gfmom td 1 levure

TD GFMOM Levure 1 14/03/12 Levure comme organisme modèle :
Cycle cellulaire ; cytokinèse ; recombinaison ; réplication ; réparation ; architecture
nucléaire ; chromatine ; transcription ; métabolisme énergétique ; trafic ; traduction ; génome ;
stabilité ; évolution ; ect
Les prions de levures qui sont très nombreux (20), utilisation de composer pour lutter contre eux : protéine infectieuse, agent responsable de la vache folle= tremblante du mouton. Protéine de l’organisme PRP, prend différent état : normal ou prion. Quand il y a rencontre entre une protéine normale et une protéine prion, la protéine prion oblige la protéine normale à changer de conformation, accumulation protéine prion, c’est à l’origine de la maladie. Il n’y a pas d’acide nucléique, c’est uniquement les interactions entre les protéines. La levure est utilisé en organisme modèle, délétion rapide, sélection de mutant et trouver de nouveau partenaire dans un organisme. Génétique direct / classique : on s’intéresse à la réparation ou à la stabilité des génomes, recherche de mutant par mutagénèse, identifier de nouveaux gènes pour complexifier le schéma. On part d’une voie, d’un phénomène qui nous intéresse et l’on recherche de nouveaux mutants pour identifier de nouveaux acteurs. Sélection par crible. Génétique inverse : gène qui nous intéresse et l’on veut savoir dans quoi intervient la protéine codée par ce gène. Dans quel mécanisme la protéine est impliquée, cela passe par la délétion du gène, et ensuite tester une batterie de phénotype pour voir ou va intervenir cette protéine. Haplodiplobiontique : la levure est capable de se multiplier à l’état haploïde, conjugaison -­‐> obtention diploïde. Multiplication, obtenir des clones à l’état diploïde et par la suite il y a la méiose, la sporulation qui permet de revenir à l’état haploïde. PARTIE I Déterminez combien de sites sont mis en jeu dans chacun des caractères considérés. En les prenant deux à deux, établissez la carte génétique de ces sites. a et α sont les types sexuels. On ne peux jamais avoir de diploïde homozygote (a/a ou α/α) Il faut déjà monter chacun des caractères, qui sont contrôlés par un seul site. On prend les caractères un par un. Hypothèse 1 : Dans ce croisement, la prototrophie pour le tryptophane est contrôlé par un site ou un gène appelé TRP1 avec deux allèles trp1-­‐1 et TRP1. On ne précise pas si le site ou le gène était situé sur un autosome ou un chromosome X car cela n’existe pas dans la levure. Pas de chromosome sexuel dans la levure mais un locus sexuel qui est sur un chromosome mais l’autre partenaire a le même, il y a juste une différence au niveau du locus sexuel, il n’y a pas de chromosome sexuel comme on l’entend chez les animaux. TD GFMOM Levure 1 14/03/12 B trp 1-­‐1 [TRP-­‐] X C TRP1 [TRP+] 2n trp 1-­‐1 [ TRP+] TRP1 TRP1 > Trp 1-­‐1 Le phénotype associé à l’allèle TRP1 est dominant sur le phénotype associé à l’allèle trp1-­‐1. Sporulation 50% trp1-­‐1 [TRP-­‐] 50% TRP1 [TRP +] Analyse sur 1000 spores [TRP + ] [TRP -­‐ ] Effectif théorique Effectif observé 500 501 500 499 On constate que les effectifs ne sont pas significativement différents, hypothèse de un site est donc accepté. Hypothèse 2 : Dans ce croisement, la prototrophie pour la méthionine est contrôlé par un site ou un gène appelé MET3 avec deux allèles met3-­‐1 et MET3. B MET3 [MET+] X C met 3-­‐1 [MET-­‐] 2n met 3-­‐1 [MET+] MET3 MET3 > met 3-­‐1 Le phénotype associé à l’allèle MET3 est dominant sur le phénotype associé à l’allèle met 3-­‐1. Sporulation 50% met 3-­‐1 [MET-­‐] 50% MET3 [MET+] TD GFMOM Levure 1 14/03/12 1000 spores [MET +] [MET -­‐] Effectif théorique Effectif observé 500 497 500 503 On constate que les effectifs ne sont pas significativement différents, hypothèse de un site est donc accepté. Hypothèse 3 : Idem pour la thermo sensibilité, on conclut à un seul site. Etude de liaison : indépendant ou liés Il y a 3 façons de faire : 1/ Test de l’indépendance trp 1-­‐1 MET3 X trp 1-­‐1 TRP1 TRP1 met 3-­‐1 MET 3 met 3-­‐1 PARENTAUX Trp 1-­‐1 TRP 1 MET3 met 3-­‐1 [TRP -­‐ MET +] [TRP + MET -­‐] RECOMBINES Trp 1-­‐1 TRP1 met 3-­‐1 MET3 [TRP – MET -­‐] [TRP+ MET+] Si il y a indépendance alors on s’attend à 25% de chacune des catégories. 1000 spores TRP-­‐ MET+ TRP+ MET-­‐ TRP-­‐ MET-­‐ TRP+ MET+ Effectif théorique 250 250 250 250 Effectif observé 401 405 98 96 Les résultats observés et théoriques sont significativement différents donc les sites sont liés. On peut calculer une distance. Distance = Nombre de recombinés x 100 = (98+96) x 100 = 19,4 cM Nombre total 1000 TD GFMOM Levure 1 14/03/12 2/ Calcul de fréquence Frec = Nombre de recombinant = 96+98 = 0,194 Nombre total 1000 La fréquence est comprise entre 0 et 1. Si fréquence de recombinaison est d’environ 0,50 alors il y a indépendance. Si fréquence de recombinaison est inférieur à 0,5, les gènes sont liés, on calcul la distance. On multiplie par 100 pour obtenir des cM. Ici les sites sont liés 0,194 < 0,5. 3/ Ici on a Parentaux > Recombinés (401+405 > 96+98) Les 2 sites sont liés, on peut calculer la distance. Distance TRP1 – TS1 = [(75+65+102) x 100] / 1000 = 14 cM Distance MET3 -­‐ TS1 = [(1+2+31+26) x 100] / 1000 = 6 cM Carte génétique 19,4 est différent de 6+14, on a négligé les doubles recombinants. Deuxième et troisième ligne du tableau. Taille du génome de Saccharomyces cerevisiae = 12/13 Mb, 6 600 gènes. 1 cM = 2 kb dans la levure. TD GFMOM Levure 1 14/03/12 PARTIE II A l’aide d’un schéma, décrivez le ou les événement(s) pouvant être à l’origine de cette souche transformée. On part du gène et on essaye de déterminer le rôle de la protéine codée par le gène. met3+ = MET3+ Transformation, on veut obtenir la délétion de t. Délétion de la partie codante. Pour faire une recombinaison dans la levure, il faut 30 pb pour que la levure soit capable de faire de la recombinaison. Puis on réalise une PCR, le produit contient le marqueur LEU2 complet plus de chaque côté les régions. (bleu et vert sur le schéma). Il y a donc possibilité de recombinaison. On obtient une souche délétée pour t. On a laissé LEU2 sous son propre promoteur et non sous le promoteur de t car on ne sait pas quand il est exprimé. Or on veut que de l’enzyme LEU2 soit toujours produite pour obtenir une souche prototrophe pour la leucine. Avec toujours les régions homologues. Obtention d’un hétérozygote LEU2 et leu2-­‐1, on obtient une souche [LEU+]. Autres types de transformant : [LEU+] -­‐ recombinaison homologue au locus LEU2 Efficacité de la recombinaison dépend de la taille des régions homologues, ici régions beaucoup plus importante donc on s’attend à avoir une efficacité plus importante. -­‐ recombinaison non homologue Recombinaison n’importe ou dans le génome. PCR sur le fragment contenant t est une bonne méthode mais on n’utilise pas de grand fragment. Le Southern Blot est là pour vérifier l’amplification par sonde. Pourquoi des diploïdes ? Car l’on peut déleter un gène essentiel à la survie contrairement aux haploïdes ou l’on obtiendrais que des recombinaisons non homologues. Attention à la délétion des gènes. TD GFMOM Levure 1 14/03/12 PARTIE III Quelles conclusion tirez-­vous de cette observation ? On récupère le diploïde, on récupère le transformant, il y a sporulation, analyse de tétrades, analyse en asques. Quand on sème 4 spores, il y en a 2 qui se développent et 2 qui ne se développent pas. On a une ségrégation 2 :2. Possibilités : T est essentiel à la survie de la levure. T est essentiel à la germination des spores. Expérience pour faire la différence entre un gène essentiel et un gène essentiel pour la germination. Mettre t sur un plasmide qui est sous le contrôle d’un promoteur inductible par le froid ou par le chaud. Avoir un promoteur régulé. Au niveau de la spore on exprime t, on regarde la germination. Si germination on se met dans des conditions ou t n’est plus exprimé et l’on regarde s’il y a survie ou non. Mettre t dans un plasmide où l’on peut induire son expression par des conditions environnementales. Est ce que l’on est capable de récupérer les spores ? Transformation du diploïde. Si oui, t est indispensable pour la germination quand on passe dans des conditions environnementales ou t n’est plus exprimé, ou même en exprimant t dans les spores qui germe. T est probablement un gène essentiel. PARTIE IV 1/ Est-­ce étonnant Non étonnant car on a remplacé t . Au niveau du diploïde à avoir une situation d’hétérozygotie pour le locus t, donc on obtient : Δt ::LEU2/t 2 spores Δt :: LEU2 [LEU+] 2 spores t [LEU-­‐] 2/ Ecrivez le génotype des 4 spores de ces différentes tétrades. Comment interprétez vous les fréquences de ces trois types de tétrades ? Analyse en asque. TD GFMOM Levure 1 14/03/12 Le nombre de DP ≠ DR donc les sites sont liés. On a aussi DP > DR Pour calculer la distance : Distance = 2TT + 4DNP / 4 x nombre de tétrades = 58*100 / 400 = 14,5 cM. Avec les tétrades, on peut tenir compte des doubles crossing over rien qu’avec 2 caractères. On considère une fois 1 CO et deux fois ceux qui on 2 CO. Quand on a 1 CO, on a un TT. O CO = DP 1 CO = TT 2 CO = DNP Quand on prend en compte les 2 CO pour le calcul de la distance : On inclut 2 fois ceux qui ont un événement de double crossing-­‐over. Distance = 4x4xnombre de DNP + 2(TT-­‐2DNP) / 4 x nombre total d’asque Distance = [(1/2)TT + 3DNP / nombre d’asque] x 100 = 16,5 cM Distance plus précise pour ces 2 sites. TD GFMOM Levure 1 14/03/12 3/ Ecrivez le génotype des 4 spores de ces différentes tétrades. Comment interprétez vous les fréquences de ces deux types de tétrades ? ( A faire à la maison) Raisonnement idem qu’au dessus pour MET Distance MET3-­‐t = 6 cM Quelle précision vous apporte l’ensemble de ces résultats sur l’événement ayant donné naissance à la souche transformée E à partir de la souche D ? Les distances sont proches, on ne peut exclure l’hypothèse que les mutants sélectionnés en première partie et t correspondent à la même chose. Ces résultats vous suggèrent-­ils une relation entre l’unité de transcription « t » et le gène dont la mutation empêche la multiplication de la souche B à 32°C ? Proposez une expérience permettant de tester cette hypothèse. 1 gène = 2 cM donc pour t et le premier caractère, on a la même distance donc il serait au même endroit donc sur le même gène. Le premier mutant soit muté dans t , l’hypothèse la plus simple pour tester cette idée est l’utilisation de la technique de complémentation fonctionnel, permet de dire si ils sont touchés sur le même gène ou non. Si retour au phénotype sauvage, ils ne sont pas mutés dans le même gène. Si maintient du phénotype mutant, ils sont mutés dans le même gène. On peut alors déterminer si TS1 est muté dans t.