THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Immunologie Présentée et soutenue par Guillaume SARRABAYROUSE Le 14 décembre 2007 Titre : Rôle régulateur des protéines Rho dans la réponse Immune anti-mélanome. JURY Pr Salvatore Valitutti Président du Jury Pr Jacques Urbain Rapporteur Pr Thierry Velu Rapporteur Dr Gervaise Loirand Examinatrice Dr Anne Françoise Tilkin-Mariamé Directrice de Thèse Pr Gilles Favre Co-directeur de Thèse Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies Unité de recherche : INSERM U563 Directeur(s) de Thèse : Dr Anne-Françoise Tilkin-Mariamé et le Pr Gilles Favre Rapporteurs : Pr Jacques Urbain et Pr Thierry Velu Résumé Les stratégies d’immunothérapie sont basées sur l’existence d’antigènes de tumeur (TAA) contre lesquels l’hôte est capable d’induire une réponse immune spécifique. Cependant, les cellules tumorales sont souvent peu immunogènes à cause de leur faible densité en complexes CMH de classe I (CMH-I)/TAA ou à cause de leur incapacité à délivrer des signaux de costimulation. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence, que l’inhibition de la géranylgéranyl transférase I par le GGTI-298 favorise l’induction d’une réponse immune anti-mélanome, en induisant, sur les cellules tumorales murines B16F10 traitées, une expression des molécules de costimulation (CD80 et CD86) et une surexpression des molécules du CMH-I, induite par l’INF-γ. Ces modifications permettent de favoriser le rejet immun des mélanomes traités injectés à des souris immunocompétentes et induisent chez ces souris l’activation de lymphocytes T spécifiques. Comme différentes petites protéines G de la famille Rho peuvent être géranylgéranylées, l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des protéines Rho (Rho A, Rho B et Rho C) a montré leur(s) implication(s) dans ces régulations. Ainsi, le traitement in vitro des cellules mélaniques murines par la combinaison d’INF-γ et d’inhibiteurs des protéines Rho (C3 exoenzyme) induit une forte surexpression des molécules CMH-I et des molécules de costimulation CD80 et CD86 à la membrane des cellules tumorales. Par ailleurs, nous avons évalué l’intérêt thérapeutique de nos traitements pharmacologiques associant l’IFN-γ et le GGTI-298. Nous avons dans un premier temps testé le potentiel vaccinal de nos traitements en montrant que des souris injectées avec des cellules B16F10 préalablement traitées et iradiées étaient partiellement protégées contre le développement de tumeurs sauvages. Dans un deuxième temps, nous avons montré que ces traitements induisent sur des tumeurs humaines une surexpression des molécules HLA de classe I et des molécules de costimulation ayant des activités activatrices (CD86) ou inhibitrices (PDL1) et provenant des familles B7 ou TNF/TNFR. De plus, nous avons mis en évidence la capacité stimulatrice de ces mélanomes humains prétraités à induire in vitro l’activation de lymphocytes T CD8 cytotoxiques spécifiques des mélanomes et sécrétant de l’IFN−γ, à partir de donneurs sains HLA-compatibles. Au cours de cette thèse nous avons également mis en évidence le rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression de deux molécules de la famille des TNF : « FasL et CD70 ». La molécule FasL est exprimée sur de nombreuses lignées tumorales et favorise le mécanisme de contre-attaque tumorale en induisant l’apoptose de LT ou LB Fas positifs par la voie d’apoptose induite par la fixation du ligand Fas-L sur son récepteur Fas. Nous avons montré que la protéine RhoA et son effecteur ROCKp160 régulent de façon négative l’expression de Fas-L à la membrane des cellules de mélanome murin B16F10. Ces protéines limitent ainsi in vitro le mécanisme de contre-attaque tumorale. La molécule CD70 est exprimée sur diverses lignées tumorales mais son rôle fait encore l’objet de controverses. Nous avons montré pour la première fois qu’une lignée de mélanome métastatique humaine exprime de façon constitutive la molécule CD70 et que cette expression, régulée positivement par la protéine RhoA, inhibe in vitro la prolifération de lymphocytes allogéniques. L’ensemble de ce travail de thèse a permis de montrer que les protéines Rho régulent l’expression de nombreuses molécules impliquées dans la mise en place de réponses immunes anti-mélanome. Ces résultats permettent d’envisager le développement de protocoles d’immunothérapie clinique utilisant des cellules de mélanomes HLA-compatibles prétraitées in vitro par l’association IFNγ plus GGTI-298 comme cellules « thérapeutiques » ou vaccinales. Summary Melanoma is a highly lethal cutaneous tumor, killing affected patients through multiple, poorly immunogenic metastases. Suboptimal activation of T lymphocytes by melanoma cells is often due to the defective expression of class I major histocompatibility antigens (MHC-I) and costimulatory molecules, or to the capacity of FasL molecules expressed on melanoma cells to induce lymphocyte apoptosis. In this work, I demonstrated that statins, inhibitors of HMGCoA reductase, enhance mIFN-γ induced expression of MHC class I antigens on murine B16F10 melanoma. GGTI298, a geranylgeranyl transferase I inhibitor, mimics this effect of statins that is related to peptide transporter protein TAP1 up-regulation. Simultaneously, GGTI-298 induces the expression of CD80 and CD86 costimulatory molecules. C3 exoenzyme, which selectively inactivates Rho proteins, phenocopies the effects of GGTI-298, indicating a role for Rho proteins in these events. Furthermore, the treatment of B16F10 cells with GGTI-298 or C3 exoenzyme associated with mIFN-gamma induces in vivo tumor growth slowing down in immunocompetent but not in nu/nu syngeneic mice. Both in vivo injections and in vitro restimulation of splenocytes with GGTI-298- and mIFN-gamma-treated B16F10 cells induces an enhancement of specific CD8 T lymphocytes labeled by TRP-2/H-2K(b) tetramers. Using a human melanoma model (LB1319-MEL), we demonstrated that in vitro treatment with hIFN-γ and GGTI-298 led to the up regulation of MHC-I and a costimulatory molecule CD86 and down regulation of an inhibitory molecule PD-1L. Co-culture experiments with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) revealed that modifications induced by hIFN-! and GGTI298 on the selected melanoma cells, enables the stimulation of lymphocytes from HLA compatible healthy donors. Indeed, as compared with untreated melanoma cells, pretreatment with hIFN-γ and GGTI-298 together rendered the melanoma cells more efficient at inducing the: i) activation of CD8 T lymphocytes (CD8+/CD69+); ii) proliferation of tumorspecific CD8 T cells (MelanA-MART1/TCR+); iii) secretion of hIFN-γ; and iv) anti-melanoma specific cytotoxic cells. In this study, it is shown that vaccination with mIFN-γ and GGTI-298 pretreated B16F10 cells induces a protection against untreated tumor growth and pulmonary metastases implantation. Furthermore the capacity of FasL molecules expressed on melanoma cells to induce lymphocyte apoptosis contributes to either antitumor immune response or escape depending on their expression level. Little is known, however, about the mechanisms regulating FasL protein expression. Using the murine B16F10 melanoma model weakly positive for FasL, we demonstrated that in vitro treatment with statins enhances membrane FasL expression. C3 exotoxin and the geranylgeranyl transferase I inhibitor GGTI-298, mimic this effect. Inhibition of RhoA expression by small interfering RNA (siRNA) increased membrane FasL expression, whereas overexpression of constitutively active RhoA following transfection of RhoAV14 plasmid decreased it. Moreover, the inhibition of a RhoA downstream effector p160ROCK also induced this FasL overexpression. We conclude that the RhoA/ROCK pathway negatively regulates membrane FasL expression in these melanoma cells. Furthermore, we have shown that B16F10 cells, through the RhoA/ROCK pathway, promote in vitro apoptosis of Fas-sensitive A20 lymphoma cells. All together, these data indicate that protein geranylgeranylation as well as Rho protein are critical for regulating on melanomas the expresion of molecules involved in anti-melanoma immune response. These results, indicate that treatment of melanoma cell lines with pharmacological molecules targeting Rho proteins, be a novel approach to produce tumor cells suitable for vaccination and for stimulation of anti-melanoma effector cells. SOMMAIRE Données Bibliographiques………………………………………………..p1 Partie I : La réponse immune anti-tumorale et ses limites I-La réponse immune innée anti-tumorale………………………………...p3 A-Les cellules Natural Killer : NK B-Les lymphocytes Natural Killer T : NKT C-Les lymphocytes T gamma-delta : LTγδ D-Les Cellules Dendritiques : Les CD 1) La capture de l’antigène 2) La dégradation et l’apprêtement des antigènes 2.1) Voie de présentation par les molécules du CMH-I 2.2) Voie de présentation par les molécules du CMH-II 2.3) Voie alternative, présentation croisée 3) Migration et maturation des CD 4) Les cytokines et chémokines E-Les Cellules dendritiques myéloïdes (CDm) et plasmacytoïdes (CDp) F-Les IKDC le chaînon manquant II-La réponse immune adaptative anti-tumorale………………………...p25 A-Les Antigènes de tumeurs 1) Les antigènes d’origine embryonnaire 2) Les antigènes de différenciation 3) Les antigènes surexprimés 4) Les antigènes spécifiques des tumeurs B-L’activation de la réponse immune adaptative 1) La signalisation par le TCR : le premier signal d’activation lymphocytaire 2) Le signal de costimulation 2-1) Les molécules de costimulation de la famille des immunoglobulines: 2-2) Les molécules de costimulation de la famille des TNF (Tumor Necrosis Factor) 2-3) Les ligands activateurs des cellules NK 3) La synapse immunologique C-Acquisition des fonctions effectrices des LT et rôles dans la réponse immune anti-tumorale. 1) Les LTCD8 cytotoxiques 2) Les LTCD4 auxiliaires D-La mémoire immunitaire associée aux LT E-Les Lymphocytes B III Mécanismes d’échappement des tumeurs à l’immunosurveillance……………………………………………………………...p44 A-Mécanismes d’échappement tumoral lié à des modifications membranaires des cellules tumorales 6) Perte ou diminution de l’expression des molécules du CMH-I 2) La contre attaque tumorale associée à l’expression de protéines de la famille du TNF 3) Rôle de deux molécules inhibitrices de la famille des immunoglobulines dans l’échappement tumoral : les protéines PD-L1 et PD-L2 4) Rôle des molécules de CMH non classique dans l’échappement tumoral : les protéines HLAG et HLA-E B-Mécanismes d’échappement tumoral associés aux effecteurs immuns 6) Les LT régulateurs : les Treg 2) Les Macrophages Associés aux Tumeurs : Les TAM 3) Les cellules dendritiques : Les CD 3.1) Les cellules dendritiques immatures (Cdi) 3-2) Les cellules dendritiques plasmacytoïdes : (CDp) 4) Les cellules suppresseurs myéloïdes : Les MSC C-Les Mécanismes d’échappement tumoral associés auxmolécules du microenvironnement 1)L’ indoleamine 2,3-dioxygenase : IDO 2) Le facteur de croissance transformant béta : TGFβ 3) Le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor): 4) Les Chémokines 5) La cyclooxygénase 2 : COX2 6) L’arginase et la nitric-oxide synthase : ARG et NOS Partie II : Les protéines Rho de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’immunothérapie du mélanome I Le mélanome cutané…………………………………………………………...p60 A-Les divers types de mélanomes B-Histologie et développement des mélanomes C-Altérations génétiques impliquées dans l’apparition des mélanomes D) La voie de signalisation Ras / Raf / MEK / Erk 2) Le facteur de transcription MITF 3) La voie de la PI3K 4) Mutations des voies de survie et d’apoptose 5)Altérations des gènes suppresseurs de tumeur D-Traitements ciblés des mélanomes II Immunothérapies du mélanome……………………………………………p72 A-L’Interféron alpha (IFN-α) et l’Interleukine 2 (IL-2) B-La chimio-immunothérapie C-Les immunoadjuvants D-La vaccination par cellules tumorales E-La vaccination par protéines de choc thermiques F-La vaccination par peptides ou protéines de tumeurs G-La Vaccination par cellules dendritiques H-Vaccination par plasmides ou vecteurs viraux I-L’immunothérapie adoptive J-Electrochimiothérapie et électroimmunothérapie III Les statines………………………………………………………………………..p83 A-Origine et mode d’action des statines B-Statines et cancer 1) Lignées de cancers colorectaux 2) Lignées de cancers du sein 3) Lignées de mélanomes C-Rôles immunomodulateurs des statines IV Les petites protéines G de la famille Rho……………………………………...p91 A-Propriétés générales des protéines Rho B-Fonctions des protéines Rho 1) GTPases Rho et cytosquelette 1-a) GTPases Rho et cytosquelette d’actine 1-b) GTPases Rho et microtubules 2) GTPases Rho et trafic cellulaire 3) GTPases Rho et expression génique 4) GTPases Rho et progression du cycle cellulaire 5) GTPases Rho et apoptose C-Propriétés immunomodulatrices des protéines Rho 1) GTPases Rho et sélection thymique 2) GTPases Rho et activation lymphocytaire 3) GTPases Rho et cytotoxicitée 4) GTPases Rho et présentation antigénique E-Moyens d’étude des fonctions des protéines Rho dans les cellules 1) Modification de l’activité et de la localisation des protéines Rho :la prénylation 2) Transfection des différentes formes mutantes des Rho 3) Extinction de la protéine Rho ou de ses régulateurs par siRNA 4) Modulation de l’activité des Rho 5) Quantification des protéines Rho activées Objectifs des travaux………………………………………………………...p104 Résultats…………………………………………………………………………….p105 RESULTAT I Geranylgeranyl transferase inhibition stimulates antimelanoma immune response through MHC class I ans costimulatory molecule expression. Tilkin-Mariamé, AF ; Cormary ,C; Ferro, N; Sarrabayrouse, G; Lajoie-MAZENC, I; Faye, JC; Favre, G. FASEB J. 2005 Sep;19(11):1513-5. RESULTAT II Enhancement of melanoma specific immune response induced by IFN-γ and GGTI-298 treatment of human melanoma cells. Sarrabayrouse, G; Armand-Labit, V; Moriez, R; Leveque, K; Favre,G ; Tilkin-Mariamé A-F. Manuscrit soumis: Molécular Cancer Therapeutics RESULTAT III Induction of protective antitumor immunity by vaccination with melanoma cells treated with IFN-γ and geranylgeranyltransferase inhibitor : GGTI-298. Sarrabayrouse, G; Armand-Labit, V; Favre, G ; Tilkin-Mariamé, A-F. Résultats préliminaires RESULTAT IV Statins stimulate in vitro membrane FasL expression and lymphocyte apoptosis through RhoA/ROCK pathway in murine melanoma cells. Sarrabayrouse, G; Synaeve, C; Leveque, K; Favre, G; Tilkin-Mariamé A-F. Néoplasia Décembre 2007 in press RESULTAT V RhoA protein positively regulates CD70 expression on a human melanoma cell line: implication toward T lymphocytes proliferation. Sarrabayrouse, G. ; Favre,G ; Tilkin-Mariamé, AF Résultats préliminaires Conclusion générale…………………………………………………………P134 Discussion…………………………………………………………………………P136 I Rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des protéines impliquées dans la réponse immune anti-mélanome p137 I-1) Mécanisme dépendant de l’IFN-γ A) Les molécules du CMH de classe I B) La protéine PD-L1 I-2) Mécanisme indépendant de l’IFN-γ A) CD80/CD86 B) FasL C) CD70 II Rôle régulateur des protéines Rho dans le développement de la réponse immune anti-mélanome……………………………………………………………… p148 II-1) Présentation des TAA par les cellules tumorales traitées II-2) Rôle in vivo de l’expression de FasL sur les cellules de mélanomes II-3) Evaluation du rôle de l’expression de CD70 à la surface des cellules tumorales dans la mise en place de la réponse immune anti-mélanome III Perspectives……………………………………………………………………….p153 III- 1) Etude du rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des CMH-II dépendante de l’IFN-γ et ses conséquences sur la réponse immune anti-tumorale III-2) Rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression par les cellules de mélanome des molécules activatrices de l’immunité innée III-3) L’inhibition des protéines Rho a-t-elle un intérêt dans la mise en place de protocoles d’immunothérapie clinique? Bibliographie …………………………………………………………………….p157 Index des figures et tableaux Figure 1 : Balance des signaux activateurs et inhibiteurs au cours des réponses immunes médiées par les cellules NK. (p4) Figure 2: Modèle d’activation des NKT par l’IL-12 (a) ou l’α-GalCer (b). (p7) Figure 3 : Rôle des LTγδ résidents et circulants dans la surveillance anti-tumorale. (p9) Figure 4 : Présentation du protéasome et de l’immunoprotéasome. (p13) Figure 5 : Voie d’apprêtement et de présentation des molécules de CMH-I. (p15) Figure 6 : Voie de présentation des antigènes par les molécules de CMH-II. (p17) Figure 7 : Présentation croisée. (p19) Figure 8 : Activation de la réponse immune adaptative par les cellules dendritiques. (p22) Tableau 1 : Les Antigènes de tumeurs. (p26) Figure 9 : Représentation du TCR. (p31) Figure 10 : Réarrangement des fragment VDJ du TCR. (p31) Figure 11 : La synapse immunologique. (p35) Figure 12 : Les deux voies de cytotoxicité lymphocytaire : voie Fas/Fas ligand et la voie perforine/granzyme. (p37) Figure 13 : Différenciation TH1/TH2/TH17. (p40) Figure 14 : Les trois phases du processus d’immunoédition des cancers. (p45) Figure 15 : Contre attaque tumorale dépendante de FasL. (p48) Figure 16 : Contre attaque tumorale dépendante de CD70. (p48) Figure 17 : Les différents stades de la liaison mélanocytaire. (p62) Figure 18 : Cycle d’activation des GTPases Ras. (p64) Figure 19 : Activation de la voie des MAPK par les facteurs de croissance.(p64) Figure 20 : La Phosphatidyl-Inositol3Kinase (PI3K). (p67) Figure 21 : Le rôle de la voie p16INK4a/RB dans l’arrêt du cycle cellulaire. (p69) Figure 22 : Structure d’un tétramère de CMH. (p78) Figure 23 : La voie du mévalonate. (p84) Figure 24 : La prénylation protéique. (p85) Figure 25 : La famille des protéines Rho. (p92) Figure 26 : Cycle d’activation des protéines Rho. (p92) Les recherches de ces vingt dernières années indiquent que les tumeurs sont potentiellement immunogènes, c’est-à-dire capables de déclencher des réponses immunes visant à les éliminer. Le système immunitaire, inné et adaptatif, intervient dans la reconnaissance des tumeurs malignes permettant parfois leur élimination. L’immunologie des tumeurs est fondée ainsi sur deux concepts essentiels : la surveillance immunitaire des cellules tumorales et les mécanismes d’évasion permettant à la cellule cancéreuse d’échapper à la destruction tumorale. Nous développerons par la suite ces deux concepts. En 1893, William Coley a observé que l’injection d’extraits bactériens pouvait entraîner la régression de tumeurs chez des patients atteints de cancer (Coley et al., 1991). Ainsi le système immunitaire après une activation non spécifique a été capable de mettre en place une réponse immune anti-tumorale efficace. Mais les toxines de Coley, n’aboutissant qu’à des résultats partiels et disparates, sont abandonnées à partir de 1910. Paul Ehrlich, en 1909, suggéra que les cellules modifiées de l’organisme pouvaient être considérées comme étrangères et être ainsi éliminées par le système immunitaire. Cinquante ans plus tard, Lewis Thomas émet l’hypothèse que l’immunité à médiation cellulaire est le principal mécanisme impliqué dans l’élimination des cellules cancéreuses. D’après ces théories, un cancer survient s’il y a échappement des cellules tumorales au système immunitaire, ce qui a conduit Macfarlane Burnet à proposer le concept d’IMMUNOSURVEILLANCE (Burnet et al., 1970). Les travaux de Burnet ont suggéré l’existence d’une relation entre système immunitaire et cancer, et l’ont conduit à élaborer ainsi la théorie de la surveillance immunitaire. Celle-ci repose sur l’hypothèse selon laquelle le système immunitaire, et en particulier les lymphocytes T (LT), joueraient un rôle de surveillance de l’organisme en reconnaissant les cellule néoplasiques comme étrangères et en les éliminant à un stade précoce, grâce à l’expression d’antigènes à leur surface. Selon ce concept, les tumeurs ne se développent que lorsque les cellules cancéreuses échappent au système immunitaire. En l’absence de preuves expérimentales formelles, cette théorie est restée longtemps très controversée. Cette notion d’immunosurveillance a évolué parallèlement aux progrès majeurs réalisés en immunologie. Elle connaît aujourd’hui un regain de vigueur (Dunn et al., 2002 ; Dunn et al., 2004) grâce à différentes observations ; notamment, la découverte, au cours d’autopsies, de tumeurs non détectées car jusqu’alors contrôlées par le système immunitaire, ou encore l’observation, confirmée par des données anatomopathologiques, de régressions spontanées de tumeurs. De plus, les cancers sont plus fréquents pendant la période néonatale ainsi que chez les sujets âgés, deux périodes de la vie au cours desquelles le système immunitaire est moins efficace. Ces maladies sont également plus fréquentes chez les sujets immunodéprimés. Un argument encore plus probant concerne l’infiltration de certaines tumeurs par des cellules lymphoïdes (lymphocytes T, cellules Natural Killer : NK) (Pagès et al., 2006). Depuis longtemps, cette infiltration est considérée comme le signe d’un pronostic favorable. L’immunosurveillance serait un processus hétérogène nécessitant l’action de différents effecteurs du système immunitaire et ceci de façon dépendante de la cellule tumorale, des mécanismes de transformation et des mécanismes d’identification immunologique. Dans ce processus d’immunosurveillance, l’immunité innée et l’immunité adaptative sont toutes les deux impliquées et collaborent pour éliminer les cellules tumorales. Dans cette première partie, nous discuterons des rôles respectifs des effecteurs de l’immunité innée et adaptative dans la réponse immune anti-tumorale mais également des mécanismes par lesquels les cellules tumorales échappent à la surveillance du système immunitaire. I La réponse immune innée anti-tumorale Les cellules impliquées dans l’immunité innée ou naturelle constituent une première barrière pour éliminer les cellules anormales, en particulier les cellules tumorales. Cette réponse immunitaire anti-tumorale innée est assurée par différentes cellules effectrices : les cellules Natural Killer (NK), les cellules NKT, les lymphocytes T gamma-delta (γδ), les cellules dendritiques (CD), les monocytes/macrophages, les polynucléaires neutrophiles et les polynucléaires éosinophiles. Dans cette partie, nous présenterons les principales cellules impliquées dans la surveillance immunitaire innée: les cellules NK, les cellules NKT, les lymphocytes Tγδ et les CD. A-Les cellules Natural Killer : NK Les NK représentent 10 à 20 % des PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Elles sont localisées dans le sang périphérique, les ganglions lymphatiques, la rate, la moelle osseuse (Ferlazzo al.,2004) et migrent aux sites de la réponse immune grâce à différentes cytokines chimioattractantes (Robertson et al., 2002). De part, le niveau d’expression membranaire de la molécule CD56 et la présence ou l’absence du marqueur de surface CD16 on distingue différentes sous populations de NKs (Farag et al., 2002). De nombreuses études in vitro ont démontré la capacité des lymphocytes NK à lyser des cellules tumorales et particulièrement des cellules tumorales ayant perdues l’expression des complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) (Smyth et al., 2002 ; Soloski et al., 2001). De plus, le rôle des cellules NK dans l’immunosurveillance anti-tumorale a également été mis en évidence in vivo chez les souris beiges. Ces souris qui possèdent des NK dépourvus d’activité lytique, ont une incidence élevée de tumeurs spontanées ou induites (Haliotis et al., 1985 ; Talmadge et al.,1980). Les cellules NK sont capables de lyser des cellules étrangères à l'organisme de manière indépendante de l'antigène et sans activation préalable, au contraire des lymphocytes T et B. Par leur fonction de lyse, on peut les rapprocher des lymphocytes T CD8+, mais la reconnaissance de la cible des NK est très différente de celle des lymphocytes T. En effet, les lymphocytes T reconnaissent et Cellule NK IFN-γ KAR + Class I - Ligands activateurs Transformation/ Infection Lyse des cellules CMH-I - NKG2D KIR CMH-I + -+ Class I IFN-γ MIC Transformation/ + - Class I + Infection Cellule normale protégée + Lyse des cellules CMH-I ayant des ligands activateurs surexprimés Figure 1 : Balance des signaux activateurs et inhibiteurs au cours des réponses immunes médiées par les cellules NK. répondent à des cibles portant un peptide particulier présenté par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), alors que les cellules NK sont spontanément lytiques envers toutes les cellules. Cependant, de nombreux mécanismes de régulation empêchent les NK de s'attaquer aux cellules saines. Il existe sur la membrane cellulaire des NK des récepteurs activateurs et/ou inhibiteurs de la fonction lytique (Bottino et al., 2004 ; Mol Moretta et al., 2004). Lorsqu'une cellule NK rencontre une autre cellule, la lyse de cette cellule ne se produira que si les signaux d'activation présents sur la cellule cible, surpassent les signaux d'inhibitions (Figure 1). Les récepteurs inhibiteurs comprennent les KIRs (Killer Ig Like Receptors) (Bottino et al., 2004) qui interagissent avec différents allèles du CMH de classe I et les récepteurs hétérodimériques CD94-NKG2A/B qui lient la molécule du CMH non-classique HLA-E (Braud et al., 1998). L’interaction d’un récepteur inhibiteur avec son ligand va transmettre à la cellule NK un signal négatif inhibant sa fonction lytique. C’est pourquoi les cellules NK ne lysent pas les cellules autologues saines qui expriment les molécules de CMH-I du soi alors qu’elles sont capables de lyser les cellules tumorales du même individu si ces cellules ont perdu l’expression des CMH-I. En absence de signal inhibiteur, l’activité cytotoxique de ces cellules est dépendante de récepteurs activateurs ; NKG2D et DNAM-1. Les récepteurs NKG2D et DNAM-1 reconnaissent des ligands induits par le stress, et exprimés à la surface des cellules tumorales comme MIC-A, UL-16 BP (Binding Protéin) et la Nectine-2 (DNAM-1 ligands) (Pende et al., 2001 ; Cerwanka et al., 2003 ; Pende et al., 2005). En plus de la balance entre signaux activateurs et inhibiteurs l’activité cytotoxique des NK est dépendante de la présence de cytokines (IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 et IFN-γ) (Bottino et al., 2004 ; Trinchieri et al., 2003). Suite à l’activation obtenue en présence de cytokines, les cellules NK deviennent des LAK (lymphokine-activated killer) qui prolifèrent, produisent à leur tour des cytokines, et surexpriment diverses protéines telles que des molécules d’adhésions, les protéines FasL, TRAIL, granzyme, perforine impliquées dans la fonction cytotoxique des NK (Bottino C et al., 2004 ; Moretta et al., 2004 ; Trinchieri et al., 1989 ; Zamai et al., 1998). B-Les lymphocytes Natural Killer T : NKT Les lymphocytes NKT, classiquement définies comme des cellules NK1.1+αβ+ chez la souris, présentent des caractéristiques qui les distinguent des cellules T et des cellules NK conventionnelles. Ces cellules expriment un récepteur pour l’antigène (TCR) (comme les Lymphocytes T) et reconnaissent des antigènes non pas par l’intermédiaire des molécules de CMH classique mais via la molécule CD1d. Plusieurs travaux ont démontré l’importance des NKT dans le rejet tumoral, notamment dans des souris suite à des injections d’galactosylcéramide (α-GalCer) ou d’IL-12. (Morita et al., 1995 ; Nakagawa et al., 1998 ; Nakagawa et al., 2000). L’ α-GalCer a été identifié comme le ligand présenté par la molécule CD1d au TCR des cellules NKT murines et humaines (Kawano et al., 1997 ; Brossay et al., 1998). Bien que possédant un TCR capable de reconnaître l’ α-GalCer, il a été montrés que les NKT ne jouaient pas le rôle d’effecteurs lytiques mais plutôt celui d’activateurs des cellules NK dans cette réponse anti-tumorale (Kitamura et al., 1999; Hayakawa et al., 2001; Tomura et al., 1999 ; Yang et al., 2000). Un modèle d’activation en trois étapes a même été suggéré pour expliquer comment la reconnaissance de cet antigène par les cellules NKT favorise l’activation des cellules NK (figure 2). Concernant l’implication des NKT dans l’effet anti-métastatique de l’IL-12 il a été montré qu’une faible quantité de cette cytokine stimulait une réponse dépendante uniquemment des NKT alors que des doses plus importantes favorisaient une réponse de type NK comme dans le cas de l’α-GalCer (Takeda et al., 2000; Smyth et al., 2000). Par ailleurs, Smyth et al ont montré que la population NKT jouait un rôle important dans la protection contre des tumeurs induite par le methylcholanthrene (MCA), en effet des souris déficientes pour la population NKT développent plus de tumeurs que des souris sauvages lorsqu’elles sont traitées par le MCA (Smyth et al.,2001). L’ensemble de ces observations semble démontrer l’implication des cellules NKT dans le rejet tumoral. Néanmoins, les travaux de Terabe et al (Terabe et al., 2000) rapportent que Figure 2: Modèle d’activation des NKT par l’IL-12 (a) ou l’α-GalCer (b). les NKT sont capables d’inhiber la réponse immune dépendante des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) via la production d’IL-13. Diverses études ont été entreprises savoir si ces cellules favorisaient ou pas la réponse immune anti-tumorale. Elles suggèrent que l’affinité du ligand, l’environnement cytokinique, la présence de signaux de costimulations ou le type de cellule présentatrice d’antigènes (APC) présentant le ligand conditionne la réponse des NKT dans le rejet tumoral. (Miyamoto et al., 2001; Hayakawa et al., 2001; Arase et al., 1994 ; Leite-De-Moraes et al., 2001 ; Hochrein et al., 2000 ; Kadowaki et al., 2001). C-Les lymphocytes T gamma-delta : LTγδ Les lymphocytes T (LT) expriment à leur surface un récepteur appelé TCR (T Cell Receptor) leur permettant de reconnaître les antigènes. On différencie deux grandes sous populations de lymphocytes T, selon que leur TCR est composé d’un hétérodimère αβ ou γδ, les Ltαβ et le LTγδ. Les cellules Tγδ proviennent de précurseurs hématopoïétiques, comme les cellules Tαβ, mais elles s’en différencient par plusieurs aspects. Les principales différences portent sur l’absence d’expression de co-récepteurs CD4 ou CD8 pour le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), la distribution dans l’organisme et la nature des structures antigéniques reconnues. En effet, les lymphocytes ab reconnaissent des complexes constitués d’un peptide antigénique lié à une molécule du CMH. Ce n’est pas le cas pour les LTγδ puisque la reconnaissance antigénique par le TCR γδ est indépendante d’une présentation par les molécules du CMH et les structures antigéniques ne sont pas des peptides. Les LTγδ représentent en moyenne 2 à 5% des lymphocytes circulants et sont abondants dans les tissus épithéliaux (Triebel et al., 1989). Dans le système sanguin ils se répartissent en deux sous populations principales différant par la nature des régions variables du TCR : les lymphocytes Vγ9Vδ2 (environ 2/3) et les lymphocytes VγxVδ1 (environ 1/3) (Figure 3). Présentes dans les tissus épithéliaux, les cellules Tγxδ1 pourraient intervenir comme première ligne de défense contre certaines infections et tumeurs (Ferrarini et al., 2002). Les cellules T qui expriment les régions variables du TCR Vγ9 et Vδ2, représentent la majorité des lymphocytes Tγδ du système lymphoïde périphérique non épithélial (Triebel et Figure 3 : Rôle des LTγδ résidents et circulants dans la surveillance anti-tumorale. Les LTγδ résidents interagissent avec des tumeurs solides exprimant MIC-A/-B ou reconnaissent les molécules CD1, alors que les LTγδ circulants reconnaissent des Ag phosphatés exprimés par les tumeurs hématologiques. D’après Ferrarini et al, 2002 al., 1989). Ces lymphocytes peuvent infiltrer certaines tumeurs et in vitro ont une activité cytotoxique contre certaines lignées de myélomes, de lymphomes ou de carcinomes (Kunzmann et al., 2000). L’implication de ces cellules dans l’immunité anti-tumorale a été mise en évidence chez la souris et chez l’homme. Girardi et al ont montré que des souris KO pour la chaîne δ du TCR, développant plus de tumeurs spontanées que les souris sauvages (Girardi et al 2001) et le groupe de Francine Jotereau a isolé à partir de l’acite d’un patient souffrant de tumeur colorectale (un clone lymphocytaires Tγ9δ2 capables de lyser les cellules tumorales autologues (Corvaisier et al 2005). Les LTγ9δ2 du sang périphérique sont activés par une variété d’antigènes de nature non peptidiques et phosphorylés appelés des phosphoantigènes. Chez les eucaryotes, ces molécules dérivent des isoprénoïdes de la voie de biosynthèse du mévalonate. Ces isoprényl-pirophosphates (IPP) capables d’activer les LTγ9δ2 sont présents en faible quantité dans les cellules saines mais leur concentration augmente dans certaines cellules tumorales. Certains types tumoraux produisent même de très grandes quantités de ces IPP permettant aux LTγ9δ2 de les reconnaître comme des antigènes tumoraux. Outre ces phosphoantigènes, il a récemment été montré que ces cellules reconnaissent la sous unité F1 de l’ATPase mitochondriale et l’apolipoprotéine A1 délipidée présente à la surface de lymphomes (Scotet et al., 2005). Par ailleurs, les récepteurs activateurs et inhibiteurs initialement caractérisés sur les cellules NK ont également été mis en évidence à la surface des LTγ9δ2. Comme pour les NK, le récepteur NKG2D est exprimé à la surface des LTγ9δ2 et interagit avec les molécules MICA/MICB et ULBPs exprimées à la surface des cellules tumorales. NKG2D joue un double rôle puisque en lui même il est capable d’activer les γ9δ2 (Rincon-Orozco et al., 2005) et potentialise l’activation des γ9δ2 induite par la liaison du TCR et de son ligand (Das et al., 2001). Tout comme les Vγ9δ2, les Tδ1 interagissent avec les molécules MICA/B et ULBPs et participent à la réponse immune anti-tumorale. En effet, Maeureur et al ont mis en évidence parmi les TIL de patients atteints de cancer colorectaux la présence de LTδ1 présentant une grande activité cytotoxique vis à vis des tumeurs autologues (Maeurer et al., 1996). D-Les Cellules Dendritiques : Les CD Les CD sont des cellules présentatrices professionnelles d’antigène (CPA) qui constituent une catégorie cellulaire extrêmement importante au niveau de la mise en place et de l’orchestration des différents acteurs lymphocytaires impliqués dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Les CD intègrent une quantité de signaux de l’environnement et participent ainsi à l’immunité innée. Elles jouent le rôle de sentinelles du système immunitaire et se trouvent à l’interface entre l’immunité naturelle et l’immunité acquise. Les CD expriment à leur surface des glycoprotéines membranaires du CMH de classe I et de classe II dont la principale fonction est la présentation des antigènes peptidiques aux lymphocytes T. Le CMH (système HLA chez l’homme et H-2 chez la souris) est un système multigénique, multiallélique et d’expression codominante. Il existe deux classes de molécules du CMH : classe I et classe II qui diffèrent de par leur localisation, leur fonction et l’origine des peptides présentés. Les CD ont la capacité de capturer, dégrader et d’apprêter ces antigènes sur les molécules de CMH. En effet, les lymphocytes T (LT) sont incapables de reconnaître un antigène sous forme native et entière. Le TCR αβ peut interagir avec un antigène uniquement si celui-ci est présenté par les molécules de CMH. 1) La capture de l’antigène : Les CD immatures possèdent une forte activité endocytique. Elles peuvent internaliser efficacement différents types d’antigène. La capture de ces antigènes peut se faire par trois mécanisme principaux : la phagocytose, la pinocytose et l’endocytose via des récepteurs membranaires. 2) La dégradation et l’apprêtement des antigènes : Les antigènes endogènes, c’est-à-dire les antigènes liés à la physiologie normale de la cellule et les antigènes provenant de pathogènes présents dans le cytosol, sont présentés aux lymphocytes T CD8+ en association avec des molécules du CMH de classe I ; alors que les antigènes exogènes ou extracellulaires sont présentés aux lymphocytes T CD4+ en association avec des molécules du CMH de classe II. Cependant plusieurs études montrent que ce modèle n’est pas absolu, notamment pour les CD. Des peptides dérivés de protéines exogènes peuvent être présentés en association avec des molécules du CMH-I dans les CD. 2.1) Voie de présentation par les molécules du CMH-I : Les molécules du CMH de classe I (HLA-A, B, C chez l’homme et H2-K, D, L chez la souris) sont exprimées de façon ubiquitaire à la surface de toutes les cellules nucléées de l’organisme sauf celles du trophoblaste, de la rétine et des spermatogonies. Elles présentent donc, aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+, des peptides le plus souvent générés à partir de protéines endogènes cytosoliques ou nucléaires. Les antigènes endogènes présents dans le cytosol sont dégradés en peptides par le complexe enzymatique : le protéasome. La molécule du CMH de classe I est formée par l’association non covalente d’une chaîne légère non polymorphe : la β2 microglobuline (β2M) et d’une chaîne lourde α polymorphique. La chaîne α est constituée de trois domaines extracellulaires (α1, α2, α3), d’une région transmembranaire et d’une région cytoplasmique. La structure tridimensionnelle de la molécule fait apparaître une cavité entre les domaines α1 et α2 dont le fond est un feuillet β plissé et les bords des hélices α. C’est dans cette zone que se situent les résidus polymorphiques qui vont interagir avec les peptides des molécules antigéniques et permettre de cette façon la présentation antigénique de peptides d’une longueur définie (9-10 acides aminés). La présentation des peptides antigéniques à la surface des CPA résulte de la dégradation intracellulaire des protéines normales ou pathologiques et de l’assemblage de ces peptides avec les molécules de CMH-I. La dégradation des protéines cellulaires est réalisée au niveau cytoplasmique par un complexe protéique multicatalytique ubiquitaire appelé PROTEASOME (Pamer et al., 1998). Une brève description de ce système s’impose (Figure 4). Le système ubiquitine-protéasome fonctionne de manière ATP-dépendante en marquant tout d’abord, en plusieurs étapes et grâce à l’intervention de plusieurs types d’enzymes, les substrats protéiques avec des molécules d’ubiquitine. Les substrats portant une chaîne Figure 4 : Présentation du protéasome et de l’immunoprotéasome. Le protéasome 20S constitue le cœur catalytique du protéasome (nommé 26S). Il est formé de 4 anneaux superposés (α-β-β-α), chaque anneau étant constitué de 7 sousunités. Les activités peptidases sont portées par 3 types de sous-unités (β1, β2 et β5). Le protéasome résulte de l’assemblage du protéasome 20S avec 2 complexes régulateurs 19S fixés à chacune de ses extrémités (un seul complexe est représenté sur la figure). Chacun de ces complexes est formé d’un couvercle dont le rôle est de fixer les protéines ubiquitinées et d’une « base » constituée de 6 ATPases responsables du dépliement des protéines et de leur translocation vers le cœur catalytique 20S. Sous l’effet de l’IFN-γ, les sous-unités catalytiques constitutives du protéasome sont remplacées par des sous-unités inductibles. Le protéasome portant ces sous-unités est appelé immunoprotéasome. D’après Kloetzel et al, 2004 d’ubiquitine seront ensuite reconnus puis dégradés par le protéasome 26S en peptides longs de quelques acides aminés. Le protéasome 26S est un complexe multicatalytique présent à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme de la cellule. Il est formé d’un cœur catalytique en forme de cylindre appelé protéasome 20S (baptisé ainsi en fonction de son coefficient de sédimentation) qui est entouré à chaque extrémité par un complexe régulateur de 19S. Le protéasome 20S est formé de quatre anneaux superposés (α-β-β-α), chaque anneau étant constitué de 7 sous-unités de type : α (α1 à 7) ou β (β1 à 7). L’ensemble forme un cylindre de type α7-β7-β7-α7 avec 2 anneaux externes α et 2 anneaux internes β. Les 2 anneaux externes α sont catalytiquement inactifs mais ont un rôle dans l’assemblage du protéasome et permettent l’association avec les complexes régulateurs à chaque extrémité du complexe 20S. Les 2 anneaux internes, formés par les sous-unités β, contiennent les sites catalytiques responsables des activités peptidases du protéasome 20S. Celles-ci sont portées par 3 des 7 sous-unités β : β1, β2 et β5. L’effet de certains facteurs environnementaux, notamment la présence d’IFN-γ induit le remplacement des trois sous-unités catalytiques β1, β2 et β5 du protéasome 20S standard par 3 nouvelles sous-unités : β1i (LMP2), β2i (MECL-1 ou LMP10) et β5i (LMP7) (Tanaka al., 1998). Le protéasome portant ces sous-unités est appelé : immunoprotéasome alors qu’en référence, le protéasome portant les sous-unités constitutives est appelé : protéasome standard. Ces modifications structurales vont entraîner une modulation de l’activité du protéasome et vont conférer à l’immunoprotéasome une spécificité d’hydrolyse plus appropriée à la production de peptides immunocompétents. De plus, le complexe activateur PA28 (Proteasom Activator), appelé aussi 11S, peut se fixer aux extrémités du protéasome 20S et entraîner ainsi des modifications fonctionnelles en favorisant également la production de peptides antigéniques (Groettrup et al., 1995). Ce complexe PA28 est constitué de deux types de sous-unités inductibles par l’IFN-γ : PA28α et PA28β. Ces protéines peuvent s’associer entre elles et s’organiser en anneau heptamérique. Les peptides générés par le protéasome sont la source majeure de peptides antigéniques présentés par le CMH-I (Figure 5). Les peptides générés au niveau cytoplasmique sont alors pris en charge par des protéines de « heat shock » (HSP 70 et HSP 90) dont le rôle est de Membrane plasmique Golgi protéine Protéasome ATP TAP-1 tapasine peptide TAP-2 LMP-7 LMP-2 calnexine HLA classe I β2-m Figure 5 : Voie d’apprêtement et de présentation des molécules de CMH-I. Les protéines du cytosol sont dégradées en peptides par le protéasome. Via les transporteurs TAP (TAP-1 et TAP-2), les peptides sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique et associés à la chaîne lourde α. La fixation de la β2microglobuline stabilise le complexe, qui est transporté dans le Golgi puis à la membrane de la cellule. transporter les peptides et de les protéger d’une dégradation supplémentaire. Ces peptides sont ensuite transportés de façon active dans le RE par les protéines transporteurs TAP (Transporteurs associés à l’apprêtement de l’antigène). Les transporteurs TAP sont formés d’un hétérodimère TAP1 et TAP2 et possèdent une spécificité de liaison pour les peptides présentant des résidus particuliers au sein de la séquence peptidique. Les peptides antigéniques s’associent avec la chaîne lourde de CMH-I et la β2M au niveau du réticulum. La formation de ce complexe nécessite plusieurs protéines chaperonnes (calnexine, calréticuline, Erp57) nécessaires au repliement correct de la molécule de CMH et à son association à la β2M. La tapasine permet ensuite le rapprochement du complexe CMH-β2M avec les protéines TAP. Après liaison du peptide antigénique, le complexe CMH-peptideβ2M ainsi formé traverse l’appareil de Golgi puis est transporté par les vésicules de sécrétion vers la surface de la cellule (York et al., 1996). Après ancrage à la membrane plasmique l’épitope, présenté par ce complexe CMH-peptide-β2M et exprimé à la surface, sera éventuellement reconnu par les CTL conduisant ainsi à une réponse immunitaire à médiation cellulaire. 2.2) Voie de présentation par les molécules du CMH-II : Les molécules de CMH de classe II (HLA-DR, DP, DQ chez l’homme et H2-IA, IE chez la souris) sont exprimées essentiellement à la surface des CPA regroupant : les CD, les monocytes-macrophages et certains lymphocytes B. Elles présentent, aux lymphocytes T CD4, des peptides provenant de protéines exogènes phagocytées entraînant ainsi la prolifération et la différenciation de clones de lymphocytes T CD4+. La molécule de classe II est formée de l’association de deux chaînes polypeptidiques α et β comportant chacune deux domaines extramembranaires. Leur organisation tridimensionnelle est semblable à celle des molécules de CMH-I, cependant la cavité peptidique (formée par les domaines α1 et β1) est plus ouverte à ses extrémités que celle des molécules de CMH-I. Les ouvertures permettent la fixation de peptides plus long que ceux qui sont présentés par les CMH-I. Récepteur Protéine exogène HLA-classe II + peptide chlatrine peptides Endosomes pH acides protéases HLA-DM Dissociation et dégradation de la chaîne invariante Golgi Lysosome Réticulum endoplasmique + + α β Chaîne invariante Figure 6 : Voie de présentation des antigènes par les molécules de CMH-II. La chaîne invariante (Ii) se fixe à des molécules du CMH-II nouvellement synthétisées et bloque la liaison des peptides et des protéines non repliées dans le réticulum endoplasmique et durant le transport des molécules du CMH-II dans les vésicules d’endocytose (premier schéma). Dans ces vésicules, les protéases clivent la chaîne invariante, laissant le peptide CLIP fixé à la molécule du CMH-II (deuxième schéma). Les pathogènes et leurs protéines sont dégradés en peptides à l’intérieur de vésicules d’endocytose acidifiées, mais ces peptides ne peuvent pas fixer les molécules du CMH-II qui sont occupées par le CLIP (troisième schéma). La molécule du CMH-II, HLA-DM, se fixe au complexe CMH-II/CLIP, catalysant la libération du CLIP et la liaison aux peptides antigéniques (quatrième schéma). D’après Janeway, 2003 Les peptides présentés par les molécules du CMH-II sont généralement des protéines exogènes endocytées par la cellule puis dégradées par protéolyse acide dans des compartiments successifs (Figure 6). Lorsque la molécule du CMH-II est synthétisée au niveau du RE, elle s’associe à une autre protéine, la chaîne invariante (Ii). Cette dernière entre en interaction avec la cavité de liaison au peptide, empêchant tous les peptides dérivés des protéines endogènes de se lier à la cavité tant que la molécule du CMH-II est dans le RE. Elle semble également être impliquée dans le repliement des chaînes α et β de classe II, dans leur sortie du RE et dans l’acheminement ultérieur des molécules de CMH-II vers la voie d’apprêtement endocytaire à partir de l’appareil de Golgi. Les chaînes α et β sont glycosylées dans l’appareil de Golgi, puis transportées dans les endosomes ou les lysosomes. Dans ces compartiments, la chaîne invariante est progressivement dégradée (l’activité protéolytique augmente dans chaque compartiment successif). Cependant un court fragment de la chaîne invariante, appelé CLIP (Class II-associated Invariant chain Peptide), continue de bloquer la cavité de liaison au peptide, empêchant toute liaison prématurée avec un autre peptide. La molécule HLA-DM ou son homologue murin H2-M permettent ensuite l’échange entre le peptide CLIP et le peptide issu de la dégradation des protéines exogènes. Les complexes CMH-II/peptide qui en résultent sont adressés vers la membrane plasmique. 2.3) Voie alternative, présentation croisée : Dans la plupart des cellules, les protéines exogènes n’ont pas accès au compartiment cytosolique et donc à la présentation par le CMH-I. Néanmoins, un certain nombre de travaux ont mis en évidence l’existence d’une présentation « croisée » permettant la présentation d’antigène d’origine exogène par le CMH-I (Figure 7) (Catros-Quemener et al., 2003). Dans les CD, comme dans toutes autres cellules, les vésicules d’endocytose (pinocytose ou endocytose spécifique) sont adressées au réseau des endosomes au sein duquel les éléments internalisés (antigènes exogènes) transitent. Dans le cas d’une tumeur, ces antigènes proviennent de débris cellulaires, de lysats ou de corps apoptotiques des cellules tumorales. Les endosomes précoces fusionnent avec des vésicules golgiennes qui Figure 7 : Présentation croisée Des antigènes exogènes sont internalisés et dégradés dans les lysosomes et peuvent être adressés à la surface cellulaire par la voie des protéines endogènes. Selon leur mode d’adressage intracellulaire, les peptides exogènes peuvent être complexés aux molécules de CMH de classe II mais aussi aux molécules de CMH de classe I, cette voie étant appelée la présentation croisée. D’après Catros-Quemener et al, 2003 favorisent une acidification progressive à l’origine de la dégradation partielle des composés endocytés. Les endosomes tardifs contenant ces éléments dégradés peuvent, dans les CPA professionnelles (comme les CD), fusionner avec des vésicules de rétention des molécules du CMH-II. Dans ces compartiments, les peptides endosomiques de bonne affinité se positionnent dans le sillon des molécules de CMH de classe II. Les vésicules contenant les complexes peptides-CMH-II sont alors adressés à la membrane plasmique par un mécanisme d’exocytose, comme c’est le cas pour des vésicules de recyclage. La phagocytose est un mécanisme distinct de l’endocytose par lequel les CD peuvent internaliser des fragments ou encore des corps apoptotiques de cellules tumorales. Dans ce cas, et à la suite d’une reconnaissance d’éléments membranaires, la cellule phagocytaire encercle les particules extracellulaires. Les éléments internalisés peuvent être hydrolysés dans les lysosomes jusqu’au stade de molécules élémentaires qui pourront rejoindre les protéines cytosoliques susceptibles d’être secondairement adressées à la surface cellulaire par la voie des protéines endogènes-CMH-I. On comprend ainsi que, selon leur mode d’adressage intracellulaire, des peptides exogènes internalisés par les CD, peuvent se retrouver non seulement complexés à des molécules de classe II, mais également de classe I. Il s’agit du phénomène de présentation croisée ou crosspriming. Celui-ci, dans les CD, peut également s’expliquer par l’importance des recyclages membranaires qui ont lieu dans ce type cellulaire. En effet, les molécules de classe I naturellement ancrées dans la membrane de la CD peuvent transiter par les endosomes au cours de ces recyclages, et les conditions physicochimiques de ce compartiment sont favorables à un échange de peptides entre molécules du CMH. Cet échange permet d’expliquer que des peptides provenant d’éléments internalisés peuvent être présentés par des molécules de classe I sans passage par le réticulum endoplasmique. Le phénomène de présentation croisée reflète l’activité de capture des cellules mortes ou leurs débris, et notamment des corps apoptotiques par des CPA (CD). La présentation croisée est un phénomène extrêmement important pour la présentation efficace par les CD d’antigènes dérivés de cellules tumorales en particulier de corps apoptotiques de cellules tumorales ou provenant de la nécrose tumorale (Berard et al., 2000). 3) Migration et maturation des CD : Les CD résidentes à un stade « immature » ont une forte capacité d’endocytose et de macropinocytose elles capturent ainsi les antigènes. En présence de certains signaux environnementaux (TNFα, IL-1β), les CD vont passer du stade immature au stade mature, transition qui se traduit par une perte de la capacité d’endocytose, une forte augmentation de l’expression de molécules du CMH de classe I et II, ainsi qu’une augmentation forte de l’expression des molécules de costimulation (CD80, CD40). Les CD activées possèdent un pouvoir migratoire vers les organes lymphoïdes secondaires extrêmement important. Cette propriété migratoire est essentielle puisque c’est là qu’elles vont présenter les antigènes aux lymphocytes T naïfs spécifiques (Figure 8). La capacité des CD à induire une réponse immune anti-tumorale a été décrite dans de nombreux modèles animaux (Zitvogel et al., 1996) mais aussi chez l’homme (Kugler et al., 2000). 4) Les cytokines et chémokines : Avec les CD, les cytokines et les chémokines constituent, elles aussi, un pont entre l’immunité innée et l’immunité adaptative dirigée contre les tumeurs (Belardelli et al., 2002). En effet, le champ de cytokines joue un rôle capital. Le champ de cytokines d’une tumeur conditionne en partie le type de réponse immunitaire qu’elle suscite (Kourilsky et al., 2001). On distingue deux classes de cytokines entre le type 1 et le type 2. Les cytokines de type 1, telles que l’IL-2, IL-12 les IFNαβγ, sont impliqués dans la réponse immune TH1 (T helper 1) et principalement dans l’immunité cellulaire. Par contre l’IL-4, IL-6, IL-10, IL-13 sont impliquées dans les réponses immunes Th2 à médiation humorale. On sait aujourd’hui que le niveau basal d’IFN-γ notamment joue un rôle particulièrement important dans la surveillance anti-tumorale (Street et al., 2001 ; Street et al., 2002). L’IFN-γ collabore notamment avec les lymphocytes T en contrôlant l’émergence de cellules tumorales Ganglion lymphatique LT CD4 CD28 LT CD8 TCR αβ CD28 TCR αβ DC Migration des lymphocytes CD8+ et CD4+ CD80 CD40 CD80 DC LT CD4 DC Activée IL-2; IFN-γ ACTIVATION Th1 CMH-I/peptides LT CD8 CMH-II / peptides LYSE CMH-I/peptides Corps apoptotiques DC APC DC Immature Antigènes tumoraux Cellules tumorales Antigènes tumoraux exogènes Figure 8 : Activation de la réponse immune adaptative par les cellules dendritiques : (Shankaran et al., 2001). D’autres cytokines telles que l’IL-12 et le GM-CSF et des chemokines telles que CXCL10 et CCL16 jouent un rôle significatif dans la réponse immune anti-tumorale, c’est pourquoi on peut envisager d’utiliser certaines chemokines et/ou cytokines dans un but d’immunothérapie des cancers (Homey et al., 2002; Smyth et al., 2000). De nombreux essais cliniques ont été réalisés ou sont en cours avec de l’IFN-α ou γ, l’IL-2, l’IL-12, l’IL-13, le GM-CSF, TRAIL, notamment. Ces différentes molécules interviennent au niveau de la présentation antigènique, la cytotoxicité des cellules effectrices, l’angiogenèse des tumeurs ou encore l’apoptose des cellules tumorales (Dranoff et al 2004). E-Les Cellules dendritiques myéloïdes (CDm) et plasmacytoïdes (CDp): Nous venons de détailler l’ensemble des caractéristiques fonctionnelles des CDs. Les cellules dendritiques peuvent être divisées morphologiquement et fonctionnellement en deux types : les CD myéloïdes (CDm) comprenant les cellules de Langerhans et les CD interstitielles (Banchereau et al., 2003), et les cellules dendritiques plasmacytoïdes (CDp) (Arpinati et al., 2003). Les CDm se développent à partir de progéniteurs myéloïdes alors que les CDp dérivent de progéniteurs lymphoïdes. L’ensemble des caractéristiques que nous venons de décrire sont retrouvées dans les deux types cellulaires cependant ces deux populations se distinguent par des marqueurs de surfaces différents et également par le type de réponses immunes CD11c+/CD4+/CD45RO+ qu’elles alors initient. que les Les CDp CDm sont présentent de les phénotype marqueurs CD11c- /CD4+/CD45RA+/CD123+. Les CDm capturent des antigènes soit par phagocytose, soit par endocytose dépendante de récepteur, ces antigènes sont alors respectivement présentés par les CMH de classe I ou de classe II. Les CDp présentent uniquement des antigènes associés aux molécules de CMH-II qui ont été internalisés par la voie d’endocytose. Les cellules d’origines myéloïdes expriment un plus fort niveau de molécules de CMH et de costimulations que les cellules plasmacytoïdes ce qui leur confèrent une plus grande capacité à stimuler la prolifération des lymphocytes T. La production de cytokines et chemokines est également différente entre ces deux types cellulaires (Mohamadzadeh et al., 2005 ; Vollstedt et al., 2004 ; Chuang et al., 2002). Enfin les Cdm sont plus a même d’induire des réponses de type T cytotoxique anti-tumorales alors que les pDC favorisent plutôt des réponses de type CD4 helper et en particulier des réponses de cellules T CD4 régulatrices. Comme nous le verrons ultérieurement ces réponses jouent un rôle dans les mécanismes d’échappement tumoraux. F-Les IKDC le chaînon manquant : Le groupe de Laurence Zitvogel a récemment mis en évidence une nouvelle population cellulaire les IKDCs (Interferon, Killer, Dendritic, Cells). Ces cellules sont des hybrides entre les cellules dendritiques plasmacytoïdes, les cellules NK et les lymphocytes T (Taïeb et al., 2006). Comme les cellules NK, les IKDCs peuvent tuer des cellules ayant dérégulé l’expression des CMH-I, comme les cellules dendritiques plasmacytoïdes elles secrètent de grandes quantités d’IFN-α, et comme les CD m elles sont capables de d’apprêter et de présenter les antigènes aux LT (Shortman et al., 2002). Toutes ces fonctions font des IKDC le lien entre l’immunité innée et adaptative. Ces cellules présentent des marqueurs de surface communs aux NK (CD49b, NK1.1, NKG2D), aux CDp et aux CDm (CD11C) mais elles ont cependant des caractéristiques propres. Dans le modèle du mélanome, les IKDC reconnaissent et détruisent mieux les cellules tumorales que les NK (Colucci et al., 2003). Cette capacité à tuer est dépendante des ligands de TRAIL, qui sont exprimés à la surface des IKDCs. Cependant dans les modèles tumoraux murins étudiés l’activation des IKDC est induite par un traitement associant le Gleevec et l’IL-2, de ce fait le rôle des IKDC dans la réponse immune naturelle reste encore controversée d’autant plus qu’aucune donnée actuelle ne met en évidence la présence des ces cellules chez l’homme. II La réponse immune adaptative anti-tumorale La réponse immune innée constitue la première ligne de défense contre les tumeurs, mais elle n’a pas la capacité d’installer un état immunitaire spécifique qui préviendrait les métastases. L’immunité adaptative se base sur la sélection clonale à partir d’un répertoire préexistant de lymphocytes, dotés de récepteurs spécifiques d’un antigène. Dans la réponse immune adaptative, les lymphocytes spécifiques d’un antigène prolifèrent et se différencient en cellules effectrices capables de reconnaître les cellules tumorales ou en cellules mémoires capables de prévenir l’apparition de métastases. Les principaux effecteurs de l’immunité adaptative sont les lymphocytes T CD8+ (LTCD8+) et lymphocytes T CD4+ (LTCD4+). Ces cellules reconnaissent respectivement les antigènes tumoraux présentés soit par les molécules de CMH-I ou CMH-II. La première caractérisation d’un antigène dit « associé aux tumeurs » (TAA) fut réalisée par le groupe de T BOON en 1991. Ces travaux pionniers réalisés à partir de cellules de mélanomes humains, ont permis d’identifier le gène MAGE (Melanoma Antigen). Depuis, différentes techniques se sont développées et ont permis d’identifier de nouveaux antigènes tumoraux. Diverses catégories d’antigènes de tumeurs peuvent êtres distingués, mais aucune classification n’est véritablement satisfaisante. A-Les Antigènes de tumeurs : (tableau 1) 1) Les antigènes d’origine embryonnaire : Ces antigènes résultent de la réactivation de gènes embryonnaires, transcriptionnellement actifs dans différents types de tumeurs (DeSmet et al., 1999) mais généralement silencieux dans les tissus adultes (DeSmet et al., 1994) mis à part, les spermatozoïdes, les spermatogonies des testicules et occasionnellement le placenta. Bien que la présence de ces antigènes dans les cellules tumorales induise une réponse immune spécifique, leur expression dans les cellules germinales n’entraîne pas de réponse de type auto-immune, Antigènes tumoraux Expression tumorale Antigènes issus de mutations ponctuelles: RasV12 CDK4 p53 Cancer du pancréas Mélanome Tumeurs variées Antigènes viraux: E6-E7 papillomavirus EBV Cancer du col de l’utérus Lymphomes, cancer du nasopharynx Antigènes communs spécifiques de tumeurs: MAGE BAGE GAGE Tumeurs variés Tumeurs variés Tumeurs variés Antigènes de différenciation: Melan-A/MART-1 Gp100 TRP-1,-2 Mélanome Mélanome Mélanome Antigènes surexprimés: HER-2/neu Télomérase P53 Carcinomes du sein, ovaires, poumons Tumeurs variés Tumeurs variés Tableau 1 : Les Antigènes de tumeurs : ces cellules n’exprimant pas les molécules de CMH-I et CMH-II (Jassim et al., 1989). Les antigènes de tumeur d’origine embryonnaire représentent l’un des plus important groupe d’antigènes testé en protocoles clinique anti-tumoraux depuis ces 10 dernières années. Le premier gène identifié de cette catégorie chez l’homme est le gène MAGE-A1 (van der Bruggen et al., 1991). Cet antigène MAGE-1 (Melanome AntiGEn) est retrouvé dans de nombreuses tumeurs solides : 37% des mélanomes, 17% des cancers du sein, 35% des cancers bronchiques autres que ceux à petites cellules. Aujourd’hui, de nombreux autres gènes ont été caractérisés par analogie au gène MAGE-A1 sur des mélanomes humains. La famille des gènes MAGE regroupe 12 membres de MAGE-A1 à MAGE-A12. Ces gènes sont aussi exprimés dans des proportions variables de tumeurs de divers types histologiques, le plus souvent des tumeurs solides. D’autres gènes ont été identifiés sur d’autres types de tumeurs solides: BAGE (Bladder AntiGEn), GAGE (Gastric AntiGEn), RAGE (Renal tumor AntiGEn), LAGE/N-ESO-1(Lethe et al., 1998; Chen et al., 1997) et SXX (Gure et al., 1997 ; Gure et al., 2002). 60 à 70% des mélanomes malins expriment au moins un de ces antigènes pouvant constituer des cibles potentielles pour des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induits par vaccination. 2) Les antigènes de différenciation : Il a été montré que les CTL, de certains patients atteints de mélanome, reconnaissent des antigènes de différenciation exprimés non seulement par les cellules de mélanome mais aussi par les mélanocytes normaux. Les antigènes spécifiques de la lignée mélanocytaire sont issus pour la plupart des protéines de la membrane du mélanosome, organelle impliquée dans la synthèse de la mélanine. Plusieurs antigènes de différenciation de la lignée mélanocytaire ont été identifiés tels que la tyrosinase, Melan-A/MART-1, gp100, TRP1 et TRP-2 (Brichard et al., 1993 ; Coulie et al., 1994 ; Bakker et al., 1994 ; Kawakami et al., 1994). L’immunodominance de l’antigène Melan-A/MART-1 est reflétée par la fréquence élevée de CTL circulants chez la majorité des patients atteints du mélanome, mais aussi chez des donneurs sains à une fréquence beaucoup plus faible. Plusieurs observations ont associé la dépigmentation par la destruction des mélanocytes sains (vitiligo) avec une régression tumorale et une amélioration du pronostic clinique de patients atteints de mélanome (Yee et al., 2000; Kawakami et al., 1998). Et ceci grâce à des lymphocytes T infiltrant (TIL) les lésions tumorales qui reconnaissent ces antigènes de différenciation mélanocytaire exprimés sur les cellules tumorales et les mélanocytes sains. Ces données mettent en évidence la rupture de tolérance immunitaire à des antigènes de différenciation et le développement d’une réponse auto-immune contre ces antigènes du soi chez des patients atteints de mélanome. Dans le cas des mélanomes, des réponses immunitaires antitumorales provoquées par des immunothérapies qui induisent une auto-immunité limitée à la dépigmentation de la peau sont acceptables. Mais cela soulève la difficulté d’une mise en place d’une réponse immune anti-tumorale en limitant les atteintes auto-immunes pour d’autres modèles tumoraux, ou les antigènes de différenciation sont présents sur des cellules vitales de l’organisme. 3) Les antigènes surexprimés : Ces antigènes ubiquitaires sont exprimés dans les cellules normales à des taux d’expression faibles, mais sont surexprimés spécifiquement dans des tissus tumoraux d’origines variées. Or, les CTL spécifiques de ces antigènes reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et non les cellules saines. Cela s’explique par le fait qu’il existe un seuil d’expression du gène au dessous duquel il n’y a pas assez de protéines, et donc de peptides antigéniques présentés, pour permettre une reconnaissance par un CTL. Le gène de la télomérase (TERT) est surexprimé dans 85% des cancers et semble quasi silencieux dans la plupart des tissus normaux. Ainsi par exemple, des CTL dirigés contre un peptide de la télomérase présenté par HLA-A2 lysent spécifiquement des cellules tumorales (Vonderkeide et al., 1999). De plus, l’induction d’une réponse immunitaire chez des souris vaccinées contre l’analogue murin de l’antigène de la télomérase n’induit pas de réactions auto-immunes contre les tissus sains, comme les cellules de la moelle osseuse ou du foie qui expriment pourtant le gène TERT. L’intérêt de cet antigène provient du fait que des CTL spécifiques de cet antigène TERT peuvent reconnaître des cellules tumorales de types histologiques différents. Ainsi, des souris vaccinées sont partiellement protégées vis à vis de l’inoculation de trois modèles différents de tumeurs (Nair et al., 2000). 4) Les antigènes spécifiques des tumeurs : La présence de mutations dans des gènes normalement exprimés dans les cellules saines est fréquemment corrélée à l’apparition du phénotype tumoral. Dans certains cas, ces altérations peuvent engendrer des antigènes tumoraux capables d’induire une réponse immune spécifique (Linard et al., 2002; Linnabacher et al., 2001 ; Gjertsen et al., 1997; Rajasekharan et al., 2006). Des mutations au niveau de proto-oncogènes tels que RAS, BRAF ou du gène suppresseur de tumeur p53 produisent des protéines mutées induisant des peptides reconnus par des lymphocytes T CD4+ et/ou CD8+ (Gedde-Dahl et al., 1992 ; Gjertsen et al., 2001). La présence de TIL spécifiques de peptides de la protéine Ras mutée a été mise en évidence chez des patients atteints de mélanomes (Linard et al., 2002). Ces antigènes dérivés des protéines Ras et p53 mutés sont particulièrement intéressants, car les mutations retrouvées au niveau de ces oncogènes sont fréquentes et communes à plusieurs types de cancer. B-L’activation de la réponse immune adaptative : Comme nous venons de le voir, il existe de nombreux peptides tumoraux. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) en exprimant à leur surface ces peptides associés aux molécules du CMH ont la capacité d’activer des réponses lymphocytaires T spécifiques. L’activation lymphocytaire est un mécanisme complexe nécessitant des signaux cellulaires transmis aux lymphocytes T lors de leurs rencontres avec les CPA. Un premier signal est transmis aux LT lors de la liaison entre leur récepteur pour l’antigène (TCR) et les complexes CMH/peptides exprimés sur les CPA. Mais ce signal ne suffit pas à induire la prolifération et la différenciation des LT naïfs en LT effecteurs. L’activation des LT naïfs, nécessite un second signal appelé signal de costimulation qui est délivré par la CPA sur laquelle le LT reconnaît son antigène spécifique. 1) La signalisation par le TCR : le premier signal d’activation lymphocytaire : Au cours de la réponse immune adaptative anti-tumorale, les récepteurs pour l’antigène des LT (TCR) reconnaissent des peptides tumoraux associés aux molécules du CMH de classe I et II. Il existe deux grandes classes de LT qui se distinguent par le type de molécule de CMH qu’ils reconnaissent. Ces cellules T ont des fonctions effectrices différentes et expriment de façon mutuellement exclusive le corécepteur CD4 ou CD8. Les corécepteurs CD4 et CD8 sont deux glycoprotéines qui participent à la reconnaissance des molécules CMH de classe I pour le CD8 et des molécules de classe II pour le CD4. La majorité des lymphocytes T (95% des LT périphériques) expriment des TCRαβ. Le TCRαβ est un hétérodimère constitué d’une sous unité α et d’une sous unité β reliées par des ponts di sulfures. Des recombinaisons somatiques analogues à celles des immunoglobulines (Ig) sont responsables de la diversité des TCR. Les chaînes α et β du TCR comportent un domaine constant C ancré à la membrane et un domaine variable V (Figure 9).Les réarrangements des domaines variables des gènes codant pour les sous unités a et B du TCR se font respectivement entre une région V (variable) et une région J (joining) pour la chaine a et trois régions V, D (diversity) et J pour la chaîne B en faisant intervenir des recombinase (RAG1 et RAG2). A partir de la configuration germinale non arrangée, la recombinase associe un segment variable (V) à un segment de diversité D et un segment de joint (J), assurant ainsi la production d’une unité VDJ fonctionnelle. Cette unité est ensuite transcrite, épissée dans sa région C constante avant d’être traduite en protéine (Figure 10). Les chaînes ab du TCR sont des protéines membranaires de type I associées de manière non covalente aux protéines membranaires du complexe CD3 dzeta (Figure 9). Les chaines a et b contiennent de petits domaines intra-cytoplasmiques dépourvus de motifs permettant la transmission du signal. La transmission du signal est assurée par le module CD3. Celui ci est composé de trois types de chaînes polypeptidiques chacune contenant des motifs qui seront phosphorylés lors de l’activation du TCR et permettront la transduction des signaux. La reconnaissance du complexe CMH/peptide par le TCR induit l’activation de plusieurs voies de signalisations parmi lesquelles la voie calcique et la voie des MAPK. Ces diverses Figure 9 : Représentation du TCR. Figure 10 : Réarrangement des fragment VDJ du TCR. voies de signalisation activent ou induisent des facteurs de transcription qui vont permettre l’expression de gènes impliqués dans l’activation et la différenciation lymphocytaire. On peut citer les facteurs de transcription de la famille NFAT et CREB régulés principalement par la voie du calcium et le complexe AP-1 (fos-jun) activés par la voie des MAPK. Ces facteurs de transcription sont très importants dans la régulation de l’expression des cytokines et notamment celle de l’IL-2 facteur de croissance autocrine majeur produit par les LT. 2) Le signal de costimulation : Comme nous venons de le dire, la reconnaissance par le TCR des complexes CMH/peptides permet de transmettre dans le lymphocyte T un premier signal d’activation. Cependant, ce signal ne peut pas à lui seul induire la prolifération des cellules T naïves et leur différenciation en cellules T effectrices. L’expansion clonale des cellules T naïves induite par l’antigène nécessite un second signal ou signal de costimulation. En effet, la fixation du complexe CMH/peptide sur le récepteur de la cellule T en absence de costimulation non seulement n’induit pas d’activation mais à la place conduit à un état d’anergie, dans lequel la cellule T est réfractaire à l’activation par son antigène spécifique. 2-1) Les molécules de costimulation de la famille des immunoglobulines: Les molécules de costimulation les mieux caractérisées sont les molécules de la famille des immunoglobulines B7.1 (CD80) et B7.2 (CD86) (Greewald et al., 2005). Leur rôle dans la costimulation a été démontré par transfection de gène codant la molécule B7.1 dans des fibroblastes exprimant des antigènes reconnus par les LT. Ces fibroblastes peuvent activer l’expansion clonale des LT naïfs. L’un des récepteurs des molécules B7.1 et B7.2 sur la cellule T est la molécule CD28, un autre membre de la famille des immunoglobulines. La fixation de CD28 sur les molécules B7 ou les anticorps anti-CD28 jouent un rôle de costimulation dans l’expansion clonale des cellules T naïves. Par contre, les anticorps antiB7, qui inhibent la fixation de B7 sur CD28, inhibent ces réponses T. Une fois qu’une cellule T naïve a été activée, elle exprime certaines protéines membranaires qui permettent de maintenir et de modifier le signal de costimulation qui induit l’expansion clonale et la différenciation. Une de ces protéines est la molécule CD40-L de la famille des TNF. CD40-L interagit avec CD40 exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigènes. La fixation de CD40-L à CD40 induit des signaux d’activation à la cellule T et en même temps active la cellule présentatrice d’antigène pour qu’elle exprime les molécules de costimulation B7, ce qui stimule la prolifération des LT. D’autres molécules de la famille de CD28 peuvent aussi être induites sur les LT activées et permettent de modifier le signal de costimulation au cours de la différenciation des cellules T. L’une d’entre elle est CLTA-4, un autre récepteur des molécules B7. CTLA-4 se fixe sur les molécules B7 avec une affinité supérieure à celle de CD28 et induit un signal inhibiteur dans les LT activés. La fixation de CTLA-4 sur les molécules B7 est essentielle pour limiter la réponse proliférative des LT en induit par l’antigène et les molécules de costimulation. Ceci a été confirmé chez des souris dont le gène CTLA-4 a été inactivé. Ces souris développent une maladie mortelle caractérisée par une prolifération lymphocytaire massive. Une troisième molécule de la famille de CD28 peut être induite sur les LT activés et peut augmenter la réponse cellulaire T. Cette molécule de costimulation inductible ou ICOS se lie à son ligand, LICOS qui est exprimé sur les cellules dendritiques activées, les monocytes et les lymphocytes B. Bien qu’il ressemble à CD28 en activant la croissance des cellules T, il en diffère en activant la production d’IL-10 au lieu d’IL-2 dans le cas de CD28. 2-2) Les molécules de costimulation de la famille des TNF (Tumor Necrosis Factor) Le signal de costimulation peut également être délivré par des molécules de costimulation de la famille des TFN (Watts 2005) comme la molécule CD40L (CD154) dont nous avons parlé précédemment (CD154) ou la molécule CD70. CD70 est retrouvée à la surface des LT et LB après activation antigénique (Lens et al., 1996; Lens et al., 1997), sur les cellules NK activées et les cellules dendritiques mature. Le récepteur de CD70, CD27, est exprimé de façon constitutive à de faibles taux par les LT, LB et NK. L’interaction CD27/CD70 contrôle l’accumulation des LTCD4+/CD8+ effecteurs (Hendriks et al., 2000; Yamada et al., 2005) et la survie des LT cytotoxiques sur les sites de l’infectieux (Dempsey et al., 2003 ; Xiao et al., 2004) aussi bien durant les réponses primaires que secondaires. De nombreux travaux démontrent un rôle important de l’interaction entre CD27 et CD70 dans la mise en place de la réponse immune anti-tumorale. Des souris CD70 transgéniques, exprimant de façon constitutive CD70 à la surface des LB sont protégées contre une petite dose de cellules tumorales qui serait létale sur des souris sauvages (Arens et al., 2004). D’autre part, l’injection à des souris syngéniques de cellules tumorales génétiquement modifiées pour exprimer la molécule CD70, permet d’installer une réponse immune anti-tumorale (Cormary et al., 2004) et de mettre en place une mémoire immune protectrice (Cormary et al., 2005). 2-3) Les ligands activateurs des cellules NK : Certains récepteurs de cellules NK pourraient également fonctionner comme des molécules costimulatrices à la surface des LT. En particulier, il a été montré in vitro que l’engagement de NKG2D, un récepteur activateur des cellules NK, par ses ligands MIC-A et MIC-B (molécules du CMH de classe I non classiques) sur des clones T CD8+CD28- activés via leur TCR induisait une augmentation de leur cytotoxicité, de leur prolifération et de leur synthèse de cytokines (Roberts et al., 2001). D’autre part il a été montré que les ligands de NKG2D MIC-A et MIC-B étaient inductibles suite à un stress cellulaire (Bauer et al., 1990), ou suite à une infection de cellules par le CMV in vitro (Groh et al., 2001). Ces ligands sont aussi exprimés sur diverses cellules tumorales (Bauer et al., 1990). Ces données suggèrent que l’interaction de NKG2D avec ses ligands pourrait réguler les fonctions effectrices des LT activés sur les sites d’infection ou de tumorigénèse. D’autre part, 5 à 10% des LT CD8 périphériques (principalement des cellules à phénotype mémoire) expriment au moins un des récepteurs NK identifiés de la famille Ly49 (récepteurs de type lectine activateurs ou inhibiteurs) chez la souris ou KIR (pour Killer inhibitory Immunoglobulin-like receptor) chez l’homme (McMahon et al., 2001). 3) La synapse immunologique La première étape de l’activation des LT nécessite sa fixation et son arrêt au contact de la cellule présentant un antigène pour lequel il est spécifique. Ceci implique la formation d’une interaction forte entre les deux types cellulaires LT/CPA. Cette contrainte physique ne peut par nature être assurée par le TCR dont l’affinité avec les complexes CMH / peptide spécifiques est connue pour être relativement faible. Un nombre croissant d’études ont Figure 11 : La synapse immunologique. rapporté la formation très organisée de “synapses“ immunes entre LT et cellules présentatrices in vitro. Ces structures ont été décrites pour la première fois par les groupes de M. Dustin, M. Davis et A. Kupfer (Grakoui et al., 2001 ; Faroudi et al 2002). Elles consistent en une zone de contact rapproché entre les membranes de l’APC et du LT où se concentrent les complexes TCR / CMH-peptide ainsi que certaines molécules de costimulation (CD80/CD86) entourée d’un anneau d’intégrines LFA-1 (Figure 11). C-Acquisition des fonctions effectrices des LT et rôles dans la réponse immune anti-tumorale. Un LT naïf qui reconnaît son antigène à la surface des CPA et qui reçoit les deux signaux nécessaires à son activation prolifère et se différencie en cellule effectrice soit en LTCD8 cytotoxique soit en LTCD4 auxiliaire. Ces cellules jouent toutes les deux un rôle majeur dans le contrôle des proliférations tumorales. 1) Les LTCD8 cytotoxiques : Les LTCD8 ont été mis en évidence dans le sang et les tissus tumoraux de patients atteints de cancers et notamment de mélanomes (Ferrini et al., 1985 ; Itoh et al., 1988 ; Belldegrun et al., 1998). Le rôle fonctionnel de ces LTCD8 a été démontré dans des situations cliniques de régressions tumorales spontanées ou induites. Ainsi à partir de biopsies de patients, chez lesquels il avait été observé une régression tumorale spontanée, des LTCD8 cytotoxiques ont été mis en évidence, suggérant fortement l’implication de ces cellules dans la régression de ces tumeurs (Mackensen et al., 1994). Par ailleurs, dans des modèles tumoraux murins, après immunisation à l’aide de différentes préparations vaccinales, l’induction d’une immunité anti tumorale dépend le plus souvent de la présence de LTCD8 (Zatloukal et al., 1995 ; Xu et al., 2000 ; Srivastava et al., 2002 ; Porgador et al., 1996 ; Dyall et al., 1998). L’implication des LTCD8+ dans la réponse immune antitumorale a permis de développer chez l’homme des stratégies d’immunothérapie qui ont confirmé le rôle majeur de ces cellules dans le contrôle du développement tumoral. Lors de vaccinations de patients par le peptide MAGE3, des infiltrations de LTCD8+ dans les lésions Figure 12 : Les deux voies de cytotoxicité lymphocytaire : voie Fas/Fas ligand et la voie perforine/granzyme. en cours de régression ont été observées (Thurner et al., 1999). De même, chez des patients recevant des infusions de clones LTCD8+ spécifiques pour des antigènes tumoraux, l’analyse des populations lymphocytaires présentes au sein de la tumeur (TIL) a démontré l’accumulation des LTCD8+ transférés (Yee et al., 2000). La différenciation des LTCD8+ en LT cytotoxiques (CTL) implique l’acquisition de fonctions cytotoxiques. La reconnaissance des cellules tumorales par les CTL conduit généralement à la lyse des cibles par plusieurs mécanismes (Kagi et al., 1994 ; Barry et al., 2002) impliquant des protéines présentes dans les CTL (Figure 12). Ces CTL renferment en effet des granules préformés contenant de nombreuses enzymes et cytotoxines. Lors du contact entre le TCR du CTL et le complexe CMH/peptide présent à la surface de la cellule tumorale, on observe une réorganisation du cytosquelette des LT-CD8 qui permet d’orienter l’exocytose de granules lytiques vers la cellule cible. Ces granules contiennent une protéine capable de former des pores : la perforine. La formation des pores membranaires n’est pas suffisante pour provoquer la mort cellulaire, mais facilite l’entrée d’autres protéines granulaires comme les granzymes, qui vont induire la lyse des cellules cibles. Des souris déficientes en perforine sont plus sensibles au développement spontané de lymphomes et de tumeurs chimio induites, ce qui démontre le rôle important de ce type de cytotoxicité dans le contrôle du développement tumoral (Smyth et al., 2000 ; van den Broek et al., 1996). L’exocytose des granules lytiques n’est pas le seul mécanisme capable d’induire la mort cellulaire. L’interaction des molécules FasL exprimées par les LT-CD8 avec les molécules Fas présentes sur les cellules cibles induit une mort par apoptose grâce à l’activation de la voie des caspases. Enfin, la cytotoxicité des CTL est également dépendante de la capacité de ces cellules à produire des cytokines comme l’IFN-γ ou le TNF-α. En effet, l’administration d’anticorps anti IFN-γ ou TNF-α peut inhiber l’efficacité thérapeutique des LTCD8 (Barth et al., 1991). Ainsi des tumeurs immunogéniques ne sont plus rejetées chez des souris déficientes pour les gènes codant ces deux cytokines (Prevost-Blondel et al., 2000). L’ensemble de ces travaux confirme le rôle majeur joué par les LTCD8+ cytotoxiques dans la réponse immune antitumorale. 2) Les LTCD4 auxiliaires : Les cellules CD4+ auxiliaires (helper) jouent un rôle primordial dans la polarisation de la réponse immunitaire. Ces cellules dérivent de précurseurs communs, les lymphocytes T helpers CD4+ naïfs qui peuvent se différencier en LTCD4 helper 1 (Th1), helper 2 (Th2) ou helper 17 (Th17) selon la nature des signaux reçus lors de leur activation (Abbas et al., 1996 ).Cette différenciation est contrôlée par la sécrétion de cytokines lors de l’activation des cellules T naïves. Selon la nature des cytokines présentes lors de cette activation, l’IL-4, l’IL12 ou l’IL-6/TGFβ, les précurseurs CD4 + se différencient respectivement en cellules Th1, Th2 ou Th17 (Macatonia et al., 1995 ; Betteli et al., 2006 ; Harrington et al., 2006) (Figure 13). La nature de la cellule présentatrice d’antigènes (Duncan et al., 1994) ou le type des molécules de costimulation impliquées dans l’activation des LTCD4+ (Palmer et al., 1997) sont également des paramètres importants dans l’orientation des cellules vers le phénotype Th1, Th2 ou Th17. Le premier critère qui permet de différencier ces sous classes de LT helpers c’est le profil de cytokines qu’elles expriment. Les TCD4+ Th1 secrètent de l’IL-2, IL-12, IFN-γ et du TNF-α tandis que les T CD4+ Th2 secrètent plutôt de L’IL-4 ,5 et 10 et les Th17 de l’IL-6, de l’IL-17 et du TNF-α. D’un point de vue fonctionnel ces sous population lymphocytaire possèdent également des caractéristiques bien spécifiques. Les cellules Th1 permettent d’orienter de la réponse immunitaire vers une réponse à médiation cellulaire en favorisant la différenciation de lymphocytes CD8+ en CTL. De plus, ces cellules sont souvent associées aux phénomènes inflammatoires de par leur capacité à secréter du TNF-α et de l’IFN-γ, deux cytokines qui induisent le recrutement d’effecteurs cellulaires de l’inflammation. Les cellules de type Th2 induisent quant à elles, des réponses immunitaires humorales et stimulent les réponses allergiques en favorisant la prolifération des mastocytes mais également la croissance et la différenciation des éosinophiles. A la différence des cellules Th1, les cytokines produites par les cellules Th2 comme l’IL-4, 10, 13 et le TGFB ne jouent pas un Figure 13 : Différenciation TH1/TH2/TH17 rôle pro mais plutôt anti-inflammatoire (Mosmann et al., 1989). Enfin les Th17 favorisent le recrutement neutrophilaire lors des infections bactériennes mais sont surtout associées à l’apparition de réponses inflammatoires chroniques dans les maladies auto-immunes Les études menées dans différents modèles tumoraux ont montré que les LTCD4 sont impliquées dans la réponse immune anti-tumorale surtout dans des modèles tumoraux exprimant des molécules de CMH-II (Hock et al., 1991 ; Lauritzen et al., 1994 ; Hung et al., 1998). Cette démonstration est basée à la fois sur des expériences de transfert adoptif des cellules T CD4 ou par déplétion de ces LT CD4. La participation des CD4 dans la réponse immune anti-tumorale se fait par le biais de divers mécanismes. Tout d’abord par la sécrétion de cytokines, les LTCD4 peuvent attirer au site tumoral des cellules immunitaire effectrices comme les NK, (Hung et al., 1998 ; Greenberg et al., 1991). Ensuite, l’IFN-γ secrété par les Th1 joue un rôle direct sur les tumeurs en favorisant la production de radicaux libres oxygénés (Williamson et al., 1983 ; Fransen et al., 1986), l’expression des CMH-I assurant leur reconnaissance et leur élimination par les CTL (Dighe et al., 1994), ou encore en réduisant la néo-angiogenèse tumorale (Coughlin et al., 1998 ; Qin et al., 2000). Enfin même si ces LTCD4 sont définies comme des cellules auxiliaires, plusieurs travaux montrent qu’elles sont douées de fonctions cytotoxiques propres dépendantes de la voie Fas, leur permettant de lyser par elle même des cibles tumorales (Zennadi et al., 2001). A la différence des Th1 et Th2 l’implication des Th17 dans la réponse immune anti-tumorale a été peu étudiée. Cependant plusieurs résultats suggèrent que ces cellules auraient favoriseraient le développement tumoral notamment en favorisant la néo-angiogenèse des tumeurs (Numasaki et al., 2003). D-La mémoire immunitaire associée aux LT L’une des conséquences les plus importantes de la réponse immune adaptative est l’établissement d’un état de mémoire immunologique. La mémoire immunologique se définit comme la capacité du système immunitaire de répondre plus rapidement et plus efficacement aux antigènes qu’il a déjà rencontré antérieurement. Elle reflète la préexistante d’une population clonalement amplifiée de lymphocytes spécifiques de l’antigène. Lors de la réponse primaire dépendante des LT on distingue généralement trois phases (Kaech et al., 2002) (i) une phase d’activation et d’expansion, (ii) une phase de mort cellulaire, (iii) puis une phase de stabilisation ou phase de mémoire. Durant la première phase, les LT spécifiques de l’Ag sont activés, prolifèrent et se différencient en effecteurs. Suite à cette expansion de clones T spécifiques de l’Ag, une phase de mort survient durant laquelle la plupart des LT activés (90%) entrent en apoptose. La troisième phase de la réponse dépendante des LT est caractérisée par l’émergence d’un « pool » stable de LT mémoires qui peut persister durant de longues périodes dans l’organisme. La caractéristique fonctionnelle fondamentale de ces cellules est qu’elles sont en mesure de générer des réponses secondaires plus rapides et plus massives car elles acquièrent la capacité de se différencier rapidement et de secréter des niveaux plus élevés de cytokines. Une des hypothèses émise pour expliquer l’apparition d’effecteurs mémoires propose que ces cellules subissent des modifications moléculaires, qui les rendraient résistantes à la phase d’apoptose qui suit l’activation lymphocytaire (Masopust et al., 2004 ; VeigaFernandes et al., 2000 ; Jameson et al., 2002). La génération de LT mémoires fonctionnels nécessite la présence de divers stimuli ; (i) des signaux d’activation provenant du TCR, (ii) des signaux de costimulation, (iii) et la présence d’un environnement de cytokines favorables. Il existe plusieurs marqueurs de surfaces qui permettent de caractériser le phénotype des LT mémoires. Néanmoins deux « pools » de lymphocytes T mémoires ont été décrits suivant le niveau d’expression des molécules de surface CD62L et CCR7 : les LT de la mémoire effectrice (LT EM) et les LT de la mémoire centrale (LT CM). Les LT EM sont caractérisés par un faible niveau d’expression des molécules CD62L et CCR7 (LTCD8 CD62L lo/CCR7 Lo) par la production d’IFN-γ , de TNF-α, de perforine et par leur localisation dans les organes périphériques non lymphoïdes. Les LT CM, localisés dans les organes lymphoïdes secondaires, présentent quant à eux un niveau d’expression élevé des molécules CD62L et CCR7 et sont capables de synthétiser de l’IL-2. L’implication de ces populations dans la réponse immune anti-tumorale a notamment été mise en évidence par le groupe de Rosenberg qui démontre la présence de LTEM spécifiques de mélanomes chez des patients répondant de façon positive à des stratégies de thérapie adoptive. E-Les Lymphocytes B Les lymphocytes B (LB) jouent également un rôle dans la réponse immunitaire anti-tumorale en produisant des anticorps spécifiques de tumeurs. Chez certains patients atteints de mélanomes on a identifié dans le sérum la présence d’anticorps dirigés contre un épitope issu de la forme mutée de la protéine BRAF. Cette mutation est fréquemment retrouvée dans les mélanomes humains (80%). Même si à l’heure actuelle il n’existe pas de protocoles thérapeutiques visant à stimuler la réponse immune-anti tumorale dépendante des LB, leur capacité à produire des anticorps est utilisée dans le développement de thérapies dites passives. Au cours de ces traitements, les patients reçoivent des anticorps dirigés contre des protéines impliquées dans le développement tumoral. C’est le cas de l’anticorps commercial trastzumab ou herceptine. Cet anticorps est dirigé contre le proto oncogène HER2/neu surexprimé dans 30% des cancers du sein. L’herceptin est utilisé pour l’immunothérapie des cancers du sein souvent en association avec d’autres agents utilisés en chimiothérapie (Cobleigh et al., 1999 ; Glennie et al., 2000). L’herceptin se lie à la molécule Her2 sur les cellules tumorales et induit une forte régulation négative du récepteur à la surface cellulaire. Cette diminution de l’expression de HER-2 entraîne une réversion du phénotype malin et une décroissance de la prolifération tumorale. Cependant certains anticorps participent également à la réponse anti-tumorale en induisant le phénomène d’ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) ou l’anticorps permet de diriger plus efficacement une cellule effectrice lytique sur sa cible tumorale. En effet le fragment Fc des anticorps peut se fixer à son récepteur CD16 présent notamment à la surface des NK favorisant ainsi la reconnaissance et la lyse des cellules tumorales par ces effecteurs immuns (Clynes et al., 2000). III Mécanismes d’échappement des tumeurs à l’immunosurveillance Malgré la surveillance exercée par le système immunitaire, il est évident que les tumeurs échappent fréquemment à leur élimination. Il se produit au cours de l’évolution tumorale un changement portant à la fois sur des caractéristiques immunologiques de la tumeur et sur celles du système immunitaire chargé de la surveiller et de la contrôler. Le système immunitaire, inné et adaptatif, intervient dans la reconnaissance des tumeurs malignes, permettant parfois leur élimination. Mais, les échecs, fréquents doivent faire préférer au terme d’immunosurveillance celui d’immuno-édition. Celui-ci implique qu’après une phase de reconnaissance et de stabilisation de la tumeur par les effecteurs immuns, pendant laquelle se produit une véritable sculpture éliminant les antigènes immunodominants, des phénomènes d’échappement vont se produire, mettant la tumeur hors de portée du système immunitaire. Ainsi, de nombreuses études montrent que les cellules tumorales sont soumises à une pression de sélection par le système immunitaire. Plutôt que de conduire à l’éradication de la tumeur, cette pression de sélection exercée par le système immunitaire favorise le développement de cellules tumorales faiblement immunogènes appelés « variants tumoraux ». Ainsi, le système immunitaire pourrait avoir un rôle de « cancer immunoediting » (Figure 14). Ce concept d’immunoediting permet d’expliquer les phénomènes d’échappement tumoral et plusieurs mécanismes différents ont été identifiés (Khong et al., 2002). A-Mécanismes d’échappement tumoral lié à des modifications membranaires des cellules tumorales : 1) Perte ou diminution de l’expression des molécules du CMH-I : L’échappement tumoral à la réponse immune est le plus souvent associé à des anomalies de la présentation des antigènes par les molécules du CMH-I à la surface des cellules Figure 14: Les trois phases du processus d’immunoédition des cancers. Les cellules normales (en gris) exposées à des stimuli oncogéniques peuvent se transformer et devenir des cellules tumorales (en rouge). Très tôt dans la tumorigégèse, ces cellules expriment des marqueurs tumoraux spécifiques et génèrent des signaux de « danger » proinflammatoires qui initient le processus d’immunoédition. Dans la première phase : phase d’élimination (ou phase d’immunosurveillance), les cellules et les molécules de l’immunité innée et adaptative peuvent éradiquer le développement tumoral et protéger l’hôte de la formation tumorale. Cependant si ce processus n’est pas efficace, les cellules tumorales peuvent entrer dans la phase d’équilibre où elles peuvent maintenues chroniquement soit sculptées immunologiquement produisant une nouvelle population de variants tumoraux. Ces variants peuvent échapper au système immunitaire par différents mécanismes et deviennent cliniquement détectables dans la phase d’échappement tumoral. tumorales (Ferrone et al., 1995 ; Garcia-Lora et al., 2003 ). Cette diminution d’expression peut être liée à la diminution de la synthèse des molécules de CMH-I ou à l’inhibition de la voie d’apprêtement des antigènes (Seliger et al., 1996). De telles déficiences ont été observées dans de nombreuses tumeurs murines ou humaines et reliées à leur progression (Seliger et al., 1997 ; Johnsen et al., 1999). Plusieurs phénotypes d’altération de l’expression des molécules du CMH-I ont été décrits, pouvant entraîner une perte totale ou partielle d’expression des molécules à la surface des cellules tumorales. La perte partielle d’expression des molécules CMH-I peut provenir de défauts dans la machinerie d’apprêtement des antigènes impliquant les protéines TAP1, TAP2, LMP2, LMP7 (Seliger et al., 2000 ; Johnsen et al., 1999). Ainsi, Johnsen et ses collaborateurs montrent, dans un modèle murin, une relation de cause à effet in vivo, entre l’absence de protéines TAP1fonctionnelles et la prolifération tumorale. En effet, lorsqu’un mélange de fibroblastes murins transformés TAP-1- et TAP-1+ est inoculé à des souris, les tumeurs TAP-1- et TAP-1+ se développent, puis une régression des tumeurs TAP-1+ est observée chez des souris immunocompétentes. Alors que les deux types cellulaires se développent chez des souris athymiques. Le rejet tumoral est induit par une réponse immune cellulaire T qui est dépendante de la présentation antigénique elle-même dépendante de l’expression de TAP1 (Johnsen et al., 1999). L’instabilité génétique des cellules tumorales conduit dans certains cas à des altérations chromosomiques pouvant entraîner la perte totale d’expression des molécules de CMH-I. ceci étant observé suite à des mutations dans le gène codant la chaîne β2-microglobuline (Hicklin et al., 1998). D’autres altérations chromosomiques conduisent, à une perte sélective d’un haplotype d’un locus ou d’un allèle entraînant une diminution de l’expression des molécules de CMH-I (Koopman et al., 2000). La perte totale des molécules CMH-I ne favorise pas nécessairement le développement tumoral car elle augmente l’efficacité des cellules NK en l’absence des signaux inhibiteurs induits par la reconnaissance du CMH-I. Par contre, la perte d’un locus ou d’un allèle peut en réalité abolir toute immunogénicité à l’égard des LT, en inhibant la présentation d’un ou plusieurs épitopes dominants, tout en conservant aux cellules tumorales leurs aptitudes à inhiber les cellules NK grâce aux récepteurs inhibiteurs reconnaissant les molécules de CMH-I. De plus, même en l’absence de molécules du CMH, les cellules NK peuvent demeurer inopérantes contre certaines cellules tumorales si les NK ne sont pas sollicitées par certaines molécules activatrices essentielles comme MIC A/B. L’échappement tumoral lié à l’absence ou l’altération de présentation des antigènes par les molécules de CMH-I à la surface des cellules tumorales est souvent observé chez des patients présentant des métastases car les cellules métastatiques sont souvent dépourvues d’expression de molécules de CMH-I. De plus, certaines études montrent une corrélation entre le faible taux d’expression des molécules CMH-I dans les tumeurs et un mauvais pronostic, notamment pour des tumeurs pancréatiques et cervicales (Torres et al., 1996; Bontkes et al., 1998). 2) La contre attaque tumorale associée à l’expression de protéines de la famille du TNF : L’un des mécanismes les plus controversés dans l’échappement tumoral est associé à l’expression par les cellules tumorales des ligands des récepteurs de mort de la famille des TNFR. FasL (CD178) une protéine membranaire de la famille des TNF peut interagir avec son récepteur, Fas (CD95), et induire une cascade d’événements intracellulaires conduisant à la mort cellulaire par apoptose (Siegel et al., 2000). FasL est exprimé sur les lymphocytes T activés et participe à l’homéostasie des lymphocytes T ainsi qu’à leur réponse cytotoxique comme nous l’avons vu précédemment (Siegel et al., 2000). De nombreux travaux montrent que l’expression de FasL à la surface des cellules tumorales permet d’induire un signal de mort aux lymphocytes T activés exprimant la molécule Fas (Hahne et al., 1996 ; O’Connell, et al., 2001 ; Andreola et al., 2002) (Figure 15). Hahne et al (Hahne et al., 1996) ont montré la capacité de FasL à conférer un privilège immun aux cellules tumorales de colon in Figure 15 : Contre attaque tumorale dépendante de FasL. Figure 16 : Contre attaque tumorale dépendante de CD70. vivo. De plus, la croissance des cellules de mélanomes Fas-L positives est diminuée dans des souris mutées pour le récepteur Fas suggérant que les cellules tumorales exprimant FasL éliminent les LT anti-tumoraux par un mécanisme dépendant de Fas. Cependant, des études contradictoires mettent en évidence un rôle différents de FasL in vivo dans la mise en place d’une réponse immune proinflammatoire anti-tumorale (Khong et al., 2002). Chen et al (Chen et al., 1998) montrent que la surexpression du gène FasL au site tumoral entraîne le rejet tumoral dans un modèle de mélanome murin. Cet effet est accompagné par une importante infiltration de neutrophiles inflammatoires. Par ailleurs, Wada et al (Wada et al., 2007) ont récemment montré que les niveaux d’expression de FasL à la surface de lignées de mélanomes déterminaient le type de réponse tumorale. Dans ce travail, il a été mis en évidence qu’un faible taux de FasL induit in vivo l’apoptose des LT anti-tumoraux et de ce fait, l’échappement tumoral alors que une forte expression de cette protéine favorise le rejet tumoral associé à l’infiltration de neutrophiles. En plus de la molécule FasL d’autres molécules comme le ligand de mort TRAIL (Giovarelli et al., 1999) et la chémokine RANTES (Mellado et al., 2001) sont impliqués dans des mécanismes de contre-attaque tumorale. Plusieurs travaux, ont également montré que l’expression du ligand de CD27 :CD70 à la surface de lignées de glioblastomes et de carcinomes rénaux induit l’apoptose de LT exprimant le récepteur CD27. Cette apoptose est induite par la voie d’apoptose dépendante de la protéine SIVA (Figure 16). 3) Rôle de deux molécules inhibitrices de immunoglobulines dans l’échappement tumoral : la famille des les protéines PD-L1 et PD-L2 : Un autre événement contribuant à l’échappement tumoral implique des molécules de la famille des immunoglobulines comme les protéines PD-L1 et PD-L2 (Blank et al 2005). L’interaction entre la molécule PD-1 présente à la surface des LT et ses ligands PD-L1 ou PD-L2 exprimés sur les cellules tumorales entraîne l’inhibition de l’activation des CTLs (Freeman et al., 2000). Dong et al ont montré que PD-L1 est exprimé à la surface de différents types tumoraux et favorise l’apoptose des effecteurs CD8+ (Dong et al., 2002). Ce résultat est conforté par le fait que le blocage de PD-L1 par un anticorps spécifique, diminue l’apoptose induite des LT conduit au rejet tumoral dans différents modèles (Dong et al., 2002 ; Iwai et al., 2002). 4) Rôle des molécules de CMH non classique dans l’échappement tumoral : les protéines HLA-G et HLA-E : Comme nous l’avons vu dans le chapitre traitant de l’immunité innée les cellules NK expriment des récepteurs inhibiteurs capables de bloquer leur activité cytotoxique. La molécule HLA-E, un ligand du récepteur inhibiteur CD94-NKG2A/B, est retrouvée à la surface de lignées de mélanomes et est capable d’inhiber in vitro la fonction cytotoxique de clones NK (Derrel et al., 2006). Par ailleurs, le groupe de Carossella a identifié à la surface de mélanomes une autre molécule du CMH non classique : HLA-G (Paul et al., 1999). HLAG a initialement était décrite comme inhibitrice de la fonction de cellules NKs intrervenant dans le contrôle de l’immunité foeto-placentaire. De nombreux travaux démontrent actuellement l’implication de cette molécule dans l’échappement de tumeurs à la surveillance par les cellules NK (Algarra et al., 2004). B-Mécanismes d’échappement tumoral associés aux effecteurs immuns : 1) Les LT régulateurs: les Treg Les lymphocytes T régulateurs (Treg) représentent une petite fraction (5 à 6%) de l’ensemble des LTCD4 et jouent un rôle fondamental dans les maladies auto-immunes en inhibant la réponse immunitaire. L’expression du marqueur CD25 sur les cellules T a longtemps été utilisé pour caractériser les Tregs. Cependant la présence de CD25 n’est pas nécessairement associée à la fonction régulatrice et ce marqueur est également exprimé sur des lymphocytes effecteurs activés non régulateurs. Le niveau d’expression d’autres molécules de surface comme GITR (Glucocorticoïde-Induced TNFR family Related Gene) et CTLA-4 ont également été utilisés comme des marqueurs des Treg (Sakaguchi et al., 2004). Néanmoins à l’heure actuelle, le marqueur le plus précis permettant de caractériser les lymphocytes Treg semble être le facteur de transcription Foxp3 (Hori et al., 2003 ; Khattri et al., 2003 ; Fontenot et al., 2003 ; Walker et al., 2003 ; Wang et al., 2004) qui n’est présent que dans cette population lymphocytaire. Parmi les LT de phénotype CD25+FOXP3+ on distingue plusieurs sous populations cellulaires de Treg. (i) Les LTreg naturels (CD4+CD25+) représentent une petite fraction des CD4 totaux et dérivent du thymus et sont présents en dehors de toute stimulation antigénique. Ces cellules expriment un haut niveau de GITR et Foxp3 et induisent la suppression immune via un contacte cellule / cellule. (ii) Les cellules Tr1 et Th3 sont des sous-populations de Tregs induites dans les tissus périphériques après stimulation antigénique. Ces cellules secrètent une grande quantité de cytokines (IL-10, TGF-β) grâce auquelles elles inhibent la réponse immune (Roncarolo et al., 2006 ; Weiner et al., 2001 ; Kawaida et al., 2005). (iii) Les LT régulateurs CD4+ adaptatif induits comme leur nom l’indique sont activés après rencontre avec l’antigène (Wang et al., 2004 ; Wang et al., 2005). Comme les LTregs naturels, ces cellules expriment un haut niveau de GITR et Foxp3 cependant elles sont capables d’inhiber la réponse immune via le contact cellulaire ou la sécrétion de cytokines immunosupréssives (différentes du TGFB et de l’IL-10). (vi) Tous les LTreg ne sont pas des LTCD4+. En effet, des LTreg de phénotype CD8+CD25+Foxp3+ ont été identifiées chez l’homme et la souris (Endharti et al., 2005 ; Wei et al., 2005 ; Shao et al., 2005). (vii) Plus étonnant encore, des travaux récents suggèrent que les cellules NKT peuvent également jouer un rôle dans la suppression de la réponse immune (Terabe et al., 2000 ; Terabe et al., 2003 ; Terabe et al., 2005). Les LT reg dans le microenvironement tumoral peuvent jouer un rôle important dans la suppression de la RI anti-tumorale. De nombreux groupes ont montré la présence d’un pourcentage élevé de lymphocytes T régulateurs de phénotype CD4+CD25+ dans le sang périphérique ou les infiltrats lymphocytaires de patients souffrant de nombreux cancers (comme les cancer du poumon (Woo et al., 2001), cancer du sein (Liyanage et al., 2002), cancer des ovaires (Curiel et al., 2004), mélanomes (Wang et al., 2004 ; Wang et al., 2005 ; Viguier et al., 2004), cancer du foie (Ormandy et al., 2005 ; Unitt et al., 2005), cancer gastrique (Kawaida et al., 2005), et lymphomes (Yang et al., 2006)). Une étude montre même que la présence d’un fort % de LTreg dans les cancers ovariens, peut être associée à un mauvais pronostic de la maladie (Curiel et al., 2004). Dans des modèles murins, l’utilisation d’anticorps bloquants CD25 ou l’utilisation de molécules pharmacologiques capables d’inhiber les LTreg ont permis de démontrer le rôle positif de ces cellules dans le développement tumoral. Plusieurs théories ont été développé pour expliquer l’origine des LT régulateurs présents au site tumoral. Certaines de ces cellules seraient des LT régulateurs naturels de phénotypes CD4+/CD25+/Foxp3+, produits par le thymus et cross réagissant avec des antigènes exprimés à la surface des cellules cancéreuses. Une autre hypothèse soutient que des LT naïfs de phénotype CD4+/CD25-/Foxp3- peuvent être convertis en LT régulateurs CD4+/CD25+/Foxp3+ au site tumoral (Walker et al., 2003 ; Walker et al., 2005). Cette conversion semble dépendante de la nature du microenvironement tumoral, qui est riche en cellules dendritiques immatures et en cytokines du type TGF-β et IL-10. Ces CD immatures ont pour particularité de présenter une faible dose d’antigène et possèdent peu ou pas de molécules de costimulations. Il a été montré dans divers modèles que la stimulation de LT naïfs par ces CD immatures permet la conversion de LT CD4+CD25- naïfs en LT CD4+CD25+ possédant des fonctions régulatrices (Apostolou et al., 2004 ; Kretschmer et al., 2005). Par ailleurs les CD immatures mais également les cellules tumorales secrètent de l’IL-10 et du TGFB deux cytokines favorisant la génération de LT reg CD4+/CD25+/Foxp3+ à partir de cellules CD4+/CD25-/Foxp3- naïves (Chen et al., 2003 ; Fantini et al., 2004 ; Marie et al., 2005 ; Ghiringhelli et al., 2005 ; Huang et al., 2006). 2) Les Macrophages Associés aux Tumeurs : Les TAM A la différence des macrophages retrouvés dans les tissus seins, les macrophage tumoraux (TAM) présentent une faible capacité à lyser les cellules tumorales, à présenter leurs antigènes aux LT et à secréter des cytokines favorisant la prolifération et les fonctions antitumorale des LT et des NK. En plus de leurs rôles dans l’inhibition de la réponse immune anti-tumorale ces cellules semblent également jouer un rôle direct dans le développement des tumeurs. Hagemann et al (Hagemann et al., 2004) ont montré que les TAM sont capables de stimuler l’invasivité tumorale en stimulant la synthèse de métaloprotéinases par les tumeurs. D’autres travaux montrent que ces cellules secrètent un grand nombre de facteurs de croissances qui stimulent la prolifération des cellules tumorales (Goswami et al., 2005 ; Tsutsui et al., 2005 ; Wang et al., 2005 ; Lewis et al., 1993). Par ailleurs, grâce à leur capacité à secréter des cytokines proangiogéniques (VEGF,TNF-α, βFGF) (Bingle et al., 2002 ; Leek et al., 2002 ; Mantovani et al., 2002 ; Hagemann et al., 2005) ces cellules jouent un rôle dans l’angiogenèse tumorale. Enfin il a été montré que la déplétion des macrophages chez des souris dans lesquelles est induit un cancer mammaire, réduit la dissémination tumorale, ce qui suggère un rôle de ces TAM dans l’apparition des métastases (Lin et al., 2001). 3) Les cellules dendritiques : Les CD Comme nous l’avons dit dans la partie I les CDs jouent un rôle central dans la génération et le maintient de la réponse immune anti-tumorale (Guermonprez et al., 2002). Cependant les CDs peuvent également contribuer à formation d’un microenvironement tumoral favorisant l’échappement des tumeurs. Les CDs peuvent se développer soit à partir de progéniteurs myéloïdes soit à partir de progeniteurs lymphoïdes on parle alors respectivement de CD myéloïdes ou plasmacytoïdes. Ces deux populations se caractérisent par des marqueurs de surfaces différents et également par le type de réponse immune qu’elles initient ou aux quelles elles participent. 3.1) Les cellules dendritiques immatures (CDi) : Dans la moelle osseuse les CDMs sont définies commes de CDs immatures (Cdi). Les Cdis, sont capables de « appréter » des antigènes mais n’expriment pas ou peu de molécules de cotimulations (CD80, CD86, CD40) et produisent très peu d’IL-12 ce qui est nécessaire pour induire la prolifération des LTs. Plusieurs travaux ont mis en évidence la présence de ces Cdi dans le microenvironement tumoral (Troy et al., 1997 ; Enk et al., 1997 ; Nestle et al., 1997 ; Chaux et al., 1997). L’addition in vitro de GM-CSF et TNF-α ou de CD40L n’est pas suffisante pour induire l’expression de CD80 à la surface de ces Cdi (Chaux et al., 1997) suggérant que l’absence d’expression des molécules de costimulation par ces cellules n’est pas dû à l’absence de signal d’activation dans le microenvironement tumoral mais serait dû à un défaut dans le développement cellulaire. Les Cdi ne sont pas capables d’induire une réponse immune anti-tumorale mais peuvent cependant induire la tolérance des LT. En effet si les CPA n’apportent pas de signaux de costimulation lors de l’activation des LT ceux-ci peuvent entrer dans un état de tolérance ou d’anergie (Steinman et al., 2003 ; Guermonprez et al., 2002). Ceci est démontré par le fait que des CD dérivées de tumeurs du colon ou de mélanome induisent une faible activation des LT mais développent tolérance et anergie (Enk et al., 1997 ; Nestle et al., 1997 ; Chaux et al., 1997). 3-2) Les cellules dendritiques plasmacytoïdes : (CDp) En plus de l’accumulation de CD immatures, de nombreuses études ont mis en évidence dans les tissus tumoraux la présence d’une sous population de CD plasmacytoïdes induisant la suppression de la réponse lymphocytaire T. L’accumulation de ces cellules a été retrouvée dans des tumeurs ovariennes et à la périphérie de mélanomes primaires (Vermi et al., 2003). Il a été montré que les ganglions drainants de souris préalablement injectées avec des cellules tumorales contiennent des CD plasmacytoïdes produisant de façon constitutive une enzyme appelée IDO qui lymphocytes (Munn et al., 2004). bloque la prolifération clonale et induit la mort des 4) Les cellules suppresseurs myéloïdes : Les MSC Différents groupes ont mis en évidence, une corrélation entre l’accumulation de cellules myéloïdes dans les organes lymphoïdes et la suppression immunitaire. Actuellement, ces cellules myéloïdes (MSCs) sont identifiées grâce à l’expression de marqueurs de surface CD11b+ et Gr-1+. Des modèles pré-cliniques ont démontré une accumulation progressive des MSCs dans la rate et le sang de souris injectées avec des cellules tumorales. Les cellules tumorales provenant de modèles animaux communément utilisés aussi bien que de nombreux modèles tumoraux humains partagent la capacité de secréter différentes cytokines qui agissent sur les précurseurs myéloïdes, comme le GM-CSF, l’IL-3, le MCSF, l’IL-6 ou le VEGF. Quand ces cytokines sont relarguées en grande quantité, par les tumeurs, elles favorisent l’expansion du « pool » de cellules myéloïdes dans les organes lymphoïdes secondaire. Liu et al ont observés durant la progression tumoral une diminution de l’activité anti-tumorale des CTLs associée à une augmentation du nombre de MSCs CD11b+ Gr-1+ dans les tumeurs (Liu et al., 2003). Et des travaux récents mettent en évidence dans un modèle d’adenocarcinome murin, un effet inhibiteur direct des MSCs sur la proliferation des CTL après stimulation du TCR (Radoja et al., 2000). C-Les Mécanismes d’échappement tumoral associés auxmolécules du microenvironnement: 1) L’ indoleamine 2,3-dioxygenase : IDO Le gène INDO code pour l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). Cette enzyme régule la réponse immune en supprimant les fonctions effectrices T par sa capacité à cataboliser le tryptophane (Melor et al., 2004). Ceci a été mis en évidence par le fait que le catabolisme du tryptophane par des macrophages est capable de bloquer la prolifération des lymphocytes T en induisant l’arrêt en phase G1 du cycle cellulaire (Munn et al., 1999). IDO peut être exprimée par les cellules tumorales ou les cellules du stroma tumoral. Cette enzyme est surexprimée par différents types de tumeurs (Uyttenhove C et al 2003) mais l’augmentation de son niveau d’expression n’est pas corrélée au pronostic vital des patients (Okamoto et al., 2005). L’expression ectopique de IDO dans des cellules tumorales inhibe la réponse lymphocytaire T (Mellor et al., 2002) et stimule la croissance tumorale chez un animal préimmunisé contre un antigène de tumeur spécifique (Uyttenhove et al., 2003). L’induction de IDO peut également être observée dans les cellules composant le stroma tumoral. Ceci peut se produire soit dans les cellules à proximité du site tumoral soit dans des cellules plus éloignées du site, comme les ganglions drainant des tumeurs, qui sont les sites privilégiés de l’activation immunitaire. Des mélanomes murins B16 génétiquement modifiés pour exprimer de façon constitutive le GMCSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) induisent l’accumulation des cellules surexprimant IDO dans les ganglions drainants des tumeurs. Ces cellules sont une sous population de cellules dendritiques CD11c+ avec une morphologie plamacytoïde exprimant le marqueur lymphocytaire B CD19 (Baban et al., 2005 ; Munn et al., 2004). 2) Le facteur de croissance transformant béta : TGFβ Le TGFβ est produit par de nombreux types tumoraux, et fonctionne comme un facteur suppresseur de tumeurs précoce dans le développement tumoral en inhibant la prolifération tumorale (Dumont et al., 2003 ; Yingling et al., 2004). Cependant au cours du développement tumoral les cellules cancéreuses deviennent résistantes à l’inhibition de prolifération induite par le TGFβ, ce qui peut conduire alors à l’apparition du phénotype métastatique. Bien que les cellules cancéreuses deviennent insensibles au TGFβ, elles continuent à le secréter, contribuant à la formation d’un microenvironnement tumoral immunosuppressif observé chez nombreux patients présentant des tumeurs métastatiques (Dumont et al., 2003 ; Yingling et al., 2004). Plusieurs études ont analysés le rôle du TGFβ dans la régulation des fonctions effectrices des LT au cours de la réponse immune antitumorale. Des cellules tumorales transfectées par le gène codant le TGFβ suppriment la fonction T effectrice in vivo et in vitro (Torre-Amione et al., 1990) et diminuent l’efficacité de vaccinations tumorales utilisant des DC (Kao et al., 2003). L’effet du TGFβ sur l’inhibition de l’activité des CTL spécifiques apparaît multifactorielle. En effet le TGFβ est capable d’inhiber la différenciation des cellules TCD4+ (Gorelik et al., 2002 ; Gorelik et al., 2000), d’induire la suppression de la production d’IFN-γ par les cellules NK (Laouar et al., 2005) et de bloquer la maturation des CD en réduisant leur capacité à présenter l’antigène, diminuant ainsi leur capacité à stimuler la prolifération des CTL (Strobl et al., 1999). 3) Le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor): Le VEGF est bien connu pour stimuler la croissance des cellules endothéliales et favoriser la néo-vascularisation des tumeurs. Cependant il a été montré que ce facteur soluble est capable d’inhiber la fonction de présentation d’antigène des DC provenant de patients ou de souris porteuses de tumeurs. L’injection d’anticorps bloquant du VEGF entraîne une augmentation du nombre de DC matures et diminue la croissance tumorale par un mécanisme dépendant de la réponse CTL (Gabrilovich et al., 1996). 4) Les Chémokines : Les Chémokines, appartiennent à une famille de molécules connue pour jouer un rôle déterminant dans la migration des leukocytes (Homey et al., 2002). La composition de l’infiltrat cellulaire des tumeurs solides, est influencé par des chémokines spécifiques produites à la fois par les cellules tumorales et par les cellules du stroma. L’une d’entre elles est la chémokine CCL22. Cette chémokine ainsi que son récepteur CCR4 semble jouer un rôle prépondérant dans la formation d’un microenvironnement tumoral de nature immunosuppresseur. Il a été démontré que le récepteur CCR4 est présent à la surface des LTreg (Curiel et al., 2004 ; Iellem et al., 2001 ; Lee et al., 2005) et que les cellules de carcinome ovariens ainsi que les macrophages infiltrants secrètent CCL22 attirant ainsi les LTreg au site tumoral. Les Treg recrutés vont alors inhiber la fonction effectrice des CTL favorisant l’échappement tumoral. La migration des CDs plasmacytoïdes sur le site de la tumeur ou dans les ganglions drainants est également associée à la présence de récepteurs aux chémokines. En effet, il a été démontré que les carcinomes ovariens peuvent produire de grande quantités de CXCL12, une autre chémokine importante, qui induit la migration des précurseurs des CD plasmacytoïdes au site tumoral (Zou et al., 2001), précurseurs qui sont capables d’inhiber la réponse CTL par sécrétion d’IL10. 5) La cyclooxygénase 2 : COX2 La cyclooxygénase (COX2) est une enzyme surexprimée dans de nombreux types tumoraux (Pereg et al., 2005). COX2 régule différents processus impliqués dans la tumorigénèse et la progression tumorale (Dannenberg et al., 2001). Dans un modèle de carcinome pulmonaire, Stolina et al ont démontré que l’inhibition de COX2 par un oligonucléotide anti-sens ou par un inhibiteur pharmacologique (SC-58236), réduit la croissance tumorale et favorise la survie (Stolina et al., 2000). Dans cette étude, la diminution de la croissance tumorale, est associée à une augmentation de l’infiltrat lymphocytaire et des concentrations d’IL12 et d’IFN-γ circulant ainsi qu’à une diminution de la concentration d’IL10. Chez des patientes souffrant de cancer du sein, il a été établi une corrélation entre la perte de fonctions des CD et des CTL et l’expression tumorale de COX2 (Pockaj et al., 2004). COX2 est également capable de stimuler une réponse immunosuppressive en faisant intervenir des Treg. En effet l’inhibition de COX2, réduit de 60% le nombre de LTregCD4+CD25+FOXP3+ infiltrant, ce qui stimule le relargage d’IFN-γ par les CTL (Sharma et al., 2005). 6) L’arginase et la nitric-oxide synthase : ARG et NOS Tout comme avec IDO, il existe une relation complexe entre le catabolisme de la (L)arginine, l’immunité et la tumorigénèse (Bronte et al., 2005 ; Rodriguez et al., 2006), qui implique aussi bien des effets directs sur la croissance et la survie tumorale que des effets indirects impliquant les cellules immunitaires associées aux tumeurs. Les deux types d’enzymes qui contrôlent le catabolisme de l’arginine sont l’arginase (ARG ; codée par ARG1 et ARG2) et la nitric-oxide synthase (NOS ; codée par NOS1,NOS2 et NOS3). Ces enzymes ainsi que les produits de ces deux voies régulent la croissance tumorale. L’ornithine, un produit issu du catabolisme de la L-arginine par l’arginase, est le précurseur de la biosynthèse de polyamines, qui sont d’importants promoteurs tumoraux (O’Brien et al ., 1997). Une augmentation du niveau de polyamines est fréquemment observée dans les tumeurs qui présentent une augmentation d’activité de l’arginase (Singh et al., 2000). Une augmentation de l’activité de l’arginase a été detectée chez des patients atteints de cancers colorectaux, de cancers du sein, de la peau ou de la prostate (Bronte et al., 2005). D’autres études ont également montré que les infiltrats de MSCs ou de TAMs peuvent être une importante source d’activité ARG, plus importante que celle produite par les cellules tumorales elles même (Kusmartsev et al., 2005 ; Zea et al., 2005 ; Rodriguez et al., 2004). En plus de ses effets directs sur la prolifération tumorale, l’activité de ARG est aussi associée à la suppression immune par les MSCs (Rodriguez et al., 2006) et les TAMs. L’effet immunosuppresseur de cette enzyme est associé à une diminution d’expression par les LT infiltrant (TIL) de la chaîne CD3 epsilon du TCR, qui est un composant clé de la signalisation du TCR. Chez des porteurs de RCC, une augmentation de l’activité l’arginase a été détectée dans les PBMCs qui est associée à une diminution de l’expression de la chaîne CD3 epsilon et à une inhibition de la production d’IL-2 et d’IFN-γ (Zea et al., 2005). Dans cette étude, la source de l’activité arginase provenait d’une population de MSC (CD11b+CD14-). La déplétion de ces cellules MSC a permis de restaure la capacité de prolifération des LT, la production de cytokines et l’expression de la chaîne CD3 epsilon. Comme nous l’avons dit la NOS contrôle également le catabolisme de l’arginine. Des travaux portant sur l’activité de la NOS dans des CMSs font de cette enzyme un composant essentiel de la suppression immune anti-tumorale. En effet, il a été montré que des CMSs (CD11b+Gr1+) isolées à partir de souris iNOS ko ne sont plus capables d’inhiber la prolifération des lymphocytes T (Mazzoni et al., 2002) et Mills et al on mis en évidence que l’activité de la NOS dans les CMS intra tumorales est corrélée à la progression tumorale (Mills et al., 1992). I Le mélanome cutané Les cancers de la peau représentent la troisième cause de cancer chez l’homme, et l’incidence globale de ces cancers est en forte augmentation. Les carcinomes basaux cellulaires, les carcinomes squameux et les mélanomes représentent les trois formes essentielles de cancers cutanés chez l’homme. L’incidence des mélanomes est actuellement de 5 à 10 nouveaux cas par an pour 10000 habitants (en France et dans les autres pays d’Europe), et ce chiffre ne cesse d’augmenter de façon inquiétante. C’est une tumeur qui touche tous les âges et le soleil représente le seul facteur environnemental identifié, impliqué dans l’épidémiologie de cette forme de cancer. Il existe cependant des cas de prédispositions familiales comme dans le contexte des mélanomes familiaux (10% des mélanomes). Si les mélanomes sont diagnostiqués précocement ils peuvent être soignés par chirurgie dans 80% des cas. Cependant il n’existe à l’heure actuelle aucune thérapeutique efficace dans le traitement des mélanomes métastatiques et la survie globale des patients varie selon les cas de 6 mois à 5 ans. Dans cette partie, nous nous attacherons à décrire les différents sous types de mélanomes, le développement histologique de ces tumeurs, et les événements moléculaires responsables de la survenue de ces cancers. A-Les divers types de mélanomes: On distingue classiquement quatre types de mélanomes cutanés : • Le mélanome nodulaire ( Nodular Melanoma, ou NM). Le NM (10 à 15% des mélanomes) est une tumeur agressive, envahissant verticalement le derme et les ganglions lymphatiques. • Le mélanome sur mélanose de Dubreuilh (Lentigo Malignant Melanoma, LMM). Cette tumeur (10 à 15 % des mélanomes) survient chez les personnes âgées à partir d’une mélanose, le plus souvent située sur la pommette ou la tempe. • Le mélanome lentigineux des extrémités (Acral Lentiginous Melanoma, ALM). Cette tumeur se développe sur la plante des pieds et plus rarement sur la paume des mains. Elle présente un potentiel d’agressivité et d’infiltration des structures sous- • Le mélanome à extension superficielle (Superficial Spreading Melanoma, SSM). Le SSM représente la forme la plus fréquente de mélanomes (70 % des mélanomes) et est associé à des épisodes répétés de brûlures solaires le plus souvent survenues dès le jeune âge. Il présente dans un premier temps une lente extension horizontale et superficielle, puis une extension verticale avec une infiltration vers le derme. B-Histologie et développement des mélanomes : Les mélanomes sont des tumeurs qui se développant à partir des mélanocytes. Ces cellules de la peau localisées normalement à la jonction dermo-épidermique sont chargées de fabriquer la mélanine, un pigment destiné à protéger la peau contre des rayonnements ultraviolets. Les mélanocytes peuvent se grouper en amas ou thèques dans l’épiderme et /ou le derme et forme ce que l’on appelle un naevus mélanocytaire communément appelés aussi « grain de beauté ». L'origine de ces nævi dits " communs ou acquis " qui apparaissent après la naissance et qui sont les plus nombreux est discutée. Ils pourraient résulter de mutations somatiques très tardives survenant dans des mélanocytes matures ce qui expliquerait leur caractère très localisé. On distingue plusieurs formes histologiques de naevi selon leur répartition dans le derme et l’épiderme: i- Les nævi jonctionnels : les cellules se disposent de façon dispersée en nappe dans la couche basale de l’épiderme. ii- Les nævi dermiques : prolifération mélanocytaire strictement intra-dermique. iii- Les nævi mixtes ou composés : à la fois dans le derme et à la jonction dermoépidermique. Les naevi sont considérés comme des tumeurs bénignes mais peuvent évoluer en mélanomes et l’on distingue alors deux phases d’extension du mélanome (Figure 17). Une phase de prolifération horizontale, radiale dans l’épiderme qui peut ensuite évoluer en phase verticale qui envahit le derme et qui constitue la phase la plus dangereuse pendant laquelle les cellules acquièrent leur potentiel métastatique. Cependant, tous les mélanomes ne suivent pas ce schéma de développement et des phases de prolifération verticale ou Figure 17 : Les différents stades de la lésion mélanocytaire : a) La peau normale : Distribution régulière des mélanocytes localisés sur la couche basale de l’épiderme. b ) Naevus mélanocytaire benin : Augmentation du nombre de mélanocyte regroupés en amas. c ) Mélanome à croissance horizontale (RGP melanoma) : premier stade de développement tumoral, prolifération radiale des cellules de mélanome. d ) Mélanome à croissance verticale (VGP melanoma) : stade du développement ayant un potentiel malin conduisant directement à la formation du mélanome malin métastatique. Les cellules de mélanome prolifèrent de façon verticale envahissent le derme et peuvent infiltrer le système vasculaire et lymphatique. horizontale peuvent se produire directement à partir de naevi ou de mélanocytes isolés et progresser ainsi en mélanome métastatique. C-Altérations génétiques impliquées dans l’apparition des mélanomes : Dans les mélanomes, comme dans la plupart des cancers, l’apparition du phénotype tumoral résulte de la survenue de modifications génétiques qui altérent des voies de signalisation cellulaires impliquées dans la prolifération, la survie, la senescence ou l’apoptose. 1) La voie de signalisation Ras / Raf / MEK / Erk : La cascade de signalisation des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) (Ras /Raf /MEK/Erk) joue un rôle clé dans la prolifération des mélanomes. La voie des MAPKinases est une voie essentielle activée au cours de la prolifération cellulaire, en réponse a de nombreux ligands. Le point central de cette réponse est l'activation des GTPases Ras. Ces protéines sont ancrées dans la partie cytosolique de la membrane plasmique par leur extrémité C-terminale fortement hydrophobe. L’activité biologique des protéines Ras est contrôlée par les cycles GTP/GDP. En effet, elles existent sous une forme inactive liée au GDP (Guanosine Diphosphate) et une forme active liée au GTP (Guanosine Triphosphate). (Barbacid et al., 1987 ; Buday et al., 1993). Les protéines Ras possèdent la capacité intrinsèque d'hydrolyser le GTP en GDP et d'échanger le GDP en GTP mais cette réaction est trop lente pour être efficace. Les facteurs d'échange (comme Sos) permettent de passer de la forme Ras-GDP à la forme Ras-GTP alors que d'autres protéines : les GAP (GTPase activating factor) stimulent l'hydrolyse de la forme Ras-GTP en Ras-GDP (Figure 18). Les signaux extracellulaires qui permettent d'activer ras sont multiples : des facteurs de croissance, des cytokines, des hormones ou encore des neurotransmetteurs. Prenons l'exemple d'un facteur de croissance pour suivre la voie de signalisation qui permet d'activer Ras (Figure 19). La fixation de l'EGF (Epidermal Growth Factor) sur son récepteur à activité tyrosine kinase (EGFR) provoque l’autophosphorylation de tyrosines dans la partie cytoplasmique du récepteur. Ce domaine phosphorylé interagit avec des domaines SH2 de Figure 18 : Cycle d’activation des GTPases Ras. Figure 19 : Activation de la voie des MAPK par les facteurs de croissance. La voie des Mitogen Activated Protein Kinases (MAP kinases) constitue l’une des voies principales de transmission des signaux de prolifération apportés par les facteurs de croissance. Cette voie, après activation des récepteurs, implique, par l’intermédiaire de protéines adaptatrices, l’activation d’une protéine Ras, à l’origine de la cascade des activités de phosphorylation : Raf (MAP kinase kinase kinase), Mek (MAP kinase kinase) et Erk (MAP kinase). Cette dernière, transloquée dans le noyau cellulaire, phosphoryle alors les facteurs de transcription qui activent la transcription de l’ensemble des gènes responsables de la réplication de l’ADN et de la mise en route du cycle cellulaire (ADN polymérases, cyclines, etc.). la protéine Grb2 (elle même associée au facteur d'échange Sos) ce qui a pour effet de transloquer le complexe Grb2/Sos à proximité de la protéine Ras sous la membrane plasmique. La protéine Sos peut alors promouvoir l'échange GDP en GTP sur Ras (Feig et al., 1994). La protéine Ras-GTP recrute à la membrane plasmique la protéine Raf qui est une sérine-thréonine kinase (Stokoe et al., 1994). Après avoir été activé par un facteur encore inconnu, Raf phosphoryle la protéine MEK (Mitogen-induced Extracellular Kinase) (ou MAPKK pour mitogen-activated protein kinase kinase) qui à son tour phosphoryle la protéine ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) (ou MAPK) qui se transloque dans le noyau. Cette cascade de phosphorylation permet l'activation de facteurs de transcription comme c-Jun, c-Myc ou c-Fos impliqués dans la régulation de l’expression de gènes, qui contrôlent la prolifération cellulaire. Ainsi, il a été montré que la voie des MAP Kinases activée par la protéine Ras-GTP, entraîne une augmentation de la cycline D1 ce qui permet à la cellule de passer de la phase G1 à la phase S, et ainsi d'induire une prolifération cellulaire (Lavoie et al., 1996). Dans 90% des mélanomes on trouve une hyper activation de la protéine ERK (Cohen et al., 2002). Dans les mélanomes ERK peut être activé par la production de facteurs de croissance autocrines (Satyamoorthy et al., 2003), ou par des mutations activatrices présentes sur des récepteurs des facteurs de croissance (WillmorePayne et al., 2005). Cependant, un mécanisme plus commun est associé à des mutations de l’oncogène NRAS (un des trois gènes Ras avec HRAS et KRAS). NRAS est muté dans 15 à 30% des mélanomes et la mutation la plus commune conduit à une substitution d’une glutamine en une leucine en position 61 (Q61L) (Davies et al., 2002). Un autre composant de cette voie, fréquemment muté est l’oncogène BRAF (un des trois gènes RAF avec ARAF et CRAF). BRAF est muté dans 70% des mélanomes (Davies et al., 2002) et la mutation la plus courante induit la substitution d’une valine par un acide glutamique en position 600 (V600E) (Davies et al., 2002). BRAF V600E stimule de façon constitutive la voie ERK et stimule la prolifération, la survie et la croissance tumorale (Gray-Schopfer et al., 2005). BRAFV600E contribue aussi à la néo-angiogenèse en stimulant la sécrétion de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (Sharma et al., 2005). La mutation BRAF V600E contrôles également l’expression de plusieurs gènes participant à la transformation tumorale des mélanomes tel que le facteur de transcription MITF. (Wellbrock et al., 2005) (Goodall et al., 2004)(Bhatt et al., 2005)(Gray-Schopfer et al., 2006 ; Michaloglou et al., 2005). 2) Le facteur de transcription MITF : MITF (Microphtalmia-associated transcription factor) est un facteur de transcription essentiel dans les mélanocytes. Il est même considéré comme le plus important régulateur de la biologie de ces cellules, car il est impliqué dans la régulation de l’expression de protéines de la mélanogenèse comme les tyrosinases et les protéines MelanA/MART-1. Ces protéines sont présentées sous formes de peptides par les mélanomes et sont reconnues par les lymphocytes T anti-tumoraux (Melan-A MART-1) (Levy et al., 2006). MITF est aussi retrouvé dans de nombreux mélanomes humains ou son expression est essentielle pour la prolifération et la survie tumorale (Levy et al., 2006). Cependant MITF est plus fortement exprimé dans les mélanocytes normaux que dans les mélanomes. Son niveau d’expression semble conditionner les capacités de prolifération du mélanome. En effet, il a été montré qu’un niveau élevé de MITF inhibe la prolifération des cellules de mélanome (Wellbrook et al., 2005) par un mécanisme associé à un arrêt du cycle cellulaire impliquant le contrôle de l’expression de protéines régulatrices du cycle cellulaire (p16, Cdk2, p21cip). De façon paradoxale, une diminution du niveau de MITF dans les mélanomes, favorise également une diminution de la prolifération cellulaire, car à de faibles doses, MITF n’agit pas sur le cycle cellulaire mais induit un mécanisme d’apoptose. Il semble donc que seul un niveau intermédiaire de cette protéine MITF favorise la prolifération des mélanomes. 3) La voie de la PI3K : Une autre protéine joue un rôle important dans la prolifération des mélanomes, il s’agit de la Phosphatidyl-Inositol3Kinase (PI3K) (Figure 20). La PI3K est un complexe dimérique composé de la sous-unité catalytique p110 et de la sous-unité régulatrice p85. Cette protéine, est une phosphatidylinositol kinase qui catalyse (4,5)-biphosphate la (PIP2) phosphorylation en du phosphatidylinositol phospholipide (3,4,5) triphosphate en réponse à des facteurs de croissance ou à des cytokines. Une fois : (PIP3) Figure 20 : La Phosphatidyl-Inositol3Kinase (PI3K) Une fois activée par des récepteurs aux facteurs de croissance, la PI3K catalyse la transformation du phosphatidylinositol (4,5)biphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol (3,4,5) (PIP3) triphosphate . Ces lipides membranaires vont jouer le rôle de second messager et permettrent l’activation de signaux intracellulaires. L’inactivation de ces voies survient après déphosphorylation des lipides par la phosphatase PTEN (Phosphatase and TENsin homolog). Dans les mélanomes, la protéine PTEN peut être mutée entraînant l’activation constitutive des voie de signalisations induites par la PI3K phosphorylés ces lipides membranaires jouent le rôle de seconds messagers (Shaw et al., 2006), capables d’activer plusieurs voies de signalisation (Cantley et al., 2002) impliquées dans la prolifération, la survie , la croissance et la mobilité cellulaire. L’inactivation de ces voies survient après déphosphorylation des lipides par la phosphatase PTEN (Phosphatase and TENsin homolog) (Figure 20). La PI3K régule ces voies de signalisations qui sont hyper actives dans les mélanomes. Cette hyperactivité est associée à plusieurs évènements comme des mutations de la PI3K (Omholt et al., 2006), des pertes de fonction ou d’expression de la phosphatase PTEN (Whu et al., 2003), ou une surexpression des effecteurs de la PI3K. 4) Mutations des voies de survie et d’apoptose : Il est intéressant de noter que certaines altérations génétiques survenant dans les mélanomes augmentent la résistance de ces tumeurs à l’apoptose. C’est le cas des mutations NRAS et BRAF, de la surexpression de la protéine Bcl2, du facteur de transcription NFkB (Nuclear Factor kappa B) et de la perte d’expression de PTEN. D’autres signaux de survie cellulaire peuvent provenir de mutations de la voie signalisation β caténine/APC (Adénomatous Polyposis of Colon) ou de la perte d’expression de protéines telles que nAPAF-1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1). 5)Altérations des gènes suppresseurs de tumeur : La protéine p16INK4a (Inhibitor of cycliN-dependent Kinase 4) agit comme suppresseur de tumeur dans les mélanomes. Elle se lie aux protéines kinases du cycle cellulaire Cdk4 (Cyclin dependant kinase 4) et CdK6 (Cyclin dependant kinase 6)et inhibe la capacité de ces kinases à phosphoryler la protéine Rb (Retinoblastome). Ainsi elle bloque la progression dans le cycle cellulaire (Serrano et al., 1993) (Figure 21). P16 est codé par le gène CdkN2A sur une séquence qui code également pour un autre gène suppresseur de tumeur p14ARF, grâce à un promoteur différent et une phase de lecture alternative (Serrano et al., 1993). Dans les mélanomes, P16 est inactivée par des mutations ponctuelles, des délétions, des méthylations du promoteur (Sharpless et al., 2003) ou par la surexpression de facteurs Figure 21: Le rôle de la voie p16INK4a/RB dans l’arrêt du cycle cellulaire: Suite à un stress oncogénique, la protéine p16 INK4 a pour fonction de se lier aux kinases du cycle cellulaire Cdk4 et Cdk6 inhibant leur capacité à phophoryler la protéine Rb et bloquant la progression dans le cycle cellulaire. inhibiteurs de la transcription. De façon surprenante, il a été montré que la cascade de signalisation induite par la mutation BRAFV600E induit in vitro la sénescence de mélanocytes via l’expression du gène suppresseur de tumeur p16 (Gray-Schopfer et al., 2006, Michaloglou et al., 2005). Ces observations suggèrent que la mutation BRAFV600E seule est insuffisante pour induire transformation maligne conduisant à la formation d’un mélanome. Cette hypothèse est renforcée par le fait que la mutation BRAFV600E est présente dans 70% des naevi primaires, qui sont des tumeurs bénignes et également par le fait que BRAFV600E est capable d’induire la transformation tumorale uniquement dans des cellules dépourvues de la protéine p16 (Wellbrock et al., 2004). Ces résultats suggèrent donc que l’inactivation de la voie p16/Rb joue un rôle important de dans la progression tumorale des mélanomes. Par ailleurs, des mutations germinales de p16INK4A sont trouvées dans 20 à 30 % de formes familiales de mélanomes. D-Traitements ciblés des mélanomes : Les mélanomes sont des tumeurs extrêmement agressives avec un très fort potentiel métastatique et une très grande résistance aux agents cytotoxiques. De nombreux agents de chimiothérapie agissent en induisant l’apoptose des cellules tumorales, mais la résistance des mélanomes à l’apoptose rend inefficace la plupart des traitements. A l’heure actuelle, la Dacarbazine (inhibiteur de la biosynthèse d’ADN) est le traitement de chimiothérapie de référence pour les mélanomes, et des drogues comme la carmustine (inhibiteur de la synthèse d’AND et d’ARN), le paclitaxel (stabilisateur des microtubules), le temozolomide (agent alkylant) et le cisplatine (inhibiteur de la synthèse d’ADN) sont également utilisées dans les protocoles de chimiothérapie chez les patients atteints de mélanomes métastatiques (Tarhini et al., 2006). Comme nous venons de le détailler, de nombreux événements moléculaires sont à l’origine du développement des mélanomes. La compréhension de ces mécanismes devrait permettre de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et de agents pharmacologiques. développer de nouveaux L’activation constitutive de la voie des MAPK est un événement retrouvé dans plus de 80% des mélanomes, c’est pourquoi des molécules utilisables en thérapie humaine, et capables d’inhiber cette voie ont été développées. C’est le cas du Sorafenid (Wilhelm et al., 2004) qui inhibe la protéine BRAF, des molécules PD et AZD (Collison et al., 2003 ; Solit et al., 2006) qui inactivent la protéine MEK1 ou encore de la toxine létale de l’anthrax (Koo et al., 2002) qui dégrade les protéines kinases MEK1/MEK2. Les protéines impliquées dans la voie de la PI3K sont également des cibles thérapeutiques intéressantes, c’est pourquoi, des agents visant à inactiver la PI3K ou ses effecteurs comme le CCI –inhibiteur (mTOR) sont actuellement en cours de développement. Par ailleurs, des molécules qui inhibent les signaux ou les facteurs de survie cellulaires tels que NF-KB ou Bcl2 sont également à l’étude. Enfin récemment, d’autres molécules sont développées non pas pour inhiber directement la prolifération tumorale mais plutôt pour inhiber la structuration du microenvironnement tumoral, les capacités pro-angiogéniques des tumeurs ou l’adhésion cellulaire (Rofstad et al., 2000). Malheureusement à ce jour, la plupart de ces molécules ont une efficacité faible en monothérapie et nécessitent souvent d’être associées à d’autres molécules ou à d’autres approches thérapeutiques, avec malgré cela des efficacités limitées. II Immunothérapies du mélanome Si l’exérèse chirurgicale d’une tumeur de faible épaisseur est généralement curative (80% des patients sont définitivement guéris), l’absence de traitements anti-cancéreux classiques (chirurgie, chimiothérapie ou radiothérapie) efficaces dans le traitement du mélanome métastatique motive de nombreuses équipes dans l’exploration de nouvelles voies thérapeutiques, telles que l’approche immunologique. Nous détaillerons dans cette partie, l’ensemble des stratégies d’immunothérapies actuelles utilisées dans le traitement du mélanome. A-L’Interféron alpha (IFN-α) et l’Interleukine 2 (IL-2) : L’interféron alpha (IFN-α) est un des agents d’immunothérapie le plus utilisé et le plus étudié mais ses cibles cellulaires et moléculaires ainsi que son mode d’action ne sont pas encore clairement établis. Plusieurs études, comme celles menées par le « Eastern Cooperative Oncology Group » aux Etats-Unis ont mis en évidence l’efficacité thérapeutique de l’IFN-α chez des patients souffrant de mélanome. Kirkwood J et al ont montré que le traitement de patients par de L’IFN-α, à raison de 1800 millions d’unités/m2, prolonge l’espérance de vie des malades à 5 ans contre 2,8 à 3,8 ans pour les patients non traités par lIFN-α (Kirkwood et al., 1996). Une étude récente, menée chez des patients atteints de mélanomes a permis de conclure que le traitement par l’IFN-α diminué l’indice de la rechute d’environ 26% (Wheatley et al., 2003). Cependant un grand nombre d’effets secondaires non négligeables, comme des réactions d’auto immunité, de fortes fièvres ou encore l’apparition d’état d’anorexie, rendent difficile la poursuite de ce traitement. L’interleukine 2 (IL-2), seule ou en association avec d’autres agents chimio ou immunothérapeutiques joue un rôle important dans le traitement de patients souffrant de mélanomes métastatiques. Cependant, l’utilisation de l’IL-2 est encore limitée par la difficulté d’identifier les patients susceptibles de répondre à ce traitement, et quelques groupes ont commencé à étudier ce problème en analysant les modifications moléculaires et génétiques associées au traitement par l’IL-2 (Pin et al., 2006 ; Panelli et al., 2002). B-La chimio-immunothérapie : La chimio-immunothérapie peut être divisée en trois groupes : Le premier groupe est basé sur l’utilisation de cytokines (IL-2), en association à un traitement au cisplatin. Des études de l’efficacité de ce traitement en phase précoce ont montré un taux de réponse globale d’environ 50% (Atkins et al., 2003 ; Mcdermot et al., 2000 ; Flaherty et al., 2001). Cependant ces types de réponses sont de durée relativement courte et fréquemment associés à des degrés élevés de toxicité systémique. A l’heure actuelle il n’y a aucune étude de chimio-immunothérapie qui ait montrée une efficacité significative dans la survie globale des patients (Keilholz et al., 1997 ; Rosenberg et al., 1999 ; Eton et al., 2002 ; Atkins et al., 2003). Le second groupe de traitements est appelé la chimio-immunothérapie immunocentrique. Cette stratégie est basée sur l’utilisation de traitements de chimiothérapie comme modulateurs de la réponse immune du patient contre ses propres cellules tumorales. Par exemple, certains groupes ont développé l’utilisation de cyclophosphamide à faibles doses. La cyclophosphamide étant connue pour sa capacité à dépléter les populations de lymphocytes T régulateurs CD4+/CD25+ (Berd et al., 1986 ; Ghiringhelli et al., 2004) qui comme nous l’avons vu précédemment, participent de façon active à l’échappement tumoral. Une troisième stratégie de traitement appelé la chimio-immunothérapie chimiocentrique est en développement. Dans cette approche, l’immunothérapie a pour but de sensibiliser les cellules tumorales du patient aux effets cytotoxiques du traitement chimiothérapeutique. Cette stratégie utilise des LT activés pour sensibiliser la tumeur avant le traitement de chimiothérapie. Cet effet est basé sur le fait que ces LT activés secrètent de nombreuses cytokines régulant la prolifération et l’apoptose des cellules tumorales, de plus ces lymphocytes peuvent exercer un effet sensibilisant sur la tumeur via leur capacité cytotoxique propre. Des études préciliniques ont montré que cette stratégie augmentait de façon importante l’apoptose de différentes lignées tumorales de mélanome, de cancer du colon ou de la prostate et du sein (Radfar et al., 2006). C-Les immunoadjuvants : Des molécules utilisées dans de nombreuses situations pathologiques sont à l’étude dans le traitement du mélanome. Ainsi les immunoadjuvants tels que l’adjuvant incomplet de Freund ou le BCG ont été développés pour stimuler la réponse immune et amplifier l’effet de vaccinations. De même que les CpG-ODNs (deoxycytidyl-deoxyguanosine oligodeoxynucléotides) qui sont des composés connus pour stimuler les réponses immunes innées et adaptatives et qui ont montré leur efficacité dans des essais cliniques de thérapies de cancers du col de l’utérus. Ces composés interagissent avec des récepteurs de l’immunité innée les TLR-9 (Toll Like Récepteur 9) présents à la surface des CD plasmacitoïdes et des LB et favorisent leur activation. De nombreuses modifications et substitutions de nucléotides ont été effectuées afin d’augmenter la capacité de ces composés à activer les TLR-9 et par conséquent la réponse immune. Ainsi, un de ces composés, le CpG 7909 a été optimisé pour stimuler les CD plasmacitoïdes et les LB et a été testé dans des études pré-cliniques ainsi que dans des essais cliniques de phase I (Krieg et al., 2006 ; Heckelsmiller et al., 2002 ; Speiser et al., 2005 ; Sandler et al., 2003 ; Davila et al., 2000 ; Tormo et al., 2006). Ces essais semblent montrer que ce composé est un immunoadjuvant efficace capable de favoriser une réponse T CD8 spécifique d’un antigène. D-La vaccination par cellules tumorales : La vaccination par cellules tumorales consiste à injecter des cellules de mélanomes autologues ou allogéniques inactivées, associées à un adjuvant, dans le but de potentialiser la réponse immunitaire. L’utilisation de cellules tumorales autologues est conceptuellement satisfaisante, car elle est à même d’entraîner une réponse immune polyclonale. Néanmoins, il faut noter que l’extraction et la purification de cellules tumorales présentent des difficultés techniques, et parfois seuls des macrophages ou des fibroblastes sont sélectionnés. Par ailleurs, à l’heure actuelle, cette technique n’a pas montré d’efficacité dans le mélanome : ainsi, Berd et al (Berd et al., 2002) n’obtiennent que 12% de réponses cliniques chez des patients atteints de mélanomes métastatiques. La découverte d’antigènes communs exprimés par les mélanomes et la difficulté que représente la purification de cellules tumorales ont conduit à utiliser en thérapeutique des lignées allogéniques de mélanome portant des antigènes fréquemment exprimés tels que MelanA/MART1, MAGE-1, gp100. Deux vaccins cellulaires établis à partir de lignées humaines, montrent une efficacité en association avec des adjuvants dans des études de phase II, mais l’efficacité est diminuée chez des patients présentant des métastases (Mitchell et al., 1995 ; Hsueh et al., 1998). Ces vaccins cellulaires, sont actuellement en cours de validation dans le cadre d’une étude de phase III. La mise en évidence dans des modèles animaux, que la transfection de cellules tumorales par un gène codant pour une cytokine (IL-2 ; IFN-α ; GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) ou IL-12 ) pouvait rendre ces cellules plus immunogéniques a déclenché le lancement d’éssais thérapeutiques chez l’homme. Les résultats sont toutefois décevants pour l’instant (Parmiani et al., 2000), sauf en ce qui concerne l’utilisation de cellules tranfectées avec le gène codant le GM-CSF. Soiffer et al, ont mis en évidence de fortes réponses immunologiques locales et dans les tumeurs, ainsi que quelques réponses cliniques chez des patients injectés par des cellules de mélanomes génétiquement modifiées pour produire du GM-CSF (Soiffer et al., 2003). E-La vaccination par protéines de choc thermiques : Les protéines de choc thermique (HSP) sont des protéines chaperones présentes dans le réticulum endoplasmique (RE) ou le cytosol, et jouant un rôle dans l’homéostasie cellulaire en protégeant les protéines intracellulaires de l’agrégation en cas de stress. Certaines de ces protéines, notamment HSP70 et gp96 sont chargées en peptides de tumeurs antigéniques et peuvent être endocytées par des cellules dendritiques. Cette endocytose provoque la maturation de la cellule dendritique ainsi que l’apprêtement de l’antigène par les molécules de CMH de classe II mais également de classe I (Castelli et al., 2004). Des essais thérapeutiques semblent confirmer l’intérêt de ces molécules. Ainsi une étude de phase I/II, utilisant des protéines gp96 isolées de la tumeur autologue dans des protocoles de vaccinations, a montré 18% de réponses cliniques chez des patients porteurs de mélanomes métastatiques (Belli et al., 2002). F-La vaccination par peptides ou protéines de tumeurs : Comme nous l’avons décrit précédemment de nombreux peptides tumoraux exprimés par les mélanomes ont été identifiés et plusieurs groupes ont développé des stratégies de vaccination dans lesquelles ces peptides sont utilisés seuls ou en association avec des cytokines (IL-2, IL-12, GMCSF) ou des adjuvants (adjuvant incomplet de Freund, ligand des récepteurs Toll) (Parmiani et al., 2002). L’un des premiers essais cliniques utilisant des peptides tumoraux de mélanomes a été entrepris par le groupe de Rosenberg (Rosenberg et al., 1998), qui a vacciné des patients atteints de mélanomes de grade IV à l’aide d’un peptide immunodominant de l’antigène gp100. La grande majorité des patients (10 sur 11) ont répondu de façon positive à l’immunisation contre ce peptide, cependant aucun des malades ne connu de rémission complète. Depuis, plusieurs essais ont été entrepris et l’analyse des données récentes de la littérature confirme que cette stratégie n’apporte que des réponses limitées d’un point de vue thérapeutique (Slingluff et al., 2003). Le problème majeur de la vaccination peptidique repose sur l’instabilité des peptides et sur la nécessité de réaliser le typage HLA du patient et surtout le profil antigénique de sa tumeur. D’autant plus que les différents nodules tumoraux se composent généralement de populations hétérogènes de cellules tumorales présentant différents niveaux d’expression d’antigènes tumoraux. La vaccination par protéines de tumeurs et non plus peptides tumoraux, semble pallier ce problème et permettre de développer une réponse polyclonale. Des essais précliniques, effectués avec l’antigène tumoral NY-ESO-1 en association avec un adjuvant, montrent que ce protocole permet d’obtenir des réponses immunologiques et semble ralentir l’évolution tumorale (Davis et al., 2004). G-La Vaccination par cellules dendritiques : Une autre approche dans l’immunothérapie du mélanome consiste à utiliser des cellules dendritiques autologues différenciées et amplifiées in-vitro à l’aide de cocktails de cytokines. Ces cellules peuvent être sensibilisées aux antigènes tumoraux par chargement direct de peptides synthétiques spécifiques, ou par chargement indirect à l’aide de corps apoptotiques ou d’exosomes provenant de la tumeur autologue (Wolfers et al., 2001). Le chargement de ces cellules dendritiques par des peptides tumoraux a pour avantage de ne pas nécessiter le prélèvement des cellules tumorales des patients mais également de rendre possible le suivi immunologique de la réponse immune par des LT spécifiques de ces peptides à l’aide de tétramères. Les tétramères, sont des molécules synthétiques, composées de quatre molécules de CMH présentant le peptide de tumeur (Figure 22). Elles se fixent sur les TCR des LT spécifiques et permettent de les identifier. Cependant, le typage HLA du patient est obligatoire, et il existe un risque d’immunosélection potentielle de variants tumoraux CMH-I négatifs ou ayant perdu l’expression de ce peptide (perte d’épitopes). L’utilisation de cellules tumorales comme source d’antigène présente quant à elle l’avantage d’induire des réponses immunitaires polyclonales incluant éventuellement des réponses immunes contre des antigènes tumoraux encore inconnus, mais elle nécessite d’avoir accès aux cellules tumorales des patients et d’établir ces tumeurs, en culture primaire. Dans la plupart des études pilotes, qui incluent une centaine de patients, des réponses immunologiques avec apparition de Lymphocytes T spécifiques sont retrouvées, mais elles s’accompagnent toutefois de moins de 15% de réponses cliniques objectives. Seule l’équipe de Banchereau (Banchereau et al., 2001) a rapporté une stabilisation ou une régression tumorale chez 10 patients sur 18, porteurs de mélanomes métastatiques HLA-A2, traités avec des cellules dendritiques chargées par les antigènes MAGE-3, MART-1, tyrosinase et Gp100. D’autres approches pour « charger » des cellules dendritiques en peptides ont été abordées, comme la fusion entre cellules tumorales et cellules dendritiques (Paczesny et al., 2003), ou la transfection de cellules dendritiques par des ARNm tumoraux. Enfin l’utilisation récente comme agent vaccinal d’exosomes de cellules dendritiques chargées avec des peptides tumoraux présentés par les molécules de CMH de classe I et II a montré des résultats efficaces in vitro pour induire des réponses immunes par des LT spécifiques. De plus, ces approches donnent des résultats encourageants in vivo (Wolfers et al., 2001 ; Escudier et al., 2005). CMH/peptide (biotinylée) Streptavidine PE Tétramère Figure 22 : Structure d’un Tétramère de CMH : Les peptides (en vert) sont présentés dans la « poche à peptides » des molécules de CMH-I lesquelles sont marquées par de la biotine qui se lie à la streptavidine marqué à la phycoérythrine. Cette structure se fixe sur le récepteur pour l’antigène (TCR) dont elle est spécifique. H-Vaccination par plasmides ou vecteurs viraux : L’utilisation de plasmides ou de vecteurs viraux codant pour des antigènes tumoraux est une autre approche utilisée dans des stratégies de vaccinations antitumorales. Dans ce type de vaccination, l’activation de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) par les CD présentant des Ag de tumeurs, peut s’effectuer de deux façon différentes. En effet, l’ADN codant pour un antigène tumoral peut être soit directement transfectée ou apportée par infection virale dans des cellules dendritiques. Soit, ce sont des cellules non présentatrices d’antigènes qui sont transfectées ou infectées par cet ADN. Dans la première approche, la protéine tumorale codée par l’ADN est apprétée par la voie endogène de présentation et présentée aux CTL (Porgador et al., 1998 ; Chattergoon et al., 1998). Dans la deuxième approche, la protéine tumorale est reprise par des CD puis apprêtée et présentée par cross-présentation (Ulmer et al., 1996 ; Fu et al., 1997). L’un des avantages de l’utilisation de plasmides vient du fait que certaines constructions plasmidiques contiennent des motifs CpG nonméthylés, capables d’activer les CD via le récepteur TLR-9 (Sato et al., 1996 ; Klinman et al., 1996). Dans une étude de phase I, portant sur des patients de grade IV, vaccinés avec un plasmide codant l’antigène gp100, 5% des patients ont développé une réponse clinique partielle, paradoxalement sans développer de réelle activation immunologique (Rosenberg et al., 2003). L’utilisation de vecteurs viraux, comme les adénovirus, canarypox virus ou virus de la vaccine, codant pour le ADNc d’intérêt, présente l’avantage d’avoir une forte efficacité d’infection des CD (Parkus et al., 1995). Mais la limite de cette technique réside dans le fait que les patients développent souvent une réponse immune antivirale, associée à la production d’anticorps dirigés contre les protéines du vecteur viral. Plusieurs études vaccinales utilisant différents virus recombinants codant pour divers antigènes tumoraux du mélanome (gp100, MART-1, tyrosine) ce sont avérées décevantes, car elles n’ont montré que des réponses immunologiques et cliniques occasionnelles (Van Baren et al., 2005 ; Lindsey et al., 2006 ; Jager et al., 2006). De plus, même l’utilisation de cellules infectées par des virus recombinants codant à la fois des antigènes tumoraux et d’autres molécules favorisant l’induction des réponses immunes comme les molécules de costimulation n’ont donné dans l’ensemble que de faibles réponses sur le plan clinique (Kaufman et al., 2000 ; Kaufman et al., 2001 ; Kaufman et al., 2003). I-L’immunothérapie adoptive : Des modèles animaux de tumeurs expérimentales ont montré que le transfert de lymphocytes T spécifiques d’antigènes de tumeurs pouvait induire une immunité passive, capable d’empêcher le développement des cellules cancéreuses greffées ou même d’éradiquer des métastases établies de ces cancers. Des études récentes montrent l’intérêt de la thérapie adoptive dans le traitement du mélanome chez l’homme. (Dudley et al., 2002 ; Yee et al., 2002 ; Labarrière et al., 2002 ; Dreno et al., 2002) Ces études établissent que des lymphocytes T spécifiques d’antigènes de mélanome, sélectionnés et multipliés in vitro, puis réinjectés, peuvent survivre plusieurs semaines chez le patient et migrer dans la tumeur. Ainsi, le groupe de S Rosenberg a testé l’efficacité de la réinjection de TIL spécifiques du peptide Melan-A/MART-1, chez des patients atteints de mélanome métastatiques (Dudley et al., 2002). Une déplétion lymphocytaire sévère est d’abord réalisée par l’injection de cyclophosphamide puis de fludarabine. Les TIL spécifiques sont ensuite injectés par voie intraveineuse à ces patients, en association avec de fortes doses d’IL-2. Les résultats montrent que les TIL injectés peuvent survivre plus de 4 mois, se multiplier et migrer dans la tumeur. Sur le plan clinique, des régressions complètes, partielles (diminution de la taille des tumeurs égale ou supérieure à 50%) ou mixtes sont obtenues chez 6 patients sur 13. Cinq patients, dont trois chez lesquels la tumeur a régressé, ont développé en parallèle une réponse auto-immune dirigée contre des cellules pigmentaires, induisant un vitiligo ou une uvéite. Malheureusement, deux patients ont développé des effets secondaires beaucoup plus graves, un lymphome B-EBV et une infection par un virus syncytial. L’émergence de ces maladies est favorisée par les traitements immunosuprésseurs. Au même moment, le groupe de Greenberg, a publié les résultats d’un essai de thérapie adoptive de phase I mené chez 10 patients atteints de mélanomes métastatiques (Yee et al., 2002). Des clones lymphocytaires T spécifiques de l’antigène Melan-A/MART-1 ou gp100 ont été injectés en association ou non avec des injections sous cutanées d’IL-2 à des patients mais, sans traitements immunosupprésseurs préalables. Vintg quatre heure après l’injection, les clones injectés peuvent représenter jusqu’à 1,5% des lymphocytes T CD8 du sang périphérique et leur survie moyenne est d’environ 17 jours ou 7 jours selon que le patient a reçu ou non de l’IL-2. Les réponses cliniques observées dans cet essai clinique sont plus modestes que dans l’étude de Rosenberg, elles consistent en une stabilisation de la maladie pouvant aller jusqu'à 21 mois. Le risque de complications infectieuses ou cancéreuses que fait courir l’immunodépression préalable associée à l’immunothérapie reste un problème sérieux, et rend indispensable l’évaluation de son utilité et l’analyse de son mécanisme. Cependant des travaux réalisés chez l’animal semblent démontrer la nécessite d’une déplétion sélective de populations lymphocytaires spécifiques telles que les LT reg . Enfin de nouveaux essais cliniques utilisant l’injection de LT CD4 spécifiques des antigènes de tumeurs présentés par les molécules du CMH de classe II, ainsi que d’autres essais avec des cellules NK et NKT ont été entrepris, afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces types cellulaire dans les stratégies d’immunothérapie adoptives. J-Electrochimiothérapie et électroimmunothérapie : L’électroporation est un moyen utilisé pour faciliter le transport de molécules non perméantes dans les cellules. Cette technique est utilisée pour charger des cellules par des sondes d’ADN, d’ARN, des ions ou des protéins in vitro (Gothelf et al., 2003) ainsi que des radiotraceurs ou des drogues in vivo (Rols et al., 1998). Ainsi, l’électrochimiothérapie (ECT) est devenue une nouvelle stratégie permettant d’augmenter la concentration d’agent chimiothérapeutiques dans les cellules tumorales, en les perméabilisant à l’aide d’un champ électrique. Plusieurs groupes ont développé cette technique pour administrer de façon plus efficace à des patients chimiothérapeutiques atteints de mélanomes (electrochimiothérapie) ou métastatiques encore divers certaines agents cytokines (électroimmunothérapie) (Sersa et al., 2000 ; Mir et al., 1998 ; Heller et al., 1996 ; Heller et al., 2006). Les résultats montrent que l’ECT apparaît comme une nouvelle stratégie thérapeutique non invasive intéressante des mélanomes métastatiques. Elle pourrait être couplée avec d’autres approches comme l’immunothérapie. III Les statines Comme nous venons de le voir, de nombreuses stratégies d’immunothérapie ont été développées dans le traitement du mélanome. Les résultats limités obtenus montrent qu’il est nécessaire de rechercher de nouvelles approches thérapeutiques capables d’induire chez le patient une réponse immune anti-tumorale plus efficace. Diverses molécules pharmacologiques sont actuellement évaluées pour leur capacité à stimuler le système immunitaire de patients atteints de cancer. Les statines sont des molécules largement employées dans des pathologies cardiovasculaires pour leurs propriétés hypocholestérolémiantes. Récemment, plusieurs études ont montré un effet bénéfique de ces molécules dans la prévention de pathologies tumorales ainsi que dans la modulation de certains types de réponses immunes. Dans cette partie, nous développerons le mode d’action des statines, leurs effets dans le traitement et la prévention des cancers ainsi que leurs propriétés immunomodulatrices. A-Origine et mode d’action des statines : Les statines sont des inhibiteurs compétitifs de la 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A réductase (HMG-CoA réductase). Ces molécules pharmacologiques constituent la classe d’agents hypocholestérolémiants la plus utilisée actuellement en clinique. Les statines de première génération (lovastatine, pravastatine et simvastatine) sont d’origine « naturelle » ou semi-synthétique. Les statines les plus récentes de deuxième (fluvastatine, mélange racémique) et troisième génération (cerivastatine (retirée du marché en 2001) atorvastatine, pitavastatine et rosuvastatine ) sont des produits entièrement synthétisés en laboratoire. Ces molécules pharmacologiques agissent en inhibant la voie de biosynthèse du mévalonate Elles bloquent inhibent de façon compétitive et réversible la transformation de l’HMG-CoA en mévalonate par l’HMG-CoA réductase (Figure 23). Il s’en suit une baisse, du taux de cholestérol expliquant son activité hypocholestérolémiante, mais aussi de la concentration de tous les autres métabolites situés en aval du mévalonate et plus particulièrement des isoprénoïdes : les farnésylpyrophosphates (FPP) et les géranylgéranylpyrophosphates Figure 23: La voie du mévalonate. Les statines inhibent la conversion du 3-hydroxy-3methylglutarylcoenzyme A (HMG-CoA) en mévalonate. Des molécules d’ATP sont utilisées pour phosphoryler le mévalonate en pyrophosphomevalonate, qui est converti en isopentenyl pyrophosphate (IPP). L’IPP peut être réversiblement converti en dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) . L’IPP et le DMAPP peuvent se combiner pour former un isoprénoïde à 10 atomes de carbonnes, le géranyl Pyrophosphate (GPP). L’addition d’IPP permet de produire un isoprénoïdes à 15 atomes de carbonne le farnesyl pyrophosphate (FPP) et le géranylgéranyl pyrophosphate un isoprénoïde à 20 atomes de carbonnes. L’inhibition par les statines est totalement réversée par du mévalonate. En inhibant la prénylation les statines inhibent également la farnésylation et la géranylgéranylation des protéines. En présence de statines l’ajout de FPP restaure la farnésylation protéique et l’ajout de GGPP la géranylgéranylation. Figure 24 : La prénylation protéique. a) Addition d’un groupement à 15 carbones, le farnésyl par la FTase en utilisant lefarnésylpyrophosphate (FPP) comme donneur ou addition d’un groupement à 20 carbones, le géranylgéranyl par la GGTase I en utilisant géranylgéranylpyrophosphate (GGPP)comme donneur. b) Digestion endoprotéolytique des 3 derniers acides aminés parl‘endopeptidase Rce1. c) Méthylation de la cystéine modifiée par la carboxy-méthyltransférase (ICMT). (GGPP) (Figure 23). Ces derniers interviennent dans les modifications post-traductionnelles, appelées isoprénylations, de différentes protéines de signalisation qui lient et hydrolysent le GTP. L’isoprénylation correspond à une maturation post-traductionnelle nécessaire aux fonctions cellulaires de certaines protéines (Zhang et al., 1996). Cette modification posttraductionnelle s’effectue par liaison covalente d’un lipide isoprénique, intermédiaire de la voie de synthèse du cholestérol. L’isoprénylation concerne entre 0.5% et 1% des protéines cellulaires qui appartiennent pour la plupart à la super famille des protéines Ras. L’isoprénylation de ces protéines est indispensable à leur fonction, elle permet leur ancrage membranaire et favorise les interactions avec leurs effecteurs. Le radical isoprényl est fixé sur une cystéine localisée au sein d’un motif carboxy-terminal consensus, la boîte CAAX, où A est un acide aminé aliphatique (figure 24). La nature de l’acide aminé X détermine le type d’isoprényl fixé sur la protéine. Si X est une leucine ou une isoleucine, la protéine est le substrat de la géranylgéranyltransférase I et la protéine est alors géranylgéranylée c’est-àdire qu’elle fixe une chaîne à 20 atomes de carbone. Pour tout autre acide aminé, la protéine sera farnésylée par la farnésyltransférase. Elle fixera alors une chaîne de 15 atomes de carbone. Après l’isoprénylation, les trois derniers acides aminés carboxy-terminaux sont éliminés et la cystéine farnésylée est carboxyméthylée. B-Statines et cancer : Comme nous venons de le voir les statines inhibent l’isoprénylation des protéines. Cette modification post-traductionnelle est nécessaire à l’activaté de certaines protéines comme les protéines de la superfamille Ras (Ras, Rho etc…). Ces protéines étant impliquées dans de nombreuses pathologies cancéreuses plusieurs études ont été menées dans le but d’évaluer l’effet des statines sur le développement tumoral. En 2005 au cours du meeting annuel de l’ASCO des travaux montrent l’effet préventif des statines dans les cancers ont été publiées. Une de ses études a porté sur une population de 500.000 hommes, dont 34% étaient traités par statines. Ce travail révèle que les sujets sous statines présentaient une baisse de 48% du risque de cancer du poumon (Khurana et al., ASCO 2005). En examinant une cohorte de 450.000 hommes, un autre essai conclut à une baisse de 54% du risque de cancer de la prostate sous statine. Ici, les auteurs ont noté en plus un effet bénéfique croissant avec la durée du traitement. Ainsi, un traitement de un à deux ans a été associé à une baisse du risque de 27%, deux à trois ans de traitement à une baisse de 58%, tandis que trois à quatre ans de prescription baisse le risque de 70%. Enfin, si le traitement a été suivi durant plus de quatre ans, la baisse enregistrée atteint 89% (Singal et al., ASCO 2005). Le même type d’étude montre que la prise de statines réduit de 59% le risque de cancer du pancréas et de 51% celui de cancer du colon. De plus une analyse portant sur 40.000 femmes montre que le risque de cancer du sein est deux fois moins élevé chez celles recevant un traitement par statines (Kochhar et al., ASCO 2005). Enfin, une publication de 1998 (Clearfield et al., 1998), sur une étude randomisée en double aveugle, démontre qu’un traitement de 5 ans par les statines prescrites en prévention de coronarite (sur 3 304 patients) avait diminué de moitié le risque d’apparition d’un mélanome par rapport à une population traitée par placebo. Le rôle bénéfique des statines sur la prévention des cancers a conduit plusieurs groupes à étudier plus précisément les effets de ces molécules sur des lignées tumorales de différentes origines, afin de comprendre leur mode d’action. 1) Lignées de cancers du colon : La protéine Ras est présente sous sa forme oncogénique (RasV12) dans 50% des cancers colorectaux. Comme les protéines Ras sont actives sous forme farnésylées. De ce fait, on a très vite pensé que les statines pourraient prévenir les cancers colorectaux grâce à leur capacité à inhiber la farnésylation de Ras. Cependant des expériences récentes montrent que les statines inhibent la croissance et induisent l’apoptose des cellules de cancer colorectaux indépendamment du statut de Ras (Ukomadu et al., 2003). Plusieurs travaux suggèrent que l’effet des statines sur l’apoptose des cellules de cancer colorectaux serait associée à leur capacité à inhiber la géranylgéranylation de la protéine RhoA. En effet, dans de nombreuses lignées cellulaires de cancers colorectaux, l’apoptose induite par les statines peut être réversée par du Géranylgéranylpyrophosphate (GGPP) mais pas par du Farnésylpyrophosphate (FPP). De plus, l’inhibition de la géranylgéranylation des protéines Rho par la lovastatine induit l’apoptose de cellules colorectales de rat (Agarwal et al., 2002). 2) Lignées de cancers du sein : Un grand nombre de statines inhibent in vitro la prolifération des cellules de cancer du sein (Rao et al., 1999 ; Mueck et al., 2003 ; Seeger et al., 2003). La protéine RhoA est surexprimée dans les cellules du cancer du sein et son niveau d’expression augmente avec le grade histologique de la tumeur (Fritz et al., 2002). Les statines induisent l’apoptose de carcinomes mammaires immortalisés vraisemblablement par un mécanisme impliquant RhoA. Dans les cellules du cancer du sein, la cerivastatine inhibe de nombreuses voies de signalisation et stimule l’arrêt en phase G1/S du cycle cellulaire et ces effets sont reversés par le GGPP mais pas par le FPP (Denoyelle et al., 2001). De plus et la C3 exo enzyme (Wilde et al., 2001) un inhibiteur des protéines RhoA, B, C produit le même effet que la cerivastatine (Denoyelle et al., 2003). Par ailleurs, des études in vivo dans des modèles murins montrent que les statines inhibent la croissance tumorale et la formation des métastases (Alonso et al., 1998 ; Farine et al., 2002). 3) Lignées de mélanomes : Les protéines RhoA et RhoC couramment sur exprimées dans les mélanomes humains sont impliquées dans l’établissement de la métastase (Collinson et al., 2002). L’inhibition de la géranylgéranylation des protéines Rho par les statines est un mécanisme important, induisant in vitro l’apoptose de lignées de mélanomes humains (Shellman et al., 2005) et inhibant in vivo dans le modèle B16F10 l’invasion et la formation de métastase (Collinson et al., 2003 ; Nakajima et al., 2003 ; He et al., 1997). Les données cliniques semblent donc démontrer un rôle bénéfique des statines dans la prévention des cancers et ce rôle parait être associé à l’inhibition de la prénylation et donc à la fonction des protéines Rho comme le suggèrent les résultats in vitro. C-Rôles immunomodulateurs des statines : Le principal effet thérapeutique des statines reste, pour l’instant, la réduction du LDLcholestérol chez des patients atteint d’hypercholestérolémie. L’hypercholesterolémie est un facteur de risque important dans la survenue d’athérosclérose. Les patients souffrant d’athérosclérose présentent aussi un taux plasmatique élevé de cytokines inflammatoires, une augmentation de l’activation des leucocytes circulants et une forte infiltration par des macrophages et des LT au sein de la plaque d’athérome. Ces symptomes, reflétent le rôle prépondérant de l’inflammation dans cette pathologie (Hansson et al., 2005). Les statines semblent pouvoir inhiber ces symptomes inflammatoires puisque des patients hypercholestérolémiques traités avec de la sinvastatine présentent une baisse du taux sérique de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8) et le taux élevé d’IL-1 présent chez des malades souffrant de maladies coronariennes est diminué après traitement par les statines (Waehre et al., 2003). En complément de ces données cliniques de nombreuses études in vitro témoignent d’un rôle anti-inflammatoire des statines. Par exemple, il a été montré qu’elles diminuent la production d’L’IL-1 et d’L’IL-6 par les cellules endothéliales (Inoue et al., 2000). Récemment Veillard et al (Veillard., et al 2005) ont mis en évidence que la sinvastatine diminue l’expression de chimiokines mais également de leurs récepteurs à la surface des macrophages et des cellules endothéliales. Le phénomène d’athérosclérose est associé à l’infiltration de la paroi artérielle par des leucocytes. Cette infiltration est dépendante de l’interaction entre la molécule ICAM-1 présente à la surface des leucocytes avec son ligand VCAM exprimé par cellules endothéliales. Plusieurs travaux ont montré un rôle inhibiteur des statines dans l’expression de ces deux molécules (Chung et al., 2002 ; Rezaie-Majd et al., 2003) confortant ainsi le rôle positif de ces molécules dans la prévention de la pathologie athéromateuse par son activité anti-inflammatoire. L’effet immunomodulateur des satines suggère que ces molécules pourraient avoir un rôle thérapeutique dans d’autres pathologies que l’athérosclérose. Ainsi, un effet bénéfique des statines a été mis en évidence dans des modèles expérimentaux de sclérose multiple et d’arthrite rhumatoïde (Leung et al., 2003 ; Aktas et al., 2003 ; Youssef et al., 2002). Dans ces études, des souris sont traitées par l’atorvastatine, et les effets bénéfiques observés sont du aux propriétés immunomodulatices des satines, comme l’inhibition de l’expression des CMH de classe II ou la sécrétion de cytokines de type TH2 et de TGFB. L’atorvastatine induit la phosphorylation du facteur de transcription STAT6 qui est nécessaire à la différenciation TH2 mais également inhibe la phosphorylation du facteur STAT4 impliqué dans la différenciation de type TH1. Ces résultats obtenus dans des modèles animaux ont été confirmés chez l’homme par de récentes études cliniques montrant un rôle bénéfique des statines dans la sclérose multiple et l’arthrite rhumatoide (McCarey et al., 2004 ; Vollmer et al., 2004 ; Abud-Mendoza et al., 2003). Un rôle immunomodulateur des statines a également été mis en évidence dans le rejet des greffes cardiaques. Les travaux de F Mach ont montré le rôle de ces molécules dans l’inhibition de l’expression des CMH-II induite par l’IFN-γ (Kwak et al., 2000). Les molécules de CMH-II sont exprimées de façon constitutive à la surface des CPA, mais peuvent être induites à la surface des leucocytes et des cellules endothéliales après traitement par l’IFN-γ une cytokine inflammatoire. L’expression des CMH-II à la surface de ces cellules joue un rôle direct dans le contrôle de la réponse immune associée au rejet du greffon. L’ensemble de ces données montrent donc le rôle des statines immunomodulateur des statines dans différentes pathologies. Bien qu’il est également été démontré un effet préventif de ces molécules dans divers type de cancers aucunes études à ce jour n’a mis en évidence un rôle immunomodulateur des statines dans la réponse immune anti-tumorale. IV Les petites protéines G de la famille Rho A-Propriétés générales des protéines Rho : Les protéines Rho (Figure 25) appartiennent à la superfamille Ras des protéines de liaison du GTP. Ce sont des protéines G monomériques de faible masse moléculaire de 20 à 40 kDa. Elles jouent le rôle de commutateurs moléculaires dans la transmission des signaux intra-cellulaires contrôlant ainsi de nombreux processus biologiques. Elles cyclent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP (Figure 26), conformation dans laquelle elles sont capables d’interagir avec leurs effecteurs et ainsi d’induire l’activation de plusieurs voies de signalisation. Leur cycle d’activation / inactivation est régulé par trois familles distinctes de protéines : Les GEF pour Guanosine exchange factors , les GAP pour GTPase Activating Protéins et les GDI pour Guanin nucleotide Dissociation inhibitors. Les GEFs stimulent l’échange du GDP par le GTP, générant ainsi la forme active des protéines Rho. Les GAP sont des activateurs de leur activité GTPasique intrinsèque et les GDI, des inhibiteurs de la dissociation du GDP. Ces protéines ont une expression ubiquitaire et sont retrouvées dans de nombreuses espèces animales allant de la levure à l’homme. Chez les mammifères, la famille Rho inclut environ une vingtaine de protéines répertoriées en 5 sous familles selon des critères d’homologie de séquence et de fonction : la sous famille Rho (RhoA,B,C), la sous famille Rac (Rac123 et RhoG), la sous famille Cdc42 (Cdc42, TC10,TCL,Wrch1 et Chp/WRCH2), la sous famille Rnd(Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7, Rnd3/RhoE), la sous-famille RhoBTB (RhoBTb1 et 2) ainsi que RhoD, RhoH/TTF et Rif qui n’appartiennent à aucun des sous-familles. Les protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 sont à l’heure actuelle, les GTPases de la famille les mieux caractérisées. Comme nous l’avons dit précédemment les protéines Rho sont modifiées post traductionellement par la fixation d’un groupement isoprénoïdes à leur extrémité C terminale. RhoA, RhoC, Rac1,Rac2 et Cdc42 possèdent un motif –CAAX reconnu par la GTPaseI et Figure 25: La famille des protéines Rho: Forme Active GTP RhoA GEFs GAPs GTP P RhoA GDP Forme Inactive GDIs GDIs RhoA GDP Figure 26: Cycle d’activation des protéines Rho: Les protéines Rho sont inactives quand elles sont associées au GDP et actives quand associées au GTP. Le contrôle de ce mécanisme d’échange GDP-GTP est régulé par l’intervention des protéines GEFs, qui catalysent l’échange du GDP en GTP et des GAPs, qui augmentent le taux d’hydrolyse du GTP en GDP. Les protéines Rho interagissent avec de nombreux effecteurs pour transmettre l’activation de voies de signalisation. Les protéines RhoGDIs, séquestrent dans le cytosol les protéines Rho et limitent leurs activations par les GEFs. sont géranylgéranylées. Rnd1,2,3,RhoD et TC10, sont farnésylées. La protéine RhoB présente la particularité d’exister sous les deux formes farnésylée et géranylgéranylée. L’isoprénylation est nécessaire à la localisation subcellulaire des GTPases Rho mais pas suffisante. Comme pour les protéines Ras, un second signal C-terminal est requis. Certaines GTPases Rho, comme RhoB sont palmitoyilées. D’autre comme RhoA et Rac1 présentent en amont du motif d’isoprénylation un domaine polybasique (sequence riche en arg/Lys). B-Fonctions des protéines Rho : Les protéines Rho étaient à l’origine connues pour leur rôle essentiel dans le réarrangement du cytosquelette d’actine. Il est maintenant manifeste que les GTPases Rho sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, dépendants mais aussi indépendants, de leur rôle sur la dynamique du cytosquelette d’actine. Les voies de signalisation qui médient leurs fonctions biologiques sont complexes et caractérisées par de nombreuses inter-connections. Par exemple, dans des fibroblastes 3T3, l’activation de Cdc42 induit l’activation séquentielle de Rac puis celle de Rho (Nobes et al., 1995). Ras est aussi capable d’activer la voie des GTPases Rho et les voies de signalisation de Ras et de Rho communiquent dans de nombreuses fonctions cellulaires (Sahai et al., 2001). 1) GTPases Rho et cytosquelette : 1-a) GTPases Rho et cytosquelette d’actine : La fonction la mieux caractérisée des protéines Rho est leur action sur la régulation du cytosquelette d’actine. De nombreuses études ont montré que les protéines de la sous famille Rho (protéines RhoA, B et C) régulent l’assemblage des filaments contractiles myosine-actine qui contriburait à la contractilité et à la formation des fibres de stress et des points focaux d’adhésion. L’activation de RhoA par l’acide lysophosphatidique (LPA) entraîne la formation de fibres de stress d’actine et de points focaux d’adhésion responsable respectivement de la forme de la cellule et de son ancrage à la matrice extracellulaire. Elles recrutent et activent les ROCK (kinases liées aux Rho), qui sont responsable de la phosphorylation de protéines du cytosquelette. Les Rho-kinases jouent le rôle de médiateurs des signaux induits par les protéines Rho et induisent la formation des fibres de stress et des points focaux d’adhésion (Kimura et al., 1996; Amano et al., 1997). Les protéines Rac (Rac1 2 et 3 et RhoG) et Cdc42 régulent la polymérisation de l’actine pour former des zones d’extension cellulaire. L’activation de Rac par le PDGF, l’EGF ou l’insuline conduit à la formation de replis membranaires (« ruffles ») et de lamellipodes. L’activation de Cdc42 par la bradykinine, induit, la formation de longs et fins prolongements de membranes appelés filopodes. Les autres protéines Rho n’ont pas en encore de rôles attribués précisément dans l’organisation du cytosquelette d’actine (Raftopoulou et al., 2004) (Ridley et al., 1992). Rho, Rac et Cdc42 participent aussi à la migration cellulaire ainsi qu’à la dynamique de formation des jonctions cellulaires (Ridley et al., 2001). RhoA participerait à la migration cellulaire en assurant notamment la déstabilisation des points d’adhésion à la matrice et en permettant la contraction des fibres d’acto-myosine pour rétracter le cytoplasme à l’arrière de la cellule (Raftopoulou et al., 2004). Cdc42 serait principalement impliqué dans l’établissement de la polarité et Rac jouerait le rôle moteur de polymérisation de l’actine à l’avant des cellules, produisant une véritable force d’expansion cellulaire responsable de la migration (Etienne-Manneville et al., 2002). 1-b) GTPases Rho et microtubules : De la même façon que les filaments d’actine, le réseau de microtubules présente une polarité intrinsèque avec une partie ancrée dans le centrosome et une dynamique d’assemblage et désassemblage permanente. L’organisation des microtubules contribue à la polarité cellulaire et à la distribution de certaines structures telles que l’appareil de Golgi et le faisceau mitotique. Les protéines RhoGTPases peuvent réguler ce réseau en différents endroits et l’effet est probablement dépendant du contexte (Jaffe et al., 2005). 2) GTPases Rho et trafic cellulaire : Les GTPases Rho ont aussi été impliquées dans le trafic membranaire et intracellulaire. Dans les étapes du trafic endocytaire, les GTPases Rac et RhoA seraient impliquées dans les étapes d’internalisation des vésicules membranaires à partir de la membrane plasmique. RhoA pourrait inhiber l’internalisation des récepteurs en les séquestrant au niveau des cavéoles et loin des puits de clathrines (Ellis et al., 2000). Plusieurs GTPases Rho ont aussi été localisées au niveau de certains compartiments vésiculaires, suggérant qu’elles puissent agir sur certaines étapes du trafic endocytaire. Par exemple, RhoD régule la vitesse du trafic des vésicules le long du réseau du cytosquelette, mais n’agit pas dans la fusion des endosomes précoces. Et RhoB est impliqué dans la régulation du trafic endosomes tardifs/lysosomes ralentissant la dégradation du récepteur à l’EGF (Gampel et al., 1999). 3) GTPases Rho et expression génique : Les protéines Rho régulent de nombreuses voies de transduction du signal qui conduisent à des régulations de l’expression génique. Elles modulent l’activité de SRF, NFkB, c/EBPb, Stat3, Stat5, FHL-2, PAX6, GATA-4, E2F, Estrogen Receptor a/b, CREB et les facteurs de transcription qui dépendent des voies JNK et p38 MAP kinases. Les substrats de ces kinases incluent c-Jun, ELK, PEA3, ATF2, MEF2A, Max et CHOP/2GADD153 (Benitah, Valeron et al., 2004; Jaffe et al 2005). Par exemple, le SRF (serum response factor) facteur de transcription agissant sur le SRE (serum response element), retrouvé dans de nombreux promoteurs est régulé par les Rho. En effet, le SRF nécessite le co-activateur MAL qui est capable de passer du cytoplasme vers le noyau en réponse à une activation par les Rho. 4) GTPases Rho et progression du cycle cellulaire : La progression dans le cycle nécessite l’activation séquentielle des différentes kinases cyclines-dépendantes (CDKs). Des expressions aberrantes des protéines du cycle cellulaire, en particulier celles qui contrôlent la progression à travers la phase G1, ont été impliquées dans la pathogénicité de plusieurs types de tumeurs. Dans les cellules NIH-3T3 les mutants actifs de RhoA et Rac1 stimulent la transcription d’une construction possédant le promoteur de la cycline D1 (Welsh et al., 2000). L’activité des CDKs est régulée par la variation d’expression de ses partenaires qui peuvent être activateurs comme les cyclines ou inhibiteurs (les CDKIs). Il a été rapporté que les protéines Rho, Rac et Cdc 42 modifient l’activité de ces CDKs en régulant le niveau de la cycline D1, et des CDKIs p21WAF1 et p27KIP1 qui modulent l’activité des CDK (Sahai et al., 2002). 5) GTPases Rho et apoptose : Les protéines Rho sont impliquées à la fois dans des voies de signalisation pro et anti apoptotiques et dans le processus apoptotique lui même. L’utilisation de mutants actifs des Rho permet d’accroître l’apoptose dans différents types cellulaires in vitro et dans des cellules cancéreuses in vivo (Aznar et al., 2001). Il a été mis en évidence l’existence dans des cellules tumorales d’une voie de survie dépendante de Rac médiée par les ions superoxides intracellulaires. (Pervaiz et al., 2001). D’autre part, RhoB est requis pour l’apoptose induite par les agents dommageants l’ADN et les inhibiteurs de farnésyl transférase (Liu et al., 2001; Prendergast et al 2000). Les RhoGTPases ont donc été à l’origine très étudiées pour leurs fonctions régulatrices du cytosquelette d’actine, en particulier dans les mécanismes de migration cellulaire et de phagocytose. C-Propriétés immunomodulatrices des protéines Rho : En plus des propriétés générales dont nous venons de parler, il est bon de savoir que les protéines Rho participent également et à plusieurs niveaux à la régulation de la réponse immunitaire. 1) GTPases Rho et sélection thymique : L’utilisation de souris ko pour la protéine vav-1 (la GEF spécifique de Rac-1) ont permis de mettre en évidence le rôle de Rac-1 dans la sélection thymique des LT. Comme le démontrent M.Turner et al (Turner et al., 1997), ces souris présentent d’un point de vu histologique un thymus complètement destructuré dans lequel aucune sélection thymique n’a put être observée. La protéine RhoA participe également à cette sélection. En effet, la perte d’expression de cette protéine inhibe la différenciation des cellules pré-T qui sont les précurseurs des lymphocytes T (Cleverley et al., 1999). 2) GTPases Rho et activation lymphocytaire : En plus de ses fonctions dans la sélection thymique, Rac1 est un acteur important dans la transduction des signaux d’activation lymphocytaire dépendant du TCR et des molécules de costimulation (Cantrell et al., 1998 ; De Franco et al., 2001 ; Moores et al., 2000 ; Turner et al., 2002). 3) GTPases Rho et cytotoxicitée : Les protéines Rho sont également impliquées dans la cytotoxicité lymphocytaire. Ainsi Rac1 permet la réorganisation et la redistribution des granules cytotoxiques des cellules NK et la régulation du cytosquelette d’actine par la voie de signalisation RhoA/p160ROCK/LIMK. Ces modifications permettent la polarisation des LT cytotoxiques vers leurs cibles (Lou et al., 2001). La cytotoxicité lymphocytaire dépendante de la voie FasL est elle aussi régulée par les protéines Rho. Blanco-colio et al démontrent en effet, que l’augmentation de la transcription du gène codant la protéine FasL dans les LT transfectés par la forme active de la protéine RhoA, est associée à une augmentation de la fonction lytique de ces cellules (Blancio-Colio et al., 2007). 4) GTPases Rho et présentation antigénique : L’utilisation par le groupe de Amigorena de cellules dendritiques provenant de souris ko pour Rac1 ou Rac2 a permis de mettre en évidence le rôle de ces deux GTPases dans la présentation antigénique et l’activation des lymphocytes T naïfs (Benvenuti et al., 2004). Par ailleurs des virus codant des mutants dominant négatifs ou positifs des protéines Rho (RhoA, Rac1, Cdc42) ont permis de montrer le rôle régulateur de ses protéines dans la mise en place d’une réponse immune adaptative dépendante des CDs (Shurin et al., 2005). D-Rôle des protéines Rho dans l’oncogènèse : Les GTPases Rho participent à diverses fonctions cellulaires : adhérence, migration, survie et prolifération qui sont souvent mises en jeu dans les processus de transformation cellulaire (Jaffe et al., 2002 ; Ridley et al., 2004 ; Sahai et al 2002). De nombreux travaux que nous allons évoquer, ont montré que les GTPases Rho, coopèrent dans le processus de transformation oncogénique. Par exemple, certains des mutants dominants négatifs de ces GTPases Rho sont capables d’inhiber la transformation de fibroblastes induite par Ras. Inversement, des mutants constitutivements actifs de nombreuses GTPases Rho sont capables d’induire ou de potensialiser la transformation cellulaire (Khosravi-Far et al., 1995 ; Prendergast et al., 1995 ; Qiu et al., 1997 ; Qiu et al., 1995). Diverses études visant à déterminer le statut des GTPases Rho au sein des tumeurs, n’ont pas mis en évidence de mutations activatrices. Néanmoins, plusieurs GTPases Rho ont été retrouvées surexprimées ou suractivées dans différents types de tumeurs. Ainsi, certains cancers colorectaux et mammaires présentent une surexpression de Rac1b, un variant de Rac1, particulièrement actif, issu d’un epissage alternatif (Fiegen et al., 2004 ; Jordan et al., 1999 ; Schnelzer et al., 2000). La protéine Rac3 est suractivée dans certaines cellules tumorales mammaires (Mira et al., 2000). RhoC, est surexprimée dans des adénocarcinomes pancréatiques, dans des tumeurs mammaires inflammatoires ainsi que dans des mélanomes métastatiques (Clark et al., 2000 ; Suwa et al., 1998). De même, dans certaines tumeurs testiculaires, la surexpression de RhoA, Rac et Cdc42 est directement liée à un stade avancé de la maladie ( Kamai et al., 2001 ; Kamai et al., 2004). Les RhoGTPases semblent donc bien être impliquées dans la tumorigénèse. Néanmoins, leur contribution oncogénique dans les tumeurs serait le résultat non pas de mutations activatrices mais plutôt d’une surexpression ou de l’altération de l’activité de leur régulateurs. Quelques altérations génétiques ont en effet été mises en évidence dans des gènes codant pour des RhoGEF ou des RhoGAP. Par exemple, Tiam-1, est mutée dans certaines tumeurs rénales, une mutation qui semble lui conférer un gain de fonction, et notamment la capacité à transformer les fibroblastes murins (Engers et al., 2000). Certains gènes codant pour des RhoGAP (GRAF,p190 RhoGAP, DLC-2) sont aussi localisés dans des régions chromosomiques fréquemment délétées dans certains types de tumeurs (Jaffe et al., 2002 ; Ridley et al., 2004). Par ailleurs, un ensemble d’études tend à montrer que la surexpression des protéines Rho peut se produire lors de l’acquisition de caractères invasifs par une tumeur(Bhowmicks et al., 2001 ; Quinlan et al., 1999). RhoA et Rac participent aussi à la dégradation de la matrice extracellulaire permettant la métastase en agissant notamment sur la balance entre les MMP et leurs inhibiteurs (TIMP) (Engers et al., 2001 ; Zhuge et al., 2001). RhoC induit aussi la sécrétion de facteurs angiogéniques , facilitants la néoangiogenèse tumorale( van Golen et al., 2000). Cependant, certaines GTPases Rho, comme RhoB, RhoBTB2 et RhoE ou Rnd3 néanmoins semblent avoir un rôle antagoniste sur la transformation cellulaire. Ainsi, RhoBTB2 aussi appelé DBC2 (deleted in breast cancer 2) est muté ou sous-exprimé dans beaucoup de cancers mammaires et sa réexpression dans les cellules tumorales mammaires T47D inhibe la prolifération cellulaire ( Hamaguchi et al., 2002). Rnd3 inhibe la transformation des cellules NIH-3T3 induites par les oncogènes Ras et Raf et elle est impliquée dans la transition G1/S (Villalonga et al., 2004). L’expression de Rnd3 est aussi diminuée dans les cellules de prostates tumorales et sa surexpression dans les cellules tumorales induit un arrête en G2/M et augmente la mort par apoptose (Bektic et al., 2005). D-Moyens d’étude des fonctions des protéines Rho dans les cellules : Au cours de mon travail de thèse visant a étudier le rôle régulateur des protéines Rho dans la réponse immune anti-tumorale j’ai été amené à utiliser différents outils et techniques développés pour l’étude des protéines Rho et de leur fonctions. Cette liste de technique est importante et dans cette de ma thèse partie je m’attacherai à vous présenter uniquement celles que j’ai utilisées pour mener à bien mon travail et qui vont de l’inhibiteur pharmacologique, aux plasmides codant des formes actives des protéines Rho en passant par les ARN interférant. 1) Modification de l’activité et de la localisation des protéines Rho : la prénylation : De nombreux efforts ont été menés pour développer des inhibiteurs des prényl transférases FTase (FTI) et GGTaseI (GGTI) pour bloquer ces modifications des protéines Ras et Rho (Walker et al., 2005). Par exemple, le Zarnestra® (un FTI) est testé en phase III d’essais cliniques. Les inhibiteurs FTI et GGTI inhibent le transfert de la partie prényl sur les protéines Rho. Les protéines Rho ainsi traitées ne s’ancrent pas dans la membrane et ne sont pas fonctionnelles même après stimulation. Des travaux du laboratoire ont montré le rôle de la prénylation dans l’activité biologique de RhoA (Allal et al., 2000) grâce à l’utilisation d’un mutant actif RhoAV14 qui présente 2 boîtes -CAAX différentes ce qui lui permet d’être soit farnésylé soit géranylgéranylé. Ces travaux ont montré que la prénylation de la forme activée de RhoA est nécessaire pour sa localisation membranaire mais que le type de prényl n’est pas important pour sa fonction. Commes nous l’avons vu précedemment, les statines, ont une action anti-prénylation sur les protéines Rho. Ces substances bloquent la néo-synthèse du groupement prényl et vident le pool cellulaire de protéines Rho prénylées. Un traitement par exemple, par la lovastatine permet d’empêcher la localisation membranaire de la protéine RhoA. Cependant, la spécificité d’action de ces traitements est limitée car l’inhibition de la prénylation concerne toutes les protéines normalement prénylées. L’action sur l’inhibition de la prénylation peut être plus ou moins ciblée suivant le temps de demi-vie de la protéine étudiée. Si celle-ci est dégradée en un temps court, il est possible d’appliquer un traitement « anti-prénylation » pendant une courte durée ainsi les protéines ayant un temps de demi-vie long conserveront leur prényl. Mais ces traitements ne sont pas pour autant spécifiques des protéines étudiées. 2) Transfection des différentes formes mutantes des Rho : En modifiant des acides aminés présents dans les séquences des protéines Rho, il est possible d’altérer leurs activités de façon positive ou négative. L’utilisation de ces mutants permet de préciser les fonctions de ces protéines dans les cellules. Ces mutants ont été créé sur la base des mutants analogues des protéines Ras. Il existe des mutants des protéines Rho codant pour des protéines constitutivement activées : RhoA, B ou C G14V et Q63L. Ces 2 mutations portant sur un acide aminé, dans les domaines impliqués dans la liaison au GTP (G14V) ou dans le « switch 2 » (Q63L), altèrent l’activité hydrolytique intrinséque GTPasique de la protéine et sa sensibilité à la régulation par les GAPs (Longenecker et al., 2003). Comme elles sont constitutivement activées, l’introduction de ces protéines dans les cellules induit une stimulation persistante des cascades de signalisation. Au cours d’études de marquages fluorescents, ces mutants activés permettent de préciser la localisation des protéines Rho quand elle sont activées. Les mutants V14 de RhoA, B et C, ont été utilisés par exemple, pour l’étude de leurs localisations par l’équipe de Robertson (Robertson et al., 1995) ou pour étudier l’effet de la prénylation sur la forme active (Allal et al., 2000). Les dominants négatifs des Rho sont utilisés essentiellement pour définir les voies de signalisation que régule l’activité des Rho. La substitution de l’asparagine en thréonine en position 19 de RhoA est connue pour induire des fonctions de dominants négatifs grâce à l’association augmentée de RhoAN19 avec les GEFs. Cette liaison de RhoAN19 spécifiquement sur une GEF inhibe l’interaction de cette GEF avec la protéine RhoA endogène. Cet événement perturbe les voies de transduction du signal empruntées normalement par la GEF. Les mutants V14 et N19 ont été utilisés par exemple pour rechercher les protéines RhoGDI et RhoGEF associés préférentiellement sur un des types de mutant (Strassheim et al., 2000). 3) Extinction de la protéine Rho ou de ses régulateurs par siRNA : Il a été montré il y a quelques années que des petits ARN interférents (siRNAs) peuvent être utilisés pour réguler l’expression de gènes cibles dans des cellules de mammifères en culture (Elbashir et al., 2001). Les siRNA peuvent éteindre l’expression d’un gène en procédant au clivage spécifique de l’ARNm cible en impliquant la protéine Dicer et le complexe RISC. Cette technologie permet d’éteindre l’expression de gènes dans de nombreuses lignées cellulaires aussi bien que de créer des animaux transgéniques dans lesquels l’expression d’un gène est éteinte de façon stable (Tuschl et al., 2001). Leur utilisation, en entraînant la suppression de l’expression de la protéine ciblée, permet d’analyser l’action de cette protéine dans les voies de signalisation étudiées. Ainsi, il est possible de répondre à des questions telles que : « L’absence de la protéine provoque-t-elle des modifications de réponse de la cellule à des stimuli exogènes? ». Par exemple, l’utilisation du siRNA de Vav2 qui supprime l’expression de cette GEF a permis de montrer l’implication de cette GEF dans l’activation de RhoB induite par la stimulation de la voie du récepteur à l’EGF (Gampel et al., 2002). Suivant leurs séquences, les siRNA risquent d’inhiber aussi l’expression de protéines dont la séquence en ARN est très proche. La difficulté d’utilisation de ces outils est donc liée au contrôle de la spécificité d’action du siRNA. D’autre part même si le siRNA éteint l’expression exclusivement de la protéine étudiée, la cellule peut mettre en place, en réponse à cette inhibition, des voies adaptées de signalisation alternative impliquant d’autres protéines ayant des fonctions proches et permettant d’induire une réponse de la cellule aux stimuli exercés. 4) Modulation de l’activité des Rho : Dans les années 1990, il a été découvert que les protéines Rho sont les protéines eucaryotes cibles de nombreuses toxines bactériennes. Ces toxines bloquent les fonctions des Rho. La C3 exoenzyme, isolée à partir de Clostridium botulinum inhibe spécifiquement les protéines RhoA, B et C par ADP-ribosylation de l’asparagine en position 41 (Schmidt et al., 1998). Les effets bloquants l’activité des Rho seraient du à la séquestration des protéines Rho dans les complexes Rho/RhoGDI. Des toxines isolées de Clostridium difficile (Tox-A et Tox-B) bloquent les protéines Rho, Rac et Cdc42 par glucosylation de la thréonine en position 37 (35 pour Rac et Cdc42) (Schmidt et al., 1998). Cette glucosylation bloquerait les couplages des protéines Rho avec leurs effecteurs. Il existe aussi des toxines bactériennes activatrices : les CNFs (Cytotoxique Necrotic Factors). Les CNFs agissent en déamidant les RhoGTPases au niveau de la glutamine en position 63. Le CNFy, isolé de Yersinia pseudotuberculosis, est un activateur puissant et spécifique de RhoA sans activation concomitante sur Rac1 ou Cdc42 (Hoffmann et al., 2004). Ces différentes toxines permettent d’étudier les conséquences de la perturbation de l’activation ou l’inhibition de ces protéines Rho. 5) Quantification des protéines Rho activées : Dans le but de pouvoir étudier l’activation des protéines Rho endogènes, l’équipe de Ren a mis au point un système de mesure de la quantité des protéines Rho activées dans un lysat cellulaire (Ren et al., 2000). Ce système, nommé TRBD, permet de précipiter spécifiquement les formes liées au GTP des protéines Rho endogènes. Il est basé sur l’utilisation du Rho Binding Domain (RBD) de la Rhotekine, un des effecteurs des protéines Rho. Ce domaine se lie de façon spécifique aux protéines Rho-GTP. Ainsi le lysat cellulaire est incubé avec ce RBD (fixé sur des billes de glutathion) qui va précipiter par affinité les protéines Rho liées au GTP. Après lavage, il est possible d’identifier et quantifier le type de protéines Rho (A, B ou C) fixé sur le RBD. Alors il est possible d’estimer la proportion de chaque protéine Rho activées par rapport à la quantité totale contenue dans le lysat cellulaire. Pour l’étude de l’activité des protéines Rac et Cdc42, il existe un système équivalent, utilisant le PBD (p21-binding domain) de PAK-1, un effecteur commun des protéines Rac et Cdc42. Objectifs des travaux Les régressions tumorales spontanées observées chez quelques patients atteints de mélanome ont été associées à la mise en place de réponses immunes anti-tumorales protectrices. Sur ces observations, de nombreuses stratégies thérapeutiques visant à stimuler le système immunitaire des malades ont été développées. Ces stratégies d’immunothérapie sont basées sur l’existence d’antigènes de tumeur (TAA) contre lesquels l’hôte est capable d’induire une réponse immune spécifique. Cependant, les cellules tumorales sont souvent peu immunogènes à cause de leur faible densité en complexes CMH de classe I (CMH-I)/TAA ou à cause de leur incapacité à délivrer des signaux de costimulation. Au cours de ce travail nous avons recherché à la surface de lignées de mélanomes traitées par divers inhibiteurs pharmacologiques des protéines Rho, la présence de modifications phénotypiques susceptibles de les rendre plus immunogènes. Nous avons également tenté de mettre en évidence, les mécanismes moléculaires responsables de ces modifications. Enfin nous avons cherché à savoir si de tels traitements rendaient ces cellules capables d’induire des réponses immunes anti-tumorale efficaces, spécifiques et protectrices. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier les rôles régulateurs des protéines Rho dans la mise en place de la réponse immune anti-mélanome. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RESULTAT I Geranylgeranyl transferase inhibition stimulates antimelanoma immune response through MHC class I ans costimulatory molecule expression. Tilkin-Mariamé, AF ; Cormary ,C; Ferro, N; Sarrabayrouse, G; Lajoie-MAZENC, I; Faye, JC; Favre, G. FASEB J. 2005 Sep;19(11):1513-5. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Le contrôle du développement tumoral par le système immunitaire constitue la base des traitements par immunothérapie. Ces approches thérapeutiques sont cependant souvent décevantes car les cellules cancéreuses mettent en place des stratégies dites « d’échappement tumoral » leur permettant de ne plus être reconnues et détruites par les effecteurs immuns. L’un de ces mécanismes, décrit par Seliger et al (Seliger et al., 96) dans le modèle de mélanome murin B16F10, correspond à la perte d’expression des molécules de CMH-I par les cellules tumorales. Ce phénomène est associé à un défaut d’expression des protéines intervenant dans l’apprêtage et la présentation antigénique par les CMH-I telles que les protéines TAP-1 et LMP-2. Néanmoins, l’expression de ces composants et par conséquent des molécules de CMH-I peut être restaurée in vitro par le traitement des cellules B16F10 par l’IFN-γ (Seliger et al., 2000). Plusieurs travaux montrent que les statines sont capables de réguler l’expression de protéines induites par l’IFN-γ. En effet Menschikowski et al (Menschikowski et al., 2005) ont montré que les statines stimulent l’expression de la phospholipase A2 induite par l’IFN-γ et le groupe de François Mach a mis en évidence un effet inhibiteur des statines sur l’expression, dépendante de l’IFN-γ, des molécules de CMH-II (Kwak et al., 2000). Dans ce premier travail, nous avons évalué l’effet des statines sur l’expression des CMH-I, induite par l’IFN-γ, à la surface des cellules de mélanome murin B16F10. Les résultats obtenus montrent que le traitement in vitro des cellules B16F10 par une association d’IFN-γ et de statines induit une surexpression du CMH-I. Cet effet passe par l’inhibition de la géranylgéranylation car les traitements combinant L’IFN-γ et le GGTI-298 permettent d’obtenir un résultat identique à celui obtenu avec les statines. Par contre, ceux associant l’IFN-g et le FTI-277 n’induisent pas cette surexpression. L’action de l’IFN-γ passe par la voie de signalisation JAK/STAT pour induire, entre autres, l’expression des sous unité TAP1 et TAP2 du transporteur peptidique TAP, impliqué dans l’expression membranaire des molécules du CMH-I. L’analyse par western-blot des cellules tumorales traitées par l’IFN-γ et/ou le GGTI-298 montre que la quantité de TAP1 est doublée lorsque le traitement associe les deux molécules. Nos résultats montrent aussi que l’expression des CMH-I, induite par le traitement in vitro des cellules tumorales B16F10 par l’IFN-γ et le GGTI-298, favorise la réponse immune observée chez des souris syngéniques immunocompétentes. En effet, l’injection de cellules traitées préalablement in vitro est suivie d’une croissance tumorale significativement ralentie par rapport à la croissance tumorale des cellules non traitées. L’analyse in vitro du cycle cellulaire des cellules traitées montre qu’après l’arrêt du traitement les cellules tumorales survivantes prolifèrent de façon similaire aux cellules non traitées. Les différences dans la croissance des tumeurs in vivo ne sont donc pas dues à une mort cellulaire ou une inhibition directement liée aux traitements. Les résultats des injections chez les souris athymiques confirment que les capacités de prolifération tumorale des cellules B16F10 traitées ne sont pas altérées par ces prétraitements. Ils constituent également un argument en faveur d’une réponse immunitaire T impliquée dans les ralentissements de croissance observés lorsque les cellules prétraitées sont injectées chez les souris immunocompétentes. L’étude des cellules de la rate de ces souris corrobore cette hypothèse car les quantités de lymphocytes T activés (CD8+/CD27+) et de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène immunodominant de la lignée B16F10 (CD8+/H2Kb Trp2+) sont plus importantes chez les souris ayant reçu l’injection de cellules B16F10 traitées in vitro par l’association de l’IFN-γ et du GGTI-298. Des tests de l’activité lytique des lymphocytes T activés sur des cellules tumorales in vitro seraient nécessaires pour préciser cette réponse immunitaire. Les expériences in vivo suggèrent d’autre part un effet du GGTI-298 indépendant de la présence de l’IFN-g car on observe un ralentissement de la croissance des cellules tumorales injectées après traitement par le GGTI-298 seul. L’effet de cet inhibiteur a donc été testé sur l’expression de molécules de costimulation favorisant la réponse immune. Ces molécules ne sont généralement pas présentes sur les cellules tumorales, mais les travaux de xxx et al ont montré qu’un traitement pharmacologique par le melphalan pouvait induire leur expression à la surface de cellules tumorales. La présence de CD80 et CD86 à la surface des cellules B16F10 est effectivement induite par le GGTI-298. La présence de ces molécules de costimulation devrait permettre d’éviter le risque d’anergie des lymphocytes T spécifiques des antigènes de tumeur et renforce de ce fait la réponse antitumorale. Les résultats obtenus suite aux traitements in vitro du mélanome murin B16F10 par l’IFN-g et le GGTI-298 sont retrouvés dans deux modèles de mélanome humain, LB1319-MEL et BB74-MEL. Ces cellules traitées par l’association de l’IFN-γ et du GGTI-298 présentent une surexpression des molécules du CMH-I, même lorsque la tumeur exprime déjà fortement ces molécules comme c’est le cas du mélanome LB1319-MEL. Les molécules de costimulation CD80 et surtout CD86 sont également exprimées à la surface de ces mélanomes humains suite à l’addition du GGTI-298 dans le milieu de culture. L’effet de ces traitements n’est donc pas limité au modèle murin ou à des cellules tumorales exprimant peu les CMH-I. L’ensemble des résultats obtenus suggère l’implication d’une protéine géranylgéranylée dans les mécanismes d’échappement des cellules de mélanome à la réponse immunitaire. L’activité des protéines Rho est dépendante de leur géranylgéranylation et nous avons montré qu’un traitement des cellules B16F10 par le GGTI-298 inhibe l’activation de la protéine RhoA. Ces arguments nous ont donc conduits à évaluer l’implication des protéines Rho dans les effets observés lors du traitement par le GGTI-298. Nous avons montré dans le modèle B16F10 que l’inhibition des protéines Rho par la C3 exoenzyme mime les effets observés avec le GGTI-298, sur l’expression des CMH-I, des molécules de costimulation et sur la croissance tumorale in vitro. Ces résultats mettent en évidence un rôle de régulateur négatif des protéines Rho dans la réponse immune anti-mélanome et montrent que des traitements ex vivo de cellules de mélanomes par l’association de l’IFN-γ et des statines ou du GGTI-298 augmentent leur immunogénicité. Ces résultats pourraient donc être la base de nouvelles stratégies thérapeutiques par l’injection de cellules traitées. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RESULTAT II Enhancement of melanoma specific immune response induced by IFN-γ and GGTI298 treatment of human melanoma cells. Sarrabayrouse, G; Armand-Labit, V; Moriez, R; Leveque, K; Favre,G ; Tilkin-Mariamé A-F. Manuscrit soumis: Molécular Cancer Therapeutics --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Les stratégies d’immunothérapie des mélanomes comme les stratégies de transfert adoptif utilisent des cellules de mélanomes de patients pour stimuler in vitro l’activation d’effecteurs immuns cytotoxiques spécifiques des tumeurs qui pourront être réinjectés chez les malades dans le but de détruire leurs cellules tumorales. L’une des limites de cette stratégie est liée à la faible immunogénicité des cellules tumorales qui ne permet pas toujours une activation lymphocytaire optimale. Nous avons montré qu’un traitement in vitro associant l’IFN-γ et un inhibiteur de la géranylgéranyl transférase de type I, le GGTI-298, induit la surexpression des molécules de CMH-I et de costimulation à la surface de cellules de mélanome murin B16F10. A partir de là, nous avons évalué l’intérêt des traitements in vitro par l’IFN-γ et le GGTI-298 pour induire dans des lignées de mélanomes humaines des cellules plus immunogéniques qui seraient donc de meilleurs outils cellulaires pour l’immunothérapie. Dans cette étude, nous avons évalué la capacité de mélanomes humains traités in vitro par de l’IFN-γ et du GGTI-298 à induire une réponse lymphocytaire T spécifique de la tumeur. Dans un premier temps, nous avons sélectionné parmi trois lignées mélaniques humaines celle présentant la plus forte expression des molécules CMH-I et de costimulation après ces traitements. Sur ces critères la lignée LB1319-MEL a été retenue pour la suite du travail. Comme dans le modèle murin B16F10, nos résultats montrent que le GGTI-298 stimule l’expression dépendante de l’IFN-γ des protéines TAP1 et TAP2 du transporteur peptidique TAP, ce qui permet l’induction d’une surexpression de CMH-I membranaire. Comme dans le modèle murin B16F10 nous avons aussi mis en évidence une capacité du GGTI-298 à modifier l’expression membranaire de molécules de costimulation. Dans ce modèle LB1319MEL nous avons testé des molécules de costimulation des familles B7 et TNF/TNFR et en particulier les molécules de costimulation activatrices (CD86) ou inhibitrices (PD-L1 et CD70). Nous avons observé que nos traitements par le GGTI-298 augmentent l’immunogénicité des tumeurs. En effet, nous avons mis en évidence une diminution de l’expression de deux molécules de costimulation inhibitrices CD70 et PD-L1 et une augmentation d’une molécule activatrice CD86. La lignée LB1319-MEL présente l’antigène de tumeur MelanA-MART1 par la molécule de CMH de classe I d’haplotype HLA-A0201. Des expériences de coculture entre ces cellules de mélanomes traitées et des PBMC de donneurs sains d’haplotypes compatibles (HLAA0201+) nous ont permis de montrer l’efficacité de notre traitement pour induire l’activation de lymphocytes T (LTCD8/CD69 et CD8/CD27) et l’acquisition par ces cellules de la fonction cytotoxique (LTCD8+/CD107a+). Nous avons également mis en évidence une cytotoxicité spécificité de LTCD8 qui lysent des cellules tumorales d’haplotype HLA-A0201 présentant l’antigène MelanA-MART1 (LB1319-MEL) et pas des cellules tumorales contrôles (Jurkat). L’ensemble de ces observations suggèrent que le prétraitement in vitro de cellules de mélanomes humains HLA-A0201+/MelanA-MART1+ par l’IFN-γ et GGTI-298 pourrait être un nouvelle stratégie permettant de générer des LT CD8 cytotoxiques utilisables dans des approches d’immunothérapies adoptive mais également de vaccinations. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RESULTAT III Induction of protective antitumor immunity by vaccination with melanoma cells treated with IFN-γ and geranylgeranyltransferase inhibitor : GGTI-298. Sarrabayrouse, G; Armand-Labit, V; Favre, G ; Tilkin-Mariamé, A-F. Résultats préliminaires --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- La vaccination thérapeutique est l’une des stratégies d’immunothérapie développée actuellement dans le traitement du mélanome métastatique. Cette technique consiste à stimuler la réponse immunitaire du malade en lui injectant des antigènes tumoraux, sous forme native ou associés à des cellules dendritiques. Une autre voie de vaccination est basée sur l’injection au patient des cellules tumorales irradiées. Cette stratégie est intéressante car contrairement à la vaccination par injections de peptides, les cellules tumorales induisent généralement une réponse de type polyclonale. Cependant la limite de cette méthode reste la faible immunogénicité des tumeurs. Néanmoins, différents groupes ont mis en évidence l’efficacité de la vaccination à l’aide de cellules tumorales génétiquement modifiées pour surexprimer des molécules de CMH ou de costimulation. Nos résultats précédents montrent qu’un traitement associant l’IFN-γ et le GGTI-298 induit une surexpression des molécules du CMH de classe I et une expression des molécules de costimulation (CD80, CD86) à la surface de la lignée de mélanome murin B16F10. Nous avons donc évalué in vivo le potentiel vaccinal de ces cellules prétraitées in vitro. Pour cela des souris syngéniques immunocompétantes C57B6 ont été injectées en sous-cutané avec des cellules B16F10 prétraitées in vitro par divers traitements (Non Traitées NT ;IFN-γ, GGTI-298, IFN-γ/GGTI-298) et irradiées à 120 Grey. 30 jours après la vaccination, les souris ont été injectées avec des cellules B16F10 non irradiées et non traitées et la croissance de ces tumeurs a été suivie pendant 17 jours (Figure A1). Comme le montre la courbe présentée figure A2, la croissance tumorale est ralentie dans les souris vaccinées par les cellules tumorales irradiées et prétraitées avec de l’IFN-γ et du GGTI-298 par rapport aux autres conditions. Nous avons même observé que 60% des souris vaccinées avec ce traitement ne développent pas de tumeurs. Des résultats préliminaires ont également montré que 50% des souris vaccinées à l’aide des cellules traitées par l’association des deux molécules étaient protégées contre l’apparition de métastases pulmonaires. Ces résultats montrent que nos traitements favorisent la capacité des cellules B16F10 irradiées à mettre en place une réponse immunitaire mémoire capable de prévenir ou de ralentir le développement tumoral. Ces résultats encourageants devront néanmoins être répétés et complétés. Le protocole de vaccination sera optimisé notamment avec l’utilisation d’adjuvants ou d’injections répétées de cellules tumorales prétraitées in vitro et irradiées. La présence de lymphocytes de phénotype mémoire (CCR7/CD62L) dans les organes lymphoïdes des souris vaccinées sera¨recherchée. A1 B16F10 irradiées *B16F10 NT *B16F10 IFN-γ *B16F10 GGTI-298 *B16F10 IFN-γ + GGTI-298 B16F10 J-30 J0 Suivie de la croissance tumorale J17 A2 500 Mean tumor size (mm2) 450 400 B16F10 NT B16F10 IFN B16F10 GGTI B16F10 IFN +GGTI 350 300 250 200 150 100 50 0 J7 J11 J14 Days post tumor injection J17 FIGURE A : Evaluation d’un protocole de vaccination antitumorale dans le modèle du mélanome murin B16F10 : (A1) Des souris immunocompétantes C57Bl6 ont été vaccinées à j -30 par des cellules de mélanome murin B16F10 irradiées (120Gy) soit non traitées (B16F10 NT), soit prétraités in vitro pendant 4 jours par de l’IFN-γ (50ui/mL) (B16F10 IFN), du GGTI-298 (10µM) (B16F10 GGTI) ou l’association de ces deux molécules (B16F10 IFN+GGTI). A j0 des cellules B16F10 non traitées et non irradiées sont à nouveau injectée dans les souris vaccinées et la croissance tumorale est suivie pendant 17 jours ( A2). --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RESULTAT IV Statins stimulate in vitro membrane FasL expression and lymphocyte apoptosis through RhoA/ROCK pathway in murine melanoma cells. Sarrabayrouse, G; Synaeve, C; Leveque, K; Favre, G; Tilkin-Mariamé A-F. Néoplasia Décembre 2007 in press --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- La dérégulation de l’expression des CMH-I par les cellules tumorales ne constitue pas le seul m écanisme d’échappement au système immunitaire. L’expression de la protéine FasL à la surface de certaines cellules tumorales est à l’origine d’un mécanisme d’échappement tumoral controversé appelé la « contre attaque-tumorale ». Cette expression permet aux cellules tumorales d’éliminer les effecteurs immuns Fas positifs. Deux travaux récents montrent que les protéines Rho régulent l’expression de FasL dans des lymphocytes TCD4 (Blanco-Colio et al., 2003) et des lignées tumorales ovariennes (Meng, Y et al., 2004). La lignée de mélanome B16F10 exprime de façon constitutive un faible niveau de FasL. Au cour de ce troisième travail, nous avons étudié dans ce modèle, l’effet des statines mais également l’implication de la protéine RhoA et de son effecteur, la protéine ROCK sur l’expression de la molécule FasL. Nous avons également évalué le rôle régulateur de ces deux protéines sur la capacité de la lignée B16F10 à induire in vitro l’apoptose d’un lymphome B murin (A20) exprimant la molécule Fas . Nous avons montré par cytofluorométrie que l’atorvastatine augmente le pourcentage de cellules exprimant la molécule FasL à leur surface alors que le niveau d’expression total de cette protéine, analysé par western blot, n’est pas modifié par le traitement. Ce résultat suggère que l’atorvastatine modifie la stabilité ou le traffic de la protéine FasL à la membrane plasmique. Des résultats identiques ont été obtenus sur des cellules B16F10 traitées par le GGTI-298 ou la C3 exoenzyme, deux inhibiteurs des protéines Rho et en particulier de la protéine RhoA. L’utilisation d’un ARN interférant ou d’un mutant constitutivement actif de RhoA (RhoAV14) nous ont permis de montrer le rôle de régulateur négatif de RhoA dans l’expression membranaire de FasL dans le modèle B16F10. Cependant la C3 exoenzyme est un inhibiteur commun des protéines RhoA, RhoB, RhoC, Rac et Cdc42, c’est pourquoi il serait intéressant de d’évaluer également l’implication de ces protéines sur l’expression membranaire de FasL. ROCKp160 est l’un des principaux effecteurs de RhoA et nous avons montré que son inhibition par un inhibiteur pharmacologique le H1152 augmente également l’expression membranaire de FasL. Des travaux récents ont mis en évidence dans des lignées de mélanomes l’expression de la protéine FasL dans des vésicules lysosomales migrant vers la membrane plasmique. De plus Nishimura et al (Nishimura et al 2000) ont montré l’implication de la voie RhoA/ROCK dans le traffic intra-cytoplasmique des lyzosomes. Ces deux travaux confortent nos résultats et suggèrent un rôle de la voie RhoA /ROCK dans le traffic de la protéine FasL vers la membrane plasmique. Le mécanisme de contre-attaque tumorale dépendant de l’expression de la molécule FasL à la surface des mélanomes est controversé, c’est pourquoi nous avons voulu confirmer la capacité des cellules B16F10 à induire l’apoptose de lymphocytes. Nos résultats expérimentaux ont montré que la protéine FasL présente à la surface des cellules B16F10 induit l’apoptose du lymphome A20, une lignée lymphocytaire B sensible à l’apoptose dépendante de la voie Fas/FasL. Par ailleurs, nous avons également montré que la voie RhoA/ROCK régule également la capacité de B16F10 à induire l’apoptose lymphocytaire via l’expression membranaire de FasL. Ce travail, réalisé dans un modèle de mélanome murin met en évidence, le rôle régulateur négatif de la voie de signalisation RhoA / ROCK dans l’expression membranaire de FasL et dans sa capacité à induire in vitro l’apoptose de lymphocytes Fas positifs. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RESULTAT V RhoA protein positively regulates CD70 expression on a human melanoma cell line: implication toward T lymphocytes proliferation. Sarrabayrouse, G. ; Favre,G ; Tilkin-Mariamé, AF Résultats préliminaires --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Remarque préliminaire : Ce travail n’est pas achevé à l’heure actuelle, il n’a pas encore fait l’objet d’une rédaction sous forme d’article en anglais. Il sera donc présenté sous une forme proche d’un article mais en français. Résumé La protéine CD70 appartient à la famille des TNF (Tumor Necrosis Factor). Cette protéine est présente à la surface des LT, LB et cellules NK activés. Son expression a également était mise en évidence à la surface de CD murines et humaines. L’interaction entre CD70 et son récepteur, CD27, joue un rôle important dans les signaux de costimulation permettant l’activation et la prolifération lymphocytaire. Des travaux récents ont mis à jour un nouveau mécanisme d’échappement tumoral associé à l’expression de la protéine CD70 à la surface de lignées de glioblastomes et de carcinomes rénaux. En effet, l’interaction entre CD70 présent à la surface de cellules tumorales et son récepteur CD27 exprimé par les lymphocytes inhibe la prolifération des lymphocytes en induisant leur apoptose. Dans ce travail, nous décrivons pour la première fois, l’expression de la molécule CD70 à la surface d’une lignée de mélanome humain et nous montrons la capacité de cette protéine à inhiber la prolifération lymphocytaire. Par ailleurs nous mettons également en évidence le rôle régulateur positif de la protéine RhoA dans le contrôle du niveau d’expression de CD70 dans la lignée de mélanome humain LB1319-MEL. Introduction L’activation des lymphocytes T (LT) est un mécanisme complexe nécessitant des signaux cellulaires transmis aux lymphocytes T lors de leurs rencontres avec les cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Un premier signal est transmis aux LT lors de la liaison entre leur récepteur pour l’antigène (TCR) et les complexes CMH-peptide présentés par la CPA. Mais cette liaison ne suffit pas à induire les lymphocytes T naïfs à proliférer et à se différencier en cellules T armées. L’expansion clônale et l’activation des LT naïfs, nécessitent un second signal costimulateur qui est délivré par la CPA sur laquelle le LT reconnaît son antigène spécifique. Les molécules de costimulation appartiennent à deux grandes familles de protéines, la famille des immunoglobulines et la famille des TNF (Tumor Nécrosis Factor). Les molécules costimulatrices les mieux caractérisées sont les glycoprotéines B7.1 et B7.2, de la famille des immunoglobulines et les molécules CD154 et CD70 de la famille des TNF. CD70 (CD27-L) est une protéine de 21 kDa retrouvée à la surface des LT et LB après activation antigénique (Lenz et al., 1996/1997). C’est un bon marqueur de l’activation antigénique précoce. Cette molécule est également retrouvée sur les NK activés, les cellules dendritiques matures (Akiba et al., 2000 ; Futugawa et al., 2002). CD70 se lie à son récepteur CD27 exprimé constitutivement à de faibles taux par les LT, LB et Natural Killer (NK). CD27 possède dans sa partie intracytoplasmique un ou plusieurs domaines nommés TIM permettant la liaison de protéines adaptatrices appelées TRAF pour TNFR associated factors (Dempey et al., 2003). Ces adaptateurs sont connus pour activer différentes voies de signalisations cellulaires (NF-kB, JNK, PI3K, MAPK) induisant la prolifération, la survie cellulaire et certaines fonctions effectrices des lymphocytes. La région intracytoplasmique de CD27 peut également lier la protéine Siva. Siva transduit non plus des signaux de survie mais des signaux pro-apoptotiques, ce qui pourrait être une voie alternative conduisant à l’apoptose (Prasad et al., 1997), et jouant ainsi un rôle important dans l’homéostasie des populations lymphocytaires (Hintzen et al., 1991, ; Loenen et al., 1992). L’activation de ses différentes voies de signalisation se produit suite à liaison de CD70 sur son récepteur CD27, un homotrimètre de CD70 interagissant avec trois homodimère de CD27. L’interaction CD27/CD70 contrôle l’accumulation des LT CD4+ et des LT CD8+ effecteurs (Hendriks et al., 2000 ;Yamada et al., 2005) et la survie des LT cytotoxiques sur les sites infectieux ( Hendriks et al., 2003) (Xiao et al., 2004) aussi bien durant les réponses primaires que secondaires. De nombreux travaux montrent un rôle important de l’interaction entre CD27 et CD70 dans la mise en place d’une réponse immune anti-tumorale (Couderc et al. 1998 ; Cormary et al. 2004 et 2005). Des souris CD70 transgéniques, exprimant de façon constitutive CD70 à la surface des LB sont protégées contre une petite dose de cellules tumorales qui serait létale sur des souris sauvages (Arens et al., 2004). D’autre part, l’injection à des souris syngéniques de cellules tumorales génétiquement modifiées in vitro pour exprimer la molécule CD70, permet de mettre en place une réponse immune antitumorale protectrice qui induit une inhibition partielle de la croissance in vivo des cellules génétiquement modifiées (Couderc et al. 1998 ; Cormary et al. 2004 et 2005). L’injection de ces tumeurs génétiquement modifiées permet également de mettre en place une mémoire immune protectrice (Cormary et al., 2005). Une expression ectopique de CD70 a été mise en évidence à la surface de différentes lignées tumorales humaines (Diegmann et al., 2006 ; Wischhusen et al 2002). Des travaux récents montrent que l’expression de cette molécule sur des lignées de glioblastomes ou de carcinomes rénaux inhibe la prolifération de LTCD4+/CD27+ ou de LTCD8+/CD27+ allogéniques en induisant leur apoptose in vitro dans des expériences de co-cultures. Cette observation inattendue permettrait de proposer la molécule CD70 comme un acteur important dans un mécanisme de “contre attaque tumorale”. Un travail récent mené dans l’équipe montre que la protéine RhoA est capable de réguler l’expression de la molécule FasL à la surface de la lignée murine de mélanome B16F10 (Sarrabayrouse et al., 2007). Comme CD70, FasL est une molécule de la superfamille des TNF. FasL est impliquée dans l’apoptose induite par les LT (Blanco-Colio et al., 2003) mais également dans le mécanisme de « contre attaque tumorale » (Sarrabayrouse et al., 2007). L’existence d’une régulation de l’expression d’un membre de la famille des TNF par les protéines Rho, nous a conduit à étudier un rôle éventuel de ces protéines dans l’expression de la molécule CD70 à la surface de lignées de mélanomes. Pour cela, dans un premier temps nous avons étudié l’expression de CD70 à la surface de lignées mélaniques humaines. Ensuite, en utilisant différentes molécules pharmacologiques connues pour moduler l’activité des protéines Rho nous avons recherché un rôle de ces GTPases dans la régulation de l’expression de CD70. Enfin nous avons étudié dans notre modèle tumoral la capacité des molécules CD70 à inhiber la prolifération lymphocytaire par des expériences de co-cultures in vitro. Matériel et Méthodes Lignées cellulaires Les lignées de mélanomes utilisées sont les lignées murines B16F10, B16F10CD70, B16F10CD70s et les lignées humaines LB1319-MEL, LB283-MEL, LB1752-MEL, LB1829MEL, BB74-MEL, LB2033-MEL. Les lignées B16F10CD70 et B16F10CD70s ont été obtenues par transfections stables de la lignée B16F10 par des plasmides codant soit pour la molécule CD70 soit pour une forme soluble de cette même molécule. Les lignées humaines ont été fournies par le Pr.T.Boon (Institut Ludwig de Recherche contre le Cancer, Bruxelles). Ces lignées cellulaires sont maintenues in vitro par des passages en série dans du milieu RPMI 1640 (Cambrex) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté (SVF) (Dutcher). Immunofluorescence Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verres dans des plaques 6 puits afin d’obtenir 60% de confluence au bout de 48h. Les cellules sont fixées sur les lamelles au PFA 3,7% (Paraformaldéhyde) pendant 20 minutes puis lavées au PBS froid. Elles sont incubées pendant 30 min dans du PBS 10%SVF puis chaque lamelle est incubée 30 minutes à température ambiante en présence de 100μL d’anticorps anti-CD70 (BD Bioscience ) dilué au 1 :100. Après 3 lavages dans du PBS les lamelles sont incubées toute la nuit avec un anticorps secondaire couplé au FITC. Les lamelles sont à nouveau lavées dans du PBS puis montées sur lames et observées au microscope à fluorescence à l’immersion. Transfection des cellules par les ARNsi dirigés contre les ARNm des protéines Rho Les cellules LB1319-MEL sont ensemencées à J0 à une densité de 500.000 cellules par boîte de Pétri de 100 mm de diamètre. A J1, les cellules sont transfectées par les ARNsi spécifiques de chacune des protéines suivantes: siRhoA (5’GAAGTCAAGCATTTCTGTC3’, Eurogentec), siRhoB (5’CCGTCTTCGAGAACTATGT3’, (5’AATAAGAAGGACCTGAGGCAA3’, Eurogentec), GCUGCAGCUGAAUCACACA 3’ (Eurogentec) Dharmacon), siRNACD70 siRhoC 5’ ou par un ARNsi contrôle (siContrôle: 5’ACUCUAUCUGCACGCUGACUU3’, Eurogentec) à 2.10-8M chacun, grâce à l’utilisation d’oligofectamine (Invitrogen) et de milieu Opti-MEM (Invitrogen). 4 heures plus tard, la transfection est arrêtée en ajoutant un volume identique de milieu Opti-MEM additionné de 20% SVF (10% final). Les cellules sont maintenues en culture pendant 3jours puis réensemencées à J3 dans du RPMI 1640 complémenté avec 10% de SVF. Cytofluorimétrie L’étude de l’expression membranaire de la molécule CD70 est effectuée par cytofluorimétrie. 1x106 cellules sont marquées avec 10μL d’anticorps anti-CD70 couplé au PE (BD Bioscence). Après une incubation de 45 minutes à 4°C et à l’obscurité, et 2 lavages au PBS, les culots sont remis en suspension dans 500μL de PBS pour l’analyse en cytométrie de flux. L’expression membranaire est rapportée par l’indice de fluorescence. Ce dernier est calculé comme suit : ((médiane de fluorescence spécifique - médiane de fluorescence du contrôle isotypique) / médiane de fluorescence du contôle isotypique) X 100 Le contrôle isotypique correspond à la fluorescence obtenue lorsque les échantillons sont en présence d’immunoglobulines de la même classe que celle de l’anticorps spécifiqueet couplées avec le même fluorophore. Traitement in vitro des cellules tumorales par la C3 exoenzyme Les cellules LB1319-MEL ont été mises en culture dans des plaques 6 puits (Dutsher) (100.000 cellules par puit) dans 1 ml de milieu RPMI 1640 ; 10% SVF, 100 unités / mLde Pénicilline-Streptomicine, 1% de L-Glutamine. Les cellules sont ensuite traitées pendant 48h avec de la C3exoenzyme à une concentration finale de 20μg/ml. Extraction des ARNs Les ARN des cellules LB1319-MEL sont extraits par le kit RNeasy (Qiagen). Les cellules sont lysées par 600 µl de tampon RLT additionné de 10 µl de βMercaptoéthanol. Les ADN sont ensuite éliminés par précipitation avec 700 µl d’éthanol à 70%. On passe au travers d’une colonne 700 µl de la solution contenant les ARN puis cette colonne est lavée par passage successif de différents tampons ( un lavage avec 700 µl de tampon RW1, puis deux lavages successifs avec 500 µl de tampon RPE). Les ARN restant sur la colonne sont élués avec 30 µl d’H2O RNAses free (Eurogentec). Reverse Transcription On dilue 500 ng d’ARN dans 10 µl d’H2O sans RNAse (Eurogentec). On additionne 2 µl d’un mélange 1/1 de dNTP (10 mM) (Qbiogen) et de random primer (200 ng/µl) (Qbiogen) par échantillon d’ARN. On dénature 5 min à 65°C, puis on ajoute 7 µl de Mix de Reverse Transcription (4 µl de tampon 5X, 2 µl de DTT, 1 µl de RNase OUT (Invitrogen)). On lance le programme RT-Blue pendant 2 min à 42°C, puis on additionne 1 µl de SuperScript (Invitrogen) qui contient la Reverse Transcriptase. On relance le programme pendant 1h15 : 10 min à 25°C, 50 min à 42°C et 15 min à 75°C. PCR la préparation, on laisse refroidir et on coule le gel. On dépose ensuite 2 µl de chaque Les fragments désirés (CD70) sont amplifiés par PCR classique à partir d’ADNc. Les échantillons sont préparés comme suit : on mélange 5µl de tampon PCR (Biolabs), 1µl de dNTPs (Qbiogen), 39 µl d’H2O sans RNase (Eurogentec), 6 µl d’amorce sens (Eurogentec) et 6 µl d’amorce antisens (Eurogentec). Puis, on ajoute 2 µl d’ADNc traité ou non traité. Enfin, on ajoute 1 µl de la Taq polymérase (Qbiogen). Puis on prépare un gel d’agarose à 1% : on pèse 1g d’agarose que l’on dilue dans 100 ml de TAE 0,5X. On porte à ébullition échantillon et 1 µl de marqueur de taille (Eurogentec). Après migration à 100 Volts, le gel est immergé 5 min dans un bain de SybrGreen 1X (Amresco) sous agitation. On révèle le gel sous UV. Western Blot Après un lavage au PBS, les cellules LB1319-MEL traitées ou non, sont grattées avec 100µL de tampon de lyse (Tris HCL 50mM, NaCl 150mM, Triton X100 1%, EDTA 5mM, NaF 50mM, Désoxycholate de Na 0,5%, SDS 0,1%). Après 35 minutes d’incubation dans la glace et une centrifugation de 12 minutes à 12000 rpm à 4°C, le surnageant est prélevé. Les protéines sont dosées par la méthode de BCA. 40µg à 100μg de protéines cellulaires dénaturées dans le tampon d’échantillon (Tris 60 mM pH 6,8 ; SDS 2% ; glycérol8% ; bleu de bromophénol 0,004% ; βmercaptoéthanol 2%) sont séparées par électrophorèse sur gel d’acrylamide dans le tampon de migration (Tris 25mM pH 8,3 ; glycine 192mM ; SDS 0,1%). Les protéines sont ensuite électro-transférées à 60V sur une membrane de PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciences) dans le tampon de transfert (Tris 50mM pH 8,5 ; glycine 300mM ; SDS 0,1% ; méthanol 20%). La membrane est saturée pendant 1 heure à température ambiante dans du TBST (Tris 25mM pH 8 ; NaCl 140mM ; Tween 20 0,05%) contenant 10% de lait. Puis la membrane est marquée la nuit à 4°C dans du TBST contenant 1% de lait et l’anticorps primaire. Après lavage au TBST, la membrane est incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Biorad) pendant 1 heure. La révélation est effectuée par chimiluminescence avec l’ECL, les autoradiogrammes sont numérisés par un scanner Power Look II (Umax) et quantifiés par le logiciel Imax Quant (Moleculars Dynamics). Les différents anticorps utilisés sont les suivants : Anticorps primaire (dilution) RhoA (1/5000) RhoB (1/5000) CD70 (1/500) Anticorps secondaire Anti souris (1/10000) Anti lapin (1/5000) Anti chèvre (1/5000) % de polyacrilamide 12,50% 12,50% 15% Récupération et congélation des PBMC de donneurs sains volontaires Les PBMC de donneurs sains volontaires sont recueillis par gradient de densité Lymphoprep (Nycomed) à partir de concentrés globulaires obtenus auprès de l’Etablissement Français du Sang (EFS). Dépôt de 2 volumes de concentrés globulaires dilués dans du PBS stérile, sur un volume de Lymphoprep. Centrifugation 20 minutes à 2000rpm à température ambiante. Prélèvement de l’anneau correspondant aux lymphocytes, puis deux lavages dans du PBS avant de reprendre les PBMC dans 5mL de milieu de congélation (RPMI1640, 10% DMSO, 20%SVF). Ils sont ensuite conservés quelques semaines à –80°C. Traitement des PBMC de donneurs Différents échantillons de PBMC de donneurs sains sont décongelés et mis en culture dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10% de SVF. Les lymphocytes en suspension sont séparés des monocytes/macrophages après 18h de culture en plaque 6 puits par adhésion sur plastique des monocytes/macrophages. Puis les lymphocytes en suspension sont récupérés et traités 48h avec de la PHA (Phytohémagglutinine) à 30µg/mL. Test de prolifération lymphocytaire par incorporation de méthyl thymidine tritiée 1x105 PBMC, traitées à la PHA sont cocultivées en plaque 96 puits, en présence de 5x103 cellules LB1319-MEL préalablement irradiées (120Gy). Après deux jours de coculture la méthyl-3H thymidine est ajoutée pendant 24h à raison d’un micro Ci par godets, puis l’incorporation de thymidine est analysé à l’aide d’un compteur béta. Analyse statistique La comparaison des résultats avec les conditions contrôles précisées dans les légendes est effectuée par un test de Student (*p<0,05, **p<0,01 et *** p<0,001). Résultats Mise en évidence de l’expression de la molécule de costimulation CD70 à la membrane de la lignée de mélanome humain LB1319-MEL : La molécule de costimulation CD70 est retrouvée à la surface de nombreuses lignées d’origine lymphoïdes, cependant son expression a été également mise en évidence sur quelques lignées d’origines tumorales. Nous disposons au laboratoire de différentes lignées de mélanome humain et nous avons recherché l’expression de la molécule CD70 à la surface de ces cellules. Par cytofluorimétrie, nous avons analysé l’expression de cette molécule sur les différentes lignées de mélanomes humains (LB1829-MEL, LB283-MEL, LB1751-MEL, BB74-MEL, LB1319-MEL) cultivées pendant 48h en milieu complet. Nous avons superposé ("overlays") les expressions de CD70 observées avec un anticorps isotypique contrôle et avec un anticorps spécifique (cf Matériels et Méthodes). Les overlays présentés sur la figure 1A montrent que seule la lignée LB1319-MEL exprime la molécule de costimulation CD70. Cette expression est confirmée par une analyse en immunofluorescence (figure 1B). Pour cela, les cellules LB1319-MEL ont été cultivées pendant 48h sur des lamelles, fixées et marquées soit avec un anticorps primaire anti-CD70 puis un anticorps secondaire couplé à l’isothiocianate de fluoresceine (FITC), soit avec l’anticorps secondaire seul que nous utiliserons comme un témoin négatif. Les photos présentées sur la figure 1B montrent un marquage fluorescent présent sur toute la membrane des cellules marquées par l’anticorps CD70. Marquage qui est absent à la surface de notre témoin négatif. Ce résultat confirme la présence de cette protéine à la surface de la lignée LB1319-MEL. Par ailleurs, nous avons également analysé l’expression de la protéine CD70 par western blot (WB). La figure 1C présente l’analyse par western blot de trois lignées : une lignée de mélanome murin B16F10 transfectée de façon stable par la molécule de costimulation CD70 humain (B16F10-CD70) une lignée de mélanome murin B16F10 sauvage (WT) et la lignée LB1319-MEL. La lignée B16F10-CD70 est utilisée comme témoin positif de l’expression de CD70 et la lignée B16F10 WT comme contrôle négatif. Les résultats obtenus figure 1C montrent un marquage positif pour la protéine CD70, pour les lignées tumorales B16F10-CD70 et LB1319-MEL et ceci à trois poids moléculaires différents : 25, 50 et 75 kDa correspondant respectivement à des formes monomériques ou multimériques de cette molécule. Une analyse de l’expression de l’ARNm codant CD70 a également été menée sur ces trois lignées par RT-PCR. Le gel d’agarose présenté sur la figure 1C met en évidence la présence de l’ARNm codant CD70 dans la lignée LB1319-MEL et dans la lignée contrôle positif B16F10-CD70, mais pas dans la lignée B16F10 WT. Ces résultats nous permettent d’affirmer que la lignée de mélanome humain LB1319-MEL exprime de façon constitutive la molécule de costimulation CD70. Nous avons donc retenu cette lignée cellulaire pour la suite de notre travail. L’expression de CD70 à la membrane de cellules LB1319-MEL inhibe la prolifération de PBMC allogéniques mis en co-culture Le rôle de la molécule CD70 exprimée à la surface de lignées tumorales fait encore l’objet de controverses. Wichhusen et al. (Wischhusen et al., 2002) montrent que l’expression de la molécule CD70 à la surface de lignées de glioblastomes inhibe in vitro la prolifération de lymphocytes allogéniques en induisant leur apoptose, alors que des travaux réalisés au laboratoire (Couderc et al., 1998) montrent que l’expression de cette même molécule sur des lignées mélaniques murines favorisent la prolifération et l’activation lymphocytaire. Afin d’évaluer le rôle fonctionnel de CD70 à la surface de la lignée humaine LB1319-MEL, nous avons inhibé l’expression de cette molécule par la technique de l’ARN interférant (ARNi). Pour cela, un ARNi spécifique de l’ARNm de CD70 a été conçu et sa capacité à inhiber l’expression de CD70 a été évaluée. Les résultats de cytofluorimétrie (figure 2A) et de western blot (figure 2B) montrent une diminution importante de l’expression de CD70 dans les cellules transfectées par l’ARN interférant spécifique de cette protéine (SiCD70) par rapport aux cellules transfectées par l’ARN interférant contrôle (Scramble). Ceci nous permet de valider l’efficacité de notre ARNi pour inhiber l’expression de CD70. Nous avons ensuite testé le rôle de la molécule CD70 exprimée par les cellules LB1319-MEL sur la prolifération de lymphocytes allogéniques. Après stimulation par la PHA (un mitogène polyclonal induisant la prolifération des LT) des PBMC allogéniques de donneurs sains ont été cocultivés pendant 72h en présence de cellules LB1319-MEL tranfectées soit par un ARNi contrôle (scramble) soit par l’ARNi dirigé contre CD70. La prolifération des PBMC a été évaluée par incorporation de methyl thymidine trititée. L’incorporation de methyl thimidine tritiée est plus importante dans les PBMC cocultivés en présence de cellules transfectées par l’ARNi dirigé contre CD70 qu’en présence de cellules transfectées par un ARNi contrôle (figure2C). Cette observation met donc en évidence une inhibition de la prolifération lymphocytaire par la protéine CD70 exprimée à la surface de la lignée LB1319-MEL. RhoA contrôle l’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319MEL : Les travaux récents menés dans l’équipe montrent que les protéines Rho contrôlent l’expression de la molécule FasL à la surface de la lignée mélanique murine B16F10. CD70 étant comme FasL une molécule de la famille des TNF nous avons cherché à savoir si son expression à la surface de la lignée LB1319-MEL, pouvait être régulée par les protéines Rho. Pour cela nous avons traité les cellules LB1319-MEL par la C3 exoenzyme, une toxine produite par la bactérie Clostridium botulinum. Cette enzyme est connue pour inhiber de façon spécifique l’activité des protéines RhoA, RhoB et RhoC par le mécanisme d’ADP ribosylation. Les résultats présentés sur la figure 3A montrent que le traitement par la C3 exoenzyme diminue l’expression membranaire de CD70 d’un facteur 2. Cette expression étant analysée par cytofluorométrie et quantifiée par l’Index Spécifique de Fluorescence (ISF) (cf Matériels et Méthodes). De plus, par western blot nous avons vérifié l’efficacité de l’enzyme C3 à ADP ribosyler la protéine RhoA dans notre modèle tumoral (figure 3A). Comme nous le montre la figure 3A on observe la présence de deux bandes sur les extraits provenant des cellules traitées par la C3 alors qu’une seule bande n’est visible sur les extraits provenant de cellules non traitées. La bande du haut correspond aux protéines RhoA ayant déjà subit l’ADP ribosylation (inactivées) et celle du bas aux protéines RhoA non ADP ribosylées. Cette analyse confirment donc, l’efficacité de notre traitement. Les résultats obtenus précédemment montrent que l’expression de CD70 à la surface des cellules LB1319-MEL est diminuée par la C3 exoenzyme utilisée pour inhiber les protéines RhoA, B, C. Les protéines Rho régulent donc positivement l’expression de CD70 dans cette lignée de mélanome huamain. Afin de caractériser de façon plus précise laquelle de ces trois protéines Rho joue un rôle dans l’expression de CD70, nous avons choisi d’utiliser la technique des ARNs interférants (ARNi). Les cellules LB1319-MEL ont été transfectées par des ARNis spécifiques des ARNm codant les protéines RhoA, RhoB ou RhoC ou par un ARNi non fonctionnel (scramble : séquence aléatoire avec les mêmes nucléotides). 72 heures après la transfection les cellules LB1319-MEL ont été repiquées. 24h après le repiquage une partie des cellules a été lysée afin d’évaluer par western blot l’efficacité des ARNis, dans nos conditions et notre modèle tumoral, à inhiber spécifiquement les protéines Rho (figure 3B). De plus, 48h après le repiquage nous avons évalué par cytofluorimétrie le niveau d’expression de CD70 à la surface des cellules traitées (figure 3C). L’analyse par western blot présentée sur la figure 3B montre que les ARNis dirigés contre les protéines RhoA et RhoB inhibent de façon spécifique leur cible sans modifier de façon significative l’expression des autres protéines Rho. Nous n’avons pas pu évaluer l’efficacité du ARNi dirigé contre RhoC par manque d’anticorps spécifiques dirigés contre cette protéine. Après avoir démontré l’efficacité de nos ARNis, nous avons évalué l’effet de l’inhibition des différentes protéines Rho sur l’expression membranaire de CD70. Sur l’histogramme de la figure 3C on observe que seul le ARNi de RhoA diminue l’expression de la molécule CD70 à la surface des cellules LB1319-MEL. L’inhibition de l’expression de CD70 dans des cellules transfectées par l’ARNi de RhoA a également été mis en évidence par western blot (figure 3D). Ainsi, l’ensemble de ces observations met en évidence dans la lignée LB1319-MEL, un rôle régulateur positif de la protéine RhoA sur l’expression totale de la molécule CD70. Discussion En situation physiologique normale, la molécule CD70 joue un rôle prépondérant dans la mise en place d’une réponse immune efficace. Cette molécule est présente sur plusieurs lignées lymphoïdes et son expression à la surface de lignées tumorales est souvent associée à un mauvais pronostic de la maladie. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes intervenants dans la régulation de la réponse immune anti-tumorale et nous disposons au laboratoire de plusieurs lignées de mélanomes humains. Nous avons recherché l’expression de la molécule CD70 à la surface de différentes lignées mélaniques humaines. Nous avons clairement mis en évidence qu’une seule de nos lignées exprime de façon constitutive la molécules CD70 ; il sagit de la lignée LB1319-MEL. L’analyse par western blot nous montre que cette lignée exprime les trois formes (monomériques, dimériques et trimériques) de la molécule décrites dans la littérature. Nous avons voulu évaluer la capacité des cellules LB1319-MEL à développer un mécanisme de contre-attaque tumorale dépendant de la molécule CD70. Le mécanisme de contreattaque tumorale est généralement associée à l’expression de FasL à la surface des cellules tumorales, c'est-à-dire la capacité de certaines cellules tumorales «à « attaquer » les effecteurs de la réponse immune exprimant le récepteur Fas et à induire leur mort par apoptose. Les travaux de l’équipe de Wischusen ont mis en évidence un mécanisme de contre attaque tumorale in vitro impliquant la molécule CD70 dans un modèle de glioblastome (Wischhusen et al., 2002). Il a été montré que des lignées de glioblastomes positives pour CD70 inhibent la prolifération de lymphocyte allogéniques en induisant leur apoptose par contact entre la molécule CD70 et son récepteur CD27 présent sur ces lymphocytes. Afin d’analyser par des techniques de cocultures (lymphocytes / tumeurs) l’effet de CD70 sur la prolifération et l’apoptose lymphocytaire, nous avons bloqué l’expression de cette molécule par la technique de l’ARN interférent (ARNi), pour comparer les résultats obtenus avec des tumeurs exprimant ou non la molécule CD70. Nos résultats montrent une diminution de la prolifération des lymphocytes allogéniques associée à la présence de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL. Cette observation met en évidence un effet de CD70 sur la prolifération lymphocytaire mais ne permet pas de conclure qu’il sagit d’un mécanisme d’apoptose lymphocytaire. C’est pourquoi, nous proposons d’évaluer par des tests spécifiques (Annexine V, SubG1, Clivage de la caspase 3) l’effet de CD70 sur l’apoptose de PBMC totaux ou de lymphocytes T exprimant le récepteur CD27. Ces cellules, préalablement traitées à la PHA, seront cocultiveés en présence de cellules LB1319-MEL transfectées soit par un ARNi contrôle ou par un ARNi spécifique de CD70 et des tests d’apoptose seront réalisés. Comme nous l’avons dit précédemment CD70 appartient à la famille des TNF comme la molécule FasL. Des travaux menés au laboratoire montrent que la protéine RhoA inhibe l’expression membranaire de la protéine FaL à la surface de la lignée de mélanome murin B16F10 (Sarrabayrouse et al., 2007). En utilisant la C3 exoenzyme connue pour inhiber l’activité des protéines Rho (RhoA, RhoB, RhoC, Rac, Cdc42) nous avons mis en évidence que ces protéines contrôlaient le niveau d’expression de CD70 à la surface des cellules LB1319-MEL. Nous avons cherché l’implication de chacune des protéines RhoA, B et C dans la régulation de l’expression de la molécule CD70. Pour cela, nous avons optimisé l’utilisation de la technique des ARN interférents sur les cellules LB1319-MEL. Cependant, l’efficacité et la spécifiité du siRhoC n’ont pu être visualisées faute d’anticorps spécifiques. C’est pourquoi l’étude de l’effet du siRhoC sera entreprise ultérieurement par la technique de RT-PCR quantitative. Par contre, l’efficacité et la spécificité des Si RhoA et RhoB ont été vérifiées dans notre modèle. Nous avons montré par cytométrie de flux que l’expression membranaire de CD70 diminuait d’un facteur trois en comparaison à celle observée pour le contrôle et ceci uniquement lorsque les cellules LB1319-MEL étaient transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. De plus, l’analyse par Western Blot du taux global cytoplasmique et membranaire d’expression de CD70 après inhibition spécifique de RhoA a permis de constater que le taux global de la protéine CD70, était diminuée dans les cellules transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. Cette observation met en évidence un rôle régulateur positif de RhoA dans l’expression du taux global de la protéine CD70 et non pas un rôle de régulateur négatif de son expression membranaire comme nous l’avons démontré pour une autre protéine de la famille des TNF :FasL. De plus, ce résultat suggère un rôle de RhoA dans la régulation transcriptionnelle ou traductionnelle de la protéine CD70. Des résultats préliminaires de RT-PCR semi-quantitative montrent une diminution du niveau d’expression de l’ARNm codant la protéine CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. Ce résultat conforte l’hypothèse d’un contrôle transcriptionnel du gène codant la molécule CD70 par la protéine RhoA et devra être confirmé par l’utilisation d’un plasmide codant le gène de la luciférase sous contrôle du promoteur de CD70. Par ailleurs, le clonage et le séquençage du promoteur de CD70 ont mis en évidence la présence d’éléments de réponse pour le facteur de transcription NFkB. Or, plusieurs travaux ont décrit une diminution de l’activité transcriptionelle de NFkB associée à l’inhibition des protéines Rho (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 et 1999). Des expériences seront donc entreprises pour étudier le rôle éventuel de RhoA mais également de la voie RhoA/NFkB dans la régulation transcriptionnelle du gène codant CD70. Figure 1 : La lignée de mélanome humain LB1319-MEL exprime de façon constitutive la molécule de costimulation CD70 Les différentes lignées mélaniques humaines (LB1319-MEL, LB283-MEL, LB1829-MEL, BB74-MEL, LB2033-MEL) sont cultivées pendant 48h en milieu complet. L’expression de la molécule CD70 est évaluée par les courbes obtenues en cytofluorimétrie (A). L’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL a également été illustrée par immunofluorescence (B). (C, D) Les cellules B16F10CD70 (modifiées génétiquement pour exprimer la molécule CD70 humaine), B16F10WT et LB1319-MEL sont cultivées pendant 48h en milieu complet. L’expression de la protéine CD70 (C) ou de l’ARNm (D) de la molécule CD70 sont ensuite évaluées respectivement par western blot (C) ou RT-PCR (D). Figure 2 : Evaluation du rôle de la molécule CD70 exprimée par la lignée LB1319-MEL ,dans la prolifération de PBMC allogéniques (A)(B) Un ARN interférant dirigé contre la protéine CD70 a été conçu et son efficacité à inhiber l’expression de la molécule CD70 a été évaluée par western blot (A) ou cytométrie de flux (B). Des cellules LB1319-MEL ont été transfectées par un ARNi spécifique de CD70 ou un ARNi contrôle. Ces cellules ont ensuite été cocultivée pendant 48h avec des PBMC de donneurs sain allogénique prétraités à la PHA. De la méthyl-3H thymidine est ajoutée pendant 24h à raison d’un micro Ci par godets, puis l’incorporation de thymidine est analysé à l’aide d’un compteur béta (C). Figure 3 : RhoA régule l’expression de la molécule CD70 dans la lignée LB1319-MEL Les cellules LB1319-MEL sont traitées à la C3 exoenzyme pendant 48h l’expression membranaire de CD70 est analysée par cytofluorimétrie, les résultats sont exprimés en indice de fluorescence (A) et le niveau d’ADP ribosylation de la protéine RhoA est évalué par western blot (A). Les cellules LB1319-MEL sont tranfectées par un ARNi contrôle (Sc) ou par des ARNi spécifiques de RhoA (SiA2), RhoB (SiB2), ou RhoC (SiC2). La diminution d’expression de ces protéines est testée à J4 après la transfection par western blot illustré par B. A J5 l’expression de la molécule CD70 est évaluée soit par cytofluorimétrie (C) soit par immunoempreinte (D). Pour A et C, les moyennes et les écartstypes sont calculés à partir d’au moins 3 epériences indépendantes. Conclusion générale Le but de ce travail de thèse, était d’évaluer le rôle des protéines Rho dans la mise en place d’une réponse immune anti-tumorale dans le modèle du mélanome métastatique. Tout d’abord dans des lignées cellulaires de mélanome humain et murin, nous avons par diverses approches modifié l’activité ou l’expression des protéines Rho puis nous avons analysé dans ces cellules l’expression membranaire de différentes protéines impliquées dans la mise en place de la réponse immunitaire. Nous avons ensuite évalué l’impact de nos traitements sur ces réponses immunes anti-tumorales, in vitro par des expériences de cocultures et in vivo par des injections dans des souris syngéniques. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence, que l’inhibition des protéines Rho favorise l’induction d’une réponse immune anti-mélanome, en induisant, sur les cellules tumorales murines B16F10 traitées, une expression des molécules de costimulation (CD80 et CD86) et une surexpression des molécules du CMH-I, induite par l’INF-γ. Ces modifications permettent de favoriser le rejet immun des mélanomes traités injectés à des souris immunocompétentes et induisent chez ces souris l’activation de lymphocytes T spécifiques. Par ailleurs, nous avons évalué l’intérêt thérapeutique de traitements associant l’IFN-γ et un inhibiteur pharmacologique des protéines Rho ; le GGTI-298. Nous avons dans un premier temps testé le potentiel vaccinal de nos mélanomes traités en montrant que des souris injectées avec des cellules B16F10 préalablement traitées et iradiées étaient partiellement protégées contre le développement de tumeurs sauvages. Dans un deuxième temps, nous avons montré que ces traitements induisent sur des tumeurs humaines une surexpression des molécules HLA de classe I et des molécules de costimulation ayant des activités activatrices (CD86) ou inhibitrices (PD-L1) et provenant des familles B7 ou TNF/TNFR. De plus, nous avons mis en évidence la capacité stimulatrice de ces mélanomes humains prétraités à induire in vitro l’activation de lymphocytes T CD8 cytotoxiques spécifiques des mélanomes et sécrétant de l’IFNγ, à partir de donneurs sains HLA-compatibles. Enfin, au cours de cette thèse nous avons également mis en évidence le rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression de deux molécules de la famille des TNF : FasL et CD70. La molécule FasL est exprimée sur de nombreuses lignées tumorales et favorise le mécanisme de contre-attaque tumorale en induisant l’apoptose de LT ou LB Fas positifs par la voie d’apoptose induite par la fixation du ligand Fas-L sur son récepteur Fas. Nous avons montré que la protéine RhoA ainsi que l’un de ses effecteurs la protéine ROCK régulent de façon négative l’expression de Fas-L à la membrane des cellules de mélanome murin B16F10 limitant ainsi in vitro le mécanisme de contre-attaque tumorale. La molécule CD70 est exprimée sur quelques lignées tumorales, mais son rôle fait encore l’objet de controverses. Nous avons montré pour la première fois qu’une lignée de mélanome métastatique humaine exprime de façon constitutive la molécule CD70 et que l’expression de cette molécule, impliquée dans l’inhibition de la prolifération lymphocytaire, peut être régulé par la protéine RhoA. L’ensemble de ce travail a permis de montrer que les protéines Rho régulent l’expression de plusieurs molécules impliquées dans la mise en place de réponses immunes anti-mélanome. Ces résultats permettent d’envisager le développement de protocoles d’immunothérapie clinique utilisant des cellules de mélanomes HLA-compatibles prétraitées in vitro par l’association IFNγ plus GGTI-298 comme cellules « thérapeutiques » ou vaccinales. Le mélanome est une forme de cancer de la peau extrêmement agressif pour lequel de nombreuses stratégies d’immunothérapies ont été développées. A ce jour seuls quelques patients inclus dans ces protocoles cliniques ont répondu de façon positive aux traitements avec quelques rares cas de rémissions complètes (Gattinoni et al ., 2006). C’est pourquoi la recherche de nouvelles approches et de nouvelles cibles thérapeutiques est un enjeu majeur dans le développement de l’immunothérapie du mélanome. Le développement tumoral est un mécanisme complexe qui associe le plus souvent la transformation tumorale à une perte de reconnaissance des cellules cancéreuses par les effecteurs immuns. De nombreux mécanismes regroupés sous le terme « d’échappement tumoral » expliquent cette inefficacité de la réponse immune (Zitvogel et al., 2006). Les statines couramment utilisées dans les traitements des hypercholestérolémies ont démontré un effet positif dans la prévention des cancers (Demierre et al., 2005). Plusieurs études in vitro réalisées sur divers modèles tumoraux, ont mis en évidence un rôle inhibiteur de ces molécules sur l’activité des protéines Rho (Denoyelle et al., 2001) (Shellman et al ., 2005 ) (Agarwal et al., 2002). De plus, de nombreux travaux ont montré un rôle des statines dans la régulation de l’expression membranaire de ligands de l’immunité à la surface de divers modèles cellulaires (Takahashi et al.,2005) (Wagner et al., 2002) (Blancon-Colio et al., 2003). A partir de ces observations nous avons choisis d’évaluer l’effet des statines, puis des protéines Rho dans la mise en place de la réponse immune en particulier par l’expression membranaire de protéines intervenants dans ces réponses. Nos travaux ont permis de montrer que les protéines Rho régulent des mécanismes indépendants et dépendant de l’IFN-γ favorisant la mise en place d’un RI anti-mélanome. I) Rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des protéines impliquées dans la réponse immune anti-mélanome. Le GGTI-298 ou la C3-exoenzyme seule stimulent l’expression des molécules de costimulation CD80/CD86 à la surface des lignées de mélanome alors que l’association du GGTI-298 avec l’IFN-γ est nécessaire pour stimuler celle des molécules de CMH-I. Ces résultats suggèrent que deux mécanismes, l’un dépendant et l’autre indépendant de l’IFN-γ, sont à l’origine de ces observations. I-1) Mécanisme dépendant de l’IFN-γ : A) Les molécules du CMH de classe I : Nos résultats montrent, dans des modèles de mélanomes humains et murins, que les protéines Rho régulent négativement l’expression dépendante de l’IFN-γ des CMH de classe I en modifiant le niveau d’expression du transporteur peptidique TAP1/2. Les résultats décrits dans cette thèse, sont focalisés uniquement sur le modèle du mélanome mais nous avons obtenus des résultats similaires dans d’autres types tumoraux (cellules de cancer du sein ou de la prostate) et même dans des lignées non tumorales (fibroblaste murin MC57). Ces observations suggèrent donc que le contrôle de l’expression IFN-γ dépendante des CMH-I, par les protéines Rho, n’est pas un mécanisme spécifique de la physiopathologie des mélanomes mais s’inscrirait plutôt dans un mécanisme de contrôle négatif de la voie de signalisation de l’IFN-γ. Cette hypothèse est appuyée par les travaux de Menschikowski et al (Menschikowski et al.,2005) qui montrent que l’inhibition des protéines Rho, par les statines ou la toxine B, potentialise l’expression IFN-γ dépendante de la phospholypase A2 (PLA2). L’ensemble de ces résultats permet de suggérer un rôle des protéines Rho comme régulateurs négatifs de la voie de signalisation de l’IFN-γ. La fixation de l’IFN-γ à son récepteur induit l’association de plusieurs chaînes du récepteur et l’activation d’une cascade de signaux intracellulaires. L’interaction récepteur-ligand induit, l’activation des tyrosine kinases JAK1/2 (Janus Kinases) , lesquelles phosphorylent alors les chaînes du récepteur activé et créent ainsi des sites d’ancrage pour les facteurs de transcription STAT1. Les protéines STAT1 sont alors phosphorylées par les JAK et forment des dimères qui migrent vers le noyau pour se fixer sur des séquences d’ADN consensus GAS (gamma associated sequence) présentes dans les promoteurs des gènes cibles (Figure A). Trois familles de protéines, les phosphotyrosines phosphatase, les SOCS (suppresor of cytokine signaling) et les PIAS (protein inhibitor of activated STAT) inhibent la voie JAK/STAT à différents niveaux. Les phosphotyrosines phosphatases inhibent cette voie en déphosphorylant les, JAK, les STAT. Les PIAS interagissent avec les STAT activées et empêchent leur liaison à l’ADN. Les SOCS sont induites par la voie JAK/STAT elle-même, en réponse au stimuli. Elles exercent un rétrocontrôle négatif en se fixant aux JAK activées empêchant le recrutement des STAT en inhibant l’activité enzymatique de JAK et/ou en déclenchant leur dégradation par le protéasome. Les travaux de Kreiselmeier et al., (Kreiselmeier et al., 2003) montrent que les protéines Rho et plus précisément RhoA est un régulateur négatif de la protéine STAT1. En effet, ces auteurs montrent que l’activation de RhoA stimule l’expression de la protéine PIAS1 ubiquitaire qui inhibe alors l’activité du facteur de transcription STAT1. Ce modèle semble être en accord avec nos résultats. Nous pourrions alors émettre l’hypothèse selon laquelle les protéines Rho en stimulant l’expression de PIAS1 dans les mélanomes inhiberaient l’expression IFN-γ dépendante du transporteur TAP1/TAP2 et par conséquent des molécules de CMH-I (Figure B). Les protéines STAT1 sont des facteurs de transcription connus pour interagir avec des co-Activateurs transcriptionnels tel que le complexe CBP/p300 (Zhang et al., 1996). Les travaux de Su et al montrent dans un modèle d’adénocarcinome mammaire que l’inhibition des Rho favorise l’association du complexe CBP/P300 sur le récepteur des oestrogènes et stimule son activité transcriptionnelle (Su et al., 2002). Dans nos modèles de mélanome, l’augmentation du recrutement de CBP/p300 sur le facteur de transcription STAT1, suite à l’inhibition des Rho , pourrait également Figure A : La voie de l’IFN-γ Figure B : Rôle des protéines Rho dans l’expression dépendante de l’IFN-γ des protéines TAP1/2 et des CMH-I. Figure C : Rôle des protéines Rho dans l’expression dépendante de l’IFN-γ des protéines TAP1/2 et des CMH-I. Figure D : Rôle des protéines Rho dans l’expression dépendante de l’IFN-γ des protéines TAP1/2 et des CMH-I : expliquer les effets que nous avons observé (Figure C). Enfin le clonage et le séquençage du gène TAP-1 a mis en évidence la présence d’un site GAS de réponse à l’IFN-γ mais également la présence de deux autre site consensus pour SP1 et NFkB (ChatterjeeKishore et al., 1998) sur la région promotrice du gène. Or, l’inhibition des protéines Rho stimule l’activité transcriptionelle d’un promoteur minimum composé de séquences consensus pour SP1, comme l’ont montré Su et al (Su et al., 2001). Cette observation permet d’émettre une dernière hypothèse quant au mode d’action par lequel l’inhibition des protéines Rho stimule la transcription IFN-γ dépendante du gène TAP1. On peut en effet émettre l’hypothèse d’un recrutement plus important du facteur de transcription SP1 sur le site consensus présent dans le promoteur TAP1 qui se comporterait alors comme une séquence enhancer (Teferedegne et al., 2006) capable de stimuler l’expression IFN-γ et STAT1 dépendante du gène TAP1 (Figure D). Pour évaluer l’implication de ces différents mécanismes dans la régulation de l’expression des CMH-I et de la protéine TAP-1 induites par l’IFN-γ il serait tout d’abord intéressant dévaluer l’expression de ces protéines dans des cellules traitées par l’IFN-γ, transfectées par des ARN interférant de PIAS1 ou de SP1. Par ailleurs des expériences d’immunoprécipitation de chromatine permettront d’évaluer l’implication des protéines Rho dans le recrutement de corégulateurs transcriptionnels (CBP/p300) sur les protéines STAT1. B) La protéine PD-L1 : La protéine PD-L1 dont l’expression à la surface des cellules tumorales peut être stimulée par l’IFN-γ (Lee et al., 2006), favorise l’échappement des tumeurs au système immunitaire. Nous avons montré que l’expression dépendante de l’IFN-γ de PD-L1 à la surface de la lignée LB1319-MEL est significativement diminuée par le GGTI-298. Cette observation, qui devra être complétée par un traitement associant l’IFN-γ et la C3 exoenzyme suggère néanmoins un rôle des protéines Rho dans la régulation de l’expression induite par l’IFN-γ de la protéine PD-L1. Lee, SK et al (Lee et al., 2006) ont mis en évidence l’implication du facteur de transcription NFkB dans l’expression dépendante de l’IFN-γ de la protéine PD-L1 et plusieurs travaux ont montré le rôle des protéines Rho dans l’activation de la transcription dépendante de NFkB (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 ; Montaner et al., 1999). Il serait donc intéressant d’évaluer l’implication d’une voie Rho/NFkB dans l’expression dépendante de l’IFN-γ de la molécule PD-L1. Pour cela, l’expression de PD-L1 pourrait être analysée dans des cellules traitées par une molécule activatrice des protéines Rho (LPA,CNF1) dans lesquelles l’activité du facteur NFkB serait bloquée par un inhibiteur pharmacologique (SN50). I-2) Mécanisme indépendant de l’IFN-γ A) CD80/CD86 Les molécules de costimulation jouent un rôle essentiel dans l’activation des LT. Leur expression a été majoritairement décrite sur les CPA (Cellules Dendritiques (CD), Macrophages, Lymphocytes B (LB)). La présence de ces molécules a également été mise en évidence à la surface de cellules tumorales, comme les lymphomes (Trentin, L et al 2000), certains carcinomes (Li et al., 1996) et même certains mélanomes primaires (Denfeld et al., 1995). Nos résultats montrent qu’un traitement par le GGTI-298 ou la C3-exoenzyme induit à la membrane de nos lignées de mélanomes l’expression des molécules de costimulation CD80 et CD86. Ces observations impliquent donc un rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression de ces molécules. Nous avons amplifié à partir de l’ADN génomique de la lignée LB1319-MEL le promoteur du gène codant CD86 et nous l’avons cloné dans un système rapporteur luciférase. Des résultats préliminaires montrent que l’inhibition des protéines Rho par la C3 exoenzyme stimule l’activité transcriptionnelle du promoteur du gène codant CD86. Or, le groupe de Nicole Suciu-Foca (Li et al. 2000,) a identifié dans le promoteur de CD86, deux séquences consensus de liaison pour le facteur de transcription NFkB et a démontré le rôle central de ces séquences dans la transcription du gène codant CD86. Par ailleurs, dans des cellules tumorales p815, Donepudi et al ont mis en évidence l’implication de NFkB dans l’expression de CD86 induite par un agent alkylant ; le Melphalan (Donepudi et al., 2001). Sur la base de ces deux travaux, nous avons émis l’hypothèse qu’il y aurait dans nos mélanomes traités, une activation de la transcription du gène codant CD86 qui serait dépendante du facteur NFKB et induite par l’inhibition des protéines Rho. Cette hypothèse est en contradiction avec plusieurs données de la littérature, qui montrent qu’une inhibition des protéines Rho favorise plutôt l’inhibition que l’activation de la transcription dépendante du facteur NFkB (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 ; Montaner et al., 1999), mais cette régulation pourrait être inversée dans nos lignées de mélanomes. En effet Fritz,G et al ont mis en évidence un rôle répresseur de RhoB sur l’activation de NFkB (Fritz et al., 2001). D’autre par, la présence sur le promoteur de CD86 de séquences consensus capables de lier des facteurs de transcriptions activés par l’inhibition des protéines Rho pourrait expliquer le rôle de régulateur négatif de ces protéines sur la transcription du gène codant CD86. Nous rechercherons donc à l’aide de logiciels informatiques la présence dans ce promoteur de séquences de liaisons consensus à des facteurs de transcription connues pour être activés par l’inhibition des protéines Rho, comme par exemple le facteur Sp1. B) FasL Au cours de nos travaux, nous avons mis en évidence une implication de la voie de signalisation RhoA / ROCK dans la régulation de l’expression membranaire de la protéine FasL à la surface des cellules de la lignée B16F10. Comme le montrent nos résultats l’inhibition de la protéine RhoA ou de son effecteur ROCK augmente uniquement l’expression membranaire de FasL sans affecter le niveau d’expression total de la protéine analysé par western blot ou par RT-PCR. La voie RhoA/ROCK est impliquée dans diverses fonctions cellulaires associées au réarrangement du cytosquelette. Récemment Nishimura et al ont montré que cette voie de signalisation contrôle la localisation intracytoplasmique des lysosomes, (Nishimura et al., 2000), or les lysosomes dans les cellules tumorales, sont les vésicules responsables du traffic de FasL vers la membrane plasmique. Ainsi, une modification du traffic lysosomal, suite à l’inhibition de la voie RhoA/ROCK, pourrait rendre compte d’une augmentation du niveau d’expression de FasL à la membrane plasmique (Abrahams et al., 2003) (MartinezLorenzo et al., 2004).Il serait donc intéressant par microscopie confocale d’étudier la présence de FasL dans les lysosomes et leur localisation dans les cellules B16F10 traitées ou non par des inhibiteurs de RhoA et de ROCK. Par ailleurs, l’inhibition de la voie RhoA / ROCK par la simvastatine (Turner et al., 2005) inhibe dans les cellules musculaire lisses la synthèse de la métaloprotéinase 9 (MMP9), or la perte d’ expression de MMP9 dans les neurones, est corrélée à une absence d’expression membranaire de FasL (Kiaei et al., 2007). Il serait donc intéressant d’évaluer le rôle de la voie RhoA/ROCK dans l’expression de la MMP9 dans les cellules B16F10 (Bianchini et al., 2006), puis d’étudier le rôle éventuel de cette protéine dans l’expression membranaire de FasL en utilisant des ARNi. C) CD70 Nous décrivons pour la première fois, l’expression de la molécule CD70 à la surface d’une lignée de mélanome humain et nous mettons également en évidence le rôle de la protéine RhoA dans le contrôle du niveau d’expression de CD70 dans cette lignée LB1319-MEL. En effet, nous avons observé par cytofluorimétrie une inhibition d’un facteur 3 de l’expression de CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par un ARNi spécifique de RhoA par rapport aux cellules transfectées par un ARNi contrôle. Par ailleurs, des résultats préliminaires de PCR semi-quantitative montrent une diminution du niveau d’expression de l’ARNm codant la protéine CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par un ARNi spécifique de RhoA. Ces résultats soutiennent l’hypothèse d’un contrôle transcriptionnel du gène codant la molécule CD70 par la protéine RhoA. Ils devront être confirmé par l’utilisation d’un plasmide codant le gène de la luciférase sous contrôle du promoteur de CD70 qui sera transfecté dans des cellules traitées ou non par des inhibiteurs ou des ARNi de RhoA. Ces observations nous permettent de conclure que RhoA contrôle le niveau d’expression de CD70 dans la lignée LB1319-MEL, mais ne nous permettent pas de dire que l’expression de CD70 est uniquement sous le contrôle de la protéine RhoA. En effet, si cela était le cas, l’inhibition de RhoA inhiberait totalement l’expression de CD70. C’est pourquoi nous avons entrepris d’étudier cette lignée cellulaire l’implication de différentes voies de signalisation dans le contrôle de l’expression de CD70. Ainsi, au cours de travaux qui n’ont pas été présentés dans ce manuscrit, nous avons montré que l’activation constitutive de la voie des MAPK, induite par la mutation V600E de la protéine BRAF, contrôle également l’expression de la molécule CD70 dans ce modèle. En effet, l’inhibition de BRAF par un ARNi spécifique ou l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des protéines MEK1/2 (U0126 ; PD98059) diminue le niveau d’expression de la protéine CD70. Par ailleurs, nous avons observé que l’inhibition simultanée de la voie des MAPK et de la protéine RhoA induit une perte totale d’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL. Ce résultat suggère qu’une voie de signalisation initiée par la protéine RhoA associée à une activation constitutive de la voie des MAPK, induite par la mutation V600E de la protéine BRAFV660E sont responsables de l’expression de CD70 dans la lignée de mélanome LB1319-MEL. La mutation BRAFV600E est un événement fréquent dans les mélanomes (Maldonado et al., 2003) que nous avons retrouvé dans la lignée BB74-MEL qui pourtant n’exprime pas CD70. Toutes ces observations suggèrent que l’expression de CD70 dans la lignée LB1319-MEL est dépendante de deux voies de signalisation, la première associée à l’activation des MAPK induite par la protéine BRAFV600E, la seconde initiée par la protéine RhoA. Nous émettons l’hypothèse que cette deuxième voie pourrait être dépendante de l’activation constitutive de la protéine RhoA dans cette lignée de mélanome. Afin de confirmer cette hypothèse il serait nécessaire de comparer le niveau d’activation de la protéine RhoA entre la lignée LB1319MEL et d’autres lignées de mélanomes n’exprimant pas CD70. Cette analyse du niveau d’activation de RhoA devrait être complétée par des expériences de transfection de protéines RhoA activées (V14) dans des lignées mutées pour BRAFV600E qui n’expriment pas CD70. L’analyse de l’expression de cette molécule serait alors réalisée dans ces lignées transfectées. Il serait également intéressant de rechercher la cause de cette éventuelle activation de la protéine RhoA dans la lignée LB1319-MEL. Une activation directe par l’intermédiaire de récepteurs pourrait être envisageable (Figure E). En effet, l’interaction entre le TNF-α et son récepteur est connue pour activer RhoA (McKenzie et al., 2007) et Castelli, C et al (Castelli et al., 1994) ont mis en évidence un taux élevé de sécrétion de TNF-α dans certaines lignées de mélanome. Il serait donc nécessaire d’évaluer la sécrétion de TNF-α produite par les cellules LB1319-MEL et de la comparer avec celle produite par d’autres lignées de mélanome n’exprimant pas CD70. Un effet indirect associé à la présence dans cette lignée de mutations susceptibles d’activer RhoA sera également évaluée. Une étude de Goel, VK et al (Goel et al., 2006) portant sur 69 mélanomes primaires a mis en évidence une perte d’expression de la protéine PTEN dans 19% de ces tumeurs. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence dans la lignée LB1319-MEL la délétion de la protéine PTEN. La perte d’expression de PTEN entraîne une activation constitutive de la PI3K qui est connue pour activer les GPTase de la famille Rho par l’intermédiaire de la protéine Vav1 (Han et al.,1998) (Liliental et al., 2000). L’expression de Vav1 est retrouvée dans les mélanomes (Bartolomé et al., 2006) et Palmby, TR et al (Palmby et al., 2004) ont mis en évidence le rôle de cette protéine dans l’activation de la protéine RhoA. Ainsi on peut émettre l’hypothèse qu’une activation constitutive de RhoA dépendante de la protéine Vav1 serait induite par la délétion PTEN dans cette lignée LB1319-MEL (Figure F). Enfin, le clonage et le séquençage du promoteur de CD70 ont mis en évidence la présence d’éléments de réponse pour le facteur de transcription NFkB (Lu, Q et al p6212 2005). Plusieurs résultats montrent une diminution de l’activité transcriptionelle de NFkB associée à l’inhibition des protéines Rho (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 ; Montaner et al., 1999). Ces observations nous pousserons donc à confirmer un rôle de RhoA mais également de la voie RhoA/NFkB dans la régulation transcriptionnelle du gène codant CD70, en particulier en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques de la voie NFkB. Figure E : Mécanisme d’activation des protéines RhoA par la sécrétion autocrine de TNF-α Figure F : Mécanisme d’activation des protéines RhoA suite à une mutation de la protéine PTEN II) Rôle régulateur des protéines Rho dans le développement de la réponse immune anti-mélanome. Comme nous venons de le discuter, l’inhibition de l’activité des protéines Rho modifie l’expression à la membrane des mélanomes de molécules connues pour prendre part à la réponse immunitaire anti-tumorale. La façon dont ces modifications influence la réponse immune anti-mélanome sera discutée dans cette partie. II-1) Présentation des TAA par les cellules tumorales traitées : Nous avons montré que l’expression des molécules de CMH-I et de costimulations induite par nos traitements stimule in vitro et in vivo l’activation de LT spécifiques de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la (sur)expression des CMH-I et des molécules de costimulation induite par nos traitements transforme les cellules tumorales en « CPA-like » capables d’activer par elles mêmes des LTCD8 spéficiques de la tumeur (Figure G). Cette hypothèse est en accord avec des résultats obtenus, dans des modèles tumoraux génétiquement modifiés pour exprimer des CMH et des molécules de costimulation. En effet, Bellone, M et al (Bellone et al.,1994) ont mis en évidence in vitro la capacité de cellules tumorales RMA-S génétiquement modifiées pour exprimer CD80 et présentant des peptides tumoraux dérivés du mélanome B16F10, à stimuler des LTCD8+ qui présentent alors une activité cytotoxique spécifique des cellules B16F10. De plus, dans un autre modèle tumoral, l’activation de LTCD8+ spécifiques de l’antigène tumoral P1A peut être induite in vivo, en absence de CPA compétentes pour la présentation de l’antigène P1A aux LTCD8+, après injection de cellules tumorales génétiquement modifiées pour exprimer CD80 et présentant des complexes CMHI / P1A. Dans ce modèle, la présentation des antigènes tumoraux aux LTCD8+ spécifiques de P1A et leur activation, au niveau des tissus lymphoïdes, peuvent être induites directement par des cellules tumorales métastatiques CMHI+/P1A+/CD80+ (Bai et al., 2001). Ces résultats confortent notre hypothèse suivant laquelle les cellules de mélanomes qui expriment des CMH-I et des molécules de costimulation après nos traitements in vitro A B Figure G: Représentation schématique de l’activation lymphocytaire: (A) L’activation lymphocytaire par des CPA professionnelles nécessitent deux signaux de stimulation. La premier délivré suite à l’interaction entre le récepteur pour l’antigène (TCR) et le complexe CMH/peptide. Le second délivré par l’interaction entre les molécules de costimulation présentes sur les CPA et leur ligands exprimés par les LT. (B) Nos traitement associant l’IFN-g et le GGTI-298 stimulent l’expression des CMH-I et des molécules de costimulation à la surface des cellules tumorales. Ces cellules se transforment alors en « CPA-like » capables d’activer une réponse immune anti-tumorale. pourraient se comporter comme des CPA. Néanmoins l’intervention de CPA n’est pas exclue, notamment dans le cas des cellules de mélanomes exprimant uniquement des molécules de costimulation après traitement par le GGTI-298 seul. En effet, le travail de Bai et al (Bai et al., 2001) montrent ainsi que le transfert adoptif de LTCD8+ et marqués par le CFSE (carboxyl fluorescéine indiacétate succinyl ester) exprimant un TCR transgénique spécifique pour l’antigène tumoral P1A à des souris porteuses de tumeurs exprimant P1A et génétiquement modifiées pour exprimer CD80, induit une prolifération initiale des LTCD8+ spécifiques de la tumeur dans les organes lymphoïdes secondaires et non dans la tumeur. Ce résultat suggère l’intervention de CPA professionnelles capables d’induire l’activation des LTCD8+ par un mécanisme de présentation croisée. Afin de conforter notre hypothèse sur la transformation de mélanomes traités en « CPA like » et d’exclure l’intervention des CPA, il serait nécessaire de co-cultiver les cellules de mélanome traitées avec des lymphocytes T CD8 naïfs isolés pour tester et de rechercher l’activation de LTCD8 spécifiques de la tumeur. De plus, nous pourrions tenter évaluer in vivo la croissance des cellules de mélanome traitées dans des modèles murins compatibles dépourvues de CPA compétentes c’est à dire déplétées en CD, macrophages ou LB. II-2) Rôle in vivo de l’expression de FasL sur les cellules de mélanomes: Nous avons mis en évidence in vitro un contrôle du mécanisme de « contre-attaque » tumorale dépendant de FasL par la voie RhoA / ROCK. L’apoptose de lymphocytes exprimant la protéine Fas induite par des cellules tumorales, présentant à leur surface la molécule FasL, constitue pour ces tumeurs, un moyen d’échapper à la surveillance par le système immunitaire. Bien que ce mécanisme ait été clairement caractérisé in vitro la relevance de ce phénomène in vivo fait l’objet de controverses. En effet, des études contradictoires mettent en évidence un rôle de FasL in vivo dans la mise en place d’une réponse immune proinflammatoire anti-tumorale (Khong et al., 2002). Chen et al (Chen et al., 1998) montrent que la surexpression du gène FasL au site tumoral entraîne le rejet tumoral. Cet effet est accompagné par une importante infiltration de neutrophiles inflammatoires. Par ailleurs, Wada et al ont récemment montré que le niveau d’expression de FasL à la surface de lignées de mélanomes déterminait le type de réponse cellulaire vis à vis de la tumeur (Wada et al., 2007). Dans ce travail, il a été mis en évidence qu’un faible taux de FasL induit in vivo l’apoptose des LT et l’échappement tumoral alors que une forte expression de cette protéine favorise le rejet tumoral associé à l’infiltration de neutrophiles. En nous appuyant sur ces résultats, nous avons analysé in vivo l’effet de la surexpression de FasL, induite par l’inhibition de RhoA. Nous avons observé, au cours d’expériences préliminaires, un ralentissement de la croissance tumorale des cellules B16F10 transfectées par un ARNi de RhoA et nous avons également noté dans ces tumeurs la présence d’un infiltrat neutrophilaire important. Ces observations bien qu’encore préliminaires, nous portent à croire que comme l’ont montré Wada et al, (Wada et al., 2007) une surexpression de FasL favoriserait le rejet tumoral par l’activation d’une réponse immune inflammatoire. Afin de confirmer cette hypothèse, il serait nécessaire d’évaluer la croissance tumorale et l’importance de l’infiltrat neutrophilaire dans des tumeurs induites par des cellules B16F10 transfectées par l’ARNi de RhoA chez des souris traitées par un anticorps capable de bloquer in vivo l’interaction Fas/FasL. II-3) Evaluation du rôle de l’expression de CD70 à la surface des cellules tumorales dans la mise en place de la réponse immune anti-mélanome : Wischhusen et al (Wischhusen et al., 2002) ont montré que l’expression de CD70 à la surface de glioblastomes induit l’apoptose in vitro de LT allogéniques. Nous avons observé que l’expression de CD70 à la surface de la lignée de mélanome LB1319-MEL inhibe la prolifération de LT allogéniques. Ce résultat met en évidence un rôle de CD70 dans l’inhibition de la prolifération mais pas directement un rôle dans l’apoptose lymphocytaire que nous évaluerons ultérieurement par des tests d’apoptose spécifiques (cycle cellulaire, caspase3, AnnexineV). Diegmann et al (Diegmann et al., 2006) et al et Wischhusen et al (Wischhusen et al., 2002) montrent que CD70 participe à la protection des cellules tumorales vis à vis des effecteurs immuns en induisant leur apoptose. Ces résultats sont en désaccord avec les travaux précédents de l’équipe (Cormary et al., 2005) (Cormary et al., 2004) qui montrent que l’expression membranaire ou la sécrétion de CD70 par des cellules tumorales murines génétiquement modifiée favorise le rejet de la tumeur in vivo par activation d’effecteurs immuns. Ces résultats qui semblent contradictoires pourraient être compatibles si l’hypothèse proposée par le groupe de Michael Weller était vérifiées dans notre modèle tumoral (Aulwurm et al., 2006). Dans ce travail, ils montrent que des cellules génétiquement modifiées pour exprimer CD70 induisent in vitro l’apoptose des cellules NK tout en activant leur fonction lytique, et que ce sont ces mêmes cellules NK qui sont responsables in vivo du rejet des tumeurs exprimant CD70. Cette hypothèse est en accord avec les résultats obtenus par notre équipe qui avaient mis en évidence une implication des cellules NK dans le rejet des tumeurs génétiquement modifiées pour exprimer CD70 (Cormary et al., 2005). L’ensemble de ces données montrent donc qu’ in vivo, l’effet immuno-stimulateur de CD70 outrepasse son effet proapoptotique favorisant ainsi une réponse immune antitumorale protectrice. Par contre, in vitro l’expression de CD70 sur les cellules tumorales induirait l’apoptose de lymphocytes mis en co-culture. III) PERSPECTIVES III- 1) Etude du rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des CMH-II dépendante de l’IFN-γ et ses conséquences sur la réponse immune anti-tumorale : Au cours de travaux préliminaires nous avons observé, qu’un traitement par les statines ou le GGTI-298 inhibe l’expression des CMH-II induite par l’IFN-γ à la surface des mélanomes B16F10. Ces résultats sont en accord avec ceux déjà publiés par l’équipe de F Mach sur des lignées de monocytes/macrophages (Kwak et al., 2000). Un traitement associant l’IFN-γ et la C3 exoenzyme permettra d’évaluer l’implication des protéines Rho dans ce mécanisme. Même si l’expression des molécules de CMH-II à la surface des mélanomes favorise leur lyse par des effecteurs T CD4 cytotoxiques (Zennadi et al., 2001), Mukherji et al (Mukherji et al., 1989) ont montré que ces molécules stimulent également l’activation de LT régulateurs (LTreg). Ces populations participent de façon active à l’échappement tumoral, c’est pourquoi nous chercherons à savoir si l’inhibition de l’expression des CMH-II par nos traitements pourrait être associée à une diminution de la réponse des LTreg. Pour cela, la croissance tumorale de cellules traitées sera suivie dans trois types de souris de CMH compatibles : des souris sauvages, des souris scruffy dépourvues de LTreg et des souris génétiquement modifiée pour exprimer un grand nombre de cellules T régulatrices (Khattri et al., 2003). Il sera également intéressant de rechercher la présence de LTreg (CD4+/Foxp3+/CD25+) dans la rate et les ganglions des souris sauvages injectées par des cellules traitées par l’IFN-γ et/ou le GGTI-298 et de comparer la fréquence de ces LTreg avec celle de souris injectées avec des cellules de mélanomes non traitées. III-2) Rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression par les cellules de mélanome des molécules activatrices de l’immunité innée: Notre travail, a mis en évidence le rôle régulateur des protéines Rho dans la mise en place d’une réponse immune adaptative (LTCD8+) anti-mélanome. Cependant, plusieurs travaux montrent l’importance des effecteurs de l’immunité innée dans le contrôle du développement de ces tumeurs (Nasca et al., 1999). Les protéines murines Rae et H60 ainsi que leurs homologues humains MICA/B et ULPB sont présentes à la surface des cellules tumorales et favorisent leur élimination en activant les effecteurs de l’immunité innée les NK et les LTγδ. Des résultats préliminaires nous ont permis d’observer que le traitement par le GGTI-298 stimule l’expression de ces molécules à la surface des cellules B16F10. Nous envisageons donc l’étude du rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des ligands activateurs de l’immunité innée présents à la surface des mélanomes murins et humains. Pour cela il sera intéressant d’évaluer l’expression des protéines Rae, H60, MICA/B et ULPB(123)à la surface de diverse lignées de mélanomes murines et humaines. L’implication des protéines Rho dans le niveau d’expression de ces molécules sera d’abord évaluée par des traitements à la C3exoenzyme puis avec des ARNi. Enfin l’utilisation de souris dépourvue des LTγδ ou de souris possédant des cellules NK sans activité lytique (beige) nous permettront d’aborder l’étude le rôle régulateur des protéines Rho dans la réponse innée anti-mélanome. III-3) L’inhibition des protéines Rho a-t-elle un intérêt dans la mise en place de protocoles d’immunothérapie clinique? Nos résultats montrent que le traitement associant l’IFN-γ et le GGTI-298 stimule in vitro la capacité des cellules de mélanome à activer des effecteurs LTCD8+ cytotoxiques spécifiques. Dans notre modèle, les cellules tumorales expriment des tumeurs exprimant le peptide MelanA-MART1 présenté par l’haplotype HLA-A0201 du CMH-I. Ces résultats paraissent intéressants pour le développement d’immunothérapies adoptives. Cependant il est primordial de pouvoir confirmer la spécificité et la fonctionnalité des lymphocytes activés avec des cellules tumorales traitées. Grâce à l’utilisation de souris immunodéficiences (Scid) et/ou de souris transgéniques exprimant HLA-A2 (Pajot et al., p3060) sur lesquelles nous implanterons des cellules du mélanome humain LB1319-MEL, (HLA-A0201+/MelanAMART1+) nous testerons la capacité des différents effecteurs immuns obtenus après nos stimulations in vitro à contrôler la croissance tumorale. Cette expérience évalue, dans un modèle pré clinique l’efficacité en thérapie adoptive, des effecteurs immuns obtenus après stimulation avec les cellules de mélanome HLA compatibles prétraitées. Ces effecteurs immuns seront induits à partir de lymphocytes du sang périphérique de donneurs sains ou de patients porteurs de mélanomes (HLA-A0201+). Notre travail a également permis de mettre en évidence l’efficacité de notre protocole de vaccination utilisant des cellules de mélanome murin traitées par l’association IFN/GGTI298. L’a confirmation du potentiel vaccinal, des cellules de mélanome murines prétraitées in vitro, sera réalisée par la mise en évidence de populations mémoires dans des souris immunisées. Dans le modèle humain des expériences de co-cultures de PBMC et de cellules de mélanome traitées, permettront la recherche de LT CD8+/CD28+/CD27+/CD62L-/CCR7qui ont été décrites par Rosenberg et al (Powell et al., 2005) comme les effecteurs mémoires spécifiques des mélanomes et impliquées dans les effets cliniques. Ces aspects du travail seront entrepris afin de préparer la phase translationnelle vers des partenaires cliniques. Ils seront réalisés en collaboration étroite avec les cliniciens de l’Institut Claudius Regaud responsables du traitement des patients atteints de mélanome, en vue de la mise en place de protocoles d’immunothérapie (Figure H). Vaccination Transfert Adoptif Figure F : Applications thérapeutiques de nos travaux A Abbas, A. K., K. M. Murphy, et al. (1996). "Functional diversity of helper T lymphocytes." Nature 383(6603): 787-93. Abrahams, V. M., S. L. Straszewski, et al. (2003). "Epithelial ovarian cancer cells secrete functional Fas ligand." Cancer Res 63(17): 5573-81. Abud-Mendoza, C., H. de la Fuente, et al. (2003). "Therapy with statins in patients with refractory rheumatic diseases: a preliminary study." Lupus 12(8): 607-11. Agarwal, B., B. Halmos, et al. (2002). "Mechanism of lovastatin-induced apoptosis in intestinal epithelial cells." Carcinogenesis 23(3): 521-8. Aktas, O., S. Waiczies, et al. (2003). 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