-γ par les lymphocytes TH et activation
sélective des CPA dans l’environnement tumoral
L’utilisation de lymphocytes TH permettra d’évaluer l’impact des Treg sur l’inhibition de la
sécrétion polarisée d’IFN-γ par des lymphocytes T CD4+ effecteurs. La production d’IFN-γ par
des lymphocytes TH au niveau du site tumoral est un facteur favorisant l’action des CTL et
des NK. Il sera donc intéressant d’étudier la capture spécifique de l’IFN-γ par une CPA
interagissant avec un lymphocyte TH en présence ou en absence de Treg. La sécrétion
polarisée d’IFN-γ permet l’activation de la CPA avec, entre autre comme conséquence, la
production de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1 ou l’IL-6, qui participent à
l’installation d’un environnement pro-inflammatoire au niveau de la tumeur favorisant ainsi
une réponse immunitaire anti-tumorale active. De plus il a été décrit que l’IL-1 et l’IL-6 ont un
effet antiprolifératif puissant sur certaines lignées de mélanomes (Lazar-Molnar et al. 2000).
La capture spécifique de l’IFN-γ par des CPA interagissant avec des lymphocytes TH sera
évaluée, en présence ou en absence de Treg, en réalisant un marquage intra-cellulaire pour
STAT1-P. Le marquage par immunofluorescence de la forme phosphorylée de STAT1 sur
des conjugués cellulaires fixés Treg/CPA/TH permettra de quantifier l’impact de l’inhibition de
la polarisation des lymphocytes TH sur la sécrétion polarisée des cytokines. Afin de
compléter cette approche nous réaliserons, dans les mêmes conditions de coculture, le
marquage intracellulaire STAT1-P en cytométrie en flux (en ayant marqué au préalable les
CPA afin de pouvoir clairement les identifier).
L’activation de la CPA pourra être également mesurée plus en aval en analysant d’autres
paramètres comme la production d’IL-1 et d’IL-6 par ELISA ou bien en suivant
113
Discussion générale et Perspectives
l’augmentation du niveau d’expression des molécules de CMH ou de molécules accessoires
comme ICAM-1.
Il sera également intéressant d’évaluer par microscopie confocale, sur des échantillons fixés
et perméabilisés, le recrutement à la SI TH/CPA du récepteur à l’IFN-γ (en marquant la
protéine CD119) et ce, en présence ou en absence de Treg.
Parallèlement à cela, il est imaginable que la totalité de l’IFN-γ produit par les lymphocytes
TH ne soit pas capturé par la CPA. L’excédent d’IFN-γ pourrait alors être relargué dans le
milieu environnant et aller se fixer de manière paracrine sur d’autres cellules immunitaires ou
tumorales exprimant le récepteur à l’IFN-γ à leur surface. Par ce mécanisme, les
lymphocytes TH sur le site de la tumeur pourraient, en plus d’orchestrer la réponse
immunitaire antitumorale, agir directement sur les cellules tumorales.
Afin de mettre en place un modèle permettant de répondre à ces questions, nous avons lors
d’expériences préliminaires essayé de confirmer la fonctionnalité de la voie JAK/STAT au
sein de nos deux lignées de mélanomes et donc la capacité de ces cellules tumorales à
mettre en place une réponse biologique suite à une stimulation par de l’IFN-γ.
Nous avons donc dans un premier temps testé la sensibilité de nos lignées de mélanome
D10 et HBL à l’IFN-γ (Cf Figure 1 des « Résultats préliminaires »). Lors d’un traitement
avec de l’IFN-γ soluble durant 15 minutes des mélanomes D10 et HBL, nous pouvons
observer par microscopie confocale la détection de la forme phosphorylée de STAT-1 au
niveau cytoplasmique (noyaux marqué au PI (Propidium iodide, iodure de propidium))
(Figure 1A). STAT1-P n’est pas détectable en absence de traitement par de l’IFN-γ, cela
indique que les deux lignées de mélanomes répondent à l’IFN-γ.
Dans un second temps, pour tester la réponse fonctionnelle des mélanomes HBL et D10,
nous avons cultivé les lignées cellulaires tumorales durant 72h en présence ou en absence
d’IFN-γ soluble. Après culture, nous avons mesuré le niveau d’expression de CD119 et
d’ICAM-1 à la surface des mélanomes D10 et HBL par cytométrie en flux. Nous pouvons
ainsi observer pour les deux lignées de mélanomes : une augmentation du niveau
d’expression d’ICAM-1 (ce qui pourrait potentiellement favoriser la stabilité de l’interaction
CTL/mélanomes) parallèlement à une diminution de l’expression de CD119 (internalisation
du récepteur à l’IFN-γ en réponse à la fixation de la cytokine) (Figure 1B).
Pour évaluer, de manière préliminaire, l’importance de la production « bystander » d’IFN-γ
par des lymphocytes TH sur des cellules tumorales, nous avons cocultivé des mélanomes de
la lignée D10 avec des lymphocytes TH activés de manière polyclonale (par des billes antiCD3/CD28). Après 72h, nous avons mesuré comme précédemment par cytométrie en flux le
niveau d’expression des molécules ICAM-1 et CD119. De manière intéressante, nous avons
obtenu des résultats similaires à ceux obtenus avec de l’IFN-γ soluble (Figure 1C). Nous
114
Discussion générale et Perspectives
avons également testé lors de cette expérience si le traitement des cultures par un anticorps
bloquant anti-TGF-β (2G7) pourrait potentiellement influencer l’effet de l’IFN-γ. En effet, dans
le cas où les mélanomes D10 produiraient du TGF-β, cela pourrait potentiellement avoir une
influence sur la sécrétion d’IFN-γ. Lors de cette expérience, le traitement des cocultures par
du 2G7 n’a pas altéré la réponse des mélanomes de la lignée D10 à la production d’IFN-γ
par les lymphocytes TH.
2. Impact des Treg sur l’interaction CTL/cellule tumorale :
Dans une seconde partie, nous appliquerons les approches décrites précédemment à des
CTL spécifiques d’antigènes tumoraux interagissant avec des mélanomes en présence ou
en absence de Treg (activés polyclonalement par des CPA ou par des billes antiCD3/CD28). Parallèlement, le traitement de cocultures CTL/mélanomes par du TGF-β1
soluble sera réalisé afin d’évaluer l’impact direct de cette cytokine sur la sécrétion polarisée
des CTL.
Un autre aspect de ce travail consistera à évaluer l’impact de la production de TGF-β par les
cellules tumorales sur la polarisation de la machinerie sécrétoire de CTL spécifiques. Afin de
répondre à cette question, nous sélectionnerons les cellules tumorales sur leur capacité à
produire du TGF-β, en analysant par ELISA les surnageants de culture.
Les CTL seront cocultivés avec les cellules sélectionnées en présence ou en absence
d’anticorps bloquant anti-TGF-β. La sécrétion polarisée des cytokines par les CTL, mais
également, l’activation de la voie de signalisation de STAT1, sera évaluée par microscopie
confocale et par cytométrie en flux.
Le rôle que pourraient jouer les Treg en amplifiant l’inhibition déjà induite par la production
tumorale de TGF-β, grâce à leur propre sécrétion de TGF-β sera testé en rajoutant aux
cocultures des Treg activés de manière polyclonale.
Afin de faciliter la compréhension de ce projet visant à étudier l’impact de l’inhibition de la
polarisation de la machinerie sécrétoire des lymphocytes T effecteurs par les Treg, les
différentes questions posées ont été schématisées sur la Figure 25 ci-après (page 112).
Chaque point d’interrogation représente une question soulevée précédemment.
115
Discussion générale et Perspectives
116
Résultats préliminaires
Figure 1. Les lignées de mélanomes HBL et D10 répondent à un stimulus pro-inflammatoire : l’IFN-γ. (A) Les lignées de
mélanomes HBL et D10 ont été traitées (Ab, Ad, Af, Ah) ou non (Aa, Ac, Ae, Ag) avec de l’IFN-γ soluble (2000 UI/ml)
pendant 15 minutes à 37°C. Les noyaux ont été marqués au PI (rouge) afin de visualiser la localisation intra-cellulaire
de la forme phosphorylée du facteur de transcription STAT1 (en vert). (B) Les lignées de mélanomes ont été cultivées
en présence ou en absence d’IFN-γ soluble (2000 UI/ml) durant 72h. Les niveaux d’expression de CD119 (IFN-γR1) et de
la molécule d’adhésion ICAM-1 ont ensuite été mesurés. (C) Co-culture de mélanomes D10 en présence ou en absence
de lymphocytes TH. Certaines cultures ont été traitées avec un anticorps bloquant anti-TGF-β. Après 72h de culture, les
niveaux d’expression de CD119 et ICAM-1 ont été mesurés.
117
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
118
Références Bibliographiques
Afkarian, M., J. R. Sedy, J. Yang, N. G. Jacobson, N. Cereb, S. Y. Yang, T. L. Murphy and K.
M. Murphy (2002). "T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive
CD4+ T cells." Nat Immunol 3(6): 549-57.
Ahmadzadeh, M. and S. A. Rosenberg (2006). "IL-2 administration increases CD4+ CD25(hi)
Foxp3+ regulatory T cells in cancer patients." Blood 107(6): 2409-14.
Alam, S. M., P. J. Travers, J. L. Wung, W. Nasholds, S. Redpath, S. C. Jameson and N. R.
Gascoigne (1996). "T-cell-receptor affinity and thymocyte positive selection." Nature
381(6583): 616-20.
Alarcon, B., B. Berkhout, J. Breitmeyer and C. Terhorst (1988). "Assembly of the human T
cell receptor-CD3 complex takes place in the endoplasmic reticulum and involves
intermediary complexes between the CD3-gamma.delta.epsilon core and single T cell
receptor alpha or beta chains." J Biol Chem 263(6): 2953-61.
Alarcon, B., M. Swamy, H. M. van Santen and W. W. Schamel (2006). "T-cell antigenreceptor stoichiometry: pre-clustering for sensitivity." EMBO Rep 7(5): 490-5.
Aluvihare, V. R., M. Kallikourdis and A. G. Betz (2004). "Regulatory T cells mediate maternal
tolerance to the fetus." Nat Immunol 5(3): 266-71.
Aluvihare, V. R., M. Kallikourdis and A. G. Betz (2005). "Tolerance, suppression and the fetal
allograft." J Mol Med 83(2): 88-96.
Anderson, M. S., E. S. Venanzi, L. Klein, Z. Chen, S. P. Berzins, S. J. Turley, H. von
Boehmer, R. Bronson, A. Dierich, C. Benoist and D. Mathis (2002). "Projection of an
immunological self shadow within the thymus by the aire protein." Science 298(5597):
1395-401.
Annacker, O., R. Pimenta-Araujo, O. Burlen-Defranoux, T. C. Barbosa, A. Cumano and A.
Bandeira (2001). "CD25+ CD4+ T cells regulate the expansion of peripheral CD4 T
cells through the production of IL-10." J Immunol 166(5): 3008-18.
Annes, J. P., Y. Chen, J. S. Munger and D. B. Rifkin (2004). "Integrin alphaVbeta6-mediated
activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1." J Cell
Biol 165(5): 723-34.
Anton van der Merwe, P., S. J. Davis, A. S. Shaw and M. L. Dustin (2000). "Cytoskeletal
polarization and redistribution of cell-surface molecules during T cell antigen
recognition." Semin Immunol 12(1): 5-21.
Apostolou, I., A. Sarukhan, L. Klein and H. von Boehmer (2002). "Origin of regulatory T cells
with known specificity for antigen." Nat Immunol 3(8): 756-63.
Arcaro, A., C. Gregoire, N. Boucheron, S. Stotz, E. Palmer, B. Malissen and I. F. Luescher
(2000). "Essential role of CD8 palmitoylation in CD8 coreceptor function." J Immunol
165(4): 2068-76.
119
Références Bibliographiques
Arden, B., S. P. Clark, D. Kabelitz and T. W. Mak (1995). "Human T-cell receptor variable
gene segment families." Immunogenetics 42(6): 455-500.
Ardern-Jones, M. R., A. P. Black, E. A. Bateman and G. S. Ogg (2007). "Bacterial
superantigen facilitates epithelial presentation of allergen to T helper 2 cells." Proc
Natl Acad Sci U S A 104(13): 5557-62.
Azuma, T., T. Takahashi, A. Kunisato, T. Kitamura and H. Hirai (2003). "Human CD4+
CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions." Cancer Res 63(15): 4516-20.
Bacchetta, R., L. Passerini, E. Gambineri, M. Dai, S. E. Allan, L. Perroni, F. Dagna-Bricarelli,
C. Sartirana, S. Matthes-Martin, A. Lawitschka, C. Azzari, S. F. Ziegler, M. K. Levings
and M. G. Roncarolo (2006). "Defective regulatory and effector T cell functions in
patients with FOXP3 mutations." J Clin Invest 116(6): 1713-22.
Baecher-Allan, C., E. Wolf and D. A. Hafler (2006). "MHC class II expression identifies
functionally distinct human regulatory T cells." J Immunol 176(8): 4622-31.
Balamuth, F., J. L. Brogdon and K. Bottomly (2004). "CD4 raft association and signaling
regulate molecular clustering at the immunological synapse site." J Immunol 172(10):
5887-92.
Battaglia, M., A. Stabilini, B. Migliavacca, J. Horejs-Hoeck, T. Kaupper and M. G. Roncarolo
(2006).
"Rapamycin
promotes
expansion
of
functional
CD4+CD25+FOXP3+
regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients." J Immunol
177(12): 8338-47.
Battaglia, M., A. Stabilini and M. G. Roncarolo (2005). "Rapamycin selectively expands
CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells." Blood 105(12): 4743-8.
Beals, C. R., C. M. Sheridan, C. W. Turck, P. Gardner and G. R. Crabtree (1997). "Nuclear
export of NF-ATc enhanced by glycogen synthase kinase-3." Science 275(5308):
1930-4.
Belkaid, Y., R. B. Blank and I. Suffia (2006). "Natural regulatory T cells and parasites: a
common quest for host homeostasis." Immunol Rev 212: 287-300.
Belkaid, Y., C. A. Piccirillo, S. Mendez, E. M. Shevach and D. L. Sacks (2002). "CD4+CD25+
regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity." Nature
420(6915): 502-7.
Belkaid, Y. and B. T. Rouse (2005). "Natural regulatory T cells in infectious disease." Nat
Immunol 6(4): 353-60.
Bennett, C. L., J. Christie, F. Ramsdell, M. E. Brunkow, P. J. Ferguson, L. Whitesell, T. E.
Kelly, F. T. Saulsbury, P. F. Chance and H. D. Ochs (2001). "The immune
dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused
by mutations of FOXP3." Nat Genet 27(1): 20-1.
120
Références Bibliographiques
Benoist, C. and D. Mathis (1989). "Positive selection of the T cell repertoire: where and when
does it occur?" Cell 58(6): 1027-33.
Benvenuti, F., C. Lagaudriere-Gesbert, I. Grandjean, C. Jancic, C. Hivroz, A. Trautmann, O.
Lantz and S. Amigorena (2004). "Dendritic cell maturation controls adhesion, synapse
formation, and the duration of the interactions with naive T lymphocytes." J Immunol
172(1): 292-301.
Beresford, P. J., D. Zhang, D. Y. Oh, Z. Fan, E. L. Greer, M. L. Russo, M. Jaju and J.
Lieberman (2001). "Granzyme A activates an endoplasmic reticulum-associated
caspase-independent nuclease to induce single-stranded DNA nicks." J Biol Chem
276(46): 43285-93.
Berg, L. J., A. M. Pullen, B. Fazekas de St Groth, D. Mathis, C. Benoist and M. M. Davis
(1989). "Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in
the presence of their MHC ligand." Cell 58(6): 1035-46.
Bettelli, E., Y. Carrier, W. Gao, T. Korn, T. B. Strom, M. Oukka, H. L. Weiner and V. K.
Kuchroo (2006). "Reciprocal developmental pathways for the generation of
pathogenic effector TH17 and regulatory T cells." Nature 441(7090): 235-8.
Bevan, M. J. (1977). "In a radiation chimaera, host H-2 antigens determine immune
responsiveness of donor cytotoxic cells." Nature 269(5627): 417-8.
Bevan, M. J. (2004). "Helping the CD8(+) T-cell response." Nat Rev Immunol 4(8): 595-602.
Bi, K., Y. Tanaka, N. Coudronniere, K. Sugie, S. Hong, M. J. van Stipdonk and A. Altman
(2001). "Antigen-induced translocation of PKC-theta to membrane rafts is required for
T cell activation." Nat Immunol 2(6): 556-63.
Billadeau, D. D., J. C. Nolz and T. S. Gomez (2007). "Regulation of T-cell activation by the
cytoskeleton." Nat Rev Immunol 7(2): 131-43.
Bleesing, J. J., M. R. Brown, S. E. Straus, J. K. Dale, R. M. Siegel, M. Johnson, M. J.
Lenardo, J. M. Puck and T. A. Fleisher (2001). "Immunophenotypic profiles in families
with autoimmune lymphoproliferative syndrome." Blood 98(8): 2466-73.
Boissonnas, A., L. Fetler, I. S. Zeelenberg, S. Hugues and S. Amigorena (2007). "In vivo
imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor." J Exp Med
204(2): 345-56.
Boniface, J. J., J. D. Rabinowitz, C. Wulfing, J. Hampl, Z. Reich, J. D. Altman, R. M. Kantor,
C. Beeson, H. M. McConnell and M. M. Davis (1998). "Initiation of signal transduction
through the T cell receptor requires the multivalent engagement of peptide/MHC
ligands [corrected]." Immunity 9(4): 459-66.
Bousso, P., N. R. Bhakta, R. S. Lewis and E. Robey (2002). "Dynamics of thymocyte-stromal
cell interactions visualized by two-photon microscopy." Science 296(5574): 1876-80.
121
Références Bibliographiques
Bousso, P. and E. Robey (2003). "Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in
intact lymph nodes." Nat Immunol 4(6): 579-85.
Bousso, P. and E. A. Robey (2004). "Dynamic behavior of T cells and thymocytes in
lymphoid organs as revealed by two-photon microscopy." Immunity 21(3): 349-55.
Bretscher, M. S. (1973). "Membrane structure: some general principles." Science 181(100):
622-9.
Brossard, C., V. Feuillet, A. Schmitt, C. Randriamampita, M. Romao, G. Raposo and A.
Trautmann (2005). "Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse." Eur J
Immunol 35(6): 1741-53.
Brunkow, M. E., E. W. Jeffery, K. A. Hjerrild, B. Paeper, L. B. Clark, S. A. Yasayko, J. E.
Wilkinson, D. Galas, S. F. Ziegler and F. Ramsdell (2001). "Disruption of a new
forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder
of the scurfy mouse." Nat Genet 27(1): 68-73.
Burack, W. R., K. H. Lee, A. D. Holdorf, M. L. Dustin and A. S. Shaw (2002). "Cutting edge:
quantitative imaging of raft accumulation in the immunological synapse." J Immunol
169(6): 2837-41.
Call, M. E., J. Pyrdol, M. Wiedmann and K. W. Wucherpfennig (2002). The organizing
principle in the formation of the T cell receptor-CD3 complex. Cell. 111: 967-79.
Call, M. E. and K. W. Wucherpfennig (2005). "The T cell receptor: critical role of the
membrane environment in receptor assembly and function." Annu Rev Immunol 23:
101-25.
Celli, S., Z. Garcia and P. Bousso (2005). "CD4 T cells integrate signals delivered during
successive DC encounters in vivo." J Exp Med 202(9): 1271-8.
Chang, J. T., V. R. Palanivel, I. Kinjyo, F. Schambach, A. M. Intlekofer, A. Banerjee, S. A.
Longworth, K. E. Vinup, P. Mrass, J. Oliaro, N. Killeen, J. S. Orange, S. M. Russell,
W. Weninger and S. L. Reiner (2007). "Asymmetric T lymphocyte division in the
initiation of adaptive immune responses." Science 315(5819): 1687-91.
Chatila, T. A. (2005). "Role of regulatory T cells in human diseases." J Allergy Clin Immunol
116(5): 949-59; quiz 960.
Chatila, T. A., F. Blaeser, N. Ho, H. M. Lederman, C. Voulgaropoulos, C. Helms and A. M.
Bowcock (2000). "JM2, encoding a fork head-related protein, is mutated in X-linked
autoimmunity-allergic disregulation syndrome." J Clin Invest 106(12): R75-81.
Chen, M. L., M. J. Pittet, L. Gorelik, R. A. Flavell, R. Weissleder, H. von Boehmer and K.
Khazaie (2005). Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity
through TGF-beta signals in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 419-24.
Chen, W., W. Jin, N. Hardegen, K. J. Lei, L. Li, N. Marinos, G. McGrady and S. M. Wahl
(2003). "Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+
122
Références Bibliographiques
regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3." J Exp Med
198(12): 1875-86.
Chothia, C., D. R. Boswell and A. M. Lesk (1988). "The outline structure of the T-cell alpha
beta receptor." Embo J 7(12): 3745-55.
Clevers, H., B. Alarcon, T. Wileman and C. Terhorst (1988). "The T cell receptor/CD3
complex: a dynamic protein ensemble." Annu Rev Immunol 6: 629-62.
Cohen, J. L., A. Trenado, D. Vasey, D. Klatzmann and B. L. Salomon (2002).
"CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host
disease." J Exp Med 196(3): 401-6.
Coombes, J. L., K. R. Siddiqui, C. V. Arancibia-Carcamo, J. Hall, C. M. Sun, Y. Belkaid and
F. Powrie (2007). "A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs
induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-{beta} and retinoic acid dependent
mechanism." J Exp Med 204(8): 1757-64.
Coombs, D., A. M. Kalergis, S. G. Nathenson, C. Wofsy and B. Goldstein (2002). "Activated
TCRs remain marked for internalization after dissociation from pMHC." Nat Immunol
3(10): 926-31.
Crawford, S. E., V. Stellmach, J. E. Murphy-Ullrich, S. M. Ribeiro, J. Lawler, R. O. Hynes, G.
P. Boivin and N. Bouck (1998). "Thrombospondin-1 is a major activator of TGF-beta1
in vivo." Cell 93(7): 1159-70.
Curiel, T. J. (2007). "Tregs and rethinking cancer immunotherapy." J Clin Invest 117(5):
1167-74.
Cyster, J. G., D. M. Shotton and A. F. Williams (1991). "The dimensions of the T lymphocyte
glycoprotein leukosialin and identification of linear protein epitopes that can be
modified by glycosylation." Embo J 10(4): 893-902.
D'Oro, U., K. Sakaguchi, E. Appella and J. D. Ashwell (1996). "Mutational analysis of Lck in
CD45-negative T cells: dominant role of tyrosine 394 phosphorylation in kinase
activity." Mol Cell Biol 16(9): 4996-5003.
Davidson, T. S., R. J. DiPaolo, J. Andersson and E. M. Shevach (2007). "Cutting Edge: IL-2
is essential for TGF-beta-mediated induction of Foxp3+ T regulatory cells." J Immunol
178(7): 4022-6.
Davis, M. M., J. J. Boniface, Z. Reich, D. Lyons, J. Hampl, B. Arden and Y. Chien (1998).
"Ligand recognition by alpha beta T cell receptors." Annu Rev Immunol 16: 523-44.
Davis, S. J. and P. A. van der Merwe (1996). "The structure and ligand interactions of CD2:
implications for T-cell function." Immunol Today 17(4): 177-87.
Davis, S. J. and P. A. van der Merwe (2006). "The kinetic-segregation model: TCR triggering
and beyond." Nat Immunol 7(8): 803-9.
123
Références Bibliographiques
Delon, J., C. Gregoire, B. Malissen, S. Darche, F. Lemaitre, P. Kourilsky, J. P. Abastado and
A. Trautmann (1998). "CD8 expression allows T cell signaling by monomeric peptideMHC complexes." Immunity 9(4): 467-73.
Delon, J., K. Kaibuchi and R. N. Germain (2001). "Exclusion of CD43 from the immunological
synapse is mediated by phosphorylation-regulated relocation of the cytoskeletal
adaptor moesin." Immunity 15(5): 691-701.
Demotz, S., H. M. Grey and A. Sette (1990). "The minimal number of class II MHC-antigen
complexes needed for T cell activation." Science 249(4972): 1028-30.
Depoil, D., R. Zaru, M. Guiraud, A. Chauveau, J. Harriague, G. Bismuth, C. Utzny, S. Muller
and S. Valitutti (2005). "Immunological synapses are versatile structures enabling
selective T cell polarization." Immunity 22(2): 185-94.
Derynck, R., R. J. Akhurst and A. Balmain (2001). "TGF-beta signaling in tumor suppression
and cancer progression." Nat Genet 29(2): 117-29.
Dohlsten, M., G. Hedlund, E. Akerblom, P. A. Lando and T. Kalland (1991). "Monoclonal
antibody-targeted superantigens: a different class of anti-tumor agents." Proc Natl
Acad Sci U S A 88(20): 9287-91.
Dong, C. (2006). "Diversification of T-helper-cell lineages: finding the family root of IL-17producing cells." Nat Rev Immunol 6(4): 329-33.
Dong, C., R. J. Davis and R. A. Flavell (2002). "MAP kinases in the immune response." Annu
Rev Immunol 20: 55-72.
Donnadieu, E., G. Bismuth and A. Trautmann (1994). "Antigen recognition by helper T cells
elicits a sequence of distinct changes of their shape and intracellular calcium." Curr
Biol 4(7): 584-95.
Doucey, M. A., D. F. Legler, M. Faroudi, N. Boucheron, P. Baumgaertner, D. Naeher, M.
Cebecauer, D. Hudrisier, C. Ruegg, E. Palmer, S. Valitutti, C. Bron and I. F. Luescher
(2003). "The beta1 and beta3 integrins promote T cell receptor-mediated cytotoxic T
lymphocyte activation." J Biol Chem 278(29): 26983-91.
Dumont, N. and C. L. Arteaga (2003). "Targeting the TGF beta signaling network in human
neoplasia." Cancer Cell 3(6): 531-6.
Dunn, G. P., C. M. Koebel and R. D. Schreiber (2006). "Interferons, immunity and cancer
immunoediting." Nat Rev Immunol 6(11): 836-48.
Dustin, M. L. (2005). "A dynamic view of the immunological synapse." Semin Immunol 17(6):
400-10.
Ebinu, J. O., S. L. Stang, C. Teixeira, D. A. Bottorff, J. Hooton, P. M. Blumberg, M. Barry, R.
C. Bleakley, H. L. Ostergaard and J. C. Stone (2000). "RasGRP links T-cell receptor
signaling to Ras." Blood 95(10): 3199-203.
124
Références Bibliographiques
Ehehalt, R., P. Keller, C. Haass, C. Thiele and K. Simons (2003). "Amyloidogenic processing
of the Alzheimer beta-amyloid precursor protein depends on lipid rafts." J Cell Biol
160(1): 113-23.
Fabre, S., V. Lang, J. Harriague, A. Jobart, T. G. Unterman, A. Trautmann and G. Bismuth
(2005). "Stable activation of phosphatidylinositol 3-kinase in the T cell immunological
synapse stimulates Akt signaling to FoxO1 nuclear exclusion and cell growth control."
J Immunol 174(7): 4161-71.
Fahlen, L., S. Read, L. Gorelik, S. D. Hurst, R. L. Coffman, R. A. Flavell and F. Powrie
(2005). "T cells that cannot respond to TGF-beta escape control by CD4(+)CD25(+)
regulatory T cells." J Exp Med 201(5): 737-46.
Fallarino, F., U. Grohmann, K. W. Hwang, C. Orabona, C. Vacca, R. Bianchi, M. L.
Belladonna, M. C. Fioretti, M. L. Alegre and P. Puccetti (2003). "Modulation of
tryptophan catabolism by regulatory T cells." Nat Immunol 4(12): 1206-12.
Fallarino, F., U. Grohmann, S. You, B. C. McGrath, D. R. Cavener, C. Vacca, C. Orabona, R.
Bianchi, M. L. Belladonna, C. Volpi, P. Santamaria, M. C. Fioretti and P. Puccetti
(2006). "The combined effects of tryptophan starvation and tryptophan catabolites
down-regulate T cell receptor zeta-chain and induce a regulatory phenotype in naive
T cells." J Immunol 176(11): 6752-61.
Fantini, M. C., C. Becker, G. Monteleone, F. Pallone, P. R. Galle and M. F. Neurath (2004).
"Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells
through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7." J Immunol 172(9): 5149-53.
Fantini, M. C., S. Dominitzki, A. Rizzo, M. F. Neurath and C. Becker (2007). "In vitro
generation of CD4+ CD25+ regulatory cells from murine naive T cells." Nat Protoc
2(7): 1789-94.
Faroudi, M., C. Utzny, M. Salio, V. Cerundolo, M. Guiraud, S. Muller and S. Valitutti (2003).
"Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell interaction:
manifestation of a dual activation threshold." Proc Natl Acad Sci U S A 100(24):
14145-50.
Faroudi, M., R. Zaru, P. Paulet, S. Muller and S. Valitutti (2003). "Cutting edge: T lymphocyte
activation by repeated immunological synapse formation and intermittent signaling." J
Immunol 171(3): 1128-32.
Fernandez-Miguel, G., B. Alarcon, A. Iglesias, H. Bluethmann, M. Alvarez-Mon, E. Sanz and
A. de la Hera (1999). "Multivalent structure of an alphabetaT cell receptor." Proc Natl
Acad Sci U S A 96(4): 1547-52.
Feske, S., J. Giltnane, R. Dolmetsch, L. M. Staudt and A. Rao (2001). "Gene regulation
mediated by calcium signals in T lymphocytes." Nat Immunol 2(4): 316-24.
125
Références Bibliographiques
Filer, A., C. Pitzalis and C. D. Buckley (2006). "Targeting the stromal microenvironment in
chronic inflammation." Curr Opin Pharmacol 6(4): 393-400.
Fink, P. J. and M. J. Bevan (1978). "H-2 antigens of the thymus determine lymphocyte
specificity." J Exp Med 148(3): 766-75.
Fontenot, J. D., J. P. Rasmussen, M. A. Gavin and A. Y. Rudensky (2005). "A function for
interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells." Nat Immunol 6(11): 1142-51.
Fontenot, J. D., J. P. Rasmussen, L. M. Williams, J. L. Dooley, A. G. Farr and A. Y.
Rudensky (2005). "Regulatory T cell lineage specification by the forkhead
transcription factor foxp3." Immunity 22(3): 329-41.
Fontenot, J. D. and A. Y. Rudensky (2005). "A well adapted regulatory contrivance:
regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3." Nat
Immunol 6(4): 331-7.
Fragoso, R., D. Ren, X. Zhang, M. W. Su, S. J. Burakoff and Y. J. Jin (2003). "Lipid raft
distribution of CD4 depends on its palmitoylation and association with Lck, and
evidence for CD4-induced lipid raft aggregation as an additional mechanism to
enhance CD3 signaling." J Immunol 170(2): 913-21.
Friedl, P., A. T. den Boer and M. Gunzer (2005). "Tuning immune responses: diversity and
adaptation of the immunological synapse." Nat Rev Immunol 5(7): 532-45.
Furukawa, T., M. Itoh, N. X. Krueger, M. Streuli and H. Saito (1994). "Specific interaction of
the CD45 protein-tyrosine phosphatase with tyrosine-phosphorylated CD3 zeta
chain." Proc Natl Acad Sci U S A 91(23): 10928-32.
Gabrilovich, D. I., H. L. Chen, K. R. Girgis, H. T. Cunningham, G. M. Meny, S. Nadaf, D.
Kavanaugh and D. P. Carbone (1996). "Production of vascular endothelial growth
factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells." Nat Med
2(10): 1096-103.
Game, D. S., M. P. Hernandez-Fuentes and R. I. Lechler (2005). "Everolimus and
basiliximab permit suppression by human CD4+CD25+ cells in vitro." Am J
Transplant 5(3): 454-64.
Garcia, K. C., M. Degano, R. L. Stanfield, A. Brunmark, M. R. Jackson, P. A. Peterson, L.
Teyton and I. A. Wilson (1996). "An alphabeta T cell receptor structure at 2.5 A and
its orientation in the TCR-MHC complex." Science 274(5285): 209-19.
Gavin, M. A., T. R. Torgerson, E. Houston, P. DeRoos, W. Y. Ho, A. Stray-Pedersen, E. L.
Ocheltree, P. D. Greenberg, H. D. Ochs and A. Y. Rudensky (2006). "Single-cell
analysis of normal and FOXP3-mutant human T cells: FOXP3 expression without
regulatory T cell development." Proc Natl Acad Sci U S A 103(17): 6659-64.
126
Références Bibliographiques
Geissmann, F., T. O. Cameron, S. Sidobre, N. Manlongat, M. Kronenberg, M. J. Briskin, M.
L. Dustin and D. R. Littman (2005). "Intravascular immune surveillance by CXCR6+
NKT cells patrolling liver sinusoids." PLoS Biol 3(4): e113.
Ghiringhelli, F., C. Menard, M. Terme, C. Flament, J. Taieb, N. Chaput, P. E. Puig, S.
Novault, B. Escudier, E. Vivier, A. Lecesne, C. Robert, J. Y. Blay, J. Bernard, S.
Caillat-Zucman, A. Freitas, T. Tursz, O. Wagner-Ballon, C. Capron, W. Vainchencker,
F. Martin and L. Zitvogel (2005). "CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit natural killer
cell functions in a transforming growth factor-beta-dependent manner." J Exp Med
202(8): 1075-85.
Gil, D., W. W. Schamel, M. Montoya, F. Sanchez-Madrid and B. Alarcon (2002).
"Recruitment of Nck by CD3 epsilon reveals a ligand-induced conformational change
essential for T cell receptor signaling and synapse formation." Cell 109(7): 901-12.
Godfrey, D. I., J. Kennedy, T. Suda and A. Zlotnik (1993). "A developmental pathway
involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression." J
Immunol 150(10): 4244-52.
Godfrey, V. L., J. E. Wilkinson and L. B. Russell (1991). "X-linked lymphoreticular disease in
the scurfy (sf) mutant mouse." Am J Pathol 138(6): 1379-87.
Godfrey, W. R., Y. G. Ge, D. J. Spoden, B. L. Levine, C. H. June, B. R. Blazar and S. B.
Porter (2004). "In vitro-expanded human CD4(+)CD25(+) T-regulatory cells can
markedly inhibit allogeneic dendritic cell-stimulated MLR cultures." Blood 104(2): 45361.
Goldsmith, M. A. and A. Weiss (1988). "Early signal transduction by the antigen receptor
without commitment to T cell activation." Science 240(4855): 1029-31.
Golovkina, T. V., A. Chervonsky, J. P. Dudley and S. R. Ross (1992). "Transgenic mouse
mammary tumor virus superantigen expression prevents viral infection." Cell 69(4):
637-45.
Gondek, D. C., L. F. Lu, S. A. Quezada, S. Sakaguchi and R. J. Noelle (2005). "Cutting edge:
contact-mediated suppression by CD4+CD25+ regulatory cells involves a granzyme
B-dependent, perforin-independent mechanism." J Immunol 174(4): 1783-6.
Gorelik, L. and R. A. Flavell (2000). "Abrogation of TGFbeta signaling in T cells leads to
spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease." Immunity 12(2): 171-81.
Grakoui, A., S. K. Bromley, C. Sumen, M. M. Davis, A. S. Shaw, P. M. Allen and M. L. Dustin
(1999). "The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell
activation." Science 285(5425): 221-7.
127
Références Bibliographiques
Grohmann, U., C. Orabona, F. Fallarino, C. Vacca, F. Calcinaro, A. Falorni, P. Candeloro, M.
L. Belladonna, R. Bianchi, M. C. Fioretti and P. Puccetti (2002). "CTLA-4-Ig regulates
tryptophan catabolism in vivo." Nat Immunol 3(11): 1097-101.
Gross, D. A., M. Leboeuf, B. Gjata, O. Danos and J. Davoust (2003). "CD4+CD25+
regulatory T cells inhibit immune-mediated transgene rejection." Blood 102(13): 43268.
Grossman, W. J., J. W. Verbsky, W. Barchet, M. Colonna, J. P. Atkinson and T. J. Ley
(2004). "Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous
target cell death." Immunity 21(4): 589-601.
Guillonneau, C., M. Hill, F. X. Hubert, E. Chiffoleau, C. Herve, X. L. Li, M. Heslan, C. Usal, L.
Tesson, S. Menoret, A. Saoudi, B. Le Mauff, R. Josien, M. C. Cuturi and I. Anegon
(2007). "CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC
T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase." J Clin Invest 117(4): 1096106.
Hanash, A. M. and R. B. Levy (2005). "Donor CD4+CD25+ T cells promote engraftment and
tolerance following MHC-mismatched hematopoietic cell transplantation." Blood
105(4): 1828-36.
Harriague, J. and G. Bismuth (2002). "Imaging antigen-induced PI3K activation in T cells."
Nat Immunol 3(11): 1090-6.
Harrington, L. E., R. D. Hatton, P. R. Mangan, H. Turner, T. L. Murphy, K. M. Murphy and C.
T. Weaver (2005). "Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a
lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages." Nat Immunol 6(11): 112332.
Henkart, M. P. and P. A. Henkart (1982). "Lymphocyte mediated cytolysis as a secretory
phenomenon." Adv Exp Med Biol 146: 227-47.
Heusel, J. W., R. L. Wesselschmidt, S. Shresta, J. H. Russell and T. J. Ley (1994).
"Cytotoxic lymphocytes require granzyme B for the rapid induction of DNA
fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells." Cell 76(6): 977-87.
Hopfield, J. J. (1974). "Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in
biosynthetic processes requiring high specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 71(10):
4135-9.
Hori, S., T. Nomura and S. Sakaguchi (2003). "Control of regulatory T cell development by
the transcription factor Foxp3." Science 299(5609): 1057-61.
Hsieh, C. S., S. E. Macatonia, C. S. Tripp, S. F. Wolf, A. O'Garra and K. M. Murphy (1993).
"Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced
macrophages." Science 260(5107): 547-9.
128
Références Bibliographiques
Huang, C. T., C. J. Workman, D. Flies, X. Pan, A. L. Marson, G. Zhou, E. L. Hipkiss, S. Ravi,
J. Kowalski, H. I. Levitsky, J. D. Powell, D. M. Pardoll, C. G. Drake and D. A. Vignali
(2004). "Role of LAG-3 in regulatory T cells." Immunity 21(4): 503-13.
Hudrisier, D., B. Kessler, S. Valitutti, C. Horvath, J. C. Cerottini and I. F. Luescher (1998).
"The efficiency of antigen recognition by CD8+ CTL clones is determined by the
frequency of serial TCR engagement." J Immunol 161(2): 553-62.
Hugues, S., L. Fetler, L. Bonifaz, J. Helft, F. Amblard and S. Amigorena (2004). "Distinct T
cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity." Nat
Immunol 5(12): 1235-42.
Huppa, J. B. and M. M. Davis (2003). "T-cell-antigen recognition and the immunological
synapse." Nat Rev Immunol 3(12): 973-83.
Huppa, J. B. and H. L. Ploegh (1997). "In vitro translation and assembly of a complete T cell
receptor-CD3 complex." J Exp Med 186(3): 393-403.
Huse, M., L. O. Klein, A. T. Girvin, J. M. Faraj, Q. J. Li, M. S. Kuhns and M. M. Davis (2007).
"Spatial and temporal dynamics of T cell receptor signaling with a photoactivatable
agonist." Immunity 27(1): 76-88.
Huse, M., B. F. Lillemeier, M. S. Kuhns, D. S. Chen and M. M. Davis (2006). "T cells use two
directionally distinct pathways for cytokine secretion." Nat Immunol 7(3): 247-55.
Iezzi, G., K. Karjalainen and A. Lanzavecchia (1998). "The duration of antigenic stimulation
determines the fate of naive and effector T cells." Immunity 8(1): 89-95.
Irvine, D. J., M. A. Purbhoo, M. Krogsgaard and M. M. Davis (2002). "Direct observation of
ligand recognition by T cells." Nature 419(6909): 845-9.
Isakov, N. and A. Altman (2002). "Protein kinase C(theta) in T cell activation." Annu Rev
Immunol 20: 761-94.
Ivanov, II, B. S. McKenzie, L. Zhou, C. E. Tadokoro, A. Lepelley, J. J. Lafaille, D. J. Cua and
D. R. Littman (2006). "The orphan nuclear receptor RORgammat directs the
differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells." Cell 126(6): 112133.
Janes, P. W., S. C. Ley and A. I. Magee (1999). "Aggregation of lipid rafts accompanies
signaling via the T cell antigen receptor." J Cell Biol 147(2): 447-61.
Joffre, O., N. Gorsse, P. Romagnoli, D. Hudrisier and J. P. van Meerwijk (2004). "Induction of
antigen-specific
tolerance
to
bone
marrow
allografts
with
CD4+CD25+
T
lymphocytes." Blood 103(11): 4216-21.
Jordan, M. S., A. Boesteanu, A. J. Reed, A. L. Petrone, A. E. Holenbeck, M. A. Lerman, A.
Naji and A. J. Caton (2001). "Thymic selection of CD4+CD25+ regulatory T cells
induced by an agonist self-peptide." Nat Immunol 2(4): 301-6.
129
Références Bibliographiques
Jorgensen, J. L., U. Esser, B. Fazekas de St Groth, P. A. Reay and M. M. Davis (1992).
"Mapping T-cell receptor-peptide contacts by variant peptide immunization of singlechain transgenics." Nature 355(6357): 224-30.
Kabouridis, P. S., A. I. Magee and S. C. Ley (1997). "S-acylation of LCK protein tyrosine
kinase is essential for its signalling function in T lymphocytes." Embo J 16(16): 498398.
Kalergis, A. M., N. Boucheron, M. A. Doucey, E. Palmieri, E. C. Goyarts, Z. Vegh, I. F.
Luescher and S. G. Nathenson (2001). "Efficient T cell activation requires an optimal
dwell-time of interaction between the TCR and the pMHC complex." Nat Immunol
2(3): 229-34.
Kang, S. M., Q. Tang and J. A. Bluestone (2007). "CD4+CD25+ regulatory T cells in
transplantation: progress, challenges and prospects." Am J Transplant 7(6): 1457-63.
Kaplan, D. H., V. Shankaran, A. S. Dighe, E. Stockert, M. Aguet, L. J. Old and R. D.
Schreiber (1998). "Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor
surveillance system in immunocompetent mice." Proc Natl Acad Sci U S A 95(13):
7556-61.
Kappler, J., R. Kubo, K. Haskins, J. White and P. Marrack (1983). "The mouse T cell
receptor: comparison of MHC-restricted receptors on two T cell hybridomas." Cell
34(3): 727-37.
Kehrl, J. H., L. M. Wakefield, A. B. Roberts, S. Jakowlew, M. Alvarez-Mon, R. Derynck, M. B.
Sporn and A. S. Fauci (1986). "Production of transforming growth factor beta by
human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth." J Exp
Med 163(5): 1037-50.
Kim, J. M. and A. Rudensky (2006). "The role of the transcription factor Foxp3 in the
development of regulatory T cells." Immunol Rev 212: 86-98.
Kingsley, C. I., M. Karim, A. R. Bushell and K. J. Wood (2002). "CD25+CD4+ regulatory T
cells prevent graft rejection: CTLA-4- and IL-10-dependent immunoregulation of
alloresponses." J Immunol 168(3): 1080-6.
Klein, L., M. Klugmann, K. A. Nave, V. K. Tuohy and B. Kyewski (2000). "Shaping of the
autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic
epithelial cells." Nat Med 6(1): 56-61.
Koning, F., W. L. Maloy and J. E. Coligan (1990). "The implications of subunit interactions for
the structure of the T cell receptor-CD3 complex." Eur J Immunol 20(2): 299-305.
Korn, T., J. Reddy, W. Gao, E. Bettelli, A. Awasthi, T. R. Petersen, B. T. Backstrom, R. A.
Sobel, K. W. Wucherpfennig, T. B. Strom, M. Oukka and V. K. Kuchroo (2007).
"Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control
autoimmune inflammation." Nat Med 13(4): 423-31.
130
Références Bibliographiques
Krogsgaard, M. and M. M. Davis (2005). "How T cells 'see' antigen." Nat Immunol 6(3): 23945.
Krogsgaard, M., Q. J. Li, C. Sumen, J. B. Huppa, M. Huse and M. M. Davis (2005).
"Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and
sensitivity." Nature 434(7030): 238-43.
Kuhn, R., K. Rajewsky and W. Muller (1991). "Generation and analysis of interleukin-4
deficient mice." Science 254(5032): 707-10.
Kuhns, M. S., M. M. Davis and K. C. Garcia (2006). "Deconstructing the form and function of
the TCR/CD3 complex." Immunity 24(2): 133-9.
Kullberg, M. C., D. Jankovic, P. L. Gorelick, P. Caspar, J. J. Letterio, A. W. Cheever and A.
Sher (2002). "Bacteria-triggered CD4(+) T regulatory cells suppress Helicobacter
hepaticus-induced colitis." J Exp Med 196(4): 505-15.
Kupfer, A., T. R. Mosmann and H. Kupfer (1991). "Polarized expression of cytokines in cell
conjugates of helper T cells and splenic B cells." Proc Natl Acad Sci U S A 88(3):
775-9.
Kupfer, A. and S. J. Singer (1989). "Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions:
immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples." Annu Rev
Immunol 7: 309-37.
Kupfer, A., S. L. Swain and S. J. Singer (1987). "The specific direct interaction of helper T
cells and antigen-presenting B cells. II. Reorientation of the microtubule organizing
center and reorganization of the membrane-associated cytoskeleton inside the bound
helper T cells." J Exp Med 165(6): 1565-80.
Lahl, K., C. Loddenkemper, C. Drouin, J. Freyer, J. Arnason, G. Eberl, A. Hamann, H.
Wagner, J. Huehn and T. Sparwasser (2007). "Selective depletion of Foxp3+
regulatory T cells induces a scurfy-like disease." J Exp Med 204(1): 57-63.
Lazar-Molnar, E., H. Hegyesi, S. Toth and A. Falus (2000). "Autocrine and paracrine
regulation by cytokines and growth factors in melanoma." Cytokine 12(6): 547-54.
Le Bras, S. and R. S. Geha (2006). "IPEX and the role of Foxp3 in the development and
function of human Tregs." J Clin Invest 116(6): 1473-5.
Le Gros, G., S. Z. Ben-Sasson, R. Seder, F. D. Finkelman and W. E. Paul (1990).
"Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4
are required for in vitro generation of IL-4-producing cells." J Exp Med 172(3): 921-9.
Lee, K. H., A. R. Dinner, C. Tu, G. Campi, S. Raychaudhuri, R. Varma, T. N. Sims, W. R.
Burack, H. Wu, J. Wang, O. Kanagawa, M. Markiewicz, P. M. Allen, M. L. Dustin, A.
K. Chakraborty and A. S. Shaw (2003). "The immunological synapse balances T cell
receptor signaling and degradation." Science 302(5648): 1218-22.
131
Références Bibliographiques
Lee, K. H., A. D. Holdorf, M. L. Dustin, A. C. Chan, P. M. Allen and A. S. Shaw (2002). "T cell
receptor signaling precedes immunological synapse formation." Science 295(5559):
1539-42.
Letterio, J. J. and A. B. Roberts (1998). "Regulation of immune responses by TGF-beta."
Annu Rev Immunol 16: 137-61.
Leupin, O., R. Zaru, T. Laroche, S. Muller and S. Valitutti (2000). "Exclusion of CD45 from
the T-cell receptor signaling area in antigen-stimulated T lymphocytes." Curr Biol
10(5): 277-80.
Levings, M. K., R. Sangregorio and M. G. Roncarolo (2001). "Human cd25(+)cd4(+) t
regulatory cells suppress naive and memory T cell proliferation and can be expanded
in vitro without loss of function." J Exp Med 193(11): 1295-302.
Lewis, R. S. (2001). "Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes." Annu Rev Immunol
19: 497-521.
Li, H., A. Llera, E. L. Malchiodi and R. A. Mariuzza (1999). "The structural basis of T cell
activation by superantigens." Annu Rev Immunol 17: 435-66.
Li, M. O., Y. Y. Wan, S. Sanjabi, A. K. Robertson and R. A. Flavell (2006). "Transforming
growth factor-beta regulation of immune responses." Annu Rev Immunol 24: 99-146.
Lim, H. W., P. Hillsamer, A. H. Banham and C. H. Kim (2005). "Cutting edge: direct
suppression of B cells by CD4+ CD25+ regulatory T cells." J Immunol 175(7): 4180-3.
Lin, J. and A. Weiss (2003). "The tyrosine phosphatase CD148 is excluded from the
immunologic synapse and down-regulates prolonged T cell signaling." J Cell Biol
162(4): 673-82.
Lin, W., N. Truong, W. J. Grossman, D. Haribhai, C. B. Williams, J. Wang, M. G. Martin and
T. A. Chatila (2005). "Allergic dysregulation and hyperimmunoglobulinemia E in
Foxp3 mutant mice." J Allergy Clin Immunol 116(5): 1106-15.
Liu, V. C., L. Y. Wong, T. Jang, A. H. Shah, I. Park, X. Yang, Q. Zhang, S. Lonning, B. A.
Teicher and C. Lee (2007). "Tumor evasion of the immune system by converting
CD4+CD25- T cells into CD4+CD25+ T regulatory cells: role of tumor-derived TGFbeta." J Immunol 178(5): 2883-92.
Liu, W., A. L. Putnam, Z. Xu-Yu, G. L. Szot, M. R. Lee, S. Zhu, P. A. Gottlieb, P. Kapranov,
T. R. Gingeras, B. Fazekas de St Groth, C. Clayberger, D. M. Soper, S. F. Ziegler
and J. A. Bluestone (2006). "CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and
suppressive function of human CD4+ T reg cells." J Exp Med 203(7): 1701-11.
Lowin, B., M. C. Peitsch and J. Tschopp (1995). "Perforin and granzymes: crucial effector
molecules in cytolytic T lymphocyte and natural killer cell-mediated cytotoxicity." Curr
Top Microbiol Immunol 198: 1-24.
132
Références Bibliographiques
Luescher, I. F., E. Vivier, A. Layer, J. Mahiou, F. Godeau, B. Malissen and P. Romero
(1995). "CD8 modulation of T-cell antigen receptor-ligand interactions on living
cytotoxic T lymphocytes." Nature 373(6512): 353-6.
Lundgren, A., E. Suri-Payer, K. Enarsson, A. M. Svennerholm and B. S. Lundin (2003).
"Helicobacter pylori-specific CD4+ CD25high regulatory T cells suppress memory Tcell responses to H. pylori in infected individuals." Infect Immun 71(4): 1755-62.
Luo, X., K. V. Tarbell, H. Yang, K. Pothoven, S. L. Bailey, R. Ding, R. M. Steinman and M.
Suthanthiran (2007). "Dendritic cells with TGF-beta1 differentiate naive CD4+CD25T cells into islet-protective Foxp3+ regulatory T cells." Proc Natl Acad Sci U S A
104(8): 2821-6.
Lyons, D. S., S. A. Lieberman, J. Hampl, J. J. Boniface, Y. Chien, L. J. Berg and M. M. Davis
(1996). "A TCR binds to antagonist ligands with lower affinities and faster dissociation
rates than to agonists." Immunity 5(1): 53-61.
MacDonald, H. R., R. Schneider, R. K. Lees, R. C. Howe, H. Acha-Orbea, H. Festenstein, R.
M. Zinkernagel and H. Hengartner (1988). "T-cell receptor V beta use predicts
reactivity and tolerance to Mlsa-encoded antigens." Nature 332(6159): 40-5.
Mangan, P. R., L. E. Harrington, D. B. O'Quinn, W. S. Helms, D. C. Bullard, C. O. Elson, R.
D. Hatton, S. M. Wahl, T. R. Schoeb and C. T. Weaver (2006). "Transforming growth
factor-beta induces development of the T(H)17 lineage." Nature 441(7090): 231-4.
Manolios, N., F. Letourneur, J. S. Bonifacino and R. D. Klausner (1991). "Pairwise,
cooperative and inhibitory interactions describe the assembly and probable structure
of the T-cell antigen receptor." Embo J 10(7): 1643-51.
Marangoni, F., S. Trifari, S. Scaramuzza, C. Panaroni, S. Martino, L. D. Notarangelo, Z. Baz,
A. Metin, F. Cattaneo, A. Villa, A. Aiuti, M. Battaglia, M. G. Roncarolo and L. Dupre
(2007).
"WASP
regulates
suppressor
activity
of
human
and
murine
CD4(+)CD25(+)FOXP3(+) natural regulatory T cells." J Exp Med 204(2): 369-80.
Marie, J. C., J. J. Letterio, M. Gavin and A. Y. Rudensky (2005). "TGF-beta1 maintains
suppressor function and Foxp3 expression in CD4+CD25+ regulatory T cells." J Exp
Med 201(7): 1061-7.
Marrack, P. C. and J. W. Kappler (1975). "Antigen-specific and nonspecific mediators of T
cell/B cell cooperation. I. Evidence for their production by different T cells." J Immunol
114(3): 1116-25.
Marsland, B. J., T. J. Soos, G. Spath, D. R. Littman and M. Kopf (2004). "Protein kinase C
theta is critical for the development of in vivo T helper (Th)2 cell but not Th1 cell
responses." J Exp Med 200(2): 181-9.
133
Références Bibliographiques
Matsui, K., J. J. Boniface, P. Steffner, P. A. Reay and M. M. Davis (1994). "Kinetics of T-cell
receptor binding to peptide/I-Ek complexes: correlation of the dissociation rate with Tcell responsiveness." Proc Natl Acad Sci U S A 91(26): 12862-6.
Matzinger, P., R. Zamoyska and H. Waldmann (1984). "Self tolerance is H-2-restricted."
Nature 308(5961): 738-41.
Mazo, I. B., M. Honczarenko, H. Leung, L. L. Cavanagh, R. Bonasio, W. Weninger, K.
Engelke, L. Xia, R. P. McEver, P. A. Koni, L. E. Silberstein and U. H. von Andrian
(2005). "Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory
CD8+ T cells." Immunity 22(2): 259-70.
McGeachy, M. J., L. A. Stephens and S. M. Anderton (2005). "Natural recovery and
protection
from
autoimmune
encephalomyelitis:
contribution
of
CD4+CD25+
regulatory cells within the central nervous system." J Immunol 175(5): 3025-32.
McKeever, U., J. P. Mordes, D. L. Greiner, M. C. Appel, J. Rozing, E. S. Handler and A. A.
Rossini (1990). "Adoptive transfer of autoimmune diabetes and thyroiditis to athymic
rats." Proc Natl Acad Sci U S A 87(19): 7618-22.
McKeithan, T. W. (1995). "Kinetic proofreading in T-cell receptor signal transduction." Proc
Natl Acad Sci U S A 92(11): 5042-6.
Mempel, T. R., S. E. Henrickson and U. H. Von Andrian (2004). "T-cell priming by dendritic
cells in lymph nodes occurs in three distinct phases." Nature 427(6970): 154-9.
Mempel, T. R., M. J. Pittet, K. Khazaie, W. Weninger, R. Weissleder, H. von Boehmer and U.
H. von Andrian (2006). "Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell
function independent of effector differentiation." Immunity 25(1): 129-41.
Miller, M. J., O. Safrina, I. Parker and M. D. Cahalan (2004). "Imaging the single cell
dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes." J Exp Med
200(7): 847-56.
Mills, K. H. (2004). "Regulatory T cells: friend or foe in immunity to infection?" Nat Rev
Immunol 4(11): 841-55.
Miro, F., C. Nobile, N. Blanchard, M. Lind, O. Filipe-Santos, C. Fieschi, A. Chapgier, G. Vogt,
L. de Beaucoudrey, D. S. Kumararatne, F. Le Deist, J. L. Casanova, S. Amigorena
and C. Hivroz (2006). "T cell-dependent activation of dendritic cells requires IL-12 and
IFN-gamma signaling in T cells." J Immunol 177(6): 3625-34.
Misra, N., J. Bayry, S. Lacroix-Desmazes, M. D. Kazatchkine and S. V. Kaveri (2004).
"Cutting edge: human CD4+CD25+ T cells restrain the maturation and antigenpresenting function of dendritic cells." J Immunol 172(8): 4676-80.
Mitra-Kaushik, S., J. Harding, J. Hess, R. Schreiber and L. Ratner (2004). "Enhanced
tumorigenesis in HTLV-1 tax-transgenic mice deficient in interferon-gamma." Blood
104(10): 3305-11.
134
Références Bibliographiques
Miyara, M. and S. Sakaguchi (2007). "Natural regulatory T cells: mechanisms of
suppression." Trends Mol Med 13(3): 108-16.
Molon, B., G. Gri, M. Bettella, C. Gomez-Mouton, A. Lanzavecchia, A. C. Martinez, S. Manes
and A. Viola (2005). "T cell costimulation by chemokine receptors." Nat Immunol 6(5):
465-71.
Mombaerts, P., J. Iacomini, R. S. Johnson, K. Herrup, S. Tonegawa and V. E. Papaioannou
(1992). "RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes." Cell 68(5): 86977.
Monks, C. R., B. A. Freiberg, H. Kupfer, N. Sciaky and A. Kupfer (1998). "Three-dimensional
segregation of supramolecular activation clusters in T cells." Nature 395(6697): 82-6.
Monks, C. R., H. Kupfer, I. Tamir, A. Barlow and A. Kupfer (1997). "Selective modulation of
protein kinase C-theta during T-cell activation." Nature 385(6611): 83-6.
Morrissey, P. J., K. Charrier, S. Braddy, D. Liggitt and J. D. Watson (1993). "CD4+ T cells
that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into
congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented
by cotransfer of purified CD4+ T cells." J Exp Med 178(1): 237-44.
Mosmann, T. R., H. Cherwinski, M. W. Bond, M. A. Giedlin and R. L. Coffman (1986). "Two
types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins." J Immunol 136(7): 2348-57.
Mottet, C., H. H. Uhlig and F. Powrie (2003). "Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+
regulatory T cells." J Immunol 170(8): 3939-43.
Mucida, D., Y. Park, G. Kim, O. Turovskaya, I. Scott, M. Kronenberg and H. Cheroutre
(2007). "Reciprocal TH17 and regulatory T cell differentiation mediated by retinoic
acid." Science 317(5835): 256-60.
Muller, S., S. Demotz, C. Bulliard and S. Valitutti (1999). "Kinetics and extent of protein
tyrosine kinase activation in individual T cells upon antigenic stimulation."
Immunology 97(2): 287-93.
Munger, J. S., X. Huang, H. Kawakatsu, M. J. Griffiths, S. L. Dalton, J. Wu, J. F. Pittet, N.
Kaminski, C. Garat, M. A. Matthay, D. B. Rifkin and D. Sheppard (1999). "The integrin
alpha v beta 6 binds and activates latent TGF beta 1: a mechanism for regulating
pulmonary inflammation and fibrosis." Cell 96(3): 319-28.
Munn, D. H., M. Zhou, J. T. Attwood, I. Bondarev, S. J. Conway, B. Marshall, C. Brown and
A. L. Mellor (1998). "Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan
catabolism." Science 281(5380): 1191-3.
Munro, S. (2003). "Lipid rafts: elusive or illusive?" Cell 115(4): 377-88.
135
Références Bibliographiques
Mustelin, T., K. M. Coggeshall and A. Altman (1989). "Rapid activation of the T-cell tyrosine
protein kinase pp56lck by the CD45 phosphotyrosine phosphatase." Proc Natl Acad
Sci U S A 86(16): 6302-6.
Nikolich-Zugich, J., M. K. Slifka and I. Messaoudi (2004). "The many important facets of Tcell repertoire diversity." Nat Rev Immunol 4(2): 123-32.
Nishizuka, Y. and T. Sakakura (1969). "Thymus and reproduction: sex-linked dysgenesia of
the gonad after neonatal thymectomy in mice." Science 166(906): 753-5.
Noben-Trauth, N., J. Hu-Li and W. E. Paul (2000). "Conventional, naive CD4+ T cells provide
an initial source of IL-4 during Th2 differentiation." J Immunol 165(7): 3620-5.
Norcross, M. A. (1984). "A synaptic basis for T-lymphocyte activation." Ann Immunol (Paris)
135D(2): 113-34.
O'Garra, A. (1998). "Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T
helper cell subsets." Immunity 8(3): 275-83.
O'Keefe, J. P., K. Blaine, M. L. Alegre and T. F. Gajewski (2004). "Formation of a central
supramolecular activation cluster is not required for activation of naive CD8+ T cells."
Proc Natl Acad Sci U S A 101(25): 9351-6.
Okada, T., M. J. Miller, I. Parker, M. F. Krummel, M. Neighbors, S. B. Hartley, A. O'Garra, M.
D. Cahalan and J. G. Cyster (2005). "Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis
toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells." PLoS Biol 3(6):
e150.
Ostergaard, H. L., K. P. Kane, M. F. Mescher and W. R. Clark (1987). "Cytotoxic T
lymphocyte mediated lysis without release of serine esterase." Nature 330(6143): 712.
Ouyang, W., S. H. Ranganath, K. Weindel, D. Bhattacharya, T. L. Murphy, W. C. Sha and K.
M. Murphy (1998). "Inhibition of Th1 development mediated by GATA-3 through an
IL-4-independent mechanism." Immunity 9(5): 745-55.
Padovan, E., G. Casorati, P. Dellabona, S. Meyer, M. Brockhaus and A. Lanzavecchia
(1993). "Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells."
Science 262(5132): 422-4.
Page, D. M., L. P. Kane, T. M. Onami and S. M. Hedrick (1996). "Cellular and biochemical
requirements for thymocyte negative selection." Semin Immunol 8(2): 69-82.
Pansky, A., P. Hildebrand, E. Fasler-Kan, L. Baselgia, S. Ketterer, C. Beglinger and M. H.
Heim (2000). "Defective Jak-STAT signal transduction pathway in melanoma cells
resistant to growth inhibition by interferon-alpha." Int J Cancer 85(5): 720-5.
Park, H., Z. Li, X. O. Yang, S. H. Chang, R. Nurieva, Y. H. Wang, Y. Wang, L. Hood, Z. Zhu,
Q. Tian and C. Dong (2005). "A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue
inflammation by producing interleukin 17." Nat Immunol 6(11): 1133-41.
136
Références Bibliographiques
Patton, D. T., O. A. Garden, W. P. Pearce, L. E. Clough, C. R. Monk, E. Leung, W. C.
Rowan, S. Sancho, L. S. Walker, B. Vanhaesebroeck and K. Okkenhaug (2006).
"Cutting edge: the phosphoinositide 3-kinase p110 delta is critical for the function of
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells." J Immunol 177(10): 6598-602.
Piccirillo, C. A., J. J. Letterio, A. M. Thornton, R. S. McHugh, M. Mamura, H. Mizuhara and E.
M. Shevach (2002). "CD4(+)CD25(+) regulatory T cells can mediate suppressor
function in the absence of transforming growth factor beta1 production and
responsiveness." J Exp Med 196(2): 237-46.
Piccirillo, C. A. and E. M. Shevach (2001). "Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by
CD4+CD25+ immunoregulatory cells." J Immunol 167(3): 1137-40.
Polanczyk, M. J., B. D. Carson, S. Subramanian, M. Afentoulis, A. A. Vandenbark, S. F.
Ziegler and H. Offner (2004). "Cutting edge: estrogen drives expansion of the
CD4+CD25+ regulatory T cell compartment." J Immunol 173(4): 2227-30.
Powell, B. R., N. R. Buist and P. Stenzel (1982). "An X-linked syndrome of diarrhea,
polyendocrinopathy, and fatal infection in infancy." J Pediatr 100(5): 731-7.
Powrie, F., M. W. Leach, S. Mauze, L. B. Caddle and R. L. Coffman (1993). "Phenotypically
distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation
in C. B-17 scid mice." Int Immunol 5(11): 1461-71.
Powrie, F. and D. Mason (1990). "OX-22high CD4+ T cells induce wasting disease with
multiple organ pathology: prevention by the OX-22low subset." J Exp Med 172(6):
1701-8.
Powrie, F. and D. Mason (1990). "Subsets of rat CD4+ T cells defined by their differential
expression of variants of the CD45 antigen: developmental relationships and in vitro
and in vivo functions." Curr Top Microbiol Immunol 159: 79-96.
Pullen, A. M., J. Bill, R. T. Kubo, P. Marrack and J. W. Kappler (1991). "Analysis of the
interaction site for the self superantigen Mls-1a on T cell receptor V beta." J Exp Med
173(5): 1183-92.
Punt, J. A., J. L. Roberts, K. P. Kearse and A. Singer (1994). "Stoichiometry of the T cell
antigen receptor (TCR) complex: each TCR/CD3 complex contains one TCR alpha,
one TCR beta, and two CD3 epsilon chains." J Exp Med 180(2): 587-93.
Purbhoo, M. A., D. J. Irvine, J. B. Huppa and M. M. Davis (2004). "T cell killing does not
require the formation of a stable mature immunological synapse." Nat Immunol 5(5):
524-30.
Qin, S. X., M. Wise, S. P. Cobbold, L. Leong, Y. C. Kong, J. R. Parnes and H. Waldmann
(1990). "Induction of tolerance in peripheral T cells with monoclonal antibodies." Eur J
Immunol 20(12): 2737-45.
137
Références Bibliographiques
Rabinowitz, J. D., C. Beeson, D. S. Lyons, M. M. Davis and H. M. McConnell (1996). "Kinetic
discrimination in T-cell activation." Proc Natl Acad Sci U S A 93(4): 1401-5.
Radoja, S., M. Saio, D. Schaer, M. Koneru, S. Vukmanovic and A. B. Frey (2001). "CD8(+)
tumor-infiltrating T cells are deficient in perforin-mediated cytolytic activity due to
defective microtubule-organizing center mobilization and lytic granule exocytosis." J
Immunol 167(9): 5042-51.
Randriamampita, C., G. Boulla, P. Revy, F. Lemaitre and A. Trautmann (2003). "T cell
adhesion lowers the threshold for antigen detection." Eur J Immunol 33(5): 1215-23.
Rao, P. E., A. L. Petrone and P. D. Ponath (2005). "Differentiation and expansion of T cells
with regulatory function from human peripheral lymphocytes by stimulation in the
presence of TGF-{beta}." J Immunol 174(3): 1446-55.
Redmond, W. L. and L. A. Sherman (2005). "Peripheral tolerance of CD8 T lymphocytes."
Immunity 22(3): 275-84.
Reich, N. C. and L. Liu (2006). "Tracking STAT nuclear traffic." Nat Rev Immunol 6(8): 60212.
Reichert, P., R. L. Reinhardt, E. Ingulli and M. K. Jenkins (2001). "Cutting edge: in vivo
identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T
cells." J Immunol 166(7): 4278-81.
Reiner, S. L. (2007). "Development in motion: helper T cells at work." Cell 129(1): 33-6.
Reiser, J. B., C. Gregoire, C. Darnault, T. Mosser, A. Guimezanes, A. M. Schmitt-Verhulst, J.
C. Fontecilla-Camps, G. Mazza, B. Malissen and D. Housset (2002). "A T cell
receptor CDR3beta loop undergoes conformational changes of unprecedented
magnitude upon binding to a peptide/MHC class I complex." Immunity 16(3): 345-54.
Revy, P., M. Sospedra, B. Barbour and A. Trautmann (2001). "Functional antigenindependent synapses formed between T cells and dendritic cells." Nat Immunol
2(10): 925-31.
Rezvani, K., S. Mielke, M. Ahmadzadeh, Y. Kilical, B. N. Savani, J. Zeilah, K. Keyvanfar, A.
Montero, N. Hensel, R. Kurlander and A. J. Barrett (2006). "High donor FOXP3positive regulatory T-cell (Treg) content is associated with a low risk of GVHD
following HLA-matched allogeneic SCT." Blood 108(4): 1291-7.
Richie, L. I., P. J. Ebert, L. C. Wu, M. F. Krummel, J. J. Owen and M. M. Davis (2002).
"Imaging synapse formation during thymocyte selection: inability of CD3zeta to form a
stable central accumulation during negative selection." Immunity 16(4): 595-606.
Rincon, M. (2001). "MAP-kinase signaling pathways in T cells." Curr Opin Immunol 13(3):
339-45.
138
Références Bibliographiques
Rincon, M., H. Enslen, J. Raingeaud, M. Recht, T. Zapton, M. S. Su, L. A. Penix, R. J. Davis
and R. A. Flavell (1998). "Interferon-gamma expression by Th1 effector T cells
mediated by the p38 MAP kinase signaling pathway." Embo J 17(10): 2817-29.
Risueno, R. M., D. Gil, E. Fernandez, F. Sanchez-Madrid and B. Alarcon (2005). "Ligandinduced conformational change in the T-cell receptor associated with productive
immune synapses." Blood 106(2): 601-8.
Rojo, J. M., K. Saizawa and C. A. Janeway, Jr. (1989). "Physical association of CD4 and the
T-cell receptor can be induced by anti-T-cell receptor antibodies." Proc Natl Acad Sci
U S A 86(9): 3311-5.
Roncarolo, M. G. and M. Battaglia (2007). "Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to
self antigens and alloantigens in humans." Nat Rev Immunol 7(8): 585-98.
Rubtsov, Y. P. and A. Y. Rudensky (2007). "TGFbeta signalling in control of T-cell-mediated
self-reactivity." Nat Rev Immunol 7(6): 443-53.
Rudolph, M. G., R. L. Stanfield and I. A. Wilson (2006). "How TCRs bind MHCs, peptides,
and coreceptors." Annu Rev Immunol 24: 419-66.
Ruprecht, C. R., M. Gattorno, F. Ferlito, A. Gregorio, A. Martini, A. Lanzavecchia and F.
Sallusto (2005). "Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T
cells in inflamed synovia." J Exp Med 201(11): 1793-803.
Sadra, A., T. Cinek and J. B. Imboden (2004). "Translocation of CD28 to lipid rafts and
costimulation of IL-2." Proc Natl Acad Sci U S A 101(31): 11422-7.
Saint-Ruf, C., K. Ungewiss, M. Groettrup, L. Bruno, H. J. Fehling and H. von Boehmer
(1994). "Analysis and expression of a cloned pre-T cell receptor gene." Science
266(5188): 1208-12.
Sakaguchi, S. (2004). "Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses." Annu Rev Immunol 22: 53162.
Sakaguchi, S. (2005). "Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in
immunological tolerance to self and non-self." Nat Immunol 6(4): 345-52.
Sakaguchi, S., K. Fukuma, K. Kuribayashi and T. Masuda (1985). "Organ-specific
autoimmune diseases induced in mice by elimination of T cell subset. I. Evidence for
the active participation of T cells in natural self-tolerance; deficit of a T cell subset as
a possible cause of autoimmune disease." J Exp Med 161(1): 72-87.
Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M. Itoh and M. Toda (1995). "Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains
(CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various
autoimmune diseases." J Immunol 155(3): 1151-64.
139
Références Bibliographiques
Sakaguchi, S., T. Takahashi and Y. Nishizuka (1982). "Study on cellular events in postthymectomy autoimmune oophoritis in mice. II. Requirement of Lyt-1 cells in normal
female mice for the prevention of oophoritis." J Exp Med 156(6): 1577-86.
Salazar-Onfray, F. (1999). "Interleukin-10: a cytokine used by tumors to escape
immunosurveillance." Med Oncol 16(2): 86-94.
Samelson, L. E., J. B. Harford and R. D. Klausner (1985). "Identification of the components
of the murine T cell antigen receptor complex." Cell 43(1): 223-31.
Sant'Angelo, D. B., G. Waterbury, P. Preston-Hurlburt, S. T. Yoon, R. Medzhitov, S. C. Hong
and C. A. Janeway, Jr. (1996). "The specificity and orientation of a TCR to its peptideMHC class II ligands." Immunity 4(4): 367-76.
Sawitzki, B., C. I. Kingsley, V. Oliveira, M. Karim, M. Herber and K. J. Wood (2005). "IFNgamma production by alloantigen-reactive regulatory T cells is important for their
regulatory function in vivo." J Exp Med 201(12): 1925-35.
Scaffidi, C., S. Fulda, A. Srinivasan, C. Friesen, F. Li, K. J. Tomaselli, K. M. Debatin, P. H.
Krammer and M. E. Peter (1998). "Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways."
Embo J 17(6): 1675-87.
Schamel, W. W., I. Arechaga, R. M. Risueno, H. M. van Santen, P. Cabezas, C. Risco, J. M.
Valpuesta and B. Alarcon (2005). "Coexistence of multivalent and monovalent TCRs
explains high sensitivity and wide range of response." J Exp Med 202(4): 493-503.
Schumacher, T. N. (2002). "T-cell-receptor gene therapy." Nat Rev Immunol 2(7): 512-9.
Sebzda, E., S. Mariathasan, T. Ohteki, R. Jones, M. F. Bachmann and P. S. Ohashi (1999).
"Selection of the T cell repertoire." Annu Rev Immunol 17: 829-74.
Secrist, J. P., L. A. Burns, L. Karnitz, G. A. Koretzky and R. T. Abraham (1993). "Stimulatory
effects of the protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, on T-cell activation
events." J Biol Chem 268(8): 5886-93.
Seddiki, N., B. Santner-Nanan, J. Martinson, J. Zaunders, S. Sasson, A. Landay, M.
Solomon, W. Selby, S. I. Alexander, R. Nanan, A. Kelleher and B. Fazekas de St
Groth (2006). "Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates
between human regulatory and activated T cells." J Exp Med 203(7): 1693-700.
Segundo, D. S., J. C. Ruiz, M. Izquierdo, G. Fernandez-Fresnedo, C. Gomez-Alamillo, R.
Merino, M. J. Benito, E. Cacho, E. Rodrigo, R. Palomar, M. Lopez-Hoyos and M.
Arias (2006). "Calcineurin inhibitors, but not rapamycin, reduce percentages of
CD4+CD25+FOXP3+
regulatory
T
cells
in
renal
transplant
recipients."
Transplantation 82(4): 550-7.
Selvaraj, R. K. and T. L. Geiger (2007). "A kinetic and dynamic analysis of Foxp3 induced in
T cells by TGF-beta." J Immunol 179(2): 11 p following 1390.
140
Références Bibliographiques
Shi, Y. and J. Massague (2003). "Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to
the nucleus." Cell 113(6): 685-700.
Shinkai, Y., S. Koyasu, K. Nakayama, K. M. Murphy, D. Y. Loh, E. L. Reinherz and F. W. Alt
(1993). "Restoration of T cell development in RAG-2-deficient mice by functional TCR
transgenes." Science 259(5096): 822-5.
Shinkai, Y., G. Rathbun, K. P. Lam, E. M. Oltz, V. Stewart, M. Mendelsohn, J. Charron, M.
Datta, F. Young, A. M. Stall and et al. (1992). "RAG-2-deficient mice lack mature
lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement." Cell 68(5): 855-67.
Shull, M. M., I. Ormsby, A. B. Kier, S. Pawlowski, R. J. Diebold, M. Yin, R. Allen, C. Sidman,
G. Proetzel, D. Calvin and et al. (1992). "Targeted disruption of the mouse
transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease."
Nature 359(6397): 693-9.
Simons, K. and E. Ikonen (1997). "Functional rafts in cell membranes." Nature 387(6633):
569-72.
Stefanova, I., J. R. Dorfman and R. N. Germain (2002). "Self-recognition promotes the
foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes." Nature 420(6914): 429-34.
Stenger, S., D. A. Hanson, R. Teitelbaum, P. Dewan, K. R. Niazi, C. J. Froelich, T. Ganz, S.
Thoma-Uszynski, A. Melian, C. Bogdan, S. A. Porcelli, B. R. Bloom, A. M. Krensky
and R. L. Modlin (1998). "An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by
granulysin." Science 282(5386): 121-5.
Stinchcombe, J. C., G. Bossi, S. Booth and G. M. Griffiths (2001). "The immunological
synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges." Immunity
15(5): 751-61.
Street, S. E., J. A. Trapani, D. MacGregor and M. J. Smyth (2002). "Suppression of
lymphoma and epithelial malignancies effected by interferon gamma." J Exp Med
196(1): 129-34.
Suffia, I. J., S. K. Reckling, C. A. Piccirillo, R. S. Goldszmid and Y. Belkaid (2006). "Infected
site-restricted Foxp3+ natural regulatory T cells are specific for microbial antigens." J
Exp Med 203(3): 777-88.
Sumoza-Toledo, A., A. D. Eaton and A. Sarukhan (2006). "Regulatory T cells inhibit protein
kinase C theta recruitment to the immune synapse of naive T cells with the same
antigen specificity." J Immunol 176(10): 5779-87.
Suomalainen, M. (2002). "Lipid rafts and assembly of enveloped viruses." Traffic 3(10): 7059.
Sutton, V. R., M. E. Wowk, M. Cancilla and J. A. Trapani (2003). "Caspase activation by
granzyme B is indirect, and caspase autoprocessing requires the release of
proapoptotic mitochondrial factors." Immunity 18(3): 319-29.
141
Références Bibliographiques
Suvas, S., U. Kumaraguru, C. D. Pack, S. Lee and B. T. Rouse (2003). "CD4+CD25+ T cells
regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses." J Exp Med
198(6): 889-901.
Sykulev, Y., M. Joo, I. Vturina, T. J. Tsomides and H. N. Eisen (1996). "Evidence that a
single peptide-MHC complex on a target cell can elicit a cytolytic T cell response."
Immunity 4(6): 565-71.
Szymczak, A. L., C. J. Workman, D. Gil, S. Dilioglou, K. M. Vignali, E. Palmer and D. A.
Vignali (2005). "The CD3epsilon proline-rich sequence, and its interaction with Nck, is
not required for T cell development and function." J Immunol 175(1): 270-5.
Tadokoro, C. E., G. Shakhar, S. Shen, Y. Ding, A. C. Lino, A. Maraver, J. J. Lafaille and M.
L. Dustin (2006). "Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and
dendritic cells in vivo." J Exp Med 203(3): 505-11.
Tafuri, A., J. Alferink, P. Moller, G. J. Hammerling and B. Arnold (1995). "T cell awareness of
paternal alloantigens during pregnancy." Science 270(5236): 630-3.
Taguchi, O. and Y. Nishizuka (1981). "Experimental autoimmune orchitis after neonatal
thymectomy in the mouse." Clin Exp Immunol 46(2): 425-34.
Tang, Q., J. Y. Adams, A. J. Tooley, M. Bi, B. T. Fife, P. Serra, P. Santamaria, R. M.
Locksley, M. F. Krummel and J. A. Bluestone (2006). "Visualizing regulatory T cell
control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice." Nat Immunol 7(1): 8392.
Tang, Q., K. J. Henriksen, M. Bi, E. B. Finger, G. Szot, J. Ye, E. L. Masteller, H. McDevitt, M.
Bonyhadi and J. A. Bluestone (2004). "In vitro-expanded antigen-specific regulatory T
cells suppress autoimmune diabetes." J Exp Med 199(11): 1455-65.
Tang, Q. and M. F. Krummel (2006). "Imaging the function of regulatory T cells in vivo." Curr
Opin Immunol 18(4): 496-502.
Tarbell, K. V., L. Petit, X. Zuo, P. Toy, X. Luo, A. Mqadmi, H. Yang, M. Suthanthiran, S.
Mojsov and R. M. Steinman (2007). "Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+
CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice." J
Exp Med 204(1): 191-201.
Teh, H. S., P. Kisielow, B. Scott, H. Kishi, Y. Uematsu, H. Bluthmann and H. von Boehmer
(1988). "Thymic major histocompatibility complex antigens and the alpha beta T-cell
receptor determine the CD4/CD8 phenotype of T cells." Nature 335(6187): 229-33.
Thornton, A. M. and E. M. Shevach (1998). "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production." J Exp Med
188(2): 287-96.
Trautmann, A. and C. Randriamampita (2003). "Initiation of TCR signalling revisited." Trends
Immunol 24(8): 425-8.
142
Références Bibliographiques
Trautmann, A. and S. Valitutti (2003). "The diversity of immunological synapses." Curr Opin
Immunol 15(3): 249-54.
Treisman, R. (1996). "Regulation of transcription by MAP kinase cascades." Curr Opin Cell
Biol 8(2): 205-15.
Tschopp, J., D. Masson and K. K. Stanley (1986). "Structural/functional similarity between
proteins involved in complement- and cytotoxic T-lymphocyte-mediated cytolysis."
Nature 322(6082): 831-4.
Ueda, H., J. M. Howson, L. Esposito, J. Heward, H. Snook, G. Chamberlain, D. B. Rainbow,
K. M. Hunter, A. N. Smith, G. Di Genova, M. H. Herr, I. Dahlman, F. Payne, D. Smyth,
C. Lowe, R. C. Twells, S. Howlett, B. Healy, S. Nutland, H. E. Rance, V. Everett, L. J.
Smink, A. C. Lam, H. J. Cordell, N. M. Walker, C. Bordin, J. Hulme, C. Motzo, F.
Cucca, J. F. Hess, M. L. Metzker, J. Rogers, S. Gregory, A. Allahabadia, R.
Nithiyananthan, E. Tuomilehto-Wolf, J. Tuomilehto, P. Bingley, K. M. Gillespie, D. E.
Undlien, K. S. Ronningen, C. Guja, C. Ionescu-Tirgoviste, D. A. Savage, A. P.
Maxwell, D. J. Carson, C. C. Patterson, J. A. Franklyn, D. G. Clayton, L. B. Peterson,
L. S. Wicker, J. A. Todd and S. C. Gough (2003). "Association of the T-cell regulatory
gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease." Nature 423(6939): 506-11.
Uhlig, H. H., J. Coombes, C. Mottet, A. Izcue, C. Thompson, A. Fanger, A. Tannapfel, J. D.
Fontenot,
F.
Ramsdell
and
F.
Powrie
(2006).
"Characterization
of
Foxp3+CD4+CD25+ and IL-10-secreting CD4+CD25+ T cells during cure of colitis." J
Immunol 177(9): 5852-60.
Valitutti, S., M. Dessing, K. Aktories, H. Gallati and A. Lanzavecchia (1995). "Sustained
signaling leading to T cell activation results from prolonged T cell receptor occupancy.
Role of T cell actin cytoskeleton." J Exp Med 181(2): 577-84.
Valitutti, S. and A. Lanzavecchia (1997). "Serial triggering of TCRs: a basis for the sensitivity
and specificity of antigen recognition." Immunol Today 18(6): 299-304.
Valzasina, B., S. Piconese, C. Guiducci and M. P. Colombo (2006). "Tumor-induced
expansion of regulatory T cells by conversion of CD4+CD25- lymphocytes is thymus
and proliferation independent." Cancer Res 66(8): 4488-95.
van Meerwijk, J. P., S. Marguerat, R. K. Lees, R. N. Germain, B. J. Fowlkes and H. R.
MacDonald (1997). "Quantitative impact of thymic clonal deletion on the T cell
repertoire." J Exp Med 185(3): 377-83.
van Oers, N. S., N. Killeen and A. Weiss (1994). "ZAP-70 is constitutively associated with
tyrosine-phosphorylated TCR zeta in murine thymocytes and lymph node T cells."
Immunity 1(8): 675-85.
Veler, H., A. Hu, S. Fatma, J. S. Grunstein, C. M. DeStephan, D. Campbell, J. S. Orange and
M. M. Grunstein (2007). "Superantigen presentation by airway smooth muscle to
143
Références Bibliographiques
CD4+ T lymphocytes elicits reciprocal proasthmatic changes in airway function." J
Immunol 178(6): 3627-36.
Villasenor, J., C. Benoist and D. Mathis (2005). "AIRE and APECED: molecular insights into
an autoimmune disease." Immunol Rev 204: 156-64.
von Boehmer, H. (2005). "Mechanisms of suppression by suppressor T cells." Nat Immunol
6(4): 338-44.
von Boehmer, H. (2005). "Unique features of the pre-T-cell receptor alpha-chain: not just a
surrogate." Nat Rev Immunol 5(7): 571-7.
von Boehmer, H., I. Aifantis, F. Gounari, O. Azogui, L. Haughn, I. Apostolou, E. Jaeckel, F.
Grassi and L. Klein (2003). "Thymic selection revisited: how essential is it?" Immunol
Rev 191: 62-78.
von Boehmer, H. and H. J. Fehling (1997). "Structure and function of the pre-T cell receptor."
Annu Rev Immunol 15: 433-52.
Waldmann, H. and S. Cobbold (1998). "How do monoclonal antibodies induce tolerance? A
role for infectious tolerance?" Annu Rev Immunol 16: 619-44.
Walker, L. S. and A. K. Abbas (2002). "The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay
in the periphery." Nat Rev Immunol 2(1): 11-9.
Walker, M. R., D. J. Kasprowicz, V. H. Gersuk, A. Benard, M. Van Landeghen, J. H. Buckner
and S. F. Ziegler (2003). "Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity
by stimulated human CD4+CD25- T cells." J Clin Invest 112(9): 1437-43.
Walsh, P. T., J. L. Buckler, J. Zhang, A. E. Gelman, N. M. Dalton, D. K. Taylor, S. J.
Bensinger, W. W. Hancock and L. A. Turka (2006). "PTEN inhibits IL-2 receptormediated expansion of CD4+ CD25+ Tregs." J Clin Invest 116(9): 2521-31.
Wang, Z., E. Choice, A. Kaspar, D. Hanson, S. Okada, S. C. Lyu, A. M. Krensky and C.
Clayberger (2000). "Bactericidal and tumoricidal activities of synthetic peptides
derived from granulysin." J Immunol 165(3): 1486-90.
Ward, S. G. and D. A. Cantrell (2001). "Phosphoinositide 3-kinases in T lymphocyte
activation." Curr Opin Immunol 13(3): 332-8.
Weaver, C. T., R. D. Hatton, P. R. Mangan and L. E. Harrington (2007). "IL-17 family
cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages." Annu Rev Immunol
25: 821-52.
Weber, S., A. Traunecker, F. Oliveri, W. Gerhard and K. Karjalainen (1992). "Specific lowaffinity recognition of major histocompatibility complex plus peptide by soluble T-cell
receptor." Nature 356(6372): 793-6.
Weih, F., D. Carrasco, S. K. Durham, D. S. Barton, C. A. Rizzo, R. P. Ryseck, S. A. Lira and
R. Bravo (1995). "Multiorgan inflammation and hematopoietic abnormalities in mice
144
Références Bibliographiques
with a targeted disruption of RelB, a member of the NF-kappa B/Rel family." Cell
80(2): 331-40.
Wiedemann, A., D. Depoil, M. Faroudi and S. Valitutti (2006). "Cytotoxic T lymphocytes kill
multiple targets simultaneously via spatiotemporal uncoupling of lytic and stimulatory
synapses." Proc Natl Acad Sci U S A 103(29): 10985-90.
Wildin, R. S., F. Ramsdell, J. Peake, F. Faravelli, J. L. Casanova, N. Buist, E. Levy-Lahad,
M. Mazzella, O. Goulet, L. Perroni, F. D. Bricarelli, G. Byrne, M. McEuen, S. Proll, M.
Appleby and M. E. Brunkow (2001). "X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy
and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy." Nat Genet
27(1): 18-20.
Wildin, R. S., S. Smyk-Pearson and A. H. Filipovich (2002). "Clinical and molecular features
of the immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X linked (IPEX)
syndrome." J Med Genet 39(8): 537-45.
Wilson, A., H. R. MacDonald and F. Radtke (2001). "Notch 1-deficient common lymphoid
precursors adopt a B cell fate in the thymus." J Exp Med 194(7): 1003-12.
Wohlfert, E. A. and R. B. Clark (2007). "'Vive la Resistance!'--the PI3K-Akt pathway can
determine target sensitivity to regulatory T cell suppression." Trends Immunol 28(4):
154-60.
Woo, E. Y., C. S. Chu, T. J. Goletz, K. Schlienger, H. Yeh, G. Coukos, S. C. Rubin, L. R.
Kaiser and C. H. June (2001). "Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from
patients with early-stage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer."
Cancer Res 61(12): 4766-72.
Wood, K. J., G. Feng, B. Wei, B. Sawitzki and A. R. Bushell (2007). "Interferon gamma:
friend or foe?" Transplantation 84(1 Suppl): S4-5.
Wood, K. J. and B. Sawitzki (2006). "Interferon gamma: a crucial role in the function of
induced regulatory T cells in vivo." Trends Immunol 27(4): 183-7.
Wulfing, C., J. D. Rabinowitz, C. Beeson, M. D. Sjaastad, H. M. McConnell and M. M. Davis
(1997). "Kinetics and extent of T cell activation as measured with the calcium signal."
J Exp Med 185(10): 1815-25.
Xavier, R., T. Brennan, Q. Li, C. McCormack and B. Seed (1998). "Membrane
compartmentation is required for efficient T cell activation." Immunity 8(6): 723-32.
Yamaguchi, T., K. Hirota, K. Nagahama, K. Ohkawa, T. Takahashi, T. Nomura and S.
Sakaguchi (2007). "Control of immune responses by antigen-specific regulatory T
cells expressing the folate receptor." Immunity 27(1): 145-59.
Yannelli, J. R., J. A. Sullivan, G. L. Mandell and V. H. Engelhard (1986). "Reorientation and
fusion of cytotoxic T lymphocyte granules after interaction with target cells as
determined by high resolution cinemicrography." J Immunol 136(2): 377-82.
145
Références Bibliographiques
Yurchenko, E., M. Tritt, V. Hay, E. M. Shevach, Y. Belkaid and C. A. Piccirillo (2006). "CCR5dependent homing of naturally occurring CD4+ regulatory T cells to sites of
Leishmania major infection favors pathogen persistence." J Exp Med 203(11): 245160.
Zhang, W., J. Sloan-Lancaster, J. Kitchen, R. P. Trible and L. E. Samelson (1998). "LAT: the
ZAP-70 tyrosine kinase substrate that links T cell receptor to cellular activation." Cell
92(1): 83-92.
Zhang, W., R. P. Trible, M. Zhu, S. K. Liu, C. J. McGlade and L. E. Samelson (2000).
"Association of Grb2, Gads, and phospholipase C-gamma 1 with phosphorylated LAT
tyrosine residues. Effect of LAT tyrosine mutations on T cell angigen receptormediated signaling." J Biol Chem 275(30): 23355-61.
Zhao, D. M., A. M. Thornton, R. J. DiPaolo and E. M. Shevach (2006). "Activated
CD4+CD25+ T cells selectively kill B lymphocytes." Blood 107(10): 3925-32.
Zheng, Y., S. Z. Josefowicz, A. Kas, T. T. Chu, M. A. Gavin and A. Y. Rudensky (2007).
"Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T
cells." Nature 445(7130): 936-40.
Zheng, Y. and A. Y. Rudensky (2007). "Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage." Nat
Immunol 8(5): 457-62.
Zinkernagel, R. M., G. N. Callahan, J. Klein and G. Dennert (1978). "Cytotoxic T cells learn
specificity for self H-2 during differentiation in the thymus." Nature 271(5642): 251-3.
Zinkernagel, R. M. and P. C. Doherty (1974). "Restriction of in vitro T cell-mediated
cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic
system." Nature 248(450): 701-2.
Zorn, E., E. A. Nelson, M. Mohseni, F. Porcheray, H. Kim, D. Litsa, R. Bellucci, E.
Raderschall, C. Canning, R. J. Soiffer, D. A. Frank and J. Ritz (2006). "IL-2 regulates
FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STATdependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo." Blood
108(5): 1571-9.
Zou, W. (2006). "Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy." Nat Rev
Immunol 6(4): 295-307.
146