Cellules tumorales et ADN libre circulant dossier thématique Les cellules tumorales circulantes : place actuelle et perspectives en oncologie thoracique Circulating tumor cells: current state and perspectives in thoracic oncology Paul Hofman* génotypique des cellules tumorales circulantes (CTC) chez les patients atteints d’un cancer du poumon représentent actuellement un enjeu majeur en oncologie thoracique. En effet, outre son intérêt pronostique, ceci devrait permettre d’optimiser le monitoring de ces patients et d’adapter le traitement selon leur présence et/ou la détection d’altérations génomiques en leur sein. Toutefois, malgré l’engouement dans ce domaine, ces analyses ne sont pas encore appliquées en pratique clinique quotidienne. Nous décrivons ici l’intérêt de ce champ d’application en oncologie thoracique et les contraintes d’une telle approche. Summary RÉSUMÉ » La mise en évidence et la caractérisation phénotypique et Mots-clés : Cancer du poumon – Pronostic – Cellules tumorales circulantes – Thérapie ciblée. M * Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale, hôpital Pasteur, centre hospitalo­ universitaire de Nice et Institute for Research on Cancer and Aging (IRCAN), Inserm U1081 CNRS/ UMR CNRS 7284, centre de lutte contre le cancer Antoine­Lacassagne, université de Nice Sophia Antipolis. 168 algré les progrès thérapeutiques récents réalisés dans le cadre de la prise en charge des cancers pulmonaires, le pronostic de ces tumeurs reste sombre à 5 ans tous stades confondus. Parmi les raisons pouvant expliquer ce mauvais pronostic, on peut citer le fait que ces cancers longtemps asymptomatiques sont diagnostiqués dans la majorité des cas à un stade métastatique, que le monitoring “biologique” de ces tumeurs chez les patients ayant été opérés ou bien sous traitement médicamenteux est difficile et que des altérations génomiques responsables de résistances thérapeutiques secondaires sont souvent détectées trop tard, voire pas du tout. Ainsi, il est urgent d’identifier de nouveaux biomarqueurs spécifiques et sensibles, aisément détectables et de façon répétée. C’est dans ce cadre que l’isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang des patients atteints d’un cancer du poumon prennent toute leur importance. Compte tenu des progrès technologiques récents visant à mettre en évidence ces CTC, et de l’émergence croissante de nouvelles thérapies The detection and the phenotypic and genotypic characterisation of the circulating tumor cells (CTCs) in lung cancer patients are currently major challenges in thoracic oncology. This approach should help in prognosis evaluation and optimization of patients monitoring and allow to adapt the treatment according to the presence of CTCs and/or to the detection of genomic alterations in CTCs. However, despite the strong interest in this domain, these analyses are not applied in a daily routine practice. Here, we describe the main current interests and some of the constraints of this approach in thoracic oncology. Keywords: Lung cancer – Prognosis – Circulating tumor cells – Targeted therapy. ciblées sur des anomalies moléculaires et des voies de signalisation activées au sein des cellules cancéreuses, ce champ d’investigation devient un challenge majeur en oncologie thoracique. Le nombre croissant des publications (notamment de revues générales) sur ce sujet traduit parfaitement cet engouement (1-6). Physiopathologie des cellules tumorales circulantes et cancer du poumon La dissémination métastatique des carcinomes bronchopulmonaires se fait via la progression dans les vaisseaux de cellules tumorales issues de la tumeur primitive. Ce passage se fait progressivement, même en cas de tumeur pulmonaire de très petite taille et avant toute résection chirurgicale (7). Lors d’une intervention chirurgicale, un grand nombre de cellules tumorales peut passer dans la circulation sanguine sans que la responsabilité de ces cellules tumorales ainsi relarguées dans le futur développement de méta- Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013 Les cellules tumorales circulantes : place actuelle et perspectives en oncologie thoracique stases soit réellement démontrée (8). Le passage dans le sang est associé, pour un grand nombre de cellules tumorales, à une modification phénotypique, à la perte plus ou moins complète des marqueurs épithéliaux (notamment des cytokératines et de l’e-cadhérine) et à l’apparition des marqueurs mésenchymateux, en particulier de la vimentine (9, 10). Ce phénomène de transition épithéliomésenchymateuse permet aux cellules tumorales d’avoir une plus grande plasticité, d’augmenter leur capacité migratoire et invasive, et aussi, probablement, de mieux se protéger de la pression existant dans le flux sanguin. Les cellules tumorales circulantes résistent aussi au phénomène d’anoïkis grâce à ces modifications phénotypiques. Chez un patient atteint d’un cancer pulmonaire, certaines CTC migrent dans le flux circulatoire de façon groupée et sous forme de microemboles, ce qui semble favoriser leur survie (11). Le profil phénotypique de ces cellules tumorales associées aux microemboles montre que certaines d’entre elles n’expriment plus le phénotype épithélial mais un phénotype mésenchymateux, ce qui peut permettre une migration collective. Une fois arrivées sur le site métastatique, les CTC acquièrent à nouveau un phénotype épithélial dans un phénomène dit de transition mésenchymatoépithéliomateuse. Fait marquant, il a été démontré récemment que les CTC peuvent venir recoloniser le site tumoral primitif d’où elles se sont détachées (12). Les méthodes de détection des CTC en oncologie thoracique Les méthodes de détection des CTC chez les patients atteints d’un cancer du poumon sont très nombreuses, mais peu d’entres elles sont actuellement applicables en routine ou dans les laboratoires hospitaliers, soit à cause de leur coût, soit parce que leur sensibilité et leur spécificité n’ont pas été validées (10). Aucune technique n’a encore fait définitivement la preuve de sa supériorité pour une utilisation clinique quotidienne, toutes les méthodes rapportées présentant des avantages et des inconvénients (4, 10, 13, 14). Que doit apporter une méthode de détection des CTC par rapport à une méthode d’analyse tissulaire sur la tumeur primitive ou sur la tumeur métastatique ? Cette méthode doit être aussi sensible et spécifique et doit, idéalement, permettre de caractériser les différentes altérations génomiques accessibles aux nouvelles thérapeutiques. Même s’il n’existe pas actuellement de méthode idéale répondant à ces critères, des progrès technologiques récents laissent entrevoir ces possibilités à court terme. Parmi les méthodes directes ou indirectes développées pour la mise en évidence des CTC chez les patients atteints d’un cancer du poumon, les 2 techniques le plus souvent utilisées par les investigateurs sont la méthode CellSearch® et la méthode ISET® (10) [figure, p. 170]. La méthode CellSearch® repose sur la détection de cellules circulantes exprimant des marqueurs épithéliaux. Deux pièges sont alors possibles. Premièrement, des cellules épithéliales bénignes circulantes peuvent être détectées ; deuxièmement, des cellules n’exprimant plus les cytokératines du fait d’une transition épithéliomésenchymateuse peuvent ne pas être isolées (10) [figure, p. 170]. La méthode ISET® permet de caractériser les cellules “circulantes non hématologiques” par leur morphologie, et des critères cytologiques de malignité peuvent être ainsi attribués aux cellules isolées sur des filtres munis de pores (figure, p. 170). Lorsque ces 2 méthodes sont utilisées pour détecter des CTC dans une même cohorte de patients, on constate que le nombre des CTC comptabilisées est différent selon la méthode utilisée (15). Ceci amène à faire plusieurs commentaires. Les principaux critères d’évaluation de ces méthodes doivent intégrer, bien sûr, leur spécificité et leur sensibilité (paramètres essentiels), mais aussi leur coût, la faisabilité d’une mise en place dans le cadre d’une pratique clinique, et la qualification technique et médicale requise pour que le personnel puisse réaliser et interpréter les résultats obtenus. L’un des paramètres essentiels à évaluer actuellement est la possibilité de réaliser sur les CTC isolées des examens complémentaires (biologie moléculaire et/ou immunocytochimie) visant à identifier des biomarqueurs accessibles à des thérapies ciblées. Ainsi, certaines techniques sophistiquées ou certaines approches ont été ou sont développées actuellement et permettent de caractériser sur des CTC différentes altérations génomiques (mutations de l’EGFR, réarrangement du gène EML4-ALK) ou d’autres molécules d’intérêt par biologie moléculaire ou immunocytochimie (16-18). Ces techniques doivent maintenant être validées sur des cohortes de patients larges et indépendantes de façon à s’assurer de leur reproductibilité dans plusieurs établissements de soins. Impact pour l’évaluation du pronostic Quelle que soit la technique employée (CellSearch® ou ISET®), le nombre des CTC isolées est corrélé au pronostic (survie et/ou récidive métastatique) des patients atteints d’un cancer du poumon, soit aux stades précoces de la maladie (stades I à IIIA), soit aux stades tardifs (stades IIIB à IV) [7, 15]. Ainsi, la mise en évidence Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013 169 Cellules tumorales et ADN libre circulant dossier thématique C A B D E Figure. Détection des cellules “circulantes non hématologiques” chez les patients atteints d’un cancer du poumon par la méthode ISET®. A. Équipement permettant la filtration sanguine et le recueil des cellules non hématologiques. B. Filtre poreux présentant 10 spots colorés par la coloration de May-Grünwald Giemsa (MGG) pouvant être analysés en microscopie optique. C. Cellules “circulantes non hématologiques” montrant des critères cytologiques de malignité. D. Cellules “circulantes non hématologiques” montrant des critères cytologiques de malignité incertaine. E. Cellules “circulantes non hématologiques” montrant des critères cytologiques de bénignité. (C, D, E : cellules isolées en préopératoire chez des patients ayant un adénocarcinome pulmonaire de stade II ; MGG, grossissement × 800 ; flèches : pores de 8 μm). des CTC en phase préopératoire a été associée à un risque plus élevé de récidive postopératoire et à une survie diminuée (7). De la même façon, l’efficacité de la chimiothérapie a pu être corrélée à une chute rapide du nombre de CTC (19). Plusieurs études indépendantes utilisant des techniques de détection différentes ont ainsi clairement établi que la présence des CTC est un facteur de mauvais pronostic indépendant chez les patients atteints d’un cancer pulmonaire non à petites cellules (4, 7, 15, 19). Impact pour la prédiction de la réponse thérapeutique L’un des enjeux majeurs en oncologie thoracique est de pouvoir prédire la réponse thérapeutique (en particulier, l’efficacité des thérapies ciblées) après analyse et caractérisation des CTC. Des études récentes ont montré que les mutations du gène de l’EGFR identi- 170 fiées sur les CTC des patients atteints d’un cancer du poumon en phase métastatique étaient identiques à celles visibles au niveau tissulaire, en particulier sur la tumeur primitive (17). De la même façon, il y a une très bonne concordance entre un réarrangement d’ALK (mis en évidence par une analyse en FISH et/ou par immunocytochimie) présent sur les CTC et les tumeurs (16, 18). Ceci laisse présager plusieurs orientations : ✓ la mise en place d’une médecine stratifiée selon les résultats obtenus à partir d’une analyse sanguine (en particulier pour des patients dont le site à biopsier est difficile d’accès, en cas de récidive tumorale ou chez des patients fragilisés) ; ✓ la recherche systématique, sur un échantillon sanguin, des altérations génomiques sensibles aux ciblages thérapeutiques (les CTC isolées étant le reflet probable de l’ensemble des altérations génomiques présentes sur tous les sites tumoraux) ; ✓ le développement des méthodes de “screening” mutationnel à haut débit (PCR multiplexe ; séquençage Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013 Les cellules tumorales circulantes : place actuelle et perspectives en oncologie thoracique nouvelle génération, analyse de type “mass array” par un Sequenom) afin d’identifier de nouvelles mutations ou l’association de plusieurs altérations génomiques. Au-delà de l’intérêt théranostique, la caractérisation moléculaire des CTC peut également aider à déterminer l’origine primitive du cancer, notamment chez des patients atteints d’un cancer pulmonaire occulte, non encore détectable par l’imagerie. Cette approche nécessite des analyses moléculaires dites “à haut débit”, qui ne sont pas encore applicables en routine clinique (20). Impact pour le diagnostic Le pronostic des cancers du poumon est lié au diagnostic précoce de la maladie, qui permet une résection chirurgicale complète. Se pose alors la question d’un dépistage précoce et systématique de ce cancer dans une population ciblée et à haut risque (patients fortement exposés au tabac, patients porteurs d’une bronchopneumopathie chronique obstructive). En effet, hormis une approche par imagerie de type tomodensitométrie de dernière génération (technique coûteuse non applicable systématiquement dans une large population), il n’existe pas de biomarqueur suffisamment spécifique et sensible permettant un dépistage précoce des cancers du poumon. L’analyse par technique ISET® a montré que des patients atteints d’un cancer du poumon de stade IA pouvaient avoir des CTC, ce qui témoigne d’une dissémination précoce de la maladie avant toute résection chirurgicale (7). Ceci confirme bien certaines observations expérimentales objectivant une circulation très précoce des CTC à partir de nodules tumoraux de très petite taille. Reste à définir une technique assez sensible et assez spécifique pour pouvoir isoler, chez des patients asymptomatiques et à risque, des CTC issues d’une tumeur primitive de très petite taille. Ainsi, si une telle méthode se développe ou se confirme, on peut envisager un “pré-screening” dans une population à haut risque et, en cas d’isolement de CTC, un examen radiologique (ce dernier pouvant être éventuellement répété). Entre le doute et l’espoir Alors que les publications s’intéressant aux CTC en oncologie thoracique sont de plus en plus nombreuses, il n’y a toujours pas d’applications en pratique clinique, et donc pas d’amélioration de la prise en charge. Ceci tient certainement à différentes raisons. La première est liée au fait que la technique CellSearch® (seule méthode ayant obtenu l’autorisation de la Food and Drug Administration aux États-Unis et étant considérée comme la méthode “gold standard”) a été validée uniquement dans le cadre du suivi des patients atteints d’un cancer du côlon, de la prostate ou du sein en phase métastatique, et qu’elle semble moins facile à utiliser dans le cadre des cancers du poumon métastatiques. Le niveau de spécificité et de sensibilité des méthodes ne semble pas satisfaire encore totalement les oncologues. De plus, la multiplicité des techniques rend difficile leur “bonne lecture” par ces derniers, d’autant que beaucoup de résultats publiés tardent à être validés sur de larges cohortes de patients dans le cadre de projets multicentriques. La technique ISET®, séduisante par son approche cytomorphologique, nécessite pour l’instant le traitement rapide de l’échantillon sanguin après le prélèvement, ce qui peut apparaître comme une contrainte si le patient est loin du laboratoire. En France, peu de projets de recherche clinique intégrant la détection des CTC dans les cancers du poumon ont reçu un écho favorable lors des différents appels à projets et sont exceptionnellement soutenus de façon institutionnelle. La grande majorité des techniques déployées est aussi relativement coûteuse, imposant une grande maîtrise technologique et une bonne expertise. Enfin, d’autres approches utilisant des échantillons sanguins sont actuellement en concurrence avec la recherche des CTC dans les cancers du poumon, comme l’analyse de l’ADN tumoral libre plasmatique ou celle des microARN plasmatiques (21). Toutefois, l’émergence et l’amélioration des méthodes d’isolement et de caractérisation des CTC, la nécessité de mieux “monitorer” sur le plan biologique les patients sous traitement, la notion de plus en plus soulignée, dans la littérature, d’hétérogénéité tumorale et l’apparition de mutations de résistance sous traitement ciblé doivent permettre à ce champ d’application de l’oncologie thoracique de se développer assez vite, et ceci au bénéfice de l’offre de soins aux patients. Conclusion La détection et la caractérisation des CTC chez un patient atteint d’un cancer du poumon laissent persister plusieurs interrogations en 2013 : est-ce que les cellules tumorales isolées actuellement par les différentes techniques mises en place sont réellement les cellules les plus agressives ? Ne passe-t-on pas à côté d’une population cellulaire non détectée par ces méthodes mais ayant un potentiel très invasif ? Peut-on assimiler systématiquement les altérations génomiques détec- Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013 171 Cellules tumorales et ADN libre circulant dossier L’auteur déclare ne pas avoir de liens d’intérêts concernant cet article. thématique tées dans les CTC à celles présentes au sein de la tumeur primitive ou de ses métastases ? Les techniques utilisées sont-elles reproductibles, suffisamment sensibles et spécifiques pour qu’on puisse les utiliser en routine ? Comment réduire le volume sanguin prélevé lors des tests afin de pouvoir réaliser un monitoring régulier des patients ? Comment prendre en charge sur le plan économique ces examens biologiques et leur remboursement ? Au-delà de ces questions se pose la pertinence de développer de telles approches, connaissant la faible quantité de matériel tumoral ainsi isolée dans le sang des patients et les nombreux pièges pouvant survenir lors des phases préanalytiques et analytiques. Certaines perspectives peuvent répondre au moins partiellement à ces questions. L’isolement des CTC non fixées, “viables” et pouvant se multiplier est maintenant possible. Ces CTC “viables” pourraient alors être implantées chez la souris, comme une xénogreffe, et leur potentiel néoplasique ainsi que leur comportement in vivo pourraient être plus facilement étudiés. 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COORDONNATEUR Denis Moro-Sibilot (Grenoble) EXPERTS Bruno Coudert (Dijon) Éric Dansin (Lille) Pierre Fournel (Saint-Etienne) Nicolas Girard (Lyon) Pierre-Jean Souquet (Lyon) Gérard Zalcman (Caen) Sydney, 27-30 octobre 2013 MÉDECIN JOURNALISTE Nathalie Charbonnier (Paris) Directeur de la publication : Claudie Damour-Terrasson Rédacteur en chef : Pr Jean-François Morère (Bobigny et Villejuif) Attention, ceci est un compte-rendu de congrès et/ou un recueil de résumés de communications de congrès dont l’objectif est de fournir des informations sur l’état actuel de la recherche ; ainsi, les données présentées sont susceptibles de ne pas être validées par les autorités de santé françaises et ne doivent donc pas être mises en pratique.Le contenu est sous la seule responsabilité du coordonnateur, des auteurs et du directeur de la publication qui sont garants de son objectivité. Avec le soutien institutionnel de Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013